CN107515268A

CN107515268A - 细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法

Info

Publication number: CN107515268A
Application number: CN201710829479.3A
Authority: CN
Inventors: 葛建; 年夫照; 林芳; 胡华军; 刘辉军; 邓同乐; 张永勇; 刘军
Original assignee: China Jiliang University; Yunnan Agricultural University
Current assignee: China Jiliang University; Yunnan Agricultural University
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107515268B

Abstract

本发明公开了一种细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，以细胞裂解液作为待测对象，所述细胞裂解液由细胞液/全血中加入细胞裂解溶剂制备而得；依次进行以下步骤：在细胞裂解液中加入氢氧化钠溶液、乙醚，所得的乙醚层干燥后复溶、离心，得上清液Ⅰ；上清液Ⅰ经层析处理，得上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ进行高效液相色谱系统分析；以所得的尼古丁药物峰面积为Y，代入公式Y＝74729X–354.61，经换算，得待测细胞液/全血中的尼古丁浓度。

Description

细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种动物(包括人)细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法。

背景技术

在烟草的燃烧过程中，可以产生5000多种已知的化学物质，其中有十几种致癌或促癌物质。烟草的主要有害物质有：

尼古丁：又称烟碱，是高度成瘾性物质，其成瘾性仅次于海洛因。尼古丁可作用于吸烟者的大脑，使吸烟者对烟草产生依赖性，是导致烟草成瘾的主要成份。尼古丁还可引起血管收缩，血压升高，心跳加快，引起冠状动脉痉挛，血管内膜受损，诱发心绞痛和心肌梗死。

烟焦油：俗称“烟油子”，每支卷烟5-15mg不等，内含多种致癌物和促癌物。它可黏附在气管、肺泡的粘膜上，影响其功能，长期可以致癌，是引起肺癌和喉癌的主要原因。焦油还是吸烟者牙齿和手指发黄的原因。最新研究表明，所谓“低焦油含量”的卷烟并不安全，不会因为改吸这类卷烟而降低烟草导致的疾病风险。

其他包括：一氧化碳、多种有毒化合物(如苯并芘、甲醛、氰化钾、丙烯、醛等)、放射性物质和多种有害金属(镉、汞、铅、砷、镍等)。

现代科学研究表明，尼古丁通过肺粘膜、消化道粘膜迅速扩散到全身，通过血脑屏障进入大脑，尼古丁能够模拟乙酰胆碱(Ach)活性，同神经元表面尼古丁受体结合，发挥生理功能。尼古丁对中枢神经系统具有刺激作用，在“奖赏回路”内作用尤为显著，其通过激活相关神经通路释放多巴胺，使得神经突触内多巴胺、血清素(5-羟色胺)和去甲肾上腺素保持在高浓度水平。随着这些激素保持作用的强化，人的清醒程度更强、注意力更集中，从而更能缓解忧虑、饥饿。长期吸烟人员大脑中尼古丁含量一直处于较高水平，神经元受体(内吞或钝化)对尼古丁敏感性下降，多巴胺刺激作用也减弱，吸烟摄入的尼古丁不能满足其快感，吸烟者由此对尼古丁产生耐受性。一旦停止吸烟，体内尼古丁含量迅速下降，神经元受体(敏化)变得异常敏感，此时Ach活性相对超过正常水平，吸烟者变得烦躁、焦虑等戒断综合征，促使吸烟者进一步通过吸烟缓解症状，吸烟者也因此陷入烟瘾增强的恶性循环。

当前，我国已经加入WHO的《烟草控制框架公约》，作为成员国，控烟已经成为我国公共安全领域一项刻不容缓的任务。目前，在一系列有关环境烟草烟雾暴露的评价指标中，尼古丁及其代谢产物可替宁的特异性和灵敏性均较高，已经成为我国卫生部门广泛使用的评价烟草暴露的生物标志，用于估计人体烟草暴露的剂量、程度及时间等信息。然而，人体生物样品信息多种多样，各种生物杂质较多，对于样品的前处理问题提出了更高的挑战。尼古丁化学结构式如式1所示。

式1：尼古丁的化学结构式

目前，关于尼古丁的定量检测与分析，国内和国外均有大量相关文献报道。有研究采用氢氧化钠和水浴加热消解的方法，消解头发后提取头发中尼古丁，然后采用液-液萃取或固相萃取方法处理后，再用气相色谱或高效液相色谱方法检测头发中尼古丁和代谢产物可替宁含量。国外期刊曾报道，Che等采用三氯甲烷提取尿液中的尼古丁，然后定量分析尿液中尼古丁含量；Miki等利用二氯甲烷提取了碱化血浆中的尼古丁，在挥发溶剂过程中加入盐酸，定量分析了血浆中尼古丁含量；国内冯斌等采用氢氧化钠碱化尿液后乙醚提取尿液中尼古丁，高效液相色谱法定量测定了尿液中尼古丁含量。

根据文献可知，动物血浆或尿液或毛发中尼古丁HPLC检测能够定量分析生物样品中尼古丁的含量，结果定量准确、灵敏、重复性好，日内和日间变异系数较小，能够满足动物体内尼古丁残留富集研究。然而该研究只是定量分析了动物血浆、尿液或毛发中尼古丁的含量，动物血浆为去除红细胞、白细胞、淋巴细胞等细胞成分的一类生物样品，细胞内大量的生物杂质已经被清除，从而使得血浆样品相比已经比较洁净。而尿液中均为一些小分子化合物，不含或含有极少的细胞成分，头发中主要是一些蛋白类，也没有细胞成分。

因此，目前的研究只是定量检测了血浆或血清、尿液或毛发中尼古丁含量，尚未得知血液中所含的各类血细胞(包括红细胞、白细胞等)中尼古丁含量，也难以求出全血中或者细胞内尼古丁含量。血细胞作为药物的一个重要储库和缓冲器，有时候需要全面评价药物或毒物在血细胞中的分布特征，从而在联合用药或染毒方面保证协同活性或全面评价混合毒性，降低联合用药的副作用。因此，获知全血中尼古丁含量对于评价机体在烟草暴露特征及规律有其特定作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞裂解液中尼古丁含量的准确、定量检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，以细胞裂解液作为待测对象，所述细胞裂解液由细胞液/全血中加入细胞裂解溶剂制备而得；依次进行以下步骤：

1)、吸取细胞裂解液0.4mL于带盖容器(带盖离心管)中，加入0.2mL 1.0M的氢氧化钠溶液，混匀后加入3mL乙醚，振荡器漩涡2±0.2min，9000±500r/min高速离心5±0.5min，分别得到位于上层的乙醚层、位于下层的残渣；

在残渣中加入2mL乙醚重复上述振荡器漩涡、高速离心(振荡器漩涡2±0.2min，9000±500r/min高速离心5±0.5min)；即，残渣再重复萃取一次；

合并两次离心所得的乙醚层；于35±1℃水浴中氮气流吹干，所得的干燥物用0.2mL的10％(体积％)乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅰ；

备注说明：此上清液Ⅰ的体积为0.2mL；即，高速离心产生的沉淀微乎其微，可忽略不计；

2)、称取碱性硅藻土(pH为9.0碱处理和480℃高温处理后的硅藻土)2g放入玻璃层析柱(10×100mm规格)中，振动(于80Hz振动泵)处理5±0.5min；

3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ(0.2mL)全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用3mL纯水淋洗，然后用1％氨水溶液(v/v)5mL淋洗(淋洗杂质)，再用10％(v/v)甲醇溶液3mL淋洗；最后用5mL洗液洗脱作为待测物的尼古丁，收集全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL溶液Ⅰ复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；

所述洗液为：甲醇(色谱甲醇)：10％(体积％)乙酸水溶液＝95：5(v/v)，即，色谱甲醇-10％乙酸＝95-5(v/v)；

溶液Ⅰ为乙腈-8mmol/L磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)，

即，溶液Ⅰ的制备方法为：先配制8mmol/L磷酸二氢钾溶液，然后溶入庚烷磺酸钠至浓度为0.08mmol/L，再用磷酸调节pH至3.0，得配制液；最后将乙腈与上述配制液按照5：95的体积比混合；

备注说明：此上清液Ⅱ的体积为0.2mL；即，高速离心产生的沉淀微乎其微，可忽略不计；下述步骤的进样量20μL，即，相当于取了1/10体积的上清液Ⅱ进行后续步骤；

4)、日本岛津shimadzu 20AT高效液相色谱系统，浙江大学智达N2000色谱工作站，色谱柱采用Agilent TC-C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)；流动相为乙腈-0.008M(8mmol/L)磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)，流速0.8mL/min，柱温12℃，紫外检测波长260nm，进样量20μL；

5)、以步骤4)所得的尼古丁药物峰面积为Y，代入公式Y＝74729X–354.61(r＝0.9999)中，从而获得步骤3)所得的上清液Ⅱ中的尼古丁浓度X，该X的单位为μg/ml；

然后经换算，得待测细胞液/全血中的的尼古丁浓度。

作为本发明的细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法的改进：所述步骤1)中的细胞裂解液的制备方法为：在细胞液/全血中加入等体积的细胞裂解溶剂均匀震荡(于100±10r/min震荡5±0.5分钟)，得细胞裂解液；所述细胞裂解溶剂的配方为：氯化铵8.29g、碳酸氢钾1g和EDTA-2Na 37.2mg，溶于1000mL超纯水中。

换算公式为X*20μL*10÷0.2mL＝X；因此，待测细胞液/全血中的尼古丁浓度为X。

为了验证本发明的方法的准确性和实用性，发明人进行了如下的试验一：

1、标准曲线制备

准确称取尼古丁标准品溶解于超纯水中，作为储备液，利用流动相(即，本发明步骤4所述的流动相)将储备液分别稀释成100.0，50.0，10.0，5.0，1.0，0.5μg/mL系列标准液，取6支具塞离心管中准确加入0.36mL空白细胞裂解液，再向上述每个离心管中各加入40μL上述标准液，混匀后即得含系列浓度尼古丁标准品的细胞裂解液，即：0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0μg/mL系列标准液。按照“上述发明内容中的样品前处理方法和色谱条件”进样分析，以尼古丁峰面积(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标作标准曲线，求出标准曲线方程和相关系数(r)，即：Y＝74729X–354.61(r2＝0.9999)。

2、回收率和精密度

制备含尼古丁的标准曲线范围内高、中、低浓度空白样品0.05，0.5，5μg/mL作为质控样品(QC)，按照上述条件进样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中尼古丁峰面积与相同浓度下标准样品中尼古丁峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下回收率。

制备含尼古丁标准曲线范围内高、中、低浓度空白样品0.05，0.5，5μg/mL作为质控样品(QC)，按照上述条件进样分析，比较以上样品于日内5次进样和日间5次进样的尼古丁峰面积变化幅度，计算日内和日间5次进样所得尼古丁峰面积的变异系数(RSD)，从而得出日内和日间精密度。

备注说明：所述高、中、低浓度空白样品0.05，0.5，5μg/mL，为制备不含有尼古丁的细胞裂解液作为空白样品，然后准确加入尼古丁使其浓度分别为0.05，0.5，5μg/mL。

表1、尼古丁的回收率和精密度

3、细胞裂解液中尼古丁含量测定

大鼠BRL肝细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，大鼠气管上皮细胞(Rattus Norvegicus,Rat)购于上海哈灵生物科技有限公司。细胞购置后于超净工作台中消毒后，将细胞置于充有5％二氧化碳的培养箱中培养，培养箱温度为37℃，每隔一天给细胞更换培养液，待细胞长到铺满整个培养瓶约90％后，用预热的0.25％胰酶-1mmol/L EDTA消化液进行消化，然后分装于新的培养瓶传代，直至培养足量的细胞用于实验所需，并将实验多余细胞保存在冻存管中，于液氮罐中冻存，以备后续实验所需。

将消化后的细胞液按照1×10⁶/ml接种于6孔细胞培养板中(每孔加1.5ml)，放入细胞培养箱中培养，待细胞长至90％培养板后，倒去全部培养液，加入含尼古丁20、40和80mg/L的培养液(每孔加1.5ml)，继续培养2h后，收集全部细胞培养液(为1.5ml)，用等体积的细胞裂解溶剂(用量为1.5ml)裂解细胞，即，在细胞培养液中加入等体积的细胞裂解溶剂均匀震荡(于100±10r/min震荡5±0.5分钟)，得细胞裂解液；所述细胞裂解溶剂的配方为：氯化铵8.29g、碳酸氢钾1g和EDTA-2Na 37.2mg，溶于1000mL超纯水中。

将所得的细胞裂解液按照上述条件进样分析，然后进行HPLC分析检测，将检测所得尼古丁峰面积代入相应标准曲线方程，得出细胞裂解液中尼古丁浓度变化。

本发明具有如下技术优势：

首先，对样品前处理进行了大变化，采用碱性硅藻土作为填料，制备成固相萃取小柱，同时对淋洗液和洗脱液进行了改变，使萃取回收率得到显著提高；

其次，色谱柱采用了柱效更为高效的Agilent TC-C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)，从而使得尼古丁分离度更好，使得灵敏度得到显著提高；

最后，本发明在流动相中加入了一定比例的乙腈(5％，v/v)，同时加大了庚烷磺酸钠浓度(0.08mmol/L)，调节流动相pH约为3.0，从而使得洗脱能力更强，同时将色谱柱柱温降低，由于尼古丁属于生物碱类，这样使得尼古丁保留时间较为适中，全血中生物杂质洗脱更快、更全面，从而对尼古丁色谱峰无干扰，对色谱柱损伤更小。

本发明不仅能检测全血中尼古丁含量，而且还可以用于研究尼古丁在不同动物细胞内的跨细胞膜转运规律。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图2是对比例1-1的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图3是对比例1-2的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图4是对比例2-1的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图5是对比例2-2的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图6是对比例3-1的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图7是对比例3-2的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图8是对比例4-1的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图；

图9是对比例4-2的细胞裂解液中尼古丁浓度图和色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

细胞裂解液的制备方法为：在细胞液/全血中加入等体积的细胞裂解溶剂均匀震荡(于100±10r/min震荡5±0.5分钟)，得细胞裂解液；所述细胞裂解溶剂的配方为：氯化铵8.29g、碳酸氢钾1g和EDTA-2Na 37.2mg，溶于1000mL超纯水中。

肝细胞的细胞液中细胞浓度为1×10⁶/ml，气管细胞的细胞液中细胞浓度为1×10⁶/ml；所用的培养液均为：DMEM基础培养基，含1％非必需氨基酸，1％L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％胎牛血清；此属于常规技术。

实施例1、一种细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，以细胞裂解液作为待测对象，依次进行以下步骤：

上述碱性硅藻土的制备方法为：将硅藻土按照质量比1:1与pH9.0的碱水溶液混合，然后于480℃高温处理1h。

3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ(0.2mL)全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用3mL纯水淋洗，然后用1％氨水溶液(v/v)5mL淋洗杂质，再用10％(v/v)甲醇溶液3mL淋洗；最后用色谱甲醇-10％乙酸＝95-5(v/v)5mL洗脱待测物尼古丁，收集全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL作为溶液Ⅰ的乙腈-8mmol/L磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；

上述色谱甲醇-10％乙酸＝95-5(v/v)，即，色谱甲醇：10％(体积％)乙酸水溶液＝95：5(v/v)，其作为洗液。

溶液Ⅰ的制备方法为：先配制8mmol/L磷酸二氢钾溶液，然后溶入庚烷磺酸钠至浓度为0.08mmol/L，再用磷酸调节pH至3.0，得配制液；最后将乙腈与上述配制液按照5：95的体积比混合。

4)、日本岛津shimadzu 20AT高效液相色谱系统，浙江大学智达N2000色谱工作站，色谱柱采用Agilent TC-C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)；流动相为乙腈-8mmol/L磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)，流速0.8mL/min，柱温12℃，紫外检测波长260nm，进样量20μL；

即，所述流动相同上述溶液Ⅰ；

5)、以步骤4)所得的尼古丁药物峰面积为Y，代入公式Y＝74729X–354.61(r2＝0.9999)中，从而获得步骤3)所得的上清液Ⅱ中的尼古丁浓度X，该X的单位为μg/ml；

然后经换算，得待测细胞裂解液中的细胞液/全血的尼古丁浓度。

按照上述方法，对肝细胞的细胞液、气管细胞的细胞液分别设置了如下3个实验组：20mg/L、40mg/L、80mg/L，设置方式为：将培养好的细胞上层培养液全部倒去，然后换为等体积的、分别含有尼古丁浓度为20mg/L、40mg/L、80mg/L的新鲜培养液。所得结果如图1所述。

图1的上图中，横坐标代表向细胞培养液中加入的尼古丁浓度，纵坐标代表细胞裂解液中检测到的尼古丁浓度。

实施例1的尼古丁的回收率和精密度如上述表1所述。

对比例1-1、将实施例1步骤2)中的碱性硅藻土换成氧化铝填料，装入层析柱后不作振动处理，其余等同于实施例1的步骤1)～步骤4)。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝73372X–6741.3(r2＝0.9955)。

按照此对比例1-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表2所示：

表2.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例1-1进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图2所述。

对比例1-2、将实施例1步骤2)中的碱性硅藻土(pH为9.0碱处理和480℃高温处理后的硅藻土)改成仅仅为“pH为8.5的碱处理，但是没有进行后续480℃高温处理的”的碱性硅藻土，其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝72421X–7789.2(r2＝0.9887)。

按照此对比例1-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表3所示：

表3.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例1-2进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图3所述。

对比例2-1、将实施例1步骤3)中的“1％氨水淋洗液”换成“0.5％氨水淋洗液”，将“甲醇-10％乙酸＝95-5”换成“甲醇-1％乙酸＝80-20”，其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝73496X–6601.7(r2＝0.9962)

按照此对比例2-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表4所示：

表4.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例2-1进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图4所述。

对比例2-2、将实施例1步骤3)中的“1％氨水淋洗液”换成“0.5％氨水淋洗液”，将“甲醇-10％乙酸＝95-5”换成“甲醇-20％乙酸＝80-20”，其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝72869X–7544.7(r2＝0.9922)

按照此对比例2-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表5所示：

表5.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例2-2进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图5所述。

对比例3-1、将实施例1步骤4)中的色谱柱由“Agilent TC-C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)”改成“ODS C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)”；其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝65666X+8057.4(r2＝0.9939)

按照此对比例3-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表6所示：

表6.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例3-1进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图6所述。

对比例3-2、将实施例1步骤4)中的色谱柱由“Agilent TC-C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)”改成“BDS C18色谱柱，即，Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)”；其余等同于实施例1。

按照此对比例3-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表7所示：

表7.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例3-2进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的实验，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图7所述。

对比例4-1、将实施例1步骤4)中的流动相由“乙腈-0.008M磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)”改成“乙腈-0.008M磷酸二氢钾(含0.02mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝10-90(v/v)”；其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝72910X–7721(r2＝0.991)。

按照此对比例4-1进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表8所示：

表8.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例4进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图8所述。

对比例4-2、将实施例1步骤4)中的流动相由“乙腈-0.008M磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)”改成“乙腈-0.008M磷酸二氢钾(含0.25mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝10-90(v/v)”；其余等同于实施例1。

在0.05-10μg/mL浓度范围内标准曲线为：Y＝72370X–8653.5(r2＝0.9876)。

按照此对比例4-2进行“回收率和精密度”的实验，回收率和精密度结果如下表9所示.

表9.尼古丁的回收率和精密度

按照此对比例4-2进行“细胞裂解液中尼古丁含量测定”的，所得的细胞裂解液中尼古丁浓度如图9所述。

根据上述图1～图9的对比，能得知：根据本发明所述处理方法，研究了不同浓度处理下尼古丁在肝细胞和气管上皮细胞的跨膜转运浓度。根据不同处理方法，细胞裂解液中尼古丁浓度变化较大，采用本发明处理方法，所得细胞裂解液中尼古丁平均浓度最高(见图1)。同时根据色谱图，说明细胞裂解液中杂质及尼古丁代谢物对尼古丁定量检测干扰较小，检测基线最平稳，尼古丁色谱峰处无干扰峰。即：本发明所采用的处理方法，能够最大程度的去除细胞裂解液中各种内源性和外源性杂质对尼古丁分析检测的干扰，从而使得尼古丁定量分离、检测达到最优化。

实验1、将以下3份待测品：全血A、全血B、全血C按照实施例1所述方法进行检测，即，在全血中加入等体积的细胞裂解溶剂，以此作为细胞裂解液按照实施例1所述方法进行检测；得到尼古丁药物峰面积(Y)，代入公式Y＝74729X–354.61获得上清液中的尼古丁浓度(X)，再代入以下换算公式：X*20μL*10÷0.2mL，得待测全血中的尼古丁浓度；

所得结果如下表10。

表10

验证实验、按照GC-MS方法对全血进行检测，所得的全血中尼古丁浓度如下表11：

表11

	全血中的尼古丁浓度
		全血A	0.093
全血B	0.37
		全血C	0.61

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明中尼古丁的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，其特征是：以细胞裂解液作为待测对象，所述细胞裂解液由细胞液/全血中加入细胞裂解溶剂制备而得；依次进行以下步骤：

1)、吸取细胞裂解液0.4mL于带盖容器中，加入0.2mL 1.0M的氢氧化钠溶液，混匀后加入3mL乙醚，振荡器漩涡2±0.2min，9000±500r/min高速离心5±0.5min，分别得到位于上层的乙醚层、位于下层的残渣；

在残渣中加入2mL乙醚重复上述振荡器漩涡、高速离心；

合并两次离心所得的乙醚层，于35±1℃水浴中氮气流吹干，所得的干燥物用0.2mL的10％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅰ；

2)、称取碱性硅藻土2g放入玻璃层析柱中，振动处理5±0.5min；

3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用3mL纯水淋洗，然后用1％氨水溶液5mL淋洗，再用10％甲醇溶液3mL淋洗；最后用5mL洗液洗脱作为待测物的尼古丁，收集全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL溶液Ⅰ复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；

所述洗液为：甲醇：10％乙酸水溶液＝95：5(v/v)

溶液Ⅰ为乙腈-8mmol/L磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)；

4)、日本岛津shimadzu 20AT高效液相色谱系统，浙江大学智达N2000色谱工作站，色谱柱采用Agilent TC-C18色谱柱；流动相为乙腈-8mmol/L磷酸二氢钾(含0.08mmol/L庚烷磺酸钠，pH＝3.0)＝5-95(v/v)，流速0.8mL/min，柱温12℃，紫外检测波长260nm，进样量20μL；

5)、以步骤4)所得的尼古丁药物峰面积为Y，代入公式Y＝74729X–354.61中，从而获得步骤3)所得的上清液Ⅱ中的尼古丁浓度X，该X的单位为μg/ml；

然后经换算，得待测细胞液/全血中的尼古丁浓度。

2.根据权利要求1所述的细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，其特征是：所述步骤1)中的细胞裂解液的制备方法为：在细胞液/全血中加入等体积的细胞裂解溶剂均匀震荡，得细胞裂解液；所述细胞裂解溶剂的配方为：氯化铵8.29g、碳酸氢钾1g和EDTA-2Na 37.2mg，溶于1000mL超纯水中。

3.根据权利要求1所述的细胞裂解液中尼古丁的定量检测方法，其特征是：待测细胞液/全血中的尼古丁浓度为X。