CN106950324B - 一种黄芪建中丸指纹图谱的构建方法 - Google Patents
一种黄芪建中丸指纹图谱的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，步骤包括：1)取毛蕊异黄酮、芒柄花素和芍药苷各适量，制备得到对照品甲醇溶液；2)取黄芪建中丸制备成供试品甲醇溶液；3)取对照品及供试品甲醇溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，在超高效液相(UPLC)色谱条件下进行梯度洗脱，得到指纹图谱；液相色谱仪操作条件为：流动相由乙腈和0.1％的甲酸水溶液组成，流动相流速为0.3ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。构建的指纹图谱能够清晰地反映黄芪建中丸各有效成分的特征峰出峰位置，可用于黄芪建中丸的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱，具体属于一种黄芪建中丸指纹图谱的构建方法。
背景技术
随着现代药物分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式，中药指纹图谱是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材及中药复方制剂质量的优良，它在原药材的栽培、引种、中成药生产工艺的规范和优化，产品质量标准的制定等方面提供全方位的质量保证。建立中药指纹图谱能较为全面的反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述及评价。
黄芪建中丸由黄芪、白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣煎水取汁，外加蜂蜜组成。现代临床多用于治疗脾虚性慢性萎缩性胃炎和十二指肠溃疡等胃粘膜损伤所致疾病。目前关于黄芪建中丸整体的化学成分以及其药效物质基础研究较少。现有技术中，大部分是采用液相色谱的方法将原料成分如黄芪甲苷、芍药苷进行含量测定进行质量控制，但是这种方法仅仅检测了相应的原料组成，而真正发挥药效的并非个别化学成分，是其整体复方中各成分的总和，因此构建黄芪建中丸的指纹图谱，从整体的角度对其进行质量控制十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，该指纹图谱构建方法可用于黄芪建中丸的质量控制，具有耗时短、方法简单、操作方便的优势。
本发明提供的一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮、芒柄花素和芍药苷各适量，加甲醇适量制成每1ml含40.8μg毛蕊异黄酮、34.8μg芒柄花素和32.7μg芍药苷的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取黄芪建中丸，加液氮迅速研磨至粉末，精密称取0.1g，加1ml甲醇，称重，超声提取20min，补足容积重量，13000rpm，4℃离心15min，将上清液0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；
(3)测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，在超高效液相(UPLC)色谱条件下进行梯度洗脱，得到指纹图谱；
所述超高效液相色谱的条件：色谱柱为HSS T3柱；流动相为体积比为1:99-99:1的乙腈和0.1％的甲酸水溶液进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为30℃；紫外检测波长：254nm；
所述梯度洗脱条件：
0分钟时，流动相为1％的乙腈和99％的甲酸水溶液；
2分钟时，流动相为10％的乙腈和90％的甲酸水溶液；
3分钟时，流动相为30％的乙腈和70％的甲酸水溶液；
8分钟时，流动相为35％的乙腈和65％的甲酸水溶液；
13分钟时，流动相为40％的乙腈和60％的甲酸水溶液；
14分钟时，流动相为50％的乙腈和50％的甲酸水溶液；
17分钟时，流动相为70％的乙腈和30％的甲酸水溶液；
19分钟时，流动相为90％的乙腈和10％的甲酸水溶液；
21分钟时，流动相为99％的乙腈和1％的甲酸水溶液。
所述建立的指纹图谱中包括25个特征峰，其中峰6为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素，峰17为芍药苷。
与现有技术相比本发明的有益效果：
本发明提供的黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，耗时短、操作方便、方法简单。所构建的指纹图谱可用于黄芪建中丸的质量控制，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性,又减少了为质量达标而人为处理的可能性。该方法能更加全面、科学评价黄芪建中丸的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
附图说明
图1是黄芪建中丸UPLC指纹图谱
图2是混合对照品UPLC指纹图谱
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。这些实施例仅用来说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的的色谱仪为Waters Acqulity UPLC。
实施例1 供试品溶液的制备
1、供试品取样量
分别称取黄芪建中丸研磨好的粉末0.1g、0.15g和0.2g，加1ml甲醇溶液，称重，超声处理(功率250W，频率25kHz)20min，13000rpm离心15min，取上清经0.22μm微孔滤膜过滤制备供试品。
结果表明，取样量0.1g、0.15g和0.2g时，图谱(未示出)中差异不大，考虑色谱柱的保护，选择0.1g作为供试品取样量。
2、提取溶剂的考察
分别用水和甲醇为提取溶剂，采用超声提取法，对同一批供试品进行了提取溶剂考察。
结果表明，水提取液色谱图(未示出)中前2min出现响应值太高的色谱峰影响其他色谱峰显示，故选择甲醇为提取溶剂。
实施例2 色谱条件与系统适应性试验考察
1、指纹图谱检测方法的选择
文献调研表明，黄芪建中丸中所含主要成分为黄酮类及三萜皂苷类物质，均有较好的紫外吸收，因此选用UPLC-UV检测方法进行指纹图谱研究。
2、指纹图谱检测波长的选择
文献研究表明，黄芪建中丸七味药中所含有效成分紫外吸收波长特征各不相同，因此采用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描。
结果表明，在254nm波长处信息量大且色谱峰容易观察，因此最后确定254nm为黄芪建中丸指纹图谱的检测波长。
3、柱流速考察
按照UPLC色谱条件，分别考察了不同的柱流速(0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min)。
结果表明，0.3ml/min的流速比0.2ml/min分离度较好一些，与0.4ml/min的分离度差别不大，故选择柱流速为0.3ml/min。
4、流动相空白考察
在UPLC色谱条件下，不进样单运行程序考察21min的色谱图，未检测到任何色谱峰(图未示出)，结果表明流动相空白对指纹图谱检测无影响。
5、洗脱梯度考察
因黄芪建中丸中包含有多种极性的化合物，因此先从如下所示的均匀梯度进行考察，然后根据出峰情况进行调整，最后优选出最适宜的洗脱梯度。
0分钟时，流动相为1％的乙腈和99％的甲酸水溶液；
2分钟时，流动相为10％的乙腈和90％的甲酸水溶液；
4分钟时，流动相为20％的乙腈和80％的甲酸水溶液；
6分钟时，流动相为30％的乙腈和70％的甲酸水溶液；
8分钟时，流动相为40％的乙腈和60％的甲酸水溶液；
10分钟时，流动相为50％的乙腈和50％的甲酸水溶液；
12分钟时，流动相为60％的乙腈和40％的甲酸水溶液；
14分钟时，流动相为70％的乙腈和30％的甲酸水溶液；
16分钟时，流动相为80％的乙腈和20％的甲酸水溶液；
18分钟时，流动相为90％的乙腈和10％的甲酸水溶液；
20分钟时，流动相为99％的乙腈和1％的甲酸水溶液。
实施例3 一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮，芒柄花素和芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇适量制成每1ml含40.8μg毛蕊异黄酮、34.8μg芒柄花素和32.7μg芍药苷的混合对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：取一颗黄芪建中丸，加液氮迅速研磨至粉末，精密称取0.1g，加1ml甲醇，称重，超声提取(功率250W，频率25kHz)20min，补足容积重量，13000rpm，4℃离心15min，将上清液0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
(3)测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，在超高效液相色谱条件下进行梯度洗脱，得到指纹图谱。
所述超高效液相色谱的条件：色谱柱为HSS T3柱；流动相梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为30℃；紫外检测波长：254nm。
所述流动相梯度洗脱条件：
0分钟时，流动相为1％的乙腈和99％的甲酸水溶液；
2分钟时，流动相为10％的乙腈和90％的甲酸水溶液；
3分钟时，流动相为30％的乙腈和70％的甲酸水溶液；
8分钟时，流动相为35％的乙腈和65％的甲酸水溶液；
13分钟时，流动相为40％的乙腈和60％的甲酸水溶液；
14分钟时，流动相为50％的乙腈和50％的甲酸水溶液；
17分钟时，流动相为70％的乙腈和30％的甲酸水溶液；
19分钟时，流动相为90％的乙腈和10％的甲酸水溶液；
21分钟时，流动相为99％的乙腈和1％的甲酸水溶液。
所述建立的指纹图谱中包括25个特征峰，特征峰的具体信息如表1所示，其中峰6为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素，峰17为芍药苷。
表1黄芪建中丸指纹图谱特征峰信息表
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | ％面积 | 高度 | 开始时间 | 结束时间 | 最大吸光度 |
| 1 | 1.014 | 4596523 | 40.63 | 381445 | 0.936 | 1.448 | 1.65384 |
| 2 | 4.087 | 287120 | 2.54 | 41668 | 3.926 | 4.240 | 0.19376 |
| 3 | 7.993 | 130059 | 1.15 | 12929 | 7.782 | 8.196 | 0.07731 |
| 4 | 8.263 | 53651 | 0.47 | 9223 | 8.216 | 8.393 | 0.01103 |
| 5 | 8.503 | 97041 | 0.86 | 14841 | 8.431 | 8.648 | 0.01516 |
| 6 | 9.054 | 219631 | 1.94 | 28239 | 8.923 | 9.218 | 0.06239 |
| 7 | 9.928 | 117206 | 1.04 | 11446 | 9.809 | 10.261 | 0.02050 |
| 8 | 10.732 | 1279825 | 11.31 | 109095 | 10.339 | 10.970 | 0.59122 |
| 9 | 11.728 | 82797 | 0.73 | 9637 | 11.580 | 11.914 | 0.00964 |
| 10 | 12.672 | 48707 | 0.43 | 5311 | 12.563 | 12.917 | 0.03534 |
| 11 | 13.082 | 324489 | 2.87 | 17315 | 12.936 | 13.448 | 0.01769 |
| 12 | 13.670 | 877338 | 7.75 | 92469 | 13.566 | 13.980 | 0.09388 |
| 13 | 15.513 | 133535 | 1.18 | 16795 | 15.416 | 15.611 | 0.01715 |
| 14 | 16.942 | 76383 | 0.68 | 8106 | 16.840 | 17.154 | 0.01033 |
| 15 | 17.378 | 76870 | 0.68 | 10078 | 17.249 | 17.494 | 0.01141 |
| 16 | 17.562 | 395718 | 3.50 | 38003 | 17.098 | 18.028 | 0.06544 |
| 17 | 17.960 | 54795 | 0.48 | 6562 | 17.728 | 18.203 | 0.00796 |
| 18 | 18.193 | 111765 | 0.99 | 16012 | 18.083 | 18.518 | 0.02452 |
| 19 | 18.747 | 724650 | 6.40 | 98372 | 18.632 | 19.027 | 0.12316 |
| 20 | 19.165 | 164050 | 1.45 | 16939 | 19.067 | 19.381 | 0.02730 |
| 21 | 19.476 | 77493 | 0.68 | 16490 | 19.294 | 19.571 | 0.02640 |
| 22 | 19.729 | 84370 | 0.75 | 8914 | 19.579 | 19.874 | 0.00942 |
| 23 | 19.924 | 91964 | 0.81 | 18428 | 19.881 | 20.048 | 0.02264 |
| 24 | 20.222 | 37222 | 0.33 | 8301 | 20.066 | 20.403 | 0.01513 |
| 25 | 20.701 | 767260 | 6.78 | 107748 | 20.500 | 20.935 | 0.13896 |
以上所述，仅为本发明较佳的实施例，本发明的保护范围不应局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其方案构思加以等同替换及改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮、芒柄花素和芍药苷各适量制成对照品甲醇溶液；
(2)供试品溶液的制备：取黄芪建中丸，加液氮迅速研磨至粉末，精密称取0.1g，加1ml甲醇，称重，超声提取20min，补足容积重量，13000rpm，4℃离心15min，将上清液0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；
(3)测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，在超高效液相(UPLC)色谱条件下进行梯度洗脱，得到指纹图谱，图谱中包括25个特征峰，其中峰6为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素，峰17为芍药苷；
所述超高效液相色谱的条件：色谱柱为HSS T3柱；流动相进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为30℃；紫外检测波长：254nm；
所述流动相梯度洗脱条件：
0分钟时，流动相为1％的乙腈和99％的甲酸水溶液；
2分钟时，流动相为10％的乙腈和90％的甲酸水溶液；
3分钟时，流动相为30％的乙腈和70％的甲酸水溶液；
8分钟时，流动相为35％的乙腈和65％的甲酸水溶液；
13分钟时，流动相为40％的乙腈和60％的甲酸水溶液；
14分钟时，流动相为50％的乙腈和50％的甲酸水溶液；
17分钟时，流动相为70％的乙腈和30％的甲酸水溶液；
19分钟时，流动相为90％的乙腈和10％的甲酸水溶液；
21分钟时，流动相为99％的乙腈和1％的甲酸水溶液。
2.如权利要求1所述指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述对照品甲醇溶液每1ml含40.8μg毛蕊异黄酮、34.8μg芒柄花素和32.7μg芍药苷。
3.如权利要求1所述的方法构建的指纹图谱在黄芪建中丸的质量检测中的应用。
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