CN107412743A

CN107412743A - 通过施用重组vwf治疗凝血疾病

Info

Publication number: CN107412743A
Application number: CN201611071108.5A
Authority: CN
Inventors: F·沙伊芙林格; P·图雷切克; B·埃文斯汀; Y·W·王; M·T·休特
Original assignee: Hundred Deep Co; Hundred Deep LLC
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2032-06-11
Also published as: EP2717905A1; RU2019103386A; RU2017102679A3; CN103732244A; RU2628537C2; SI2717905T1; RU2019103386A3; AU2022201518A1; AR086904A1; WO2012171031A1; PL2717905T3; MX2020000083A; CA2838845A1; US20160184403A1; MX2013014543A; AU2017206235A1; EP3858375B1; JP2014516088A; JP6527114B2; LT2717905T

Abstract

本发明提供通过单独地施用重组冯·威利布兰德因子或将其与因子VIII结合施用而治疗包括血友病和冯·威利布兰德病的凝血疾病的方法。

Description

通过施用重组VWF治疗凝血疾病

本申请是申请日为2012年6月11日、申请号为201280038870.7(国际申请号为PCT/US2012/041957)、名称为“通过施用重组VWF治疗凝血疾病”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

诸如冯·威利布兰德病(VWD)和血友病的凝血疾病通常因凝血级联中的缺陷所致。“冯·威利布兰德病(von Willebrand Disease)”是指一组由冯·威利布兰德因子的缺陷所致的疾病。冯·威利布兰德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，这是正常凝血的必要条件。甲型血友病是指因子VIII活性的缺陷，而乙型血友病是指因子IX缺陷。这些凝血病的当前治疗包括使用含有正常凝血因子的药物制剂的替代疗法。

VWD和甲型血友病患者中的替代疗法涉及通过静脉输注反复施用含有正常凝血因子的制剂，这会对这些患者的生命构成沉重的负担，尤其是当难以实现静脉通路时。如果能够降低输注频率将是有利的。一种潜在可行的疗法是通过与诸如冯·威利布兰德因子(VWF)的第二分子的缔合而稳定因子VIII，结果是因子VIII的血浆半衰期得以延长。

VWF是一种糖蛋白，它以一系列大小从约500至20,000kD的多聚体形式在血浆中循环。已经克隆了VWF的全长cDNA；该多肽对应于全长前原VWF(Eikenboom等人(1995)Haemophilia 1,77 90)的第23至764位氨基酸残基。多聚体形式的VWF由通过二硫键连接在一起的250kD的多肽亚单位组成。VWF介导最初的血小板与受损血管壁内皮下膜的粘附，其中较大的多聚体表现出增强的止血活性。多聚VWF通过VWF的A1结构域中的相互作用结合到血小板表面糖蛋白Gp1bα，从而有利于血小板粘附。VWF上的其他位点介导与血管壁的结合。因此，VWF在血小板与血管壁之间形成桥联，这对高剪切条件下的血小板粘附和初期止血必不可少。通常，内皮细胞分泌较大的多聚形式的VWF，而具有较低分子量的那些形式的VWF则由蛋白水解裂解产生。极大分子质量的多聚体储存在内皮细胞的韦伯潘力氏小体(Weibel-Pallade body)中，并在诸如凝血酶和组胺的激动剂刺激下释放。

FVIII药代动力学取决于VWF水平得到多项之前的观察结果的支持。由于降低的VWF蛋白水平或降低的FVIII结合亲和力而导致的冯·威利布兰德病(VWD)中的FVIII结合活性降低导致内源性FVIII的稳态水平降低(在Castaman等人,Disorders of Hemostasis88(1):94-108(2003)中有所概述)，并且改善VWF的存活已被提出作为改善FVIII稳定性的可行策略(Denis等人,Thromb Haemost.2008Feb；99(2):271-8；Turecek等人,Blood,2006,108(11):Abstract 1002)。在重症甲型血友病患者之中，输注前VWF水平与输注FVIII的半衰期之间的相关性已由Fijnvandraat及其同事证实(Fijnvandraat等人,Br JHaematol.1995Oct；91(2):474-6)。在该项研究中，与具有正常VWF水平的患者中12.5小时的平均值相比，据观察，达平均VWF水平的200-300％的患者的FVIII半衰期为15-29小时。在另一项研究中，经证实，O型血患者具有与A型血患者(19.7小时)相比明显更低的VWF水平和更短的FVIII半衰期(15.3小时)(Vlot等人，Thromb Haemost.2000Jan；83(1):65-9)。已表明，化学修饰的VWF延长rFVIII的存活(Turecek等人,J.Thromb.Haemost.2007Jul 9；5(2)，摘要可见于：http/www.blackwellpublishing.com/isth2007/abstract.asp？id＝64898)。因此，共同施用rVWF和rFVIII是治疗诸如冯·威利布兰德病和甲型血友病的凝血疾病的可行策略。

发明概述

因此，本发明提供通过向对其有需要的受试者单独地施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)或将其与重组因子VIII(rFVIII)结合施用而结果是因子VIII的体内半衰期得以延长以治疗凝血疾病的方法和组合。

在一个方面，本发明提供用于治疗对其有需要的受试者中的冯·威利布兰德病或甲型血友病的方法，该方法包括：向受试者施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中rVWF为高分子量VWF多聚体组合物，其包含至少20％的VWF十聚体或更高级的多聚体，并且其中rVWF具有比血浆源冯·威利布兰德因子更高的比活性。

在另外的实施方案中并根据以上内容，本发明的方法包括向受试者共同施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)和重组因子VIII(rFVIII)。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，以单一组合物的形式一起施用rVWF和rFVIII。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用1.0IU/kg VWF:RCo至150IU/kg VWF:RCo。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用2IU/kg VWF:RCo至50IU/kg VWF:RCo。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用5IU/kg VWF:RCo至40IU/kg VWF:RCo。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用10IU/kg VWF:RCo至20IU/kg VWF:RCo。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，用于本发明方法的rVWF通过用弗林蛋白酶(Furin)处理而体外成熟。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，rVWF通过在中国仓鼠卵巢中表达(CHO细胞培养)而产生。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，rFVIII和rVWF通过在相同的细胞培养中表达而产生。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔一天不超过一次施用rVWF。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者一周不超过两次施用rVWF。

在另外的方面并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物将至少20％的VWF十聚体或更高级的多聚体在施用后维持至少3小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长约5小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少12小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少24小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中因子VIII半衰期延长至少72小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的23比率为约3:4。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，rVWF具有约20-150mU/μg的比活性。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少30％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少40％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少50％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少60％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少70％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

在另外的方面并根据以上任一个，本发明提用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯·威利布兰德病的方法，该方法包括：向受试者施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中：(a)rVWF具有比血浆源冯·威利布兰德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性为约20-150mU/μg；并且(b)FVIII半衰期是施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少约1.5倍。

在另外的方面并根据以上任一个，本发明提用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯·威利布兰德病的方法，该方法包括：向受试者施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中：(a)rVWF是包含至少20％的VWF十聚体或更高级的多聚体的高分子量VWF多聚体组合物，(b)rVWF具有比血浆源冯·威利布兰德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性为至少约20-150mU/μg；并且(c)FVIII半衰期是施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少约1.5倍。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用rVWF后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少90％。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少100％。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后36小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少80％。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后48小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少50％。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少6小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少12小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少18小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少24小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少72小时。

在另外的方面并根据以上任一个，本发明提供用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯·威利布兰德病的方法，该方法博包括：向受试者施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，该方法包括向受试者共同施用重组因子VIII(rFVIII)和重组冯·威利布兰德因子(rVWF)。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，以单一组合物的形式一起施用rFVIII和rVWF。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为约3:4。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF通过用弗林蛋白酶处理而体外成熟。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF在哺乳动物细胞培养中表达。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII在哺乳动物细胞培养中表达。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，哺乳动物培养包括CHO细胞。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII和rVWF在相同的培养中共表达。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII和rVWF共同纯化。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII和rVWF单独纯化。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII/rVWF复合物在施用前复溶。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF在复溶rFVIII/rVWF复合物前用弗林蛋白酶处理。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，将复溶的rFVIII/rVWF复合物用弗林蛋白酶处理。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，弗林蛋白酶为重组弗林蛋白酶。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每天不超过一次施用rVWF。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔两天不超过一次共同施用rVWF。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔三天不超过一次施用rVWF。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用1.5IU/kg FVIII:C至150IU/kg FVIII:C。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用10IU/kg FVIII:C至100IU/kg FVIII:C。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用25IU/kg FVIII:C至75IU/kg FVIII:C。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用40IU/kg FVIII:C至60IU/kg FVIII:C。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少90％。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少10％的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VWF多聚体组成。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少20％的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VWF多聚体组成。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少30％的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VWF多聚体组成。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少40％的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VWF多聚体组成。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少50％的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VWF多聚体组成。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少3小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少6小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少12小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少18小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少24小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少72小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少12小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少24小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少72小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中共同施用的rFVIII活性稳定至少12小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少24小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少72小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性通过延长rFVIII体内半衰期而稳定。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，FVIII半衰期与施用pdFVIII的患者相比延长至少约五小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少36小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少48小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少72小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少90小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少120小时。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1％维持至少168小时。

附图简述

图1.评估单剂rVWF:rFVIII后的耐受性和安全性的研究设计示意图。

图2.药代动力学数据。(A)提供rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII的PK数据。(B)提供关于暴露于ADAMTS13时高分子量rVWF的逐渐丧失的数据。

图3.显示rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII的FVIII PK的药代动力学数据。

图4.汇总研究的患者人口统计资料的表格。

图5.队列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治疗的药代动力学数据。

图6.关于ADAMTS13对VWF多聚体的裂解的SDS-PAGE数据。

图7.队列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治疗的药代动力学数据。

图8.研究中的不良事件汇总。

图9.研究中的rVWF PK参数数据。

图10.得自患者1的rVWF PK数据。

图11.得自患者2的rVWF PK数据。

图12.得自患者3的rVWF PK数据。

图13.患者1、2和3中rVWF PK的比较–VWF参数和FVIII活性的比较。

图14.研究所有队列中的FVIII活性。

图15.队列2患者中的rVWF PK–VWF参数和FVIII活性的比较。

图16.队列2中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的药代动力学参数汇总。

图17.队列3所有患者中的rVWF PK–VWF和FVIII的血浆参数的比较。

图18.队列3中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的药代动力学参数汇总。

图19.得自队列4中的患者的数据。

图20.队列4A中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的药代动力学参数汇总。

图21.比较共同施用的rVWF和rFVIII与Advate Pivotal的FVIII:C的药代动力学数据。

图22.接受共同施用的pdVWF/pdFVIII或rVWF/rFVIII的受试者的抗体汇总。

具体实施方式

概述

本发明提供通过单独地施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)或将其与因子VIII(其可以为重组的或血浆源的)结合施用而治疗受试者中的凝血疾病的组合物和方法。在一些方面，本发明的组合物和方法用于治疗诸如冯·威利布兰德病(VWD)或甲型血友病的凝血疾病。

在一个方面，施用给受试者的rVWF提供与因施用血浆源VWF产生的FVIII稳定性相比体内因子VIII(FVIII)活性的稳定性增强，从而允许比凝血疾病的传统治疗更低的治疗剂量和/或频率。FVIII活性的稳定性以及FVIII的水平升高可使用本领域已知的以及本文所述的方法测量，包括标准测定法，诸如一阶段凝结测定法、显色测定法和免疫测定法(参见例如Lippi等人,Blood Coagulation&Fibrinolysis,2009,20(1):1-3和Chandler等人,Am J.Clin.Pathol.,2003,120:34-39，它们每一者据此均以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与FVIII水平和活性的测定法相关的所有教导而言)。如图20中所示，平均FVIII半衰期通过rVWF相对于接受pdVWF的患者的半衰期延长5.2小时。图2和7还显示了与施用pdVWF的那些患者相比在施用rVWF的患者中FVIII活性的增加：图2显示了与施用pdVW的患者相比施用rVWF的患者的平均FVIII半衰期延长4.7小时，并且图7中得自队列4A的数据显示了与施用pdVWF的患者相比施用rVWF的患者的FVIII半衰期延长5.3小时。此外，如图21所示，与单独接受FVIII(即Advate)的患者相比，在与rFVIII相结合接受rVWF的VWD患者中，血浆FVIII的半衰期延长12.27小时。

在又一个方面，rVWF的施用稳定内源性和/或共同施用的FVIII活性，结果是FVIII的体内半衰期和/或活性增加。在其中共同施用rVWF和FVIII的实施方案中，可以单一组合物的形式将rVWF和FVIII一起施用给受试者。在另外的实施方案中，rVWF和FVIII均不被水溶性聚合物修饰。在其他实施方中，rVWF或FVIII或两者被水溶性聚合物修饰。如将会认识到，在其中与FVIII共同施用rVWF的实施方案中，FVIII可以为重组的或血浆源的。

在另外的方面并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF为包含rVWF的十聚体或更高级的多聚体的高分子量多聚体组合物。如上所讨论，使用本发明的rVWF组合物提供具有或不具有FVIII(重组的或血浆源的)的给药(再次给药)灵活性。在另外的实施方案中，施用给受试者的rVWF为包含至少20％的VWF十聚体或更高级的多聚体的高分子量VWF多聚体组合物。在具体的实施方案中，施用给受试者的rVWF不被水溶性聚合物修饰。

在另外其他方面，施用给受试者的rVWF具有比pdVWF更高的比活性。

在再一个方面，向受试者一周不超过两次施用单独的或与pdFVIII或rFVIII组合的rVWF。

在还一个方面，将rVWF在施用给受试者前用弗林蛋白酶处理。在某些实施方案中，将rVWF用重组弗林蛋白酶处理。

在另外的方面,用于本发明的rVWF根据本领域已知的并例如在2011年7月8日提交的US 2012/0035110和2012年5月8日提交的美国专利8,173,597中所述的方法产生，这些专利的每一者据此以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与rVWF组合物和产生这些组合物的方法相关的所有教导而言。

根据以上任一个，将单独的或与FVIII组合的rVWF用于治疗患有诸如VWD和甲型血友病的凝血疾病的患者。患有VWD的患者具有一定水平的FVIII，但该FVIII的稳定性通常低下，因为这些患者缺乏VWF。VWD患者的治疗可在一些实施方案中涉及用rVWF和rFVIII两者初始治疗然后反复施用单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以通过单独的rVWF进行，而后续反复施用通过rVWF和rFVIII两者进行，或者初步和后续反复施用均可以包括rVWF和rFVIII两者的共同施用。相似地，甲型血友病患者(缺乏FVIII)可接受rVWF和rFVIII两者的初始治疗，而后续反复治疗可包括施用单独的rFVIII或单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以为单独的rFVIII，而后续反复治疗涉及共同施用rVWF和rFVIII。

定义

如本文所用，“rVWF”是指重组VWF。

如本文所用，“rFVIII”是指重组FVIII。

术语“重组”当关于例如细胞或核酸、蛋白或载体使用时表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而修饰，或表示该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不存在于天然(非重组)形式的细胞内的基因，或表达原本异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。

如本文所用，"重组VWF"包括通过重组DNA技术获得的VWF。在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的WO 1986/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请序列号07/559,509(以Ginsburg等人的名义)中制备的构建体，该专利关于产生重组VWF的方法以引用方式并入本文。本发明中的VWF可包括所有潜在形式，包括单体和多聚形式。还应当理解，本发明涵盖将以组合方式使用的不同形式的VWF。例如，本发明的VWF可包括不同的多聚体、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物两者。

在本发明的背景下，重组VWF涵盖得自例如哺乳动物(诸如灵长类、人类、猴子、兔子、猪、啮齿类、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬科、猫科)的VWF家族的任何成员及其生物活性衍生物。还涵盖具有活性的突变和变体VWF蛋白，VWF蛋白的功能片段和融合蛋白也一样。此外，本发明的VWF可进一步包含有利于纯化、检测或两者的标签。本文所述的VWF可用治疗性部分或适合体外或体内成像的部分进一步修饰。

如本文所用，"血浆源VWF(pdVWF)"包括存在于血液中的所有形式的蛋白，包括具有在体内稳定(例如)至少一种FVIII分子的结合的特性的得自哺乳动物的成熟VWF。

术语“高度多聚VWF”或“高分子量VWF”是指包含至少10个亚单位或12、14或16个亚单位至约20、22、24或26个亚单位或更多个亚单位的VWF。术语“亚单位”是指VWF的单体。如本领域所已知，其通常为聚合形成更高级多聚体的VWF的二聚体。(参见Turecek等人,Semin.Thromb.Hemost.2010,36(5):510-521，其据此以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与VWF的多聚体分析相关的所有教导而言)。

如本文所用，术语"因子VIII"或"FVIII"是指具有凝血因子VIII的典型特征的任何形式的因子VIII分子，无论是患者内源性的、衍生自血浆的还是通过使用重组DNA技术而产生的，并包括因子VIII的所有修饰形式。因子VIII(FVIII)天然存在以及作为由单一基因产物而产生的多肽的异源分布而存在于治疗性制剂中(参见例如Andersson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2979-2983(1986))。包含因子VIII的治疗性制剂的市售实例包括以商品名HEMOFIL M、ADVATE和RECOMBINATE(可得自Baxter HealthcareCorporation,Deerfield,Ill.,U.S.A.)销售的那些。

如本文所用，“血浆FVIII活性”和“体内FVIII活性”可互换使用。使用标准测定法测量的体内FVIII活性可以是内源性FVIII活性、治疗性施用的FVIII(重组的或血浆源)的活性或内源性与施用的FVIII活性两者。相似地，“血浆FVIII”是指内源性FVIII或施用的重组或血浆源FVIII。

如本文所用，“冯·威利布兰德病”是指一组由冯·威利布兰德因子的缺陷所致的疾病。冯·威利布兰德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，这是正常凝血的必要条件。如在本文进一步详细描述，存在多种类型的冯·威利布兰德病。

如本文所用，术语“血友病”是指一组普遍以血液凝结或凝聚减弱为特征的病态。血友病可以指甲型、乙型或丙型血友病，或指所有三种疾病类型的复合形式。甲型血友病由因子VIII(FVIII)活性的降低或丧失所致，并为最主要的血友病亚型。乙型血友病由因子IX(FIX)凝结功能的丧失或减弱所致。丙型血友病是因子XI(FXI)凝结活性的丧失或降低的结果。甲型和乙型血友病是X染色体连锁疾病，而丙型血友病为常染色体的。血友病的常见治疗包括预防性和按需施用凝血因子，诸如FVIII、FIX(包括–VH和FXI)以及FEIBA-VH、去氨加压素，和血浆输注。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指实质上或基本上不含如在天然状态中所见的通常与之相伴的组分的材料。纯度和同质性通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术测定。VWF是存在于实质上纯化的制剂中的主要物质。术语“纯化的”在一些实施方案中表示核酸或蛋白在电泳凝胶中产生基本上一条带。在其他实施方中，意指核酸或蛋白的纯度为至少50％，更优选地至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在其他实施方中的“纯化”意指从待纯化的组合物中移除至少一种污染物。从这层意义上说，纯化不需要纯化后的化合物为均匀的，例如100％纯的。

如本文所用，“施用”(和所有语法等同形式)包括向受试者静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、作为栓剂施用、局部接触、腹膜内、病灶内或鼻内施用或植入缓释装置，例如微量渗透泵。施用通过任何途径进行，包括肠胃外和经粘膜(例如经口、鼻腔、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于脂质体制剂、静脉输注、透皮贴片等。

术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够量或剂量”是指产生为施用对象产生治疗效果的剂量。例如，可用于治疗血友病的药物的治疗有效量可以是能够预防或缓解与血友病相关的一种或多种症状的量。精确剂量将取决于治疗目的，并将能由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如Lieberman,PharmaceuticalDosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语“患者”和“受试者”可互换使用并指患有疾病或可能感染疾病的哺乳动物(优选人)。

如本文所用，术语“约”表示指定值加或减10％的大致范围。例如，用语“约20％”涵盖18-22％的范围。

如本文所用，术语“半衰期”是指物质的量衰减(或从样品或从患者中清除)到一半所需的时间周期。

本发明的组合物

本发明利用包含重组冯·威利布兰德因子(rVWF)的组合物治疗凝血疾病，诸如VWD和甲型血友病。在一些实施方案中，本发明利用与因子VIII(FVIII)相结合的rVWF。共同施用的FVIII可以为重组(rFVIII)或血浆源(pdFVIII)。在优选的方面，本发明的组合物使体内因子VIII活性(在本文也称为血浆因子VIII活性)稳定，使得因子VIII的体内半衰期与未施用rVWF或施用pdVWF的受试者中的体内半衰期相比得以延长。测量rVWF使FVIII活性稳定的程度(包括FVIII半衰期的延长)可使用本领域已知的方法进行。FVIII活性的水平可通过例如一阶段凝结测定法、显色测定法和免疫测定法测量(参见例如Lippi等人,BloodCoagulation&Fibrinolysis,2009,20(1):1-3,European Pharmacopoeia(Ph.Eur.,3rdEd.1997:2.7.4)和Chandler等人,Am J.Clin.Pathol.,2003,120:34-39，它们每一者据此均以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与FVIII水平和活性的测定法相关的所有教导而言)。

在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的WO1986/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请序列号07/559,509(以Ginsburg等人的名义)中制备的构建体，该专利关于产生重组VWF的方法以引用方式并入本文。可用于本发明的VWF包括所有潜在形式，包括单体和多聚形式。一种尤其有用的VWF形式为至少两种VWF的同源多聚体。VWF蛋白可以为生物活性衍生物，或在仅将用作FVIII的稳定剂时，VWF可以为非生物活性形式。还应当理解，本发明涵盖将以组合方式使用的不同形式的VWF。例如，可用于本发明的组合物可包括不同的多聚体、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物两者。

在初期止血中，VWF起到作为血小板与细胞外基质特定组分(诸如胶原)之间的桥联的作用。在此过程中VWF的生物活性可通过不同的体外测定法测量(Turecek等人,Semin.Thromb.Hemost.28:149-160,2002)。瑞斯托菌素辅因子测定法基于在存在VWF的情况下由抗生素瑞斯托菌素诱导的新鲜或甲醛固定血小板的凝集。血小板凝集程度取决于VWF浓度，并可通过比浊法测量，例如通过使用凝集计(Weiss等人,J.Clin.Invest.52:2708-2716,1973；Macfarlane等人,Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308,1975)。第二种方法是胶原结合测定法，这种方法基于ELISA技术(Brown et Bosak,Thromb.Res.43:303-311,1986；Favaloro,Thromb.Haemost.83:127-135,2000)。将微量滴定板包被上I型或III型胶原。然后，使VWF结合到胶原表面，然后用酶标记的多克隆抗体检测。最后一步是底物反应，其可通过ELISA酶标仪以光度学监测。如本文所提供，本发明的VWF(VWF:RCo)的瑞斯托菌素辅因子比活性通常以mU/μg VWF描述，如使用体外测定法测量。

本发明的rVWF组合物相对于pdVWF的优势在于rVWF表现出比pdVWF高的比活性。在一些实施方案中，本发明的rVWF具有至少约20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mU/μg或更高的比活性。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的rVWF具有20mU/μg至150mU/μg的比活性。在另一个实施方案中，VWF具有30mU/μg至120mU/μg的比活性。在另一个实施方案中，rVWF具有40mU/μg至90mU/μg的比活性。在再一个实施方案中，rVWF具有选自存在于表1中的变型1至133的比活性。

表1.存在于组合物中的并用于本文提供的方法的rVWF的比活性的示例性实施方案。

Var.＝变型

本发明的rVWF是包含10至约40个亚单位的高度多聚的。在另外的实施方案中，使用本发明的方法产生的多聚rVWF包含约10-30、12-28、14-26、16-24、18-22、20-21个亚单位。在另外的实施方案中，rVWF存在于大小从二聚体到超过40个亚单位的多聚体(大于一千万道尔顿)变化的多聚体中。最大的多聚体提供可与血小板受体和内皮下基质损伤部位相互作用的多个结合位点，并为最具止血活性的VWF形式。如图2(下图)中的多聚体分析所示，施加ADAMTS13将随着时间的推移裂解超大rVWF多聚体，但在产生(通常通过在细胞培养中表达)期间，本发明的rVWF组合物通常暴露于ADAMTS13并保持其高度多聚的结构。

在一个实施方案中，用于本文所述的方法的rVWF组合物具有特征在于95％的低聚物具有6与20个之间的亚单位的rVWF低聚物分布。在其他实施方中，rVWF组合物具有特征在于95％的低聚物具有选自存在于表2中的变型458至641的亚单位范围的rVWF低聚物分布。

表2.存在于组合物中的并用于本文提供的方法的rVWF低聚物的分布的示例性实施方案。

Var.＝变型

在一个实施方案中，rVWF组合物可根据存在于特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中的rVWF分子的百分比来表征。例如，在一个实施方案中，用于本文所述的方法的rVWF组合物中至少20％的rVWF分子存在于至少10个亚单位的低聚复合物中。在另一个实施方案中，用于本文所述的方法的rVWF组合物中至少20％的rVWF分子存在于至少12个亚单位的低聚复合物中。在另有其他实施方案中，根据存在于表3至表5中的变型134至457中的任一个，用于本文提供的方法的rVWF组合物在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体(例如，至少Y个亚单位的多聚体)中具有最低百分比(例如，具有至少X％)的rVWF分子。

表3.在存在于组合物中的并用于本文提供的方法的特定的更高级rVWF多聚体或更大多聚体中的rVWF分子百分比的示例性实施方案。

Var.＝变型

表4.在存在于组合物中的并用于本文提供的方法的特定的更高级rVWF多聚体或更大多聚体中的rVWF分子百分比的示例性实施方案。

Var.＝变型

表5.在存在于组合物中的并用于本文提供的方法的特定的更高级rVWF多聚体或更大多聚体中的rVWF分子百分比的示例性实施方案。

Var.＝变型

根据以上内容，施用给受试者的rVWF组合物(含或不含FVIII)通常包含高百分比的高分子量(HMW)rVWF多聚体。在另外的实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含至少10％-80％的rVWF十聚体或更高级的多聚体。在另外的实施方案中，组合物包含约10-95％、20-90％、30-85％、40-80％、50-75％、60-70％的十聚体或更高级的多聚体。在另外的实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的十聚体或更高级的多聚体。

对rVWF多聚体的数量和百分比的评估可使用本领域已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法以按尺寸分离VWF多聚体的方法，例如如Cumming等人(JClin Pathol.1993May；46(5):470–473，其据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的，尤其是与VWF多聚体的评估相关的所有教导)所述。此类技术还可以包括免疫印迹技术(诸如Western印迹)，其中将凝胶用针对VWF的放射性标记抗体免疫印迹，然后进行化学发光检测(参见例如Wen等人,(1993),J.Clin.Lab.Anal.,7:317–323，其据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的，尤其是与VWF多聚体的评估相关的所有教导)。VWF另外的测定法包括VWF:抗原(VWF:Ag)、VWF:瑞斯托菌素辅因子(VWF:RCof)和VWF:胶原结合活性测定法(VWF:CBA)，它们通常用于冯·威利布兰德病的诊断和分类。(参见例如Favaloro等人,Pathology,1997,29(4):341-456,其据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的，尤其是与VWF测定法相关的所有教导)。

在另外的实施方案中，本发明的更高级的rVWF多聚体在施用后稳定约1至约90小时。在另外其他实施方案中，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定约5-80、10-70、15-60、20-50、25-40、30-35小时。在还有其他实施方案中，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少3、6、12、18、24、36、48、72小时。在某些实施方案中，对rVWF多聚体的稳定性进行体外评估。

在一个实施方案中，用于本文提供的组合物和方法中的更高级的rVWF多聚体具有至少12小时的施用后半衰期。在另一个实施方案中，更高级的rVWF多聚体具有至少24小时的施用后半衰期。在另有其他实施方案中，更高级的rVWF多聚体具有选自存在于表6中的变型642至1045的半衰期。

表6.存在于组合物中的并用于本文提供的方法的更高级rVWF多聚体的半衰期的示例性实施方案。

Var.＝变型

在另外的方面，用于本发明的rVWF增强血浆FVIII的稳定性，如将会认识到，FVIII可包括已施用给患者的pdFVII或rFVIII，或可包括患者的内源性FVIII，或其任何组合。例如，如图22所示，与单独接受FVIII(即Advate)的患者相比，在与rFVIII相结合接受rVWF的VWD患者中，血浆FVIII的半衰期延长。在另外的实施方案中，与接受单独的FVIII的患者所见的半衰期相比，rVWF将FVIII的半衰期延长约1.5-5倍。在另外其他实施方案中，rVWF将FVIII的半衰期延长约1.0-4.5、1.5-4.0、2.0-3.5、2.5-3.0倍。在一个实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF将血浆FVIII的稳定性增加选自存在于表7中的变型1046至1089的量。在一个具体实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF/FVIII复合物将血浆FVIII的稳定性增加选自存在于表7中的变型1046至1089的量。

表7.与施用血浆源VWF和血浆源VWF/FVIII复合物后相比，在施用rVWF和rVWF/FVIII复合物后，血浆FVIII发生的半衰期延长的示例性实施方案。

Var.＝变型

在另外其他实施方案中，在施用rVWF后，FVIII半衰期的延长维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在还有其他实施方案中，在施用rVWF后，FVIII半衰期的延长维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。

在一个实施方案中，在施用rVWF后，血浆FVIII的平均滞留时间(MRT)的延长维持选自存在于表8中的变型1090至1299的时间。在一个具体实施方案中，在施用rVWF/FVIII复合物后，血浆FVIII半衰期的延长维持选自存在于表8中的变型1090至1299的时间。

表8.在施用rVWF和rVWF/FVIII复合物后，血浆FVIII稳定性的维持时间的示例性实施方案。

Var.＝变型

在另外的方面，本发明的rVWF显示出与pdVWF的效果相比对FVIII的稳定性增强的效果。例如，如图20中所示，平均FVIII半衰期通过rVWF相对于接受pdVWF的患者的半衰期延长5.2小时。在另外的实施方案中，rVWF将平均FVIII半衰期延长约1-15、2-14、3-13、4-12、5-11、6-10、5-9、6-8小时。在另外其他实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将FVIII半衰期延长约10％至约75％。在还有其他实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将FVIII半衰期延长约10-80％、15-65％、20-60％、25-55％、30-50％、35-45％。在某些实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF将FVIII的半衰期延长选自存在于表9中的变型1300至1643的量。在还有其他实施方案中，FVIII半衰期的延长平均值或百分比在施用rVWF后维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在还有其他实施方案中，在施用rVWF后，FVIII半衰期的延长维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。

表9.在施用rVWF和rVWF/FVIII复合物后，血浆FVIII发生的半衰期延长的示例性实施方案。

Var.＝变型

在另外其他方面并根据以上任一个，与pdVWF相比通过rVWF使FVIII活性稳定除了FVIII半衰期外还可以通过其他指标度量，包括平均滞留时间(MRT)和曲线下面积(AUC)。在示例性实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将MRT延长约1-15小时。在另外的实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将MRT延长约1-25、2-20、3-15、4-10、5-9、6-8小时。在另外其他实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将FVIII MRT延长约10-80％、15-65％、20-60％、25-55％、30-50％、35-45％。在还有其他实施方案中，FVIII半衰期的延长平均值或百分比在施用rVWF后维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在某些实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF将FVIII的MRT延长选自存在于表10中的变型1644至1987的量。

在还有其他实施方案中，在施用rVWF后，MRT的延长维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。在某些实施方案中，通过施用rVWF所致的FVIII的MRT的延长维持选自存在于表8中的变型1090至1299的时间。

表10.与施用血浆源VWF和血浆源VWF/FVIII复合物后相比，在施用rVWF和rVWF/FVIII复合物后，FVIII平均滞留时间的延长的示例性实施方案。

Var.＝变型

pdVWF与rVWF之间另外的示例性差异在下表中提供：

在一些实施方案中，rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:1与1:5之间。在另外的实施方案中，该比率在2:1与1:4之间。在另外其他实施方案中，该比率在5:2与1:4之间。在另外的实施方案中，该比率在3:2与1:3之间。在另外其他实施方案中，该比率为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:4或3:5。在另外的实施方案中，该比率在1:1与1:2之间。在还有其他实施方案中，该比率为1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。在某些实施方案中，在可用于本文所述的方法的组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自存在于表11中的变型1988至2140。

表11.在组合物中的并用于本文提供的方法的rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率的示例性实施方案。

Var.＝变型

在具体的方面，根据本发明使用的rVWF和/或FVIII(重组的或血浆源的)不被任何偶联、翻译后或共价修饰而修饰。在特定的实施方案中，本发明的rVWF和/或FVIII不被水溶性聚合物修饰，这些聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟乙基淀粉、聚碳水化合物部分等。

在其他方面，根据本发明使用的rVWF和/或FVIII(重组的或血浆源的)通过偶联、翻译后修饰或共价修饰而修饰，包括N端或C端残基修饰以及选定的侧链的修饰，例如在游离的巯基、伯胺和羟基处。在一个实施方案中，水溶性聚合物通过赖氨酸基团或其他伯胺连接到蛋白(直接地或通过连接基)。在一个实施方案中，本发明的rVWF和/或FVIII蛋白可通过水溶性聚合物的偶联修饰，这些聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟乙基淀粉、聚碳水化合物部分等。

可用于修饰rVWF和/或FVIII的水溶性聚合物包括直链和支链结构。偶联的聚合物可直接连接到本发明的凝血蛋白，或者可通过连接部分连接。与水溶性聚合物偶联的蛋白的非限制性实例可见于美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337以及Abuchowski和Davis"Enzymes as Drugs,"Holcenberg和Roberts,Eds.,pp.367 383,John Wiley and Sons,New York(1981)和Hermanson G.,BioconjugateTechniques 2nd Ed.,Academic Press,Inc.2008。

蛋白偶联可通过本领域的多种熟知技术进行，例如参见Hermanson G.,Bioconjugate Techniques 2nd Ed.,Academic Press,Inc.2008。实例包括通过凝血蛋白或水溶性聚合物部分一者上的羧基与另一者的胺基团之间的肽键的键合，或一者的羧基与另一者的羟基之间的酯键合。本发明的凝血蛋白能够借以偶联到水溶性聚合物化合物的另一种键合是通过席夫碱，在两者之间，聚合物部分上的游离氨基与通过高碘酸盐氧化作用在聚合物的非还原性末端形成的醛基反应(Jennings和Lugowski,J.Immunol.1981；127:1011-8；Femandes和Gregonradis,Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。生成的席夫碱可通过与NaCNBH₃的特定还原作用而稳定以形成仲胺。一种替代方法是通过在之前的氧化后用NH₄Cl进行还原性胺化而在聚合物上生成末端游离氨基。可采用双官能试剂连接两个氨基或两个羟基。例如，含有氨基的聚合物可通过如BS3(双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸盐/Pierce,Rockford,Ill.)的试剂偶联到凝血蛋白的氨基。此外，如Sulfo-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯/Pierce)的杂双官能交联试剂可用于例如连接胺基团和硫醇基团。在其他实施方中，醛反应性基团，诸如PEG醇盐加溴乙醛的二乙缩醛、PEG加DMSO和乙酸酐以及PEG氯化物加4-羟基苯甲醛的酚盐、琥珀酰亚胺基活性酯、活化的二硫代碳酸酯PEG、2,4,5-三氯苯基氯甲酸酯和对硝基氯甲酸酯活化的PEG可结合凝血蛋白使用。

在一些方面，用于本发明方法的rVWF已通过弗林蛋白酶在体外成熟。在另外的实施方案中，弗林蛋白酶为重组弗林蛋白酶。

在另外的方面，用于本发明方法的rVWF和/或rFVIII通过使用本领域已知的方法在哺乳动物细胞培养中表达而产生。在特定的实施方案中，哺乳动物培养包括CHO细胞。在另外的实施方案中，将rVWF和rFVIII在相同的培养中共表达。在此类实施方案中，将rVWF和rFVIII使用本领域已知的方法一起纯化(共纯化)或单独纯化。在其他实施方中，将rVWF和rFVIII在不同的培养中表达。

在一个示例性实施方案中，本发明的rVWF包括从CHO细胞表达系统分离的rVWF蛋白。在又一个实施方案中，前肽移除通过在体外将原-VWF暴露于弗林蛋白酶而介导，在再一个实施方案中，用于前肽移除的弗林蛋白酶为重组弗林蛋白酶。在还一个实施方案中，不存在完全糖基化的/ABO血型多糖。

在还有其他实施方案中，用于本发明方法和组合物的rVWF在合适的真核宿主系统中表达。真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物系统，诸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞和High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，VWF可在酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞等中表达。例如，在人类细胞系、仓鼠细胞系或鼠细胞系中。在一个特定的实施方案中，细胞系为CHO、BHK或HEK细胞系。通常，哺乳动物细胞(例如，得自连续细胞系的CHO细胞)可用于表达本发明的VWF。

在某些实施方案中，包含编码VWF的序列的核酸序列可以为载体。载体可以通过病毒递送或可以为质粒。编码蛋白的核酸序列可以为特定的基因或其生物功能性部分。在一个实施方案中，蛋白至少为VWF的生物活性部分。

多种载体可用于VWF的表达并可选自真核表达载体。真核表达载体的实例包括：(i)对于酵母中的表达而言，诸如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，其中使用诸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等启动子；(ii)对于昆虫细胞中的表达而言，诸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等载体，其中使用诸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等启动子；以及(iii)对于哺乳动物细胞中的表达而言，诸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等载体和衍生自诸如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等的病毒系统的载体，其中使用诸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白的启动子。

在本发明的一些实施方案中，核酸序列还包含适于蛋白的受控表达的其他序列，诸如本领域普通技术人员通常知道的启动子序列、增强子、TATA盒、转录起始位点、多聚接头、限制位点、聚腺苷酸序列、蛋白加工序列、选择性标记等。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养方法可包括使用微载体。在一些实施方案中，实施方案的细胞培养可在大型生物反应器中在适于提供高体积-培养比表面积以实现高细胞密度和蛋白表达的条件下进行。一种提供此类生产条件的手段是使用微载体在搅拌槽式反应器中进行细胞培养。微载体上的细胞生长概念最初由van Wezel(van Wezel,A.L.,Nature 216:64-5(1967))描述并允许细胞在悬浮在生长培养基中的小固体粒子表面上贴壁。这些方法提供高表面与体积比，并因而允许高效利用营养物。此外，对于在真核细胞系中的分泌蛋白的表达而言，提高的表面与体积比允许更高水平的分泌并因而在培养上清液中产生更高的蛋白产量。最后，这些方法允许容易地放大真核表达培养。

表达VWF的细胞可在细胞培养生长期间结合到球形或多孔微载体。微载体可以是选自基于葡聚糖、胶原、塑料、胶质和纤维素等的微载体的微载体，如Butler(1988.In:Spier&Griffiths,Animal Cell Biotechnology 3:283-303)中所述。还可能的是，使细胞在球形微载体上生长到一定的生物量，并当它们达到最终的发酵罐生物量时并在多孔微载体上产生表达蛋白之前将细胞传代培养，反之亦然。合适的球形微载体可包括光滑表面微载体，诸如Cytodex^TM 1、Cytodex^TM 2和Cytodex^TM 3(GE Healthcare)以及大孔微载体，诸如Cytopore^TM1、Cytopore^TM 2、Cytoline^TM 1和Cytoline^TM 2(GE Healthcare)。

在某些实施方案中，rVWF在产生高分子量rVWF的细胞培养基中培养的细胞中表达。术语“细胞培养溶液”、“细胞培养基”和“细胞培养上清液”是指本领域通常熟知的细胞培养过程的方面。在本发明的背景下，细胞培养溶液可包含细胞培养基和细胞培养上清液。将细胞培养基在外部加入细胞培养溶液，任选地与补充剂一起，以提供营养物和其他组分来培养表达VWF的细胞。细胞培养上清液是指包含来自细胞培养基的营养物和其他组分以及在培养过程中细胞释放、代谢和/或分泌的产物的细胞培养溶液。在另外的实施方案中，培养基可以为无动物蛋白的和化学限定的。制备无动物蛋白的和化学限定的培养基的方法在本领域是已知的，例如在US 2008/0009040和US 2007/0212770中，它们均并入本文以用于所有目的，尤其是对于与细胞培养基相关的所有教导而言。“无蛋白的”及相关术语是指来自培养中的细胞的外源性来源的蛋白或非培养中的细胞的蛋白，所述细胞在生长过程中自然脱落蛋白。在另一个实施方案中，培养基为无多肽的。在另一个实施方案中，培养基为无血清的。在另一个实施方案中，培养基为无动物蛋白的。在另一个实施方案中，培养基为无动物组分的。在另一个实施方案中，培养基含有蛋白，例如来自血清的动物蛋白，诸如胎牛血清。在另一个实施方案中，培养物具有外源性添加的重组蛋白。在另一个实施方案中，蛋白来自经检疫合格无病原体的动物。如本文所用的术语“化学限定的”应意指培养基不含任何不明确的补充剂，诸如动物组分、器官、腺体、植物或酵母的提取物。因此，化学限定培养基的各组分是准确限定的。在一个优选的实施方案中，培养基为无动物组分的和无蛋白的。

在某些实施方案中，表达VWF的细胞的培养可维持至少约7天或至少约14天、21天、28天，或至少约5周、6周、7周，或至少约2个月或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长。用于产生重组VWF蛋白而将细胞培养维持在的细胞密度将取决于用于蛋白表达的培养条件和培养基。本领域的技术人员将容易地能够确定产生VWF的细胞培养的最佳细胞密度。在一个实施方案中，将培养维持在约0.5×10⁶与4×10⁷个细胞/ml之间的细胞密度一段延长的时间。在其他实施方中，将细胞密度维持在约1.0×10⁶与约1.0×10⁷个细胞/ml之间的浓度一段延长的时间。在其他实施方中，将细胞密度维持在约1.0×10⁶与约4.0×10⁶个细胞/ml之间的浓度一段延长的时间。在其他实施方中，将细胞密度维持在约1.0×10⁶与约4.0×10⁶个细胞/ml之间的浓度一段延长的时间。在另有其他实施方案中，将细胞密度维持在约2.0×10⁶与约4.0×10⁶之间或约1.0×10⁶与约2.5×10⁶之间或约1.5×10⁶与约3.5×10⁶之间或任何其他相似范围内的浓度一段延长的时间。细胞培养适当的时间后，可使用本领域已知的方法将rVWF从表达系统中分离。

在一个具体实施方案中，将产生rVWF的连续细胞培养的细胞密度长期维持在不超过2.5×10⁶个细胞/mL的浓度。在其他具体实施方案中，将细胞密度维持在不超过2.0×10⁶个细胞/mL、1.5×10⁶个细胞/mL、1.0×10⁶个细胞/mL、0.5×10⁶个细胞/mL或更低。在一个实施方案中，将细胞密度维持在1.5×10⁶个细胞/mL与2.5×10⁶个细胞/mL之间。

在上述细胞培养的一个具体实施方案中，细胞培养溶液包含含铜培养基补充剂。此类细胞培养溶液例如在2011年7月8日提交的US 2012/0035110中有所描述，该专利据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的，尤其是对于与产生重组VWF的细胞培养方法和组合物相关的所有教导而言。

在另外的实施方案中，在从哺乳动物细胞培养物中纯化(单独地或一起)后，将rFVIII/rVWF复合物在施用前复溶。在另外其他实施方案中，在复溶rFVIII/rVWF复合物之前或之后，将rVWF用弗林蛋白酶处理。在另外的实施方案中，弗林蛋白酶为重组弗林蛋白酶。

在另外其他实施方案中，本发明的rVWF不暴露于ADAMTS13，结果是超大(即，包含10个或更多个亚单位)多聚体存在于本发明的rVWF组合物中。

在具体的方面，用于本发明方法的rVWF和/或rFVIII包含在含有缓冲剂、糖和/或糖醇(包括但不限于海藻糖和甘露糖醇)、稳定剂(诸如甘氨酸)以及表面活性剂(诸如聚山梨醇酯80)的制剂中。在另外的实施方案中，对于包含rFVIII的制剂而言，制剂还可以包含钠、组氨酸、钙和谷胱甘肽。

在一个方面，将包含rVWF和/或rFVIII的制剂在施用前冻干。冻干使用本领域常见的技术进行，并应针对所开发的组合物优化[Tang等人,Pharm Res.21:191-200,(2004)和Chang等人,Pharm Res.13:243-9(1996)]。

制备药物制剂的方法可包括以下一个或多个步骤：将如本文所述的稳定剂在冻干前加到所述混合物中，将选自疏松剂、渗透压调节剂和表面活性剂(它们每一者均如本文所述)的至少一种试剂在冻干前加到所述混合物中。冻干制剂在一个方面至少由缓冲剂、疏松剂和稳定剂中的一者或多者组成。在该方面，当冻干步骤期间或复溶期间的聚集成为一个问题时，对表面活性剂的实用性进行评价并加以选择。将适当的缓冲剂包含在内以将制剂在冻干期间维持在稳定的pH区内。

冻干材料的标准复溶实践是将一定体积的纯净水或无菌注射用水(WFI)(通常等于在冻干期间移除的体积)加回，但有时将抗菌剂的稀溶液用于产生供肠胃外施用的药剂[Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:1311-1354(1992)]。因此，提供了用于制备复溶的重组VWF(含或不含重组因子VIII)组合物的方法，包括将稀释剂加到本发明的冻干重组VWF组合物中的步骤。

可将冻干材料复溶为水溶液。多种水性载体，例如无菌注射用水、含防腐剂以供多剂量使用的水、或含有适量表面活性剂的水(例如，含有与适于制造水性混悬剂的赋形剂配混的活性化合物的水性混悬剂)。在多个方面，此类赋形剂为助悬剂，例如但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂为天然存在的磷脂，例如但不限于卵磷脂，或亚烷基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如但不限于十七乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的部分酯的缩合产物，例如但不限于聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。在多个方面，水性混悬剂还含有一种或多种防腐剂，例如但不限于对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

在某些实施方案中，本发明的组合物为用于通过使用注射器或其他储存容器施用的液体制剂。在另外的实施方案中，这些液体制剂由复溶为水溶液的本文所述的冻干材料产生。

在又一个方面，本发明的组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。短语“药学上”或“药理学上”可接受的是指下述分子实体和组合物，其为稳定的、抑制蛋白降解(诸如聚集裂解产物)并且除此之外在使用如下文所述的本领域熟知的途径施用时不产生过敏或其他不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上可用的溶剂、分散介质、包衣料、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等，包括上文所公开的那些试剂。

用于治疗疾病的方法的本发明组合物的施用

向受试者施用rVWF以治疗凝血疾病的优点之一在于与pdVWF相比rVWF更高的比活性允许施用的rVWF的量以及向受试者再次给予rVWF(含或不含共同施用的FVIII)的次数的灵活性。此外，rVWF组合物提供在初始共同施用rVWF和FVIII后再次单独给予rVWF的灵活性，无需另外给予FVIII。如将会认识到并在本文进一步详细讨论，共同施用的FVIII可以为重组的或血浆源的。

在一个方面，根据本发明施用rVWF导致受试者中的血浆FVIII水平和/或活性比施用pdVWF的受试者所见的更高。如上所讨论，FVIII水平和活性的增加可使用本领域的标准方法测量，从而允许确定含或不含FVIII时rVWF的合适剂量。

单次或多次施用rVWF(含或不含FVIII)通过治疗医生选择的剂量水平和模式进行。对于疾病的预防或治疗，合适的剂量取决于待治疗的疾病的类型(例如冯·威利布兰德病)、疾病的严重性和病程、药物的施用是用于预防性还是治疗性目的、之前的疗法、患者的临床史及对药物的反应以及主治医生的判断。

在另外的实施方案中并根据以上任一个，诸如VWD或甲型血友病的凝血疾病的治疗可涉及单独的或与FVIII组合的rVWF的初始治疗，然后是单独的rVWF、rVWF与FVIII一起或单独的FVIII的一个或多个重复剂量。初始及后续重复施用的性质将部分地取决于所治疗的疾病。例如，患有VWD的患者具有一定水平的FVIII，但是该FVIII的稳定性通常因患者缺乏VWF而受到不利影响。VWD患者的治疗可因此在一些实施方案中涉及用rVWF和rFVIII两者初始治疗然后反复施用单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以通过单独的rVWF进行，而后续反复施用通过rVWF和rFVIII两者进行。在另外其他实施方案中，初始和后续反复施用可均包括rVWF和rFVIII两者的共同施用。相似地，甲型血友病患者(缺乏FVIII)可接受rVWF和rFVIII两者的初始治疗，而后续反复治疗可包括施用单独的rFVIII或单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以为单独的rFVIII，而后续反复治疗涉及共同施用rVWF和rFVIII。

在另外的方面，将rVWF以0.5IU/kg–200IU/kg范围内的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，将rVWF以1-190、5-180、10-170、15-160、20-150、25-140、30-130、35-120、40-110、45-100、50-90、55-80或60-70IU/kg范围内的剂量施用。在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF(含或不含FVIII)以约1IU/kg至约150IU/kg rVWF的剂量施用给受试者。在另外其他实施方案中，将rVWF和rFVIII以1.5IU/kg至150IU/kg、2IU/kg至50IU/kg、5IU/kg至40IU/kg、10IU/kg至20IU/kg、10IU/kg至100IU/kg、25IU/kg至75IU/kg和40IU/kg至75IU/kg的剂量施用。在另外其他实施方案中，将rVWF以2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50IU/kg施用。如将会认识到并在本文进一步讨论，rVWF(或与FVIII一起的rVWF)的合适剂量可通过使用测定血药浓度剂量的既定试验与适当的剂量反应数据相结合而确定。在一个实施方案中，将rVWF以选自于表12中的变型2141至2338的剂量施用给受试者。

表12.根据本文提供的方法施用给受试者的rVWF剂量的示例性实施方案。

Var.＝变型

在另外其他实施方案中，rVWF的施用剂量使得其将血浆FVIII半衰期延长约1.0-4.5、1.5-4.0、2.0-3.5、2.5-3.0倍。在另外其他实施方案中，rVWF的施用剂量和/或频率使得FVIII半衰期的延长在施用rVWF后维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在还有其他实施方案中，rVWF的施用剂量和/或频率使得FVIII半衰期的延长在施用rVWF后维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。在一个实施方案中，rVWF的施用剂量使得其将血浆FVIII的半衰期延长选自存在于表7中的变型1046至1089的值。

如上所讨论，本发明的rVWF显示出与pdVWF的效果相比对FVIII的稳定性增强的效果。在某些方面，rVWF的施用剂量和/或频率使得其将平均FVIII半衰期延长约1-15、2-14、3-13、4-12、5-11、6-10、5-9、6-8小时。在另外其他实施方案中，rVWF的施用剂量和/或频率使得其与pdVWF相比将FVIII半衰期延长约10％至约75％。在还有其他实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将FVIII半衰期延长约10-80％、15-65％、20-60％、25-55％、30-50％、35-45％。在还有其他实施方案中，FVIII半衰期的延长平均值或百分比在施用rVWF后维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在还有其他实施方案中，在施用rVWF后，FVIII半衰期的延长维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。如将会认识到，FVIII稳定性、半衰期和/或活性的增加可使用本领域已知的方法评估，包括但不限于凝结试验。在其他实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF将FVIII的半衰期延长选自存在于表9中的变型1300至1643的量。

如上所讨论，与pdVWF相比通过rVWF使FVIII活性稳定除了FVIII半衰期外还可以通过其他指标度量，包括平均滞留时间(MRT)和曲线下面积(AUC)。在示例性实施方案中，rVWF的施用剂量和/或频率使得其与pdVWF相比将MRT增加约1-15小时。在另外的实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将MRT延长约1-25、2-20、3-15、4-10、5-9、6-8小时。在另外其他实施方案中，与pdVWF相比，rVWF将FVIII MRT延长约10-80％、15-65％、20-60％、25-55％、30-50％、35-45％。在还有其他实施方案中，FVIII半衰期的延长平均值或百分比在施用rVWF后维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时。在还有其他实施方案中，在施用rVWF后，MRT的延长维持至少5-125、10-115、15-105、20-95、25-85、30-75、35-65、40-55小时。在其他实施方案中，与施用血浆源VWF相比，施用rVWF将FVIII的MRT延长选自存在于表9中的变型1300至1643的量。

在另外的方面，施用给患者的rVWF的剂量与用于施用pdVWF/pdFVIII的剂量相当。

含或不含FVIII的rVWF的组合物可包含在药物制剂中，如本文所述。此类制剂可经口、局部、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、经阴道、经直肠或通过颅内注射而施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。也设想了通过静脉内、真皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或在特定部位的手术植入。一般来讲，组合物基本上不含热原，以及其他可能对接收者有害的其他杂质。

在一个方面，本发明的制剂通过初始推注然后连续输注而施用，以维持药品的治疗性循环水平。作为另一个实例，本发明的化合物作为一次性剂量施用。本领域的普通技术人员将容易地优化有效剂量和施用方案，它们通过良好的医疗实践和个体患者的临床病症决定。施用途径可以但不限于通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用而进行。给药频率取决于药剂的药代动力学参数和施用途径。最佳的药物制剂通过本领域的技术人员根据施用途径和所需剂量而确定。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042pages 1435-1712，该文献的公开内容据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的，尤其是对于与制剂、施用途径和药品剂量相关的教导而言。此类制剂影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和的体内清除速率。取决于施用途径，根据体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。合适的剂量可通过使用用于测定血药浓度剂量的既定试验与适当的剂量反应数据相结合而确定。最终的剂量方案由主治医生考虑到改变药物作用的多种因素来确定，这些因素例如为药物的比活性，患者的损害严重性和反应性，患者的年龄、病症、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度，施用时间以及其他临床因素。以举例的方式，本发明的重组VWF的典型剂量为约50U/kg，等于500μg/kg。在开展研究时，关于各种疾病和病症的合适剂量水平和治疗持续时间的进一步信息将会出现。

在一些实施方案中，将rVWF单独地施用给受试者。在一些实施方案中，将rVWF结合一种或多种凝血因子施用给受试者。在另外的实施方案中，与rVWF一起施用的凝血因子为FVIII。在另外其他实施方案中，将rVWF在诸如FVIII的凝血因子之前、之后或同时施用。在某些实施方案中，将rVWF和FVIII以单一组合物的形式一起施用。如将会认识到，与rVWF共同施用的FVIII可以为重组的FVIII或血浆源的。

在另外的实施方案中，将rVWF(含或不含FVIII)施用给受试者每天不超过一次。在另外的实施方案中，将rVWF(含或不含FVIII)施用给受试者：每两天不超过一次、每三天不超过一次、每四天不超过一次、每五天不超过一次、每周不超过一次、每两周不超过一次、每月不超过一次。在另外其他实施方案中，将rVWF(含或不含FVIII)施用给受试者每天不超过两次。

在另外的实施方案中，将rVWF和FVIII一起以初始剂量施用给受试者，然后通过单独的rVWF进行后续再次给药。在其他实施方中，再次给药通过rVWF和FVIII两者进行。

在另外其他实施方案中，rVWF(含或不含rFVIII)的施用剂量使得FVIII活性稳定约10至约90小时。在另外的实施方案中，血浆FVIII活性稳定至少12、24、36、48或72小时。如将会认识到，稳定的血浆FVIII活性可以是内源性FVIII、共同施用的FVIII(血浆源的或重组的)或内源性和共同施用的FVIII的组合的活性。

在一些实施方案中，rVWF和FVIII一起施用的剂量使得血浆FVIII活性的体内半衰期的延长稳定至少12、24、36、48或72小时。在另外的实施方案中，血浆FVIII活性稳定约10至约90小时。在另外其他实施方案中，血浆FVIII的半衰期的延长在患者中维持至少24、36、48、72、90、120或168小时。共同施用的FVIII可以为rFVIII或pdFVIII。在一些实施方案中，血浆FVIII活性在共同施用rVWF和FVIII后稳定选自存在于表8中的变型1090至1299的时间。

在优选的方面，本发明提供用于治疗包括血友病和冯·威利布兰德病(VWD)的凝血疾病的方法。

如本文所用，“冯·威利布兰德病”是指一组由冯·威利布兰德因子的缺陷所致的疾病。冯·威利布兰德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，这是正常凝血的必要条件。存在多种类型的冯·威利布兰德病。下表汇总了不同类型的VWD的特性：

摘自Sadler,J Thromb Haemost 2006；4,2103

治疗凝血疾病的方法包括根据本文所述的和本领域已知的施用方法的任一个向对其有需要的受试者施用rVWF或rVWF和rFVIII的组合。此类受试者可患有任何凝血疾病，包括但不限于冯·威利布兰德病或血友病。如将会认识到，任何类型的冯·威利布兰德病(包括在上表中列出的任何类型)均可根据本文所述的方法和组合物的任一个进行治疗。

在一些实施方案中，将rVWF(含或不含rFVIII)施用给受试者，使得施用后24、36、48小时或更长时间受试者血浆中因子VIII促凝血活性(FVIII:C)的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少90％。在另外的实施方案中，施用后24、36、48小时或更长时间受试者血浆中FVIII:C的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少50％至100％。在另外其他实施方案中，施用后24、36、48小时或更长时间受试者血浆中FVIII:C的水平为施用后1小时存在于血浆中的FVIII:C活性水平的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。

rVWF的施用

在一个方面，本公开提供用于治疗对其有需要的受试者中的冯·威利布兰德病(VWD)或甲型血友病的方法，其包括施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)的组合物，使得因子VIII(FVIII)稳定性与施用血浆源冯·威利布兰德因子(pdVWF)的组合物的受试者中的FVIII半衰期相比增加。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为具有比pdVWF的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，使得与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比FVIII稳定性延长至少10％、20％、30％、2小时、4小时、6小时或选自存在于表9中的变型1300至1643的量。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为具有比pdVWF的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少10％，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少20％，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少30％，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

表13.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表14.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表15.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表16.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表17.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表18.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表19.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，在本文所用的组合物中的rVWF比活性与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有10IU/kg至40IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF组合物，其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有20IU/kg至30IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有25IU/kg至75IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF组合物，其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有40IU/kg至60IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有75IU/kg至125IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF组合物，其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有75IU/kg至100IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中向受试者施用选自表12中的变型2141至2338的rVWF剂量，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为具有比pdVWF的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

表20.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表21.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表22.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表23.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表24.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表25.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表26.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表27.与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF剂量与所实现的FVIII稳定性增强的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中组合物中的rVWF具有40mU/μg至60mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中组合物中的rVWF具有至少60mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中组合物中的rVWF具有至少80mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中组合物中的rVWF具有选自存在于表1中的变型1至133的比活性，并且其中与施用pdVWF的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物为具有比pdVWF的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

表28.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表29.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表30.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表31.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表32.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表33.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

表34.可用于本文所述的方法的rVWF剂量与rVWF比活性的组合的示例性实施方案。

Var.＝变型

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中施用给受试者的rVWF的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少18小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少24小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少30小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

rVWF/rFVIII的施用

在一个方面，本公开提供用于治疗对其有需要的受试者中的冯·威利布兰德病(VWD)或甲型血友病的方法，其包括施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)和重组FVIII(rFVIII)的组合物，使得因子VIII(FVIII)稳定性与施用血浆源冯·威利布兰德因子(pdVWF)的组合物的受试者中的FVIII半衰期相比增加。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF的组合物更高的VWF比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为具有比pdVWF的组合物更高VWF比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，使得与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比FVIII稳定性延长至少10％、20％、30％、2小时、4小时、6小时或选自存在于表9中的变型1300至1643的量。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为具有比pdVWF的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少10％，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少20％，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，使得FVIII稳定性与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比延长至少30％，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有10IU/kg至40IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF/rFVIII组合物，其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有20IU/kg至30IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有25IU/kg至75IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF/rFVIII组合物，其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有40IU/kg至60IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用一定剂量的含有75IU/kg至125IU/kg的rVWF:RCo活性的rVWF/rFVIII组合物，其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物含有75IU/kg至100IU/kg的rVWF:RCo活性。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中向受试者施用选自表12中的变型2141至2338的rVWF剂量，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为具有比pdVWF/FVIII的组合物更高比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中的rVWF具有40mU/μg至60mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中的rVWF具有至少60mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中的rVWF具有至少80mU/μg的比活性，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中的rVWF具有选自存在于表1中的变型1至133的比活性，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在再一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为具有比pdVWF/FVIII的组合物更高VWF比活性的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少30％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少50％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物，其中组合物中至少70％的rVWF分子以至少10个亚单位的多聚体存在，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少18小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少24小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中受试者中的FVIII在施用后稳定至少30小时，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为4:1-3:2，并且其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:1-3:2。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:1-1:2，并且其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:2-2:3。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:6，并且其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:5。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自存在于表11中的变型1988至2140，并且其中施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为在特定的更高级rVWF多聚体或更大的多聚体中具有根据存在于表3至表5中的变型134至457的任一个的最低百分比的rVWF分子的高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自存在于表11中的变型1988至2140。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为4:1-3:2，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IUrVWF:RCo)的比率为3:1-3:2。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:1-1:2，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，组合物中的rVWF比活性与FVIII稳定性的增加的组合选自表13至表19中的变型2339至4868。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IUrVWF:RCo)的比率为3:2-2:3。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物为高分子量rVWF多聚体的组合物。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

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在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为4:1-3:2，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:1-3:2。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:1-1:2，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:2-2:3。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:6，并且其中与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:5。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自存在于表11中的变型1988至2140，并且与施用pdVWF/FVIII的组合物的受试者中的FVIII稳定性相比，rVWF的剂量与FVIII稳定性的增加选自表20至表27中的变型4869至8003。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为4:1-3:2，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:1-3:2。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:1-1:2，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为3:2-2:3。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:6，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个具体实施方案中，组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为2:3-1:5。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

在一个实施方案中，该方法包括施用rVWF/rFVIII的组合物，其中组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自存在于表11中的变型1988至2140，并且其中组合物中rVWF的剂量与rVWF的比活性选自表28至表34中的变型8004至10625。在一个实施方案中，施用给受试者的rVWF/rFVIII的组合物具有比pdVWF/FVIII的组合物更高的VWF比活性。在一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的半衰期来表征。在另一个实施方案中，FVIII稳定性通过FVIII的平均滞留时间(MRT)来表征。在又一个实施方案中，该方法用于治疗任何类型的VWD。在一个具体实施方案中，该方法用于治疗3型VWD。

除非另外指明，否则本发明的实践均可采用在本领域技术人员知识范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。此类常规技术包括聚合物阵列合成(polymer array synthesis)、杂交、连接和使用标记检测杂交。合适的技术的具体例证可参考下文的实例。然而，其他等同的常规程序当然也可以使用。此类常规技术和描述可见于标准实验室手册，诸如Genome Analysis:ALaboratory Manual Series(Vols.I-IV),Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cells:A Laboratory Manual，PCR Primer:A Laboratory Manual和Molecular Cloning:ALaboratory Manual(均得自Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)Freeman,Highly stabilized York,Gait,“OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London,Nelson and Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry 3^rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,Highlystabilized York,N.Y.以及Berg等人(2002)Biochemistry,5^th Ed.,W.H.Freeman Pub.,Highly stabilized York,N.Y.，它们均整体以引用方式并入文本以用于所有目的。

注意，除非上下文另有明确表示，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/一种“和“该/所述”包括多个指代物。因此，例如，提及“一聚合酶”是指一种试剂或此类试剂的混合物，提及“该方法”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法等等。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以用于描述和公开在该出版物中描述的并可能结合本文所述的发明使用的装置、组合物、制剂和方法的目的。

如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值(直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指出)以及该所述范围内的任何其他所述值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在所述较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值一者或两者的范围也包括在本发明内。

在以上描述中，示出了许多具体的细节以提供对本发明更全面的理解。然而，对本领域的技术人员将显而易见的是，本发明可在没有这些具体细节的一者或多者的情况下实践。在其他情况下，未描述本领域技术人员熟知的特征和程序以免使本发明复杂难懂。

虽然主要结合具体实施方案描述本发明，但是还设想的是，在阅读本公开后其他实施方案将变得对本领域的技术人员显而易见，并且此类实施方案也旨在包括在本发明的方法内。

实施例

实施例1

rVWF:rFVIII共同施用的研究。作为研究的主要终点评估了以2IU/kg、7.5IU/kg、20IU/kg和50IU/kg的VWF:RCo单剂量施用rVWF:rFVIII后的直接耐受性和安全性。次要终点包括VWF:RCo、VWF:CB、VWF:Ag、FVIII和VWF的多聚体组合物的PK。另一个次要终点为与pdVWF//pdFVIII的PK比较[队列4(50IU/kg VWF:RCo)]。有关研究设计的示意图，参见图1。

将重组人冯·威利布兰德因子(rVWF)在CHO细胞中表达。通过将原-VWF在体外暴露于重组弗林蛋白酶而介导前肽移除。不存在完全糖基化的/ABO血型多糖。重组VWF具有比血浆源VWF(pdVWF)更高的比活性并提供含或不含rFVIII的治疗性给药灵活性。用于本研究的rVWF不暴露于ADAMTS13，从而导致存在超大VWF多聚体和完整的VWF亚单位。ADAMTS13导致在TYR¹⁶⁰⁵-MET¹⁶⁰⁶处的亚单位裂解。

VWF:RCo PK/VWF多聚体动力学表明rVWF与Humate P之间高度相似的VWF:RCo的PK(VWF活性)(图2A)。Humate P是复合到VWF的人源中纯度因子VIII浓缩物。将替代标志物用于疗效和给药建议。图2A中的数据表明rVWF显示出与血浆源VW相似的活性。在暴露于ADAMTS13时观察到了高分子量rVWF的逐渐损失(图2B)，从而表明在ADAMTS13暴露前rVWF存在于高分子量多聚体中。

与Humate相比，在rVWF患者中观察到了更高的FVIII水平(图3)。这些数据表明rVWF使内源性FVIII在体内稳定。在不同的VWF:FVIII比率(1.3:1对约2.1VWF/FVIII)下观察到了存在效果的差异。这些不同的比率表明当使用血浆源VWF时可将比所需的量更少的rVWF用于稳定FVIII。该研究设计提供了在初始剂量后用单独的rVWF(无rFVIII)再次给药的灵活性。

超大分子量多聚体与rVWF一起存在–这些超大分子量多聚体在输注后快速消失。ADAMTS13介导的裂解片段在所有受试者中均观察到。VWF:RCo的药代动力学情况与pdVWF的相似。通过rVWF使内源性FVIII存在持续的稳定，与pdVWF观察到的相当。rVWF的不良药物反应情况与pdVWF/pdFVIII的相似，所有相关的不良事件(AE)均是温和的。

总体安全性和药代动力学情况表明，rVWF可用于以与pdVWF/pdFVIII相当的剂量治疗和预防出血事件，同时与使用pdVWF产生的效果相比提高FVIII的水平。不受理论的限制，可能的是，在rVWF的群体中高比例的超大多聚体(十聚体或更高级的多聚体)导致与血浆源VWF所实现的相比通过rVWF观察到了增强的FVIII稳定化。

实施例2

在重度冯·威利布兰德病(VWD)中评价药代动力学以证实安全性和耐受性的人体研究。该研究在患有3型VWD或重度1型VWD的患者中对pdVWF与rVWF的效果进行比较。

在内皮细胞和巨核细胞中合成了用于该研究的pdVWF。前肽移除的翻译后修饰在蛋白传递到高尔基体和后高尔基体区室期间在细胞内发生。存在糖基化/ABO血型多糖。pdVWF由已暴露于血浆ADAMTS13的VWF亚单位组成。在pdVWF群体中不存在超大VWF多聚体，且亚单位在TYR¹⁶⁰⁵-MET¹⁶⁰⁶处裂解。pdVWF浓缩物包含其他蛋白，包括ADAMTS13和血凝素。

用于本研究的rVWF在CHO细胞中表达。通过将原-VWF在体外暴露于重组弗林蛋白酶而介导前肽移除。不存在完全糖基化的/ABO血型多糖。rVWF不暴露于ADAMTS13。rVWF的亚单位是完整的，并存在超大VWF多聚体。在ADAMTS13暴露时未发生亚单位裂解。rVWF显示出比pdVWF更高的比活性。

研究的纳入标准为：

·3型VWD(VWF:Ag≤3IU/dL)

·重度1型VWD(VWF:RCo≤10IU/dL并且FVIII:C<20IU/dL)

·年龄18至60岁

·之前接受过凝血因子替代疗法(≥25ED)

·无出血状态

研究的排除标准为：

·其他凝血障碍

·VWF和/或FVIII抑制剂史

·心血管疾病

·血栓栓塞事件病史

·其他免疫障碍病史

作为该研究的主要终点评估了以2IU/kg、7.5IU/kg、20IU/kg和50IU/kg的VWF:RCo单剂量施用rVWF:rFVIII后的直接耐受性和安全性。次要终点包括VWF:RCo、VWF:CB、VWF:Ag、FVIII和VWF的多聚体组合物的PK。另一个次要终点为与pdVWF//pdFVIII的PK比较[队列4(50IU/kg VWF:RCo)]。该研究的患者人口统计资料在图4中示出。队列4A(3型VWD)VWF:RCo/VWF:Ag的药代动力学分析在图5中示出。这些数据表明，rVWF的总活性与pdVWF的活性相当。在暴露于ADAMTS13时观察到了高分子量rVWF的逐渐损失(图6)。队列4A(3型VWD)FVIII:C进一步的药代动力学分析在图7中示出。图7中的数据表明，rVWF在使FVIII的体内活性稳定化方面比pdVWF更有效，从而导致用rVWF/rVWF治疗后FVIII促凝血活性与用pdVWF/pdFVIII治疗相比增加。

超大分子量多聚体存在于rVWF中，并在输注后快速消失。ADAMTS13介导的裂解片段在所有受试者中均观察到。VWF:RCo的药代动力学情况与pdVWF的相似。存在内源性FVIII的持续稳定，与pdVWF观察到的相当。不良药物反应情况与pdVWF/pdFVIII的相似，所有相关的不良事件均是温和的。

总体安全性和药代动力学情况表明，rVWF可用于以与pdVWF/pdFVIII相当的剂量治疗和预防出血事件。

实施例3

rVWF:rFVIII复合物的临床研究。该研究是在先天性冯·威利布兰德病3型中的药代动力学、直接安全性和耐受性研究。图9显示了研究中的三名患者的rVWF PK参数。

图10显示了患者1的PK数据。在VWF:RCo与VWF:CBA之间存在良好的相关性。活性直至12小时是仍可测(两者在24小时时均低于定量限)。VWF:Ag在96小时时仍可测。内源性FVIII活性增至0.13IU/mL的最大值。

图11显示了患者2的PK数据。与患者1一样，在VWF:RCo与VWF:CBA之间存在良好的相关性。两活性直至12小时时均可测(尽管处于定量限)。VWF:Ag在72小时时仍可测(未检测96小时样品)。该患者的内源性FVIII活性增至0.18IU/mL的最大值。

图12显示了患者3的PK数据。VWF:RCo活性直至24小时时仍可测(尽管处于定量限)，而VWF:CBA在24小时时低于LoQ。VWF:Ag直至48小时时仍可测。该患者的内源性FVIII活性增至0.13IU/mL的最大值。

图13显示了比较三名患者的VWF参数和FVIII活性的数据。对于所测试的所有参数(VWF:RCo、VWF:CBA、VWF:Ag和FVII:Chr活性)，在所有三名患者中均存在良好的相关性。

rVWF在所有患者中均具有约100％的回收率。三名患者显示出略微不同的rVWFPK。对于VWF抗原，在应用2IU VWF:RCo/kg后30分钟存在0.06IU/ml的最大值，然后稳定下降。对于FVIII活性，在应用rVWF+rFVIII后15分钟，基线FVIII活性增至约0.1IU/ml。之后，活性进一步增至0.16IU/ml，在3-6小时达到了平台，该平台稳定至28小时，然后稳定下降。FVIII的延迟增加表明二次升高由rVWF引起。

实施例4

rVWF研究–FVII PK评估和TA评估。图14显示了所有队列中的FVIII活性数据。图15显示了得自队列1(2IU/kg VWF:RCo/1.5IU/kg FVIII)的数据。对于所测试的所有参数，该队列的所有三名患者存在良好的相关性。

图15显示了得自队列2(7.5IU/kg VWF:RCo/5.8IU/kg FVIII)的数据。图16显示了对于FVIII:C而言该队列的药代动力学数据。

图17显示了队列3(20IU/kg VWF:RCo/15.4IU/kg FVIII)的数据。这些数据显示了VWF和FVIII的血浆参数的比较。图18显示了对于FVIII:C而言该队列的药代动力学数据。

图19显示了队列4(50IU/kg VWF:RCo)的数据。FVIII给药为38.5IU/kg的rFVIII或25IU/kg的pdFVIII。这些数据表明，rVWF的参数与pdVWF(Haemate)的那些参数相似，但是rVWF在使FVIII活性稳定化方面更有效，从而导致与通过pdVWF观察到的相比在FVIII活性中观察到升高。图20显示了对于FVIII:C而言该队列的药代动力学数据汇总。从这些数据中可以看出，与pdVWF/FVIII相比，rVWF/FVIII的中位和平均T_1/2延长，从而表明rVWF在使体内FVIII稳定化方面比pdVWF更有效，从而导致延长的半衰期。

实施例5

在甲型血友病的治疗中rVWF对rFVIII半衰期的效果的临床研究。该研究评价单独的单剂量的50IU/kg rFVIII(Advate)或其与10或50IU/kg冯·威利布兰德因子:瑞斯托菌素辅因子活性(VWF:RCo)的rVWF组合后rVWF的直接耐受性和安全性。该研究还评价单独的单剂量的50IU/kg rFVIII(Advate)或其与10或50IU/kg(VWF:RCo)的rVWF组合后的药代动力学。

研究人群使用以下标准进行选择：

纳入标准：

·重度甲型血友病(FVIII:C<1IU/dL)

·年龄18至60岁

·之前接受过凝血因子替代疗法(≥150ED)

·无出血状态

排除标准：

·其他凝血障碍

·VWF和/或FVIII抑制剂史

·心血管疾病

·血栓栓塞事件病史

·其他免疫障碍病史(例外)

受试者参与时间为16周，研究总持续时间为7个月。

研究设计是评价rFVIII:rVWF在患有遗传重度甲型血友病(FVIII:C<1％)的受试者中的安全性、直接耐受性和药代动力学的多中心、非控制性、非随机、开放标签临床研究。

参与三周期PK分析的各受试者(N＝14)以非随机方式接受50IU/kg rFVIII(Advate)，不含、含10IU/kg VWF:RCo或含50IU/kg VWF:RCo rVWF，预计参与时间为约16周。

个体内药代动力学间隔5-14天，以确保至少5天的“洗出”期以及准时完成研究。安全性分析在已向6名受试者给予10IU/KG VWF:RCo rVWF以及已向6名受试者给予50IU/KGVWF:RCo rVWF后单独进行。

受试者在任一输注前至少5天不应接受过冷沉淀物、新鲜冷冻血浆或其他干扰VWF或FVIII PK的药物。

在用10IU VWF:RCo rVWF治疗了最少6名受试者后证实直接耐受性和安全性时，逐渐升高rVWF剂量。试验用药品对生命体征、血液学和临床化学参数的影响将确定短期安全性。

用于确定FVIII活性(FVIII:C)、VWF抗原(VWF:Ag)、VWF活性(VWF:RCo)、VWF:CB的水平(及VWF多聚体分布)的样品在输注前(开始输注之前30分钟内)和输注结束后15分钟(±5分钟)、30分钟(±5分钟)、1小时(±5分钟)、3小时(±10分钟)、6小时(±10分钟)、9小时(±15分钟)、24小时(±2小时)和48小时(±2小时)、72小时(±2小时)、96小时(±2小时)和120小时(±2小时)(或之后至少每24小时时，直到FVIII降到<1％以下)采集。FVIII活性使用在当地和中心实验室进行的显色和一阶段基于aPTT的测定法进行测定。

各输注对生命体征和指示不良事件(AE)的其他症状、血液学和临床化学参数的影响用作短期安全性的指标。在输注前并直至输注后120小时，对生命体征、临床化学和血液学进行了评估。对AE的发生进行持续监控直至输注后2小时(rVWF治疗的受试者)以及随访期的各个时间点。

在试验用药品输注前和研究完成随访时，对FVIII和VWF抑制剂的存在进行评估。

如果在任何时间，发生与试验用药品相关的严重AE，则独立的数据监查委员会(DMC)将建议是否继续研究。

研究的药代动力学主要终点包括：AUC₀-∞/剂(血药浓度/时间曲线从时间0到无限大下的面积)、AUC_0-96h/剂(血药浓度/时间曲线从时间0到96小时下的面积)、平均滞留时间(MRT)、清除率(CL)、T1/2(消除相半衰期)、VWF:RCo、VWF:Ag、VWF:CB和FVIII的稳态分布容积(Vss)。

药代动力学主要终点的分析包括通过中值、中值的双侧95％CI、平均值、标准偏差、变异系数和几何平均值按治疗组(单独的50IU/kg rFVIII(Advate)、与10IU/kg VWF:RCo的rVWF预混的50IU/kg rFVIII(Advate)、与50IU/kg VWF:RCo的rVWF预混的50IU/kgrFVIII(Advate))汇总的AUC_0-96h/剂、AUC_0-∞/剂、MRT、CL、T_1/2，和Vss。将描述统计学(中值和范围)用于汇总随着时间而变化的VWF:RCo、VWF:Ag、VWF:CB和FVIII水平。

安全性主要终点包括：治疗相关AE的发生率。安全性主要终点的分析包括发生治疗相关AE的受试者的数量和百分比。对治疗相关AE的数量和比率制表。

药代动力学次要终点包括：FVIII、VWF:RCo、VWF:Ag和VWF:CB的体内回收率(IVR)和增量恢复(IR)。药代动力学次要终点的分析包括按受试者确定FVIII、VWF:RCo、VWF:Ag和VWF:CB的IVR和IR并按中值和范围汇总。

安全性次要终点包括：抑制性和总结合抗VWF抗体的产生、FVIII抑制性抗体的产生、中国仓鼠卵巢(CHO)蛋白抗体的产生、小鼠免疫球蛋白G(IgG)和rFurin抗体的产生、血栓形成事件的发生率。

安全性次要终点通过将发生SAE的受试者的数量和SAE的数量制表而进行分析。此外，对发生治疗相关AE的受试者的数量以及治疗相关AE的数量和比率针对血栓形成事件、抑制性和总结合抗VWF抗体、FVIII抑制性抗体、中国仓鼠卵巢(CHO)蛋白抗体、小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体和rFurin抗体进行细分。

所有AE的列表按受试者标识、年龄、性病、不良事件首选用语及报告用语、持续时间、严重程度、严重性、采取的措施、结果、因果评估、发生日期、停止日期以及治疗AE的药物或非药物疗法展示。提供了AE的总览表，从而展示出AE的数量、发生AE的受试者的数量以及受试者在总和中按严重性及与治疗的关系相应的百分比。另外的汇总表按与治疗相关的系统器官类和首选用语展示了AE的总数(轻度、中度、重度)。

未进行该研究的正式样本大小计算。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例性目的，并且本领域的技术人员将想到其各种修改或更改，而这些修改或更改将落在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请据此整体以引用方式并入以用于所有目的。

Claims

1.在治疗冯·威利布兰德病或甲型血友病的方法中应用的重组冯·威利布兰德因子(rVWF)，其中所述rVWF为高分子量VWF多聚体组合物，其包含至少40％的VWF十聚体或更高级的多聚体，并且向所述受试者一天不超过一次施用rVWF。

2.根据权利要求1所述的rVWF，其中将所述rVWF通过用弗林蛋白酶处理而体外成熟。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的rVWF，其中重组冯·威利布兰德因子(rVWF)的应用使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯·威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中所述rVWF具有比血浆源冯·威利布兰德因子更高的比活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的rVWF，其中所述rVWF的比活性为约20-150mU/μg，约30-120mU/μg。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的rVWF，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少50％的VWF十聚体或更高级的多聚体，更优选所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少60％的VWF十聚体或更高级的多聚体，最优选所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少70％的VWF十聚体或更高级的多聚体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的rVWF，其中向所述受试者每剂施用1.0IU/kgVWF:RCo至150IU/kg VWF:RCo，优选向所述受试者每剂施用2.0IU/kg VWF:RCo至50IU/kgVWF:RCo，更优选向所述受试者每剂施用5.0IU/kg VWF:RCo至40IU/kg VWF:RCo，更优选向所述受试者每剂施用10IU/kg VWF:RCo至20IU/kg VWF:RCo。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的rVWF，其中每隔一天不超过一次、每三天不超过一次、每四天不超过一次、每五天不超过一次、每周不超过两次、每周不超过一次、每两周不超过一次、或每月不超过一次施用rVWF。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的rVWF，其中所述rVWF通过多次施用而施用。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的rVWF，其中所述应用是用于治疗冯·威利布兰德病3型的方法。

10.在治疗冯·威利布兰德病或甲型血友病的方法中应用的根据权利要求1至8中任一项所述的rVWF和因子VIII(FVIII)，其中所述方法包括向所述受试者共同施用重组冯·威利布兰德因子(rVWF)和重组因子VIII(rFVIII)。

11.根据权利要求10所述的rVWF和FVIII，其中所述FVIII是血浆源FVIII。

12.根据权利要求10所述的rVWF和FVIII，其中所述FVIII是重组FVIII。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的rVWF和FVIII，其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IU FVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间，优选其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IU FVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间，更优选其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IU FVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间，最优选其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IU FVIII:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为约3:4。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的rVWF和FVIII，其中所述rVWF通过在中国仓鼠卵巢(CHO细胞培养)中表达而产生，优选所述rFVIII和rVWF通过在相同的细胞培养中表达而产生。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的rVWF和FVIII，其中以单一组合物的形式一起施用所述rVWF和rFVIII。

16.根据权利要求10-15中任一项所述的rVWF和FVIII，其中所述应用是用于治疗冯·威利布兰德病3型的方法。

17.在治疗冯·威利布兰德病或甲型血友病的方法中使用的组合物，其中所述组合物包括根据权利要求1-8中任一项所述的rVWF。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物进一步包括FVIII。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述FVIII是血浆源FVIII。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述FVIII是重组FVIII。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中所述rVWF通过在中国仓鼠卵巢(CHO细胞培养)中表达而产生，优选所述rFVIII和rVWF通过在相同的细胞培养中表达而产生。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中所述应用是用于治疗冯·威利布兰德病3型的方法。