CN106680270A - 一种检测鸟氨酸的比色分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测鸟氨酸的比色分析方法，属于分析化学检测技术领域。本发明将邻苯二甲醛、巯基乙酸和鸟氨酸构建了三元反应显色体系；在酸性条件下邻苯二甲醛、巯基乙酸和鸟氨酸反应生成枣红色水溶性物质。据此，建立了鸟氨酸含量与枣红色水溶性产物在496 nm处吸光度线性相关性，实现液态体系中鸟氨酸含量的测定。该方法能够快速、选择性检测溶液中鸟氨酸，检测限低至4.75 μg/mL，为鸟氨酸的检测提供了简单有效的手段。该方法具有反应速度快、选择性好、检测成本低廉、操作简便等特点，适宜作为液体样品中鸟氨酸含量检测。

Description

一种检测鸟氨酸的比色分析方法
技术领域
本发明涉及一种快速、高选择性检测鸟氨酸的比色分析方法。
背景技术
鸟氨酸【Ornithine，ORT】，是一种碱性氨基酸。虽然它不属于组成蛋白质的20种氨基酸，但其存在于短杆菌酪肽，短杆菌肽S等抗菌性肽中。在鸟氨酸循环中，鸟氨酸与氨及CO2结合生成瓜氨酸，瓜氨酸再与一分子的氨生成精氨酸，精氨酸水解产生尿素，并重新生成鸟氨酸。因此，鸟氨酸循环也被称为尿素循环，是排尿素动物肝脏中由鸟氨酸循环形成的尿素是氨基氮的最终排泄产物。
目前，鸟氨酸的检测方法主要有氨基酸分析仪法、柱前衍生-液相色谱法、液相色谱-质谱法、离子色谱法、酶分析法、毛细管电泳法、芯片电泳法等。这些方法检测灵敏度尽管较高，但样品前处理去除内生干扰物干扰等操作步骤复杂，检测过程耗时，检测费用较高，且对操作要求严格不利于广泛应用。因此，寻找新的灵敏度高、选择性好并在此基础上建立操作简单，灵敏可靠，能够满足鸟氨酸检测要求的新方法十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高选择性检测鸟氨酸的比色分析方法。
本发明利用邻苯二甲醛、巯基乙酸、鸟氨酸在酸性环境反应生成红色水溶性物质，实现比色法观察和检测含有不同浓度的鸟氨酸体系。
一种检测鸟氨酸的比色分析方法，其特征在于具体步骤为：
A、将邻苯二甲醛和巯基乙酸溶液预先充分混合均匀，形成溶液A；
B、用纯度大于99%的鸟氨酸配制不同浓度的标准溶液；
C、将上述不同浓度的鸟氨酸标准溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释后与溶液A混合均匀，在50-100℃水浴中反应3-10分钟，然后经紫外-可见光谱仪检测其496 nm处吸光度值变化，绘制鸟氨酸标准曲线；
D、向待测样品中添加不同浓度鸟氨酸标准溶液，按照步骤C操作得到最终反应溶液，测定在496 nm处的吸光度值，通过标准加入法计算待测样品中鸟氨酸含量及其加标回收率。
所述邻苯二甲醛和巯基乙酸用甲醇溶解，使用前放置12-24小时。
所述邻苯二甲醛和巯基乙酸的摩尔比为1：1。
所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-6.0。
本发明的检测原理：鸟氨酸与摩尔比为1：1的邻苯二甲醛和巯基乙酸在酸性环境下生成红色水溶性衍生物，通过检测反应后溶液的吸光度对鸟氨酸定量检测。各组份反应物混合时，溶液的紫外-可见吸收光谱图见图1，由图可知只有三种反应物共存时才能生成红色产物。
本发明的选择性：通过对反应溶液颜色的不同指示其对鸟氨酸的识别，选择性实验结果见图2，由图可知本方法对鸟氨酸检测具有好的选择性，可实现常见氨基酸中鸟氨酸高选择性可视化-比色鉴别。
本发明检测鸟氨酸的线性范围为5 μg/mL-20000 μg/mL，检测限4.75 μg/mL。
本发明的有益效果：本发明发展了一种高选择性、可视化、比色方法，可实现鸟氨酸的快速识别和检测，具有较高的实用价值，为鸟氨酸高选择性检测提供便利。
附图说明
图1为不同反应物共存时溶液的紫外-可见吸收光谱图，其中a为邻苯二甲醛、b为巯基乙酸、c为巯基乙酸+鸟氨酸、d为邻苯二甲醛+鸟氨酸、e为邻苯二甲醛+巯基乙酸、f为邻苯二甲醛+巯基乙酸+鸟氨酸。
图2为本发明所述可视化-比色检测方法对鸟氨酸检测的选择性。
图3 为不同浓度鸟氨酸在反应体系中生成物的颜色变化图。
图4为不同浓度鸟氨酸（μg/mL）条件下体系的紫外-可见吸收光谱图。
图5为鸟氨酸响应的标准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
（1）鸟氨酸标准曲线绘制
A、将20 μL，0.2 M邻苯二甲醛和20 μL，0.2 M巯基乙酸加入离心管中混合均匀；
B、将A步骤所得溶液与不同浓度鸟氨酸标准溶液用50 mM，pH=5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释混匀；
C、以水为溶剂，按照表1浓度范围配制系列标准溶液，然后按照B步骤操作将所得混合溶液于60℃热水浴中恒温反应5 分钟，此时，混合溶液呈现出枣红色（见图3）。采用紫外-可见光谱仪进行溶液吸光度值测定，以吸光度A496作为纵坐标，鸟氨酸浓度作为横坐标，绘制鸟氨酸的标准曲线，（不同鸟氨酸浓度时，溶液的紫外-可见吸收光谱图，见图4），其线性关系见表2。表2结果表明响应信号与鸟氨酸浓度有显著线性相关性（图5）；以空白溶液10次测定结果标准偏差的3倍为信噪比，得出检测限，实验结果见表2，结果表明本方法检测限较低。以13.5 μg/mL标准溶液为例，进行重复平行6次测定，计算测定的结果，实验结果见表3，结果表明本方法重复性良好。
表1 系列鸟氨酸标准溶液
表2 线性相关性和检测限
表3 平行测定的重复性
（2）样品检测
取氨基酸复方注射液10 μL作为样品按照标准样品处理和检测过程进行分析，计算测定结果及加标回收率和RSD，实验结果见表4。
表4 回收率
注：复方氨基酸中不含有鸟氨酸。

Claims (4)

1.一种检测鸟氨酸的比色分析方法，其特征在于具体步骤为：
A、将邻苯二甲醛和巯基乙酸溶液预先充分混合均匀，形成溶液A；
B、用纯度大于99%的鸟氨酸配制不同浓度的标准溶液；
C、将上述不同浓度的鸟氨酸标准溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释后与溶液A混合均匀，在50-100℃水浴中反应3-10分钟，然后经紫外-可见光谱仪检测其496 nm处吸光度值变化，绘制鸟氨酸标准曲线；
D、向待测样品中添加不同浓度鸟氨酸标准溶液，按照步骤C操作得到最终反应溶液，测定在496 nm处的吸光度值，通过标准加入法计算待测样品中鸟氨酸含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述邻苯二甲醛和巯基乙酸用甲醇溶解，使用前放置12-24小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述邻苯二甲醛和巯基乙酸的摩尔比为1：1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-6.0。
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