CN106544385A - 胶原抗冻肽的分离方法 - Google Patents

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Abstract

一种胶原抗冻肽的分离方法，主要包括胶原蛋白的制备、胶原酶解复合物的制备和胶原抗冻肽的分离三个步骤，最终得到具有较高抗冻活性的胶原抗冻肽，其氨基酸全序列为Leu-Gly-Lue-Gly-Pro-Leu-Gly-Arg-Gly-Pro-Leu-Leu。该分离方法分离过程简单，成本低，易于实现规模化生产。

Description

胶原抗冻肽的分离方法
技术领域
本发明涉及生物工程，尤其涉及一种胶原抗冻肽的分离方法。
背景技术
食源性抗冻肽的来源，主要有天然食品中提取、酶解食物蛋白制备等。其中酶解蛋白制取抗冻肽具有制备条件温和、流程简单、过程便于控制等优势，已成为当前研究和实际生产的主要方法。然而，酶解得到的肽成分非常复杂，包括各种无活性肽段、目标肽以及大量盐分，因此需根据不同的研究和应用目的对其进行不同程度的筛选。目前常规的方法是采用多种色谱联用技术，每一步色谱分离都将酶解产物分成若干组分，再逐一检测各组分的活性，直至筛选出目标活性肽。整个筛选过程繁琐耗时，难以实现快速、高通量筛选目的。抗冻肽可特异性的吸附于冰晶之上，因而可据此原理设计一套“冷棒”特异性亲和吸附装置。通过降低温度，使冰晶在连接于制冷系统的棒状载体上生长固定，形成“冷棒”，当预冷的样液流经“冷棒”时，样液中的抗冻肽可特异性的与“冷棒”的冰晶相结合，再通过调控温度，溶解“冷棒”上的冰晶，从而获得分离的抗冻肽。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题，提供一种胶原抗冻肽的分离方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种胶原抗冻肽的分离方法，包括以下步骤：
A、胶原蛋白的制备
A1、取畜禽皮去除表面的毛，以蒸馏水洗净，于-20℃保存备用；
A2、将经过A1处理的畜禽皮剪碎，以10％丁醇溶液脱脂，再用蒸馏水洗净；
A3、以0.5M醋酸溶液浸泡脱脂后的畜禽皮，并以10倍体积的相同溶液匀浆；在匀浆液中加入1％的胃蛋白酶，在4℃下水解，水解完毕后离心，收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末进行盐析，静置沉淀后离心；收集沉淀溶于0.5M醋酸溶液并置于透析袋内，依次用0.02M的Na2HPO4、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析；然后将透析袋内的溶液冻干，得到含胶原蛋白的冻干液，于-20℃保存备用；
B、胶原酶解复合物的制备
B1、采用碱性蛋白酶对步骤A3所得含胶原蛋白的冻干液进行可控酶解，酶解条件为：温度55℃、酶添加量5％、pH 7.8、胶原蛋白浓度20.75mg/mL、水解度9％；
B2、酶解反应终止时，将酶解产物置于沸水浴中灭酶，冷却后离心分离，取上清液冷冻干燥后得到胶原酶解复合物；
C、胶原抗冻肽的分离
C1、搭建一个冰亲和吸附装置，该冰亲和吸附装置包括可控温的空心不锈钢棒、酶反应器、磁力搅拌器及可控温的低温反应槽，酶反应器放置在低温反应槽内；
C2、先将不锈钢棒置于-4℃的蒸馏水中，使其表面结上冰晶，再将表面结有冰晶的不锈钢棒放入酶反应器中，通过低温反应槽使其进一步降温至-5℃；将步骤B2制备的胶原酶解复合物溶于双蒸水，并置于酶反应器中，使酶反应器的温度保持在0℃左右；开启磁力搅拌器，使不锈钢棒上附着的冰晶缓慢吸附胶原酶解复合物中的胶原抗冻肽；
C3、吸附完毕后，将酶反应器中的液体倒出，并将其温度升高至2℃，使不锈钢棒上吸附的冰晶和胶原抗冻肽充分溶解，将溶解后的产物冻干，即获得胶原抗冻肽。
步骤A2中所述10％丁醇溶液由10倍体积的双蒸水与1倍体积的丁醇制备而成。
步骤A3中所述1％的胃蛋白酶由10g胃蛋白酶溶解于1000ml双蒸水中配制而成：胃蛋白酶的含量为1200U/g。
步骤A3中所述在上清液中加入NaCl粉末进行盐析要使NaCl的终浓度达到0.9M。
步骤A3中所述依次用0.02M的Na2HPO4、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析是每种溶液透析4次，每次3h。
步骤B1中所述碱性蛋白酶的含量为14300U/g。
本发明的分离方法具有分离过程简单，成本低，易于实现规模化生产的特点，其分离的抗冻肽的氨基酸序列为Leu–Gly–Lue–Gly–Pro–Leu–Gly–Arg–Gly–Pro-Leu-Leu，热滞活性达到3.4℃。
较之于常规的分离方法，本发明采用的冰亲和吸附装置和吸附技术有如下优点：
(1)通过温度的改变，易于实现样液中抗冻肽的连续分离；
(2)无需有毒有害的化学试剂，可减少环境污染和保证产品的安全性；
(3)可通过调控样液在“冷棒”上吸附与解吸附的次数，获得不同纯度的抗冻肽，以满足研究或实际应用的需要。
附图说明
图1为本发明中使用的冰亲和吸附装置的基本结构示意图；
图2为本发明中使用的葡聚糖凝胶色谱柱对胶原抗冻肽的分离示意图；
图3为本发明中分离的抗冻肽氨基酸序列测定质谱图。
具体实施方式
实施例1
一种胶原抗冻肽的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)、胶原蛋白的制备
①、用剪刀去除猪皮表面的毛，以蒸馏水洗净，于-20℃保存备用。
②、将经过①处理后的猪皮剪碎(0.5mm×0.5mm)，以10倍体积双蒸水配制的10％丁醇溶液脱脂24h，每12h换一次丁醇溶液，再用蒸馏水洗净。
③、以双蒸水配制的0.5M醋酸溶液浸泡脱脂后的猪皮12h，并以10倍体积的相同溶液匀浆；在匀浆液中加入1％双蒸水溶解的(w/v)胃蛋白酶(1200U/g)，在4℃下水解48h，水解完毕后离心(5000g，40min)，收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末进行盐析(使NaCl的终浓度为0.9M)，静置24h后离心(5000g，60min)；收集沉淀溶于0.5M醋酸溶液中，并依次用0.02M的Na2HPO4(pH 8.6)、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析；每种溶液透析4次，每次3h；将透析袋内的溶液冻干，于-20℃保存备用。
(2)、胶原蛋白的可控酶解
①、采用碱性蛋白酶(14300U/g)对胶原蛋白进行可控酶解，酶解条件为：温度55℃、酶添加量5％(酶溶于双蒸水中)、pH 7.8(用0.5mol/L的NaOH水溶液调节)、胶原蛋白浓度20.75mg/mL、水解度9％。
②、酶解反应终止时，将酶解产物置于沸水浴中灭酶10min，冷却后以5000g离心30min，将其上清液冷冻干燥后得到胶原酶解复合物。
(3)、胶原抗冻肽的分离
①、搭建冰亲和吸附装置对胶原抗冻肽进行分离。该冰亲和吸附装置由直径为5mm，长度为200mm的可控温的中空不锈钢棒、带夹套的酶反应器、磁力搅拌器及可控温的低温反应槽构成，结构如图1所示。
②、先将不锈钢棒置于-4℃的蒸馏水中，使其表面结上0.2mm厚的冰晶，再将表面结有冰晶的不锈钢棒放入酶反应器中，通过低温反应槽使其进一步降温至-5℃。将制备的胶原酶解复合物粉末溶于双蒸水(1mg/mL)，并置于酶反应器中。使酶反应器的温度保持在0℃左右。开启磁力搅拌器，使不锈钢棒上附着的冰晶缓慢吸附酶解液中的胶原抗冻肽10h。
③、吸附完毕后，将酶反应器中的液体倒出，并将其温度升高至2℃左右，使不锈钢棒上吸附的冰晶和抗冻肽充分溶解，将溶解后的产物冻干，即获得抗冻肽。
(4)、葡聚糖凝胶色谱柱对胶原抗冻肽的分离
将经过冰亲和吸附得到的抗冻肽溶解于双蒸水中，浓度为6mg/mL；用Sephadex G-25凝胶色谱柱(2.5cm*100cm)对其进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，测量波长为220nm；收集具有较高活性的洗脱，即图2中的峰2。
(5)、抗冻肽热滞活性的测定
将(4)制得的抗冻肽配制浓度为100mg/mL的双蒸水溶液，取15mg该溶液于铝皿中，再利用差式扫描热量仪(DSC)测量其热滞活性。测量方法为：先使其以10℃/min的速度由10℃降温至-20℃，再以10℃/min的速度由-20℃升温至10℃，测量其熔点；再使其以10℃/min的速度由10℃降温至-20℃，然后使其以2.5℃/min由-20℃升至保留温度(熔点附近)，再使其以1℃/min的速度缓慢降至-20℃，通过观察保留温度与起始结晶温度的差值得到抗冻肽的热滞活性从而间接表明其抗冻活性。
(6)、抗冻肽氨基酸序列测定
使用WATERS SYNAPT Q-TOF MS质谱系统和De Novo Explorer软件对图2中峰2的氨基酸序列进行测定，系统分析参数如下：反射器，阳离子；质量范围，50-2000M/Z；ESI源温度，100℃；脱溶剂温度，250℃；毛细管电压，3.5kV；光电倍增管电压，1600V。测定结果如图3所示，胶原抗冻肽氨基酸全序列为Leu-Gly-Lue-Gly-Pro-Leu-Gly-Arg-Gly-Pro-Leu-Leu。

Claims (6)

1.一种胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、胶原蛋白的制备
A1、取畜禽皮去除表面的毛，以蒸馏水洗净，于-20℃保存备用；
A2、将经过A1处理的畜禽皮剪碎，以10％丁醇溶液脱脂，再用蒸馏水洗净；
A3、以0.5M醋酸溶液浸泡脱脂后的畜禽皮，并以10倍体积的相同溶液匀浆；在匀浆液中加入1％的胃蛋白酶，在4℃下水解，水解完毕后离心，收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末进行盐析，静置沉淀后离心；收集沉淀溶于0.5M醋酸溶液并置于透析袋内，依次用0.02M的Na2HPO4、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析；然后将透析袋内的溶液冻干，得到含胶原蛋白的冻干液，于-20℃保存备用；
B、胶原酶解复合物的制备
B1、采用碱性蛋白酶对步骤A3所得含胶原蛋白的冻干液进行可控酶解，酶解条件为：温度55℃、酶添加量5％、pH 7.8、胶原蛋白浓度20.75mg/mL、水解度9％；
B2、酶解反应终止时，将酶解产物置于沸水浴中灭酶，冷却后离心分离，取上清液冷冻干燥后得到胶原酶解复合物；
C、胶原抗冻肽的分离
C1、搭建一个冰亲和吸附装置，该冰亲和吸附装置包括可控温的空心不锈钢棒、酶反应器、磁力搅拌器及可控温的低温反应槽，酶反应器放置在低温反应槽内；
C2、先将不锈钢棒置于-4℃的蒸馏水中，使其表面结上冰晶，再将表面结有冰晶的不锈钢棒放入酶反应器中，通过低温反应槽使其进一步降温至-5℃；将步骤B2制备的胶原酶解复合物溶于双蒸水，并置于酶反应器中，使酶反应器的温度保持在0℃左右；开启磁力搅拌器，使不锈钢棒上附着的冰晶缓慢吸附胶原酶解复合物中的胶原抗冻肽；
C3、吸附完毕后，将酶反应器中的液体倒出，并将其温度升高至2℃，使不锈钢棒上吸附的冰晶和胶原抗冻肽充分溶解，将溶解后的产物冻干，即获得胶原抗冻肽。
2.如权利要求1所述的胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于：步骤A2中所述10％丁醇溶液由10倍体积的双蒸水与1倍体积的丁醇制备而成。
3.如权利要求2所述的胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于：步骤A3中所述1％的胃蛋白酶由10g胃蛋白酶溶解于1000ml双蒸水中配制而成：胃蛋白酶的含量为1200U/g。
4.如权利要求1所述的胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于：步骤A3中所述在上清液中加入NaCl粉末进行盐析要使NaCl的终浓度达到0.9M。
5.如权利要求4所述的胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于：步骤A3中所述依次用0.02M的Na2HPO4、0.1M醋酸及蒸馏水作为透析外液进行透析是每种溶液透析4次，每次3h。
6.如权利要求3所述的胶原抗冻肽的分离方法，其特征在于：步骤B1中所述碱性蛋白酶的含量为14300U/g。
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