CN113156000B - 一种水解氨基酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水解氨基酸的检测方法，属于检测技术领域。本发明所述水解氨基酸的检测方法首先将待测氨基酸在特定条件下进行充分酸化水解，随后使用氧化性强且无毒的过氧化氢或过碳酸钠对水解氨基酸氧化为特定产物，避免传统方法检测过程中待测样品中部分特定氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)因部分降解而失准，或者使用有毒、腐蚀设备及污染环境的试剂；所述检测方法对设备要求低，操作简单，检测准度高，检测时间大大缩减，适用于常规水解氨基酸及特殊氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)的检测。

Description

一种水解氨基酸的检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种水解氨基酸的检测方法。
背景技术
我国国家标准《GB 5009.124-2016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》规定了氨基酸分析仪法测定16种水解氨基酸的方法，所述方法的检测步骤为：样品经酸水解后，取水解液真空干燥并复溶后，经分离柱分离后与茚三酮衍生检测含量。该检测方法虽满足一般水解氨基酸的检测要求，需要使用有毒试剂)苯酚，且对于如胱氨酸等这类具有重要功效的必要氨基酸的含量检测则因在检测过程中胱氨酸的部分氧化出现测量不准且处理时长过长的缺陷(其中酸水解长达22h，真空干燥需要超过2h)。
在此基础上，现有技术1为国家标准《GB/T 15399-2018饲料中含硫氨基酸的测定离子交换色谱法》规定了氨基酸分析仪法测定含硫氨基酸的方法，所述方法的步骤为：样品经过甲酸氧化和酸酸水解后，取水解液真空干燥并复溶后，经分离柱分离后与茚三酮衍生检测含量。该方法相对于GB 5009.124-2016因进行了氧化处理，使氨基酸在检测时较为稳定，不会被氧化；然而该氧化处理会影响某些氨基酸(如酪氨酸)的测定，仅限于含硫氨基酸种类的检测。此外，所用过甲酸使用时需要现配现用，氧化后需要使用终止剂，且该终止剂为剧毒试剂(如氢溴酸)，最终需去除，但是去除方法多为真空去除(该物质会生成溴水)，存在一定的设备腐蚀及环境污染，而所述过甲酸也具有强烈刺激性气味。
现有技术2为公开文献《蛋白质酸水解液用过甲酸氧化处理对胱氨酸的测定》，该文献中公开了一种胱氨酸的测试方法，所述方法步骤为：样品经酸水解后，1份测常规水解氨基酸，1份经过甲酸氧化真空干燥再复溶后测其中的胱氨酸含量。该公开技术与现有技术1相似，所用氧化剂(过甲酸)有强烈刺激性气味，需在通风橱操作；该方案在采用真空干燥除去过甲酸，等待时间长，容易腐蚀真空设备和污染环境；该方案需进行2次上机测试才能获得常规水解氨基酸和胱氨酸的结果。
现有技术3为国家标准《中国药典》2015年版中第一部《阿胶含量测定中测试方法》：样品经高温酸水解后，经蒸干复溶后与PITC衍生，经液相分离柱分离后检测含量，然而该公开技术仅限于检测阿胶中脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸及丙氨酸的含量。
终上所述，目前并没有一种水解氨基酸的检测方法，可用于准确检测多种水解氨基酸(包括如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)，且所述方法检测效率快，使用试剂绿色无毒。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种水解氨基酸的检测方法，该方法具有检测效率高，操作步骤简单以及使用试剂绿色无毒、检测范围广，准度高的特点。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种水解氨基酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品水解：将待测样品与盐酸溶液混合并在130～170℃中保温1h以上，降温，得水解后待测混合液；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得水解后待测混合液加入氧化剂并在50～100℃下反应5～120min，降温，用pH为2～2.5的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；所述氧化剂为过氧化氢溶液或过碳酸钠；
(3)样品检测：配制浓度为10～50mg/L的待测标准溶液，将步骤(2)所得氧化后待测混合液进行定性定量检测；所述待测标准溶液经过步骤(2)所述处理条件处理。
本发明所述水解氨基酸的检测方法，首先将待测氨基酸在特定条件下进行充分酸化水解，随后使用氧化性强且无毒的过氧化氢或过碳酸钠对水解氨基酸氧化为特定产物，避免传统方法检测过程中待测样品中部分特定氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)因部分降解而失准，或者使用有毒、腐蚀设备及污染环境的试剂；所述检测方法对设备要求低，无需真空或通风设备，操作步骤简单；检测准度高，检测速度大大提高，相比现有技术长达20h以上的检测时间，本发明所述检测方法耗费时间仅为其8～15％，适用于常规水解氨基酸及特殊氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)的检测。
优选地，步骤(1)所述待测样品的质量与盐酸溶液的体积之比为10～100mg：4～10mL；所述盐酸溶液中盐酸与水的体积比为1:0.8～1.2；所述盐酸为质量浓度36～38％的浓盐酸。
所述条件下待测样品与盐酸溶液混合更加均匀且水解程度更加彻底。
优选地，所述水解后待测混合液经过定容，所述定容的条件为：用水定容至50～200mL容量瓶中。
经过定容后待测样品中各水解氨基酸更加均匀，后续检测更加准确。
优选地，步骤(2)所述氧化剂为过氧化氢溶液时，所述溶液中过氧化氢的质量浓度为20～40％，所述水解后待测混合液与过氧化氢溶液的体积比为1：0.01～0.1。
优选地，步骤(2)所述氧化剂为过碳酸钠时，所述水解后待测混合液的体积与过碳酸钠质量的体积质量之比为1mL：20～100mg。
更优选地，所述步骤(1)所得水解后待测混合液与氧化剂混合时的添加量为10％过碳酸钠0.5～1.5mL。
所述氧化剂的添加量可确保待检测的水解氨基酸转化为特定的氧化产品，避免在检测时因外部影响氧化而使结果失准。
优选地，步骤(2)中，所述水解后待测混合液在加入氧化剂后加入调节剂调节溶液pH为-0.5～1。
更优选地，所述调节剂为体积浓度为50％的盐酸溶液。
更优选地，所述加入调节剂后的溶液中盐酸的摩尔浓度为1～2mol/L。
优选地，步骤(2)所述降温后加入维生素C以去除氧化剂。
当实际检测时间较长时，待测混合液中可以因少量存在的氧化成分导致变质，需要加入少量的维生素C避免样品的进一步氧化。
优选地，所述待测标准溶液的制备方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在50～100℃下反应5～120min，降温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液。
优选地，所述待测标准溶液的制备方法为：将胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在50～100℃下反应5～120min，降温，加入已定值的水解氨基酸标准溶液，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液。
优选地，所述待测标准溶液包括待测标准溶液A和待测标准溶液B；所述测标准溶液A的制备方法为：将胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在50～100℃下反应5～120min，降温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液A；所述待测标准溶液B的制备方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液B。
优选地，步骤(3)所述定性定量检测时胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸采用对应的氧化产物进行定性定量。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种水解氨基酸的检测方法，所述方法首先将待测氨基酸在特定条件下进行充分酸化水解，随后使用氧化性强且无毒的过氧化氢或过碳酸钠对水解氨基酸氧化为特定产物，避免传统方法检测过程中待测样品中部分特定氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)因部分降解而失准或者使用有毒、腐蚀设备及污染环境的试剂；所述检测方法对设备要求低，无需真空或通风设备，操作步骤简单；检测准度高，检测速度大大提高，相比现有技术长达20h以上的样品前处理时间，本发明所述检测方法耗费时间仅为其8～15％，适用于常规水解氨基酸及特殊氨基酸(如胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸)的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1所述水解氨基酸的检测方法结果分析图；
图2为本发明实施例1所述水解氨基酸的检测方法经加标回收后的结果分析图；
图3为本发明实施例2所述水解氨基酸的检测方法结果分析图；
图4为本发明实施例3所述水解氨基酸的检测方法结果分析图；
图5为本发明实施例4所述不同氧化温度对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图6为本发明实施例5所述不同氧化剂添加量(30％过氧化氢溶液)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图7为本发明实施例5所述不同氧化剂添加量(10％过碳酸钠溶液)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图8为本发明实施例6所述不同酸碱度对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图9为本发明实施例7所述氧化时间(50℃)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图10为本发明实施例7所述氧化时间(60℃)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图11为本发明实施例7所述氧化时间(70℃)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图12为本发明实施例7所述氧化时间(80℃)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图13为本发明实施例7所述氧化时间(90℃)对水解氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图14为本发明实施例8所述水解氨基酸的检测方法准确性的线性分析结果图；
图15为本发明实施例9所述氧化条件对各氨基酸的检测方法结果的影响分析图；
图16为本发明对比例1所述水解氨基酸的检测方法结果分析图；
图17为本发明对比例2所述水解氨基酸的检测方法结果分析图；
图18为本发明对比例2所述水解氨基酸的检测方法经加标回收后的结果分析图。
具体实施方式
若无特别说明，本发明实施例和对比例中所用原料均购自市场，所使用的仪器均为市购的普通型号。所述实施例和对比例中所用氨基酸分析仪为德国SYKAM氨基酸分析仪，型号S433D。所述实施例和对比例中使用的色谱条件如下：
分离柱：Cation Separation Column LCA K07/Li，4.6×150mm(或具同等性能的分离柱)；
除氨柱：Ammonia Filtration Column LCA K05/Li，4.6×100mm(或具同等性能的除氨柱)；
流动相梯度：
Figure BDA0002996849000000061
Figure BDA0002996849000000071
温度梯度：
Figure BDA0002996849000000072
显色剂：茚三酮溶液，起始时间0min，停止时间61min(可视情况设定)，流速0.15～0.25mL/min；
洗液：20％～40％异丙醇溶液或甲醇溶液；
反应器温度：130℃；
检测波长：570nm和440nm(脯氨酸采用440nm定性定量，其它氨基酸采用570nm定性定量)；
进样体积：50μL(可视情况设定，如10～100μL)；
图谱时间：65min(可视情况设定，如64～73min)。
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。
实施例1
本发明所述水解氨基酸的检测方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样品水解：将100mg玉米肽与10mL体积浓度为50％盐酸溶液混合于20mL水解管中，经过氮气吹扫30s后密封，并在150℃中保温1.5h，降温至室温，用水定容至50mL容量瓶中，得水解后待测混合液；所述盐酸溶液使用质量浓度为36～38％的浓盐酸与水混合配制而得；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得水解后待测混合液取1mL转移至25mL比色管中加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并在90℃下反应10min，降温至室温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
(3)样品检测：配制浓度约为10mg/L的待测标准溶液，将步骤(2)所得氧化后待测混合液和待测标准溶液导入氨基酸分析仪，将所得图谱扣除氧化剂图谱后，对水解氨基酸进行定性定量，其中胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸采用对应的氧化产物进行定性定量；
所述待测标准溶液包括待测标准溶液A和待测标准溶液B；所述测标准溶液A的制备方法为：将10mg胱氨酸、10mg蛋氨酸和10mg酪氨酸准确称量后，用0.1mol/L盐酸定容于50mL容量瓶中，取1mL转移至25mL比色管中加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并在90℃下反应10min，降温至室温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液A；所述待测标准溶液B的制备方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液B；。
测试结果如图1及表1所示。
表1
氨基酸 含量 氨基酸 含量
天冬氨酸 5.92％ 异亮氨酸 3.53％
苏氨酸 2.91％ 亮氨酸 14.81％
丝氨酸 4.20％ 酪氨酸 4.62％
谷氨酸 24.28％ 苯丙氨酸 4.65％
甘氨酸 2.20％ 组氨酸 1.42％
丙氨酸 8.77％ 赖氨酸 0.86％
胱氨酸 0.65％ 精氨酸 1.45％
缬氨酸 4.30％ 脯氨酸 8.35％
蛋氨酸 1.90％ —— ——
从表1及图1可知，各水解氨基酸均被检测，该方法对含有胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸的蛋白质样品的氨基酸定性定量具有真实性。
对所述样品进行加标回收，所述方法与本实施例上述水解氨基酸的检测方法所述步骤的区别仅在于，步骤(1)中的玉米肽原料中还加入约10mg胱氨酸、10mg蛋氨酸和10mg酪氨酸。测试结果如表2及图2所示。
表2
Figure BDA0002996849000000091
从表2及图2可知，本发明所述检测方法中胱氨酸、蛋氨酸及酪氨酸的加标回收率分别达到98％、98.5％和100.8％，满足方法学要求。
实施例2
本实施例与实施例1的差别仅在于，所述步骤(2)混合液降温至室温后，加入0.2mL5％的维生素C，再加入柠檬酸钠溶液定容。
所述检测方法及结果如实施例1
测试结果如图3及表3所示。
表3
Figure BDA0002996849000000092
Figure BDA0002996849000000101
从表3及图3可知，各水解氨基酸均被检测，该方法对含有胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸的蛋白质样品的氨基酸定性定量具有真实性，相比于实施例1其含量更高一些，说明维生素C的加入可使样品避免进一步氧化，最终检测结果更准确。
实施例3
本发明所述水解氨基酸的检测方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样品水解：将100mg螺旋藻与10mL体积浓度为50％盐酸溶液混合于20mL水解管中，经过氮气吹扫30s后密封，并在150℃中保温1.5h，降温至室温，用水定容至50mL容量瓶中，得水解后待测混合液；所述盐酸溶液使用质量浓度为36～38％的浓盐酸与水混合配制而得；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得水解后待测混合液取1mL转移至25mL比色管中加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并在90℃下反应10min，降温至室温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
(3)样品检测：配制浓度约为10mg/L的待测标准溶液，将步骤(2)所得氧化后待测混合液和待测标准溶液导入氨基酸分析仪，将所得图谱扣除氧化剂图谱后，对水解氨基酸进行定性定量，其中胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸采用对应的氧化产物进行定性定量；
所述待测标准溶液包括待测标准溶液A和待测标准溶液B；所述测标准溶液A的制备方法为：将10mg胱氨酸、10mg蛋氨酸和10mg酪氨酸准确称量后，用0.1mol/L盐酸定容于50mL容量瓶中，取1mL转移至25mL比色管中加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并在90℃下反应10min，降温至室温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液A；所述待测标准溶液B的制备方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液B；。
所述检测方法同实施例1。
测试结果如图4及表4所示。
表4
氨基酸 含量 氨基酸 含量
天冬氨酸 6.55％ 异亮氨酸 3.68％
苏氨酸 3.26％ 亮氨酸 5.98％
丝氨酸 2.73％ 酪氨酸 2.89％
谷氨酸 9.29％ 苯丙氨酸 3.05％
甘氨酸 3.38％ 组氨酸 1.17％
丙氨酸 5.15％ 赖氨酸 2.98％
胱氨酸 0.71％ 精氨酸 3.45％
缬氨酸 4.33％ 脯氨酸 2.52％
蛋氨酸 1.43％ —— ——
从表4及图4可知，各水解氨基酸均被检测，该方法对含有胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸的蛋白质不同样品的氨基酸定性定量均具有真实性。
实施例4
为验证本发明所述水解氨基酸的检测方法中氧化温度对特定氨基酸检测效果的影响，制备不同检测样品，具体步骤如下：
(1)将25mg胱氨酸、25mg蛋氨酸和25mg酪氨酸准确称量后，用纯水定容于50mL容量瓶中；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得溶液液取1mL转移至25mL比色管中，加入0.2mL体积浓度为50％的盐酸溶液后，加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并分别在50～90℃下反应10min，降温至室温，加入0.2mL 5％的维生素C，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
将各检测样品进行三种氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表5和图5所示，其中相对峰面积即为各氨基酸的峰面积÷最大峰面积×100％。
表5
Figure BDA0002996849000000121
从表5和图5可以看出，不同的氧化温度对各目标检测物质的相对峰面积影响较大，从图中可以看出，氧化时间一定时，需按实际情况决定氧化温度；当氧化时间较少(10min)时，其氧化温度需较高温度(70℃以上)才能保证检测准确性。
实施例5
为验证本发明所述水解氨基酸的检测方法中不同氧化剂的添加量对特定氨基酸检测效果的影响，制备不同检测样品，具体步骤如下：
(1)将25mg胱氨酸、25mg蛋氨酸和25mg酪氨酸准确称量后，用纯水定容于50mL容量瓶中；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得溶液液取1mL转移至25mL比色管中，加入0.2mL体积浓度为50％的盐酸溶液后，分别加入10～100μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并分别在90℃下反应10min，降温至室温，加入0.2mL 5％的维生素C，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
将各检测样品进行三种氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表6和图6所示，其中相对峰面积即为各氨基酸的峰面积÷最大峰面积×100％。
表6
Figure BDA0002996849000000122
Figure BDA0002996849000000131
将上述氧化剂替换为0.2～2mL的质量浓度为10％的过碳酸钠溶液，而所述过碳酸钠溶液添加前的盐酸溶液添加量分别对应替换为0.24mL、0.3mL、0.4mL、0.5ml和0.6mL(以保证酸碱度一致)，测试结果如表7和图7所示。
表7
Figure BDA0002996849000000132
从表中和图中可以看出，无论氧化剂选取过氧化氢溶液还是过碳酸钠，优选范围内的氧化剂添加量对三种水解氨基酸的相比峰面积检测结果影响不大，在优选范围内均可保证检测准确度。
实施例6
为验证本发明所述水解氨基酸的检测方法中氧化时溶液酸碱度对特定氨基酸检测效果的影响，制备不同检测样品，具体步骤如下：
(1)将25mg胱氨酸、25mg蛋氨酸和25mg酪氨酸准确称量后，用纯水定容于50mL容量瓶中；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得溶液液取1mL转移至25mL比色管中，加入0～0.5mL体积浓度为50％的盐酸溶液后(此时盐酸在溶液中的摩尔浓度为0～3mol/L)，分别加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并分别在90℃下反应10min，降温至室温，加入0.2mL 5％的维生素C，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
将各检测样品进行三种氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表8和图8所示，其中相对峰面积即为各氨基酸的峰面积÷最大峰面积×100％。
表8
Figure BDA0002996849000000141
从图8及表8可以明显看出，氧化过程中溶液的酸碱度对氧化程度的影响十分显著，当氧化剂为过氧化氢溶液时，使用pH调节剂盐酸对溶液进行调节，只有溶液中盐酸的摩尔浓度达到优选的1～2mol/L时，三种氨基酸的相对峰面积较大；但浓度持续变大时，酪氨酸的准确性又开始出现一定偏差。
实施例7
根据实施例4可知，氧化时间与氧化温度的多少均会协同影响氨基酸的氧化程度，为验证本发明所述水解氨基酸的检测方法中氧化时间对特定氨基酸检测效果的影响，本实施例制备不同检测样品，具体步骤如下：
(1)将25mg胱氨酸、25mg蛋氨酸和25mg酪氨酸准确称量后，用纯水定容于50mL容量瓶中；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得溶液液取1mL转移至25mL比色管中，加入0.2mL体积浓度为50％的盐酸溶液后，加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并分别在50～90℃下反应5～120min，降温至室温，加入0.2mL 5％的维生素C，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
将各检测样品进行三种氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表9～13和图9～13所示，其中相对峰面积即为各氨基酸的峰面积÷最大峰面积×100％。
表9
Figure BDA0002996849000000151
表10
Figure BDA0002996849000000152
表11
Figure BDA0002996849000000153
表12
Figure BDA0002996849000000154
Figure BDA0002996849000000161
表13
Figure BDA0002996849000000162
从图9～13及表9～13可看出，当选取氧化温度越低(50～70℃)，氧化所需时间越长，当氧化温度为50℃时，其氧化时间至少应该达到60min以上才能保证检测结果的准确性；当氧化温度达到60～70℃时，优选范围内的氧化时间对各氨基酸相对峰面积的影响不大，准确性均较高；当温度达到80～90℃时，过长的氧化时间反而会导致检测结果偏差变大：当温度达到80℃时，若氧化时间超过30min，酪氨酸的相对峰面积显著变小；而当其达到90℃时，氧化时间只有保持在20min内才能保证检测结果的准确性。
实施例8
本实施例采用线性方法检测所述水解氨基酸的检测方法的准确性，具体步骤为：
(1)将100mg胱氨酸、100mg蛋氨酸和100mg酪氨酸准确称量后，用体积浓度为50％的盐酸溶液定容于100mL容量瓶中，所得溶液液取1～10mL转移至20mL水解管中，加入体积浓度为50％的盐酸溶液至溶液达到10mL，密封并置于电热烘箱中150℃下保温1.5h，待恢复至室温后转移至50ml容量瓶中用纯水定容；所述盐酸溶液使用质量浓度为36～38％的浓盐酸与水混合配制而得；
(2)样品氧化：将步骤(1)所得溶液液取1mL转移至25mL比色管中，加入50μL质量浓度为30％的过氧化氢溶液并分别在90℃下反应10min，降温至室温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；
将各检测样品进行三种氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表14和图14所示。
表14
Figure BDA0002996849000000171
根据表14及相关计算结果，三种氨基酸的线性相关系数均大于0.995，即说明本发明所述检测方法符合方法学要求。
实施例9
为验证本发明所述水解氨基酸的检测方法中氧化条件对各氨基酸检测效果的影响，制备不同检测样品，具体步骤如下：
(1)待测混合液A制备：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得未氧化的待测混合液A；
(2)待测混合液B制备：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在90℃下反应10min，降温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后的待测混合液B；
将各检测样品进行氨基酸的定性定量检测，所述检测方法同实施例1。
测试结果如表15和图15所示。
表15
Figure BDA0002996849000000181
从表15和图15可以看出，在该氧化条件下，除了胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸之外，其它氨基酸的峰面积均未有显著偏差，即未被氧化；而胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸则全部被氧化。
对比例1
本对比例采用GB 5009.124-2016标准方法对实施例1相同的玉米肽进行水解氨基酸检测。测试结果如图16及表16所示。
表16
Figure BDA0002996849000000191
从表16可以清楚看出，使用对比例1所述方法的检测结果中，胱氨酸、蛋氨酸及酪氨酸的含量与本发明所述检测方法结果相比，检测偏差均达到5％以上，而胱氨酸的偏差高达125.8％，其余氨基酸的偏差则几乎均在5％以下，说明本发明所述检测方法相较于传统检测方法不仅检测准度更高，检测氨基酸的范围更广，且检测时间更短。
对比例2
本对比例所述水解氨基酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品氧化：将100mg玉米肽与1mL过甲酸溶液混合于10mL广口瓶中，冷冻氧化16h，待恢复至室温后，加入0.15mL 5％的维生素C终止氧化；
(2)样品水解：将上述溶液转移至于20mL水解管中，用10mL体积浓度为50％盐酸溶液少量多次润洗步骤(1)所用广口瓶后也转移至水解管中，密封；将水解管置于电热烘箱中110℃保温22h，待恢复室温后，转移至50mL容量瓶中并用纯水定容，得待测液；
(3)样品检测：配制浓度约为10mg/L的待测标准溶液，将步骤(2)所得氧化后待测混合液和待测标准溶液导入氨基酸分析仪，将所得图谱扣除氧化剂图谱后，对水解氨基酸进行定性定量，其中胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸采用对应的氧化产物进行定性定量；
所述待测标准溶液包括待测标准溶液A和待测标准溶液B；所述测标准溶液A的制备方法为：将10mg胱氨酸、10mg蛋氨酸和10mg酪氨酸准确称量后，用0.1mol/L盐酸定容于50mL容量瓶中，取1mL按步骤(1)～(3)方法处理后，得待测标准溶液A；所述待测标准溶液B的制备方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液B。
所述测试方法同实施例1。
测试结果如图17及表17所示。
表17
Figure BDA0002996849000000201
Figure BDA0002996849000000211
从表中可以看出，对比例2所述方法测试得到的胱氨酸、蛋氨酸等偏差较小，但酪氨酸偏差较大，达到60.9％。
对所述样品进行加标回收，所述方法同实施例1。测试结果如图18及表18所示。
表18
Figure BDA0002996849000000212
从表18及图18可知，对比例2所述检测方法中胱氨酸、蛋氨酸及酪氨酸的加标回收率分别为99.7％、95.2％和73.4％，酪氨酸的加标回收率不满足方法学要求。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种水解氨基酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品水解：将待测样品与盐酸溶液混合，经过氮气吹扫30s后密封，并在130~170℃中保温1h以上，降温，得水解后待测混合液；
（2）样品氧化：将步骤（1）所得水解后待测混合液加入氧化剂并在50~100℃下反应5~120min，降温，用pH为2~2.5的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得氧化后待测混合液；所述氧化剂为过氧化氢溶液或过碳酸钠；
（3）样品检测：配制浓度为10~50mg/L的待测标准溶液，将步骤（2）所得氧化后待测混合液进行定性定量检测；所述待测标准溶液经过步骤（2）所述处理条件处理。
2.如权利要求1所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述待测样品的质量与盐酸溶液的体积之比为100mg：4~10mL；所述盐酸溶液中盐酸与水的体积比为1:0.8~1.2；所述盐酸为质量浓度36~38%的浓盐酸。
3.如权利要求2所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，所述水解后待测混合液经过定容，所述定容的条件为：用水定容至50~200mL容量瓶中。
4.如权利要求1所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化剂为过氧化氢溶液时，所述溶液中过氧化氢的质量浓度为20~40%，所述水解后待测混合液与过氧化氢溶液的体积比为1：0.01~0.1。
5.如权利要求1所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述氧化剂为过碳酸钠时，所述水解后待测混合液的体积与过碳酸钠的质量之比为1mL：20~100mg。
6.如权利要求4或5所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述水解后待测混合液在加入氧化剂后加入调节剂调节溶液pH，所述调节剂为盐酸溶液，所述加入调节剂后的溶液中盐酸的摩尔浓度为1~2mol/L。
7.如权利要求1所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，所述待测标准溶液的制备方法为：将胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在50~100℃下反应5~120min，降温，加入已定值的水解氨基酸标准溶液，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液。
8.如权利要求1所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，所述待测标准溶液包括待测标准溶液A和待测标准溶液B；所述测标准溶液A的处理方法为：将胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中加入过氧化氢溶液或过碳酸钠并在50~100℃下反应5~120min，降温，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液A；所述待测标准溶液B的处理方法为：将已定值的水解氨基酸标准溶液取1mL转移至25mL比色管中，用pH为2.2的柠檬酸钠溶液定容至刻度，过滤，得待测标准溶液B。
9.如权利要求7所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，所述待测标准溶液中含有胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸的氧化产物。
10.如权利要求7或8所述的水解氨基酸的检测方法，其特征在于，步骤（3）所述定性定量检测时胱氨酸、蛋氨酸或酪氨酸采用对应的氧化产物进行定性定量。
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