CN107418948A - 一种碱性果胶酶的高效率固定化方法 - Google Patents

一种碱性果胶酶的高效率固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，具体步骤为：首先制备纳米氧化硅分散液；将丙烯酰胺、N，N‑二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液，将其加入到分散液中，再加入引发剂，制得高分子包覆的纳米氧化硅微球，之后用戊二醛溶液处理，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；配制质量浓度为1.5‑3.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定1‑5h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶。该方法制得的固定化果胶酶热稳定性好，酶失活小，且酶不易从载体脱落。

Description

一种碱性果胶酶的高效率固定化方法
技术领域：
本发明涉及生物酶制剂制备领域，具体的涉及一种碱性果胶酶的高效率固定化方法。
背景技术：
酶是由生物体产生的具有催化活性的化合物，它有许多如催化效率高，催化条件温和，专一性强，反应产物污染小，能耗低，反应易控制等其它化学催化剂无法比拟的优点。但在工业使用中，它又有一些不足之处。因为大多数酶的化学本质是蛋白质，其生物活性容易受到外界环境的影响，对酸、碱、热及有机溶液等外界环境的改变反应敏感，容易发生酶蛋白的变性作用，降低或失去其生物活性。而且酶催化反应通常是在溶液中进行，会有回收困难以及产品生化分离提纯操作上的困难，增加生产工艺步骤，提高生产成本。而使用游离酶，酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作。这严重地阻碍了酶工程的发展应用。将游离酶固定化是克服上述缺点的方法之一。
固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上或用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。酶固定化技术于20世纪60年代产生，并在近几十年中得到迅速发展。
与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：(1)固定化酶一般对温度和pH的适应范围增大，稳定性提高，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；(2)反应完成后固定化酶可通过简单的方法回收，回收的固定化酶可重复使用，同时固定化酶不易游离到产品中，便于产品的分离和纯化；(3)固定化酶的研究使批量或连续操作模型的实现成为可能，更适于连续化、自动化、产业化生产。
随着果胶酶的应用越来越广泛，果胶酶的需求量不断增大以及工业化生产的需要，研究果胶酶的固定化方法对于提高产品质量和提高经济效益具有重要意义。目前，关于果胶酶的固定化方法研究越来越多。
中国专利(CN201310104631.3)公开了一种利用新型纳米硅材料固定化果胶酶的方法，其采用逐层自组装技术制备新型纳米硅材料，并对该材料进行活化，改性和包被，通过戊二醛交联实现果胶酶的高效固定化。但是交联反应条件一般比较苛刻，容易使酶失活。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其以自制的高分子包覆的纳米氧化硅微球为载体，表面具有较多的活性基团，可以在温和的条件下与酶发生交联，制得的固定化酶不易脱落，热稳定性好，重复使用性能佳。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至100-120℃，回流反应8-13h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理1-4h，得到分散液；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应1-3h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理3-5h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；
(4)配制质量浓度为1.5-3.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定1-5h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶。
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：(0.8-1.5)：1。
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：(0.03-0.06)：(4-8)。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：(0.5-1)：10。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述单体溶液的滴加速度为3-5mL/min、其与分散液的质量比为8：(1-4)。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：(0.6-1)。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述戊二醛溶液的质量浓度为1-5％。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：(13-17)。
作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述缓冲溶液为柠檬酸钠和柠檬酸的混合水溶液，缓冲溶液的质量浓度为5-8％。
作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为(2-6)：1。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用高分子包覆的纳米氧化硅微球作为载体来固定化果胶酶；为了改善载体在酶制剂溶液中的分散性，本发明首先制备纳米氧化硅，且将反应产物不进行过滤干燥而是浓缩，并将浓缩物采用去离子水在硅烷偶联剂的作用下分散，制得分散液，分撒液中国，纳米氧化硅具有良好的分散性；
为了改善纳米氧化硅与酶制剂的相容性，本发明采用高分子包覆，并采用分散聚合的方法，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、N,N-二甲基丙烯酰胺为单体，合理控制聚合条件，使得纳米氧化硅表面实现均匀的包覆，且表面具有较多的羧基等活性基团，可以与果胶酶在常温条件下发生交联，从而固定果胶酶；该方法制得的固定化果胶酶稳定性好，酶失活小，且重复使用性能优异。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。
实施例1
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至100℃，回流反应8h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理1h，得到分散液；其中，环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：0.8：1；浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：0.03：4；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应1h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：0.5：10；单体水溶液的滴加速度为3-5mL/min、其与分散液的质量比为8：1；丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：0.6；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理3h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，戊二醛溶液的质量浓度为1％；高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：13；
(4)配制质量浓度为1.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定1h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶；其中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为2：1。
实施例2
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至120℃，回流反应13h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理4h，得到分散液；其中，环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：1.5：1；浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：0.06：8；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应3h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：1：10；单体水溶液的滴加速度为5mL/min、其与分散液的质量比为8：4；丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：1；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理5h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，戊二醛溶液的质量浓度为5％；高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：17；
(4)配制质量浓度为3.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定5h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶；其中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为6：1。
实施例3
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至105℃，回流反应9h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理2h，得到分散液；其中，环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：1：1；浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：0.04：5；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应1.5h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：0.6：10；单体水溶液的滴加速度为3.5mL/min、其与分散液的质量比为8：2；丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：0.7；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理3.5h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，戊二醛溶液的质量浓度为2％；高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：14；
(4)配制质量浓度为2％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定2h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶；其中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为3：1。
实施例4
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至110℃，回流反应10h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理3h，得到分散液；其中，环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：1.2：1；浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：0.045：6；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应2h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：0.7：10；单体水溶液的滴加速度为4mL/min、其与分散液的质量比为8：3；丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：0.8；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理4h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，戊二醛溶液的质量浓度为3％；高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：15；
(4)配制质量浓度为2.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定3h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶；其中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为4：1。
实施例5
一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至110℃，回流反应12h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理3.5h，得到分散液；其中，环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：1.4：1；浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：0.05：7；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应2.5h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：0.8：10；单体水溶液的滴加速度为4.5mL/min、其与分散液的质量比为8：3.5；丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：0.9；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理4.5h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；其中，戊二醛溶液的质量浓度为4％；高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：16；
(4)配制质量浓度为3％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定4h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶；其中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为5：1。
用次碘酸钠法测定酶活回收率，酶活回收率高达95.1％，使用pH为2.5-6，而且制得的固定化酶热稳定性较好，在60℃时酶活才有下降，而游离的果胶酶在40℃酶活就显著下降，对于重复使用性能，固定化的果胶酶在重复使用6次后酶活为90.8％，而游离果胶酶仅为46.9％。

Claims (10)

1.一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以环己烷为溶剂，加入无水乙醇、冰醋酸搅拌混合均匀后转移至带有冷凝管的三口烧瓶中，往三口烧瓶中缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后缓慢升温至60-70℃，继续往三口烧瓶中滴加三乙胺，滴加完毕后，升温至100-120℃，回流反应8-13h，反应结束后将反应产物在70℃下浓缩处理10min，得到的浓缩物和去离子水混合，滴加硅烷偶联剂，500W功率下超声处理1-4h，得到分散液；
(2)将丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和去离子水混合搅拌得到单体水溶液；将制得的单体水溶液滴加到步骤(1)制得的分散液中，搅拌混合均匀，加入引发剂，混合均匀后升温至60-70℃，反应1-3h，反应结束后冷却至室温，过滤，固体洗涤干净用盐酸浸泡处理，处理结束后过滤，过滤得到的沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到高分子包覆的纳米氧化硅微球；
(3)将上述制得的高分子包覆的纳米氧化硅微球和戊二醛溶液混合，300W功率下超声处理3-5h，处理结束后，过滤，沉淀用去离子水洗涤，真空干燥，得到活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球；
(4)配制质量浓度为1.5-3.5％碱性果胶酶溶液，并和缓冲溶液混合后加入活化的高分子包覆的纳米氧化硅微球，500r/min转速下搅拌固定1-5h，然后过滤，沉淀用去离子水洗涤感觉后，真空冷冻干燥，得到固定化碱性果胶酶。
2.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述环己烷、无水乙醇、冰醋酸、正硅酸乙酯、三乙胺的体积比为50:8:8：(0.8-1.5)：1。
3.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浓缩物、硅烷偶联剂和去离子水的质量比为1：(0.03-0.06)：(4-8)。
4.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、去离子水的质量比为3:1：(0.5-1)：10。
5.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述单体水溶液的滴加速度为3-5mL/min、其与分散液的质量比为8：(1-4)。
6.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，丙烯酰胺、引发剂的质量比为7：(0.6-1)。
7.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述戊二醛溶液的质量浓度为1-5％。
8.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高分子包覆的纳米氧化硅微球、戊二醛溶液的质量比为1：(13-17)。
9.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述缓冲溶液为柠檬酸钠和柠檬酸的混合水溶液，缓冲溶液的质量浓度为5-8％。
10.如权利要求1所述的一种碱性果胶酶的高效率固定化方法，其特征在于，步骤(4)中，碱性果胶酶溶液、高分子包覆的纳米氧化硅微球的质量比为(2-6)：1。
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