CN101509913A - 一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法，其中，基酸含量检测包括：1)制备多个浓度的氨基酸混合标准溶液，用氨基酸自动分析仪检测，绘制标准曲线图；2)将样品水解后用与步骤1)同样的方法检测，得到检测结果A；将检测结果A与标准曲线图比对，得各种氨基酸含量；回收实验方法为：将蛋白质纯品或标准小麦营养粉用与步骤2)中样品相同的方法水解和检测，得到检测结果B，将检测结果B与标准曲线图比对，得到蛋白质纯品或标准小麦营养粉中氨基酸含量实测值，实测值与蛋白质纯品或标准小麦营养粉中氨基酸标准含量的比值即为各种氨基酸检测的回收率。本方法解决了用传统加标回收方法无法进行验证该类氨基酸检测方法的难题。

Description

一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法

技术领域

本发明涉及一种乳及乳制品的检测方法，尤其涉及一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法，属于分析技术领域。

背景技术

自1958年氨基酸自动分析方法出现，经过40多年的发展，氨基酸的分析方法得到不断的改进和完善，由最初的阳离子交换色谱分离——柱后茚三酮衍生化方法中茚三酮的不稳定，到目前的试剂由氮气作为保护气，延长了茚三酮溶液与茚三酮缓冲液的稳定周期，氨基酸组成分析在生物化学、食品科学、微生物学、临床诊断等领域有广泛的应用。

蛋白质的氨基酸组成分析是一个相对复杂的分析过程，它包括两个步骤：即多肽的完全水解并游离出所有的氨基酸残基以及游离氨基酸定性和定量色谱分析。研究表明，水解操作的不正确是测定结果错误的主要原因。虽然多肽的氨基酸组成分析向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展的技术改进已有一些报道，但还没有一种单独适用于所有残基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出现，所以水解仍然是整个分析中最难控制的步骤。温度、时间、水解试剂及添加剂等对水解的完全程度均有影响。多肽水解可以是化学方法也可以是酶解方法。化学水解又包括酸性水解和碱性水解。

回收率是衡量检测方法和操作准确度的一个重要指标，其越接近100％，即表明实验方法的准确度越好。对于乳品中氨基酸检测，运用传统的加标回收的方式，即在一定量的样品中加入已知的不同浓度的标准溶液(一般加入标准物质的量为待测样品量的0.5～2.0倍)，通过(实测加标值-样品实测值)与理论值(即标样值)的比值来表示回收率的状况，不能成功。因为标样中部分游离氨基酸在高温及酸(碱)的作用下会破坏、分解而损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法，其克服了传统加标回收实验方法无法检验上述氨基酸检测方法的回收率的困难。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法，所述氨基酸含量检测以外标法检测，具体来说包括：

1)制备多个不同浓度的氨基酸的混合标准溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制各种氨基酸含量与检测结果之间的标准曲线图；

2)将样品水解后用与步骤1)同样的方法进行检测，得到检测结果A；

3)将步骤2)中的检测结果A与所述的标准曲线图比对，得到样品中各种氨基酸含量；

4)上述步骤中使用的检测设备为氨基酸自动分析仪。

其中，所述回收实验方法包括：

将蛋白质纯品或小麦营养粉用与步骤2)中样品相同的方法水解和检测，得到蛋白质纯品或标准小麦营养粉的检测结果B，将检测结果B与所述标准曲线图比对，得到蛋白质纯品或标准小麦营养粉中各种氨基酸含量的实测值，所述实测值与所述蛋白质纯品中各种氨基酸标准含量的比值即为各种氨基酸检测的回收率。蛋白质含量大于90％的一类单纯蛋白质，称为蛋白质纯品。

优选的，蛋白质纯品选自牛血清蛋白、溶菌酶、酪蛋白、核糖核酸酶中的一种。

本发明中，氨基酸混合标准溶液中的氨基酸选自天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸中的一种或几种。

优选的，上述氨基酸混合标准溶液中，脯氨酸的浓度为4nmol/20uL，其它氨基酸的浓度为2nmol/20uL。

优选的，上述样品水解的方法为酸水解，特别是盐酸水解，具体的说，其水解方法为：取牛奶样品1.0g左右或奶粉30～50mg于水解管中，加入10～15ml浓度为6mol/l的盐酸后，用漩涡混合器混合，使样品溶解；置于液氮或干冰中冷冻3～5min，然后抽真空至7Pa(≤5×10^-2mm汞柱，指盛放样品的耐压水解管内大气压强)或充氮气后封口，再将水解管置于108～110℃下恒温干燥箱内水解22-24小时。

样品水解后进一步还经过如下处理：冷却后开管、用高纯水定容至50ml、过滤、取1ml的滤液置于旋转蒸发器或浓缩器中赶酸，用0.02mol/l盐酸稀释、利用超声波混合均匀，经0.22μm滤膜过滤，即得到待测溶液。

优选的，赶酸的方法为在50～80℃，优选60℃下挥发赶酸，必要时可加水反复2～3次。

上述用0.02mol/l盐酸稀释为，对于牛奶样品制备的滤液，稀释4～5倍，对于奶粉样品制备的滤液，稀释2倍。

上述氨基酸分析仪利用在弱酸性溶液中，茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物(茚二酮胺)在570nm处有最大吸收，脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有最大吸收，茚三酮与氨基酸反应后的颜色变化来检测氨基酸的含量。

氨基酸检测利用无机酸水解时，常使用盐酸为催化剂，盐酸水解的优点是水解彻底，除了色氨酸遭到破坏外，几乎能使全部氨基酸以L-型形式存在，不引起外消旋作用。在水解过程中，蛋白质的分子是逐步降解的，巨大的胶性高分子变成游离氨基酸需要有一定的时间，当绝大部分蛋白质水解成氨基酸及少量的小肽时，此时水解率达到最高峰。但对于酸水解而言，水解率在达到高峰后，继续延长水解时间，水解率则下降，这是由于已生成的部分氨基酸在高温及酸的破坏下分解所致。如果采用传统的加标回收方法，在样品中直接加入游离的氨基酸标准溶液，则在样品中的蛋白质水解率达到高峰之前，部分所加入的氨基酸就会在高温及酸的破坏下分解，因而不能得出正确的回收率。蛋白质含量大于90％的一类单纯蛋白质，称谓蛋白质纯品。蛋白质纯品本身蛋白质含量高，而乳及乳制品中蛋白质含量在3.0％-3.5％，从蛋白质的结构、性质上来说，两者没有区别，蛋白质本身是巨大胶性蛋白高分子，所以在检测乳样样品和蛋白质纯品处理(水解、赶酸、上机测定)过程相同，不会向传统加标回收方法那样因部分氨基酸被破坏而影响回收率结果。

本发明的氨基酸含量检测的回收实验的方法具有如下优点：

1)运用传统的酸水解方法，通过衍生化的间接分析法，操作简单、结果准确和可靠，重现性好，能同时分析17中氨基酸的含量，包括8种必需氨基酸、4种半必需氨基酸和5种非必需氨基酸。

2)灵敏度高。检出限仅为3p mol/ul能够满足国际及国内对氨基酸含量的检测要求。

2)解决了用传统加标回收方法无法进行验证该类方法的一大难题，既满足了实验要求，也验证了方法的可行性。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：

图1是本发明的实施例中的17种氨基酸标准样品的色谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示电压响应信号强度，单位为mv。

图2是本发明的实施例1中纯牛奶的17种氨基酸的色谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示电压响应信号强度，单位为mv。

图3是本发明的实施例2中婴幼儿配方奶粉的17种氨基酸的色谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示电压响应信号强度，单位为mv。

图4是本发明的实施例1中酪蛋白粉的17种氨基酸的色谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示电压响应信号强度，单位为mv。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。

实施例1 检测纯牛奶中17种氨基酸的含量及回收实验。

1.纯牛奶中氨基酸含量的检测：

(1)制备氨基酸混合标准溶液。

取氨基酸混合标液0.4ml(日本味之素公司生产，在0.1mol/L HCl溶液中各种氨基酸混合标液，其浓度为2.50μmol/ml，其中脯氨酸是5.0μmol/ml)，用0.02mol/L盐酸溶液溶解并定容至10ml，配制成2n mol/20uL(2纳摩尔每20微升)氨基酸混合标准工作液，其中脯氨酸为4n mol/20uL。

(2)样品的水解制备：

(2.1)准确称取混合均匀的纯牛奶1.027g于水解管中，加入10～15ml浓度为6mol/l的HCl后，用旋涡混合器混样使其溶解，置于液氮或干冰中冷冻3～5min，然后抽真空至7Pa(≤5×10^-2mm汞柱，指盛放样品的耐压水解管内大气压强)或充氮气后封口，将水解管放在108～110℃恒温干燥箱内水解22～24小时。

(2.2)冷却、开管，用高纯水定容到50mL容量瓶中、混匀、用定量滤纸过滤，取1mL的滤液置50mL小烧杯中，放置到电热板上进行浓缩至干(赶酸)，赶酸温度50～80℃，(温度太低，则耗时；温度太高，则容易飞溅，样品有损失现象)，把握赶酸温度为60℃正适宜。加水重复蒸干2～3次，用0.02mol/l HCl将样品稀释4～5倍、利用超声波混合均匀，经0.22μm滤膜过滤，即得到上机测试液，待用。

(2.3)氨基酸自动分析仪(日立L-8900型)测定条件：

仪器分析条件 分离柱：

410×150mm；树脂：日立2622号(分析用)

             除氨柱：

410×120mm；日立2650号(除氨用)

             缓冲液泵：流速0.425ml/min，压力80～120kg/cm²

             茚三酮泵：流速0.30ml/min，压力15～30kg/cm²

             仪器程序设计55min标准程序。

(2.4)上机测定

用外标法测定，即：用已知不同含量的氨基酸标样系列等量进样分析，然后做出检测结果(即响应信号)与氨基酸含量之间的标准曲线(如图1所示)。定量分析样品时，在测标准曲线的相同条件下进等量的待测上机测试液，从色谱图上测出峰高或峰面积，得到检测结果A，将检测结果A与标准曲线比对，即可得出样品的含量。本实施例中，可由仪器自动计算出纯牛奶试样中氨基酸含量测定纯牛奶试样测定液的氨基酸含量。各种氨基酸依次出峰图谱见如图2所示。

(2.5)结果计算：

按下式计算：

$X=\frac{C\×1/20\×F\×V\×M\×100}{m\×{10}^9}$

X------样品中氨基酸含量，单位为g/100g；

C------上机测试液中氨基酸含量，单位为纳摩尔每20微升(n mol/20ul)；

F------稀释倍数；

M------各氨基酸的分子量；

V------水解后样品定容体积；

m------样品质量，单位为克(g)；

10⁹------将样品含量由ng转换成g的系数。

17种氨基酸分子量：天门冬氨酸(Asp)133.1、苏氨酸(Thr)119.1、丝氨酸(Ser)105.1、谷氨酸(Glu)147.1、脯氨酸(Pro)115.1、甘氨酸(Gly)75.1、丙氨酸(Ala)89.1、胱氨酸(Cys)121.2缬氨酸(Val)117.1、蛋氨酸(Met)149.2、异亮氨酸(Ile)131.2、亮氨酸(Leu)131.2、酪氨酸(Tyr)181.2、苯丙氨酸(Phe)165.2、组氨酸(His)155.2、赖氨酸(Lys)146.2和精氨酸(Arg)174.2。

(2.6)检测结果如下：(单位：g/100g)

 

名称	Asp	Thr	Ser	Glu	Gly	Ala	Cys	Val	Met
										结果	0.351	0.217	0.267	0.852	0.089	0.158	0.014	0.126	0.116
名称	Ile	Pro	Leu	Tyr	Phe	Lys	His	Arg
										结果	0.206	0.478	0.409	0.221	0.214	0.405	0.062	0.168

2.回收实验：

准确称取酪蛋白粉0.010g于水解管中，按与上述样品处理相同的方法处理该酪蛋白粉(科瑞乳业生产的食用级干酪素)后，利用上述氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量，各种氨基酸依次出峰图谱见图4，所测结果如下表所示：

酪蛋白粉水解后，各种氨基酸的回收率结果及FAO值

备注：FAO值----蛋白质中各氨基酸残基与其的百分比

可以看出，各种氨基酸的回收率在70％～151％之间，FAD值在0.34％～20.62％之间，从而表明本申请方法测定氨基酸含量准确度很高，该回收试验方法在酸水解法处理条件下事实可行。

实施例2 检测奶粉中17种氨基酸的含量及回收实验。

1.不同奶粉中17种氨基酸含量的检测：

(1)制备氨基酸混合标准溶液。

取氨基酸混合标液0.4ml(日本味之素公司生产，在0.1mol/L HCl溶液中各种氨基酸混合标液，其浓度为2.50μmol/ml，其中脯氨酸是5.0μmol/ml)，用0.02mol/L盐酸溶液溶解并定容至10ml，配制成2n mol/20uL氨基酸混合标准工作液，其中脯氨酸为4n mol/20uL。

(2)样品的水解制备：

(2.1)分别准确称取均匀的全脂奶粉0.0302g和婴幼儿配方奶粉0.0508g于水解管中，加入10～15ml浓度为6mol/l的HCl后，用旋涡混合器混样使其溶解，置于液氮或干冰中冷冻3～5min，然后抽真空至7Pa(≤5×10-2mm汞柱，指盛放样品的耐压水解管内大气压强)或充氮气后封口，将水解管放在108～110℃恒温干燥箱内水解22～24小时。

(2.2)冷却后开管、用高纯水分别定容到50mL容量瓶中、混匀、用定量滤纸过滤，取1mL的滤液置50mL小烧杯中，放置到电热板上进行浓缩至干(赶酸)，赶酸温度50～80℃，(温度太低，则耗时；温度太高，则容易飞溅，样品有损失现象)，把握赶酸温度为60℃正适宜。加水重复蒸干2～3次，用0.02mol/l HCl溶液将样品各自稀释2倍、利用超声波混合均匀，经0.22μm滤膜过滤，即得到上机测试液，待用。

(2.3)氨基酸自动分析仪(日立L-8900型)测定条件：

仪器分析条件 分离柱：

410×150mm；树脂：日立2622号(分析用)

             除氨柱：

410×120mm；日立2650号(除氨用)

             缓冲液泵：流速0.425ml/min，压力80～120kg/cm²

             茚三酮泵：流速0.30ml/min，压力15～30kg/cm²

             仪器程序设计55min标准程序

(2.4)上机测定

用外标法测定，即：用已知不同含量的氨基酸标样系列等量进样分析，然后做出检测结果(即响应信号)与氨基酸含量之间的标准曲线(如图1所示)。定量分析样品时，在测标准曲线的相同条件下进等量的待测上机测试液，从色谱图上测出峰高或峰面积，得到检测结果A，将检测结果A与标准曲线比对，即可得出样品的含量。本实施例中，可由仪器自动计算出奶粉试样中氨基酸含量测定奶粉样测定液的氨基酸含量。各种氨基酸依次出峰图谱见如图2所示。各种氨基酸依次出峰图谱如图3所示。

(2.5)结果计算：

按下式计算：

$X=\frac{C\×1/20\×F\×V\×M\×100}{m\×{10}^9}$

X------样品中氨基酸含量，单位为g/100g；

C------上机测试液中氨基酸含量，单位为纳摩尔每20微升(n mol/20ul)；

F------稀释倍数；

M------各氨基酸的分子量；

V------水解后样品定容体积；

m------样品质量，单位为克(g)；

109------将样品含量由ng转换成g的系数。

(2.6)全脂奶粉检测结果如下：(单位：g/100g)

 

名称	Asp	Thr	Ser	Glu	Gly	Ala	Cys	Val	Met
										结果	2.004	1.142	1.408	4.227	0.449	0.743	0.093	1.124	0.423
名称	Ile	Leu	Tyr	Phe	Lys	His	Arg	Pro
										结果	0.930	1.786	1.333	1.036	2.259	0.254	0.962	0.295

(2.7)婴幼儿配方奶粉检测结果如下：(单位：g/100g)

 

名称	Asp	Thr	Ser	Glu	Gly	Ala	Cys	Val	Met
										结果	2.125	1.207	1.579	4.314	0.421	0.769	1.023	1.246	0.578
名称	Ile	Leu	Tyr	Phe	Lys	His	Arg	Pro
										结果	1.012	1.824	1.369	1.140	2.354	0.231	0.958	0.342

2.回收实验：

称取小麦营养粉0.1012g于水解管中，按与上述样品处理相同的方法处理该小麦营养粉(国家标准物质中心所购)后，利用上述氨基酸分析仪测定各氨基酸的含量，所测回收率结果如下表所示：

GBW(E)100010-小麦营养粉水解后，各种氨基酸的回收率情况如下：

 

各种氨基酸	小麦营养粉测定回收率％
		Thr苏氨酸	101
Ser丝氨酸	106
		Glu谷氨酸	101
Pro脯氨酸	93
		Gly甘氨酸	95
Ala丙氨酸	100
		Met蛋氨酸	98
Ile异亮氨酸	96
		Leu亮氨酸	100
Tyr酪氨酸	101
		Phe苯丙氨酸	111
Lys赖氨酸	97
		His组氨酸	104
Arg精氨酸	117

备注：该物质只能测14种氨基酸的回收率。

以上各种氨基酸的回收率在93％～117％之间，从而表明本申请方法测定氨基酸含量准确度很高。

实施例3 传统加标回收率对比实验

向含已知氨基酸的牛奶样品中分别加入不同量的氨基酸混合标准溶液(与实施例1中所用氨基酸混合标准溶液相同)，使该牛奶样品中添加的氨基酸含量分别为0.1n mol/ul、0.2n mol/ul、1n mol/ul三个梯度(脯氨酸含量加倍)，按照实施例1的方法水解处理样品后测定氨基酸的含量，每个样品平行测定5次，计算回收率：

回收率＝(加混合标准溶液后实测值-样品实测值)/混合标准溶液理论值。

结果如下：

 

各种各种氨基氨基酸	加0.1n.mol/ul标液(回收率％)	加0.2n.mol/ul标液(回收率％)	加1n.mol/ul标液(回收率％)
				Asp天门冬氨酸	17.4	5.35	-1.93
Thr苏氨酸	7.2	1.6	-0.61
				Ser丝氨酸	8.9	1.7	-1.18
Glu谷氨酸Pro脯氨酸	89.338.6	32.2511.26	-8.261.23
				Gly甘氨酸	1.6	-0.25	-0.29
Ala丙氨酸	4	0.15	0.03
				Cys胱氨酸	-0.9	-0.15	-0.11
Val缬氨酸	15.5	5.85	-1.03
				Met蛋氨酸	3.6	0.5	-0.8
Ile异亮氨酸	21.2	1.75	-0.25
				Leu亮氨酸	48.7	4.45	-0.21
Tyr酪氨酸	-2.5	-0.95	0.11
				Phe苯丙氨酸	10.6	1.65	-1.12
Lys赖氨酸	6.8	2.85	0.45
				His组氨酸	4.7	1.00	-0.31
Arg精氨酸	48.5	48.35	6.43

从上表可以看出，各种氨基酸的回收率在-8.26％～89.3％之间，且随着标准氨基酸含量的增加，回收率呈下降趋势，最后达到负值，因为以上试验1运用传统的加标回收的方式，在一定量的样品中加入已知的标准溶液的不同浓度，(一般加入标准物质的量应为待测样品量的0.5--2.0倍，)通过(实测加标值-样品实测值)与理论值(标样值)的比值来表示回收率的状况，由于酸水解过程中加所加入的标准溶液中的氨基酸遭到破坏，导致不能检出正确的回收率。由试验结果也可以看出，传统的加标回收实验方法不能适用。

除实施例1中的酪蛋白粉和小麦营养粉外，牛血清蛋白、溶菌酶等蛋白质纯品，均为含量大于90％的单纯蛋白质，可以水解成单个的氨基酸，也可以用上述回收实验。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种乳及乳制品中氨基酸含量检测的回收实验方法，所述氨基酸含量检测的方法包括：

1)制备多个不同浓度的氨基酸的混合标准溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制各种氨基酸含量与检测结果之间的标准曲线图；

2)将样品水解后用与步骤1)同样的方法进行检测，得到检测结果A；

3)将步骤2)中的检测结果A与所述的标准曲线图比对，得到样品中各种氨基酸含量；

4)上述步骤中使用的检测设备为氨基酸自动分析仪；

其特征在于，所述回收实验方法包括：

将蛋白质纯品或标准小麦营养粉用与步骤2)中样品相同的方法水解和检测，得到蛋白质纯品或标准小麦营养粉的检测结果B，将检测结果B与所述标准曲线图比对，得到蛋白质纯品或标准小麦营养粉中各种氨基酸含量的实测值，所述实测值与所述蛋白质纯品中各种氨基酸标准含量的比值即为各种氨基酸检测的回收率。

2.如权利要求1所述的回收实验方法，其特征在于：所述蛋白质纯品选自牛血清蛋白、溶菌酶、酪蛋白、核糖核酸酶中的一种。

3.如权利要求1或2所述的回收实验方法，其特征在于：所述步骤1)中的氨基酸混合标准溶液中的氨基酸选自天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸中的一种或几种。

4.如权利要求3所述的回收实验方法，其特征在于：所述氨基酸混合标准溶液中，脯氨酸的浓度为4n mol/20uL，其它氨基酸的浓度为2n mol/20uL。

5.如权利要求4所述的回收实验方法，其特征在于：所述样品水解的方法为用酸水解。

6.如权利要求5所述的回收实验方法，其特征在于：所述酸为盐酸。

7.如权利要求6所述的回收实验方法，其特征在于：所述水解方法为：取牛奶样品1g或奶粉样品30～50mg，加入10～15ml浓度为6mol/l的盐酸后，混合使其溶解；置于液氮或干冰中冷冻3～5min，然后抽真空至7Pa或充氮气后密封，再于108～110℃下恒温水解22-24小时。

8.如权利要求7所述的回收实验方法，其特征在于，所述样品水解后进一步经过如下处理：冷却、用高纯水定容至50ml、过滤、取1ml的滤液赶酸，用0.02mol/l盐酸稀释、利用超声波混合均匀，经0.22μm滤膜过滤，即得到上机测试液。

9.如权利要求8所述的回收实验方法，其特征在于：所述赶酸的方法为高温温度在(50～80)℃条件下挥发，加水反复2～3次，优选60℃。

10.如权利要求9所述的回收实验方法，其特征在于：所述用0.02mol/l盐酸进行稀释，对于牛奶样品制备的滤液，稀释4～5倍，对于奶粉样品制备的滤液，稀释2倍。

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