CN106893752A

CN106893752A - 一种孕甾-1,4双键-11酮-21-醋酸酯类化合物的制备方法

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Publication number: CN106893752A
Application number: CN201510966589.5A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 王福军; 高占元
Original assignee: Tianjin Jinyao Group Co Ltd
Current assignee: Tianjin Jinyao Group Co Ltd
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2017-06-27

Abstract

本发明为了更好的完成对于具有孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯的基本结构化合物的制备，发现通过调整生物脱氢反应、11位羟基氧化酮基的反应，从而可以高收率按照以下反应路线得出孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯的基本结构化合物。

Description

一种孕甾-1,4双键-11酮-21-醋酸酯类化合物的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种孕甾化合物的制备方法，该类孕甾化合物具有孕甾-1,4双键-11酮-21-醋酸酯的基本结构。

背景技术：

在对甾体激素的合成研究中人们发现，分子结构的化学修饰，如某些基团的引入可以大大增加药物的疗效，减少副作用，甚至能使药物产生不同种类的疗效。抗炎甾体结构在C1,2位置导入双键后，能成倍地提高其抗炎活性，泼尼松与可的松的结构仅相差1,2位双键，但抗炎活性相差4倍。在抗炎甾体结构中引入的C一11含氧功能团就是药物具有抗炎和糖代谢作用所必不可缺的。在21位引入醋酸酯的基团，有助于人体吸收。

事实上，1，4双键、11酮、21-醋酸酯是目前抗炎甾体激素的常用基本结构。制备具有上述基团的化合物既可以成为供临床使用的药物，也可以成为制备甾体药物的中间体

鉴于孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯为甾体药物的基本结构，其合成方法较多。目前现有技术中制备含有孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯基本结构化合物的方法，主要是采用生物发酵和化学合成相结合的方式来实现。

例如CN201410747521中公开了，通过化合物Ⅰ为起始原料，依次经过醚化、次甲基化、氢化、发酵脱氢、上溴及脱溴反应，制得6a-甲基泼尼松龙，问题在于该方法中反应过程中一直存在21位醋酸酯，在反应过程中容易出现副反应，产生21位羟基的杂质，而国内主要使用的是含有21位醋酸酯的产品，如醋酸泼尼松，醋酸地塞米松等，如果需要维持21位醋酸酯，则会造成中间体或反应步骤的浪费。

国内生产该类常用的起始原料为来源于双烯的霉菌氧化物，它先经过C11位氧化后再经过C1、2位脱氢，之后再在侧链进行修饰得到21位酯化。此工艺的难点在于C11位羰基和C1、2位双键的引入，由于在C11位周围，没有活性功能基团对其起影响，常规条件下很难将C11位羟基氧化成C11位羰基；而且沃式氧化物经过C11位氧化后，下一步的C1、2位脱氢很难进行，存在着收率低、成本高的问题。也有直接用醋酸可的松作起始原料，进行C1、2位的生物发酵，得到醋酸泼尼松。此工艺的缺点在于生物发酵的收率低，导致成本高。

文献CN201310594449.0报道了一条制备泼尼松的化学合成路线，它经氧化反应、氰基取代反应、硅烷氧基保护反应、分子内亲核取代反应和酯化反应而制得，此工艺需要用到的氰化试剂为剧毒品，需要用到的碱金属试剂为易爆燃品，不利于工业化大生产。

文献CN201510076695公开了一种氧化体系，可将化合物11α,17α-二羟基孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮的C11位羟基氧化成C11位羰基，此氧化方法据称成本较低，容易操作，污染小，适合工业化大生产。

由于1，2位生物发酵脱氢反应受到甾体结构上11位、6位、21位等多个基团的影响，涉及底物溶解速率、溶解物结晶速率、产物抑制以及酶反应动力学等情况，不同底物转化率和收率差距较大，对于底物的要求较为苛刻，限制了制备路线的设计。而将11α-羟基氧化为11-酮基关键在于底物的21位不能有醋酸酯，这是由于存在21-位醋酸酯会使得该结构随着氧化反应遭到破坏，CN201210070704和CN201510076695等多个文献均证明了这一点。同时使用常规的醋酸、三氧化铬进行氧化，反应较为强烈，而如果孕甾的其他位置存在双键则也易被氧化，产生杂质，三氧化铬反应后会产生极为细小的氢氧化铬，呈现泥状，极为难易滤除，更重要的是由于无法根除铬离子，造成氧化产物的颜色为绿色和重金属超标，反复精制也无法去除。

技术人员面对了这样的困局：

1，2位双键生物发酵引入要求21位没有醋酸酯基团，避免过低的底物溶解速率和脱氢酶对于21位醋酸酯的破坏，同时也要求11位不能是酮基，以避免生物脱氢转化率的下降。

众所周知，酮基具有强烈的吸电子作用，其的α位的氢易被卤素取代，当20位、11位同时存在酮基时，相应的α位的氢也会易出现卤代反应，造成杂质增加。21位卤代置换反应则出于避免21位卤代反应杂质的出现，要求11位避免出现酮基，尽可能避免卤代物杂质增加后期精制困难等问题。

11α-羟基氧化为11-酮基又要求底物的21位不能有醋酸酯，避免醋酸酯随着氧化反应遭到破坏。

因此现有工艺对于C11位羰基和1，2位双键的引入均存在不尽如人意的地方。

近年来科研人员努力地方向更多的是对于单步工艺进行革新和改良，但是囿于传统经验思维，目前还开展工艺路线的调整目前进展较小。

发明内容

为了更好的完成对于具有孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯的基本结构化合物的制备，我们通过不断地研究，发现通过调整生物脱氢反应、11位羟基氧化酮基的反应，从而可以高收率按照以下反应路线得出孕甾-1，4双键-11酮-21-醋酸酯的基本结构化合物。

一种式1化合物的制备方法，其特征在以式2化合物为原料，经过以下步骤制备式1化合物，

其中

R₁＝H或OH，

R₂＝H、OH或甲基，

R₃＝H或卤素，

R₄＝H或甲基，

R1，R2＝或即16，17位之间是双键或环氧，

步骤a：以式2化合物为原料，通过简单节杆菌生物发酵得到化合物3，

步骤b：以化合物3为原料，通过对21位甲基进行碘化或氯化后进行置换反应得到化合物4，

步骤c：以化合物4为原料，通过对11位羟基进行氧化，得到式1化合物。

上述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝H或甲基，

R₃＝H、F或Cl，

R₄＝H或甲基。

上述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝α或β甲基，

R₃＝F，

R₄＝H。

上述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝H，

R₃＝H，

R₄＝甲基。

上述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝H，

R₃＝H，

R₄＝H。

上述的制备方法，其特征在于步骤a为化合物2通过简单节杆菌进行生物发酵，得到化合物3，优选简单节杆菌为Arthrobacter Simple ATCC 21032。

上述的制备方法，其特征在于步骤b为化合物3通过在液态氯代烷中加入氯化钙、氧化钙和碘液反应后得到化合物3的21位碘化物，再通过与醋酸钾在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应得到化合物4。

上述的制备方法，其特征在于步骤b为化合物3通过在有机溶媒、NO供体的条件下与酸、可以将NO氧化为NO2的氧化剂、碘或溴化氢反应生成化合物3的21位碘化物或溴化物，再通过与醋酸钾在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应得到化合物4，NO供体为亚硝酸盐、亚硝酸的6个碳以内的酯中的一种或几种，氧化剂为氧气、空气、H₂O₂。

上述的制备方法，其特征在于步骤c为化合物4在液态氯代烷中与二甲基亚砜、活化剂进行反应，反应后加入碱将PH调节至8.5-10，得到化合物1，活化剂为二环己基碳二亚胺、草酰氯、醋酸酐、三氟醋酸酐、五氧化二磷、二氯磷酸苯酯、乙酰氯、苯甲酰氯、卤气或N-氯代琥珀酰亚胺中的一种或几种。优选活化剂为二氯化磷酸苯酯、N-氯代琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中的一种或几种。

优选液态氯代烷为二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷。

将式(1)化合物粉碎或以溶剂全溶或半溶，投入已培养好节杆菌或简单节杆菌的发酵罐中进行生物脱氢反应，转化后提取得到脱氢物即化合物(2)。所述溶剂选自但不仅限于甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的一种或几种，所述粉碎投料的式(1)化合物优选微粉化为D₉₀(90％通过粒径)≤100μm的微粒。优选粉碎投料时向发酵液中加入促溶剂，所述的促溶剂为优选吐温-80。

化合物(1)的投料浓度为≤4％(相对于发酵液容积)；优选投料浓度为1％～3％，发酵温度30～34℃，优选促溶剂加入量为0.01～3％(v/v)。生物脱氢反应时间30～72小时。

生物脱氢反应结束后终止反应，优选采用将发酵液升温至70～90℃而使菌体灭活的方法，终止反应后用优选采用溶媒萃取发酵液的形式提取脱氢产物。所述萃取用溶媒优选乙酸乙酯。

所述生物脱氢所使用简单节杆菌(拉丁命名：Arthrobacter simplex)优选以下几种菌株：AS 1.754、AS 1.94*(均由中国科学院微生物研究所提供)，更优选ArthrobacterSimple ATCC 21032。

所述的生物脱氢反应可以采用以下发酵工艺：

斜面培养—一级培养—一级培养—加入化合物(1)发酵进行生物脱氢反应—终止反应。

物发酵工艺还可采用任何公知的生物发酵工艺方法，如参考《生物合成药物学》(化学工业出版社，2000年出版，褚志义主编；666～675页)中公开的生物发酵工艺。

所述的生物脱氢所用的培养基优选采用以下配比：

斜面培养基(％)：葡萄糖1.3，酵母膏1.3，琼脂2.0，以及余量的蒸馏水，pH7.0-7.2，用于斜面培养

发酵培养基(％)：葡萄糖1.0，酵母膏0.16，KH₂PO₄0.25，玉米浆1，以及余量的蒸馏水，pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物脱氢反应中。

实施例

底物转化率的测定：转化率用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质量的百分比来表示。采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈：水(体积比)＝60：40的溶于流速为1.5mL/min。采用面积归一法计算底物转化率。

斜面培养：将斜面培养基分装于15mL的试管中，灭菌30min后摆成斜面。斜面于37℃培养箱中放置2d，观察无染菌情况即可进行接种。接种后斜面于30℃下培养2d，然后置于4℃冰箱中保存。

一级培养：从生长良好的简单节杆菌斜面上取菌体，接入装有30ml培养基的250mL三角瓶中，30～34℃，180r/min振荡培养，24小时

二级培养：将完成一级培养后的发酵液以5％-10％接种量接入装有150ml培养基的1000mL二级种子培养三角瓶中，以同样的条件进行二级培养，二级培养时间为24小时

生物脱氢：将二级培养得后得到的发酵液按照与二级培养相同的接种量接入5L发酵罐中，培养基量为3L，培养温度30～34℃，搅拌转速180r/min，通气量1.5L/min，培养24小时后加入底物进行生物脱氢反应。

本发明实施例中底物与溶剂的比例为重量体积比。所述“溶于”是指全溶或半溶，只与底物和溶剂本身的物理性质有关，底物投料浓度为底物与5L发酵罐中培养基的重量体积。

实施例1

反应通式：

反应过程：将简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC 21032依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为28-32℃，将微粉化的底物化合物2投入5L发酵罐中，投料浓度为3-4％，反应温度为28-32℃，当底物剩余低于4％以下时，认为完成发酵。反应完成后升温至70℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将乙酸乙酯浓缩，测得底物转化率，后重结晶法利用甲醇得到化合物3。

对照实施例1

反应通式、反应过程同实施例1，但菌种有所改变

实施例2

反应通式：

合成工艺：

将5g化合物3投入反应器中，加入甲醇50ml，降温到20℃，加入3g氧化钙，1-2小时滴加碘液(碘液配制办法：9g碘投入200ml单口瓶中，加入2g无水氯化钙、30ml甲醇，搅拌2小时溶解)完毕，保温至无原料点后加入冰水400ml，搅拌析出固体，过滤获得到碘化物，不需干燥，再将直接投入另一反应器中，加入200ml丙酮，20ml冰乙酸，10g醋酸钾，加热到60℃反应至无原料点后，减压浓缩丙酮，加入冰水400ml搅拌析出物，过滤得到固体，80℃干燥得到化合物4。

实施例3

反应通式：

反应过程：在-15℃100ml氯代烷中加入10g化合物4(含量为97.4％，最大杂质<2％)、二甲基亚砜30g、活化剂进行反应，通过高效液相检测底物含量<1％后，加入有机碱将PH调节至8.5-10，减压浓缩至无氯代烷，降温至0℃，搅拌下稀释与100ml0℃水中，过滤，得到化合物1。

对照实施例3

反应过程同实施例3，但化合物4’的1,2位为单键。

Claims

1.一种式1化合物的制备方法，其特征在以式2化合物为原料，经过以下步骤制备式1化合物，

其中

R₁＝H或OH，

R₂＝H、OH或甲基，

R₃＝H或卤素，

R₄＝H或甲基，

R1，R2＝或即16，17位之间是双键或环氧，

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝H或甲基，

R₃＝H、F或Cl，

R₄＝H或甲基。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于式1化合物取代基为：

R₁＝OH，

R₂＝α或β甲基，

R₃＝F，

R₄＝H。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤a为化合物2通过简单节杆菌进行生物发酵，得到化合物3。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b为化合物3通过在液态氯代烷中加入氯化钙、氧化钙和碘液反应后得到化合物3的21位碘化物，再通过与醋酸钾在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应得到化合物4。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b为化合物3通过在有机溶媒、NO供体的条件下与酸、可以将NO氧化为NO2的氧化剂、碘或溴化氢反应生成化合物3的21位碘化物或溴化物，再通过与醋酸钾在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应得到化合物4，NO供体为亚硝酸盐、亚硝酸的6个碳以内的酯中的一种或几种，氧化剂为氧气、空气、H₂O₂。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c为化合物4在液态氯代烷中与二甲基亚砜、活化剂进行反应，反应后加入碱将PH调节至8.5-10，得到化合物1，活化剂为二环己基碳二亚胺、草酰氯、醋酸酐、三氟醋酸酐、五氧化二磷、二氯磷酸苯酯、乙酰氯、苯甲酰氯、卤气或N-氯代琥珀酰亚胺中的一种或几种。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于简单节杆菌为Arthrobacter SimpleATCC 21032。

9.如权利要求5、7所述的制备方法，其特征在于液态氯代烷为二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于活化剂为二氯化磷酸苯酯、N-氯代琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺中的一种或几种。