CN101865796B - 一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液，该制备方法为：将标准蛋白样品溶于含尿素的蛋白裂解液中并在常温下保存，即得到电泳上样时不需加热可直接进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白质标样，本发明还公开了上述蛋白标样制备过程中采用的蛋白裂解液，该裂解液中含7～9M的尿素；采用上述方法制备的蛋白标样保存时间长，不用加热，操作简便，电泳图谱上所得的蛋白条带清晰、无明显拖尾。

Description

一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，具体涉及一种蛋白标样的制备方法及其采用的蛋白裂解液。

背景技术

1970年，Laemmli在分离T4噬菌体外壳蛋白时首次使用了十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用蛋白质分子量大小不同来分离不同蛋白质，具有很好的分离效果。此后，该项技术被广泛应用于生物化学、法医学、遗传学和分子生物学研究中。由于SDS凝胶电泳中的蛋白样品每单位质量具有相同的电荷量，所以与SDS结合的蛋白是按分子量大小不同来进行分离的，目前这个方法已经成为世界上使用最广泛的生化分析手段。根据Laemmli的方法，蛋白质样品与SDS-PAGE上样缓冲液充分混匀后，煮沸或加热1.5min再进行SDS-PAGE分析。

在Laemmli不连续SDS凝胶系统基础上，O’Farrell设计出了分离、检测和分析蛋白的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)技术，现在这一技术也是从蛋白质组学方面来研究蛋白质来源的基本手段。O’Farrell的双向电泳体系，蛋白质溶解在裂解液(9.5M尿素，2％(w/v)NP-40，2％Ampholines，5％β-巯基乙醇)，在第一向电泳等电聚焦(IEF)中根据等电点(pI)的不同进行分离性，然后在第二向的SDS凝胶电泳再根据分子量(Mr)对蛋白进行分离。因为pI和Mr是两个不相关的参数，所以在2-DE图谱上可以获得1000个以上分布均匀的蛋白点。最近，为了更好的分离2-DE图谱中酸性或碱性蛋白质，以及提高其重复性、分辨率的问题，广泛使用了固相pH梯度(IPGs)胶条，增加了等电聚焦的稳定性和可重复性。因此，使用IPGs的2-DE与蛋白质谱鉴定相结合的方法是当前蛋白质组研究中分离鉴定复杂蛋白质混合物的最核心技术。

现在双向电泳体系，最常用的样品溶解缓冲液是在O’Farrell的裂解缓冲液(O’Farrell 1975)基础上进行改进的，其中含9M尿素，2-4％CHAPS，1％DTT，和2％Ampholines。不过并不是所有种类的蛋白(尤其是膜蛋白)都能很好的溶解于含尿素的裂解液中。为增加疏水性蛋白的溶解使用了硫脲。此后，数种含有高浓度尿素和硫脲的裂解液被广泛应用于蛋白质组学分析。

蛋白样品与标准Laemmli上样缓冲液混合后，如果裂解液中含有高浓度尿素，蛋白就不应进行高温变性。众所周知，高温条件下尿素可水解为异氰酸酯，从而使蛋白氨基甲酰化。很多时候，具体的热变性过程是在100℃沸水浴中加热30min，10min，2min，或者直接在100℃加热块中加热10min，3min，或在37℃下温育30min等，加热后都作为了在1-DE和的2-DE蛋白质组研究中检测蛋白品质的标样，但是在1-DE凝胶图谱上都有不同程度的拖尾效应。

目前，现有技术中提供的蛋白标样，使用时将蛋白样品溶解于缓冲液中，但都需要加热才能用，并且需要低温-20度运输，这样既不方便，成本也较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白标样的制备方法，采用该方法制备的蛋白标样进行电泳分析时获得的蛋白条带清晰、无明显拖尾，且将标准蛋白溶于蛋白裂解液中所得的混合溶液常温下保存时间长，使用时不加热可直接进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳分析，采用该方法制备的蛋白标样使用方便，成本低廉。

本发明还提供了上述蛋白标样制备过程中采用的蛋白裂解液。

为达到上述目的，本发明提供的蛋白标样的制备方法：将标准蛋白样品溶于含尿素的蛋白裂解液中并在常温下保存，即得上样时不需加热可直接进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白标样。

上述蛋白标样的质量体积浓度为1.0～5.0μg/μl。

本发明可改进为：上样前加入占标准蛋白和含尿素的蛋白裂解液总体积的1/4～1/2的3×Laemmli标样缓冲液。

上述的3×Laemmli标样缓冲液含有下述组分：625mM pH为6.8的Tris-HCl、2％(w/v)SDS、5％(v/v)β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚蓝。

优选的，所述的标准蛋白样品为兔肌肉磷酸化酶B、牛血清蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、兔肌动蛋白和蛋清溶菌酶中的一种或几种。

优选的，所述的标准蛋白样品为从盐角草根、盐芥叶片、血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌中提取的蛋白的一种或几种。

本发明提供的上述蛋白标样制备方法中采用的含有尿素的蛋白裂解液，所述的含尿素的蛋白裂解液中含7～9M的尿素。

优选的，所述的裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～3M硫脲、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT。

优选的，所述的裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT。

本发明的有益效果是：

(1)使用这种方法制备的蛋白标样可以使SDS-PAGE上的蛋白条带清晰并且没有拖尾效应；

(2)使用这种方法进行SDS-PAGE分析时可以减少后续蛋白质谱实验的干扰；

(3)本发明制备方法步骤简便，制备的蛋白标样不用加热可直接上样，室温下保存时间长，方便使用和运输。

附图说明

图1是加热不同时间的从盐角草根和盐芥叶片提取的蛋白标样的SDS-PAGE蛋白图谱；

图2是加热不同时间的从血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌提取的蛋白标样的SDS-PAGE蛋白图谱；

图3是磷酸化酶B、兔肌动蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂与牛血清白蛋白样品加热不同时间(A)和常温下保存不同时间(B)的蛋白标样的SDS-PAGE蛋白图谱。

具体实施方式

如无特殊指明，以下所采用的试剂或方法均为常规试剂或常规方法，其中w/v指重量体积百分含量，v/v指体积百分含量。

实施例1

采用BPP法分别从盐角草根、盐芥叶片、血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌中提取标准蛋白样品，然后将上述标准蛋白样品置于蛋白裂解液中，该蛋白裂解液的组成为：7～9M尿素、1～3M硫脲、1～2％(v/v)的CHAPS(二甲氨基丙磺酸)和12～15mM DTT(二硫苏糖醇)，然后将上述混合溶液常温保存，制备的蛋白标样的质量体积浓度为1.0～5.0μg/μl，使用时再加入到三分之一体积的3×Laemmli标样缓冲液，3×Laemmli标样缓冲液含有以下组分：625mM pH为6.8的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl、2％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)、5％(v/v)β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚蓝，不加热直接进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳分析即可。

其中，从盐角草根中提取蛋白过程如下：采用BPP法，每1g的盐角草根中加入3ml BPP蛋白提取液，然后室温将混合物剧烈漩涡振荡5分钟后，加入两倍体积Tris-饱和酚(pH 8.0)，继续涡混振荡10min，4℃、15000g离心15min之后将上层酚相转入一个新的离心管。向其中加入等体积蛋白提取液，涡混振荡10min，4℃、15000g离心15min，将上层酚相转入一个新的离心管中。向其中加入5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h或过夜，过夜后在4℃，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤一次，再在4℃，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀再用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤两次，每次洗涤后4℃，15000g离心15min，将蛋白沉淀在室温风干，最后用裂解液在室温融解蛋白2小时以上。提取好的蛋白可以不用加热，直接上样。其它采用BPP法从盐芥叶片、血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌提取蛋白的过程与上述过程类似。

SDS-PAGE使用的是16厘米平板凝胶，分离胶为12.5％聚丙烯酰胺、浓缩胶为4％聚丙烯酰胺(Laemmli 1970)，然后将上述混合溶液常温保存，使用时不加热直接进行凝胶电泳SDS--PAGE分析即可，16℃、30mA条件下进行电泳4小时，凝胶上蛋白的分子量以标样蛋白作为标样来确定，检测结果如附图1-2所示。

凝胶采用考马斯亮蓝进行染色，图像使用BandScan软件(版本5.0)按用户操作说明书对其进行分析。

蛋白质的鉴定用MALDI TOF。将获得的胰蛋白酶肽段信息通过Mascot软件(Version 2.2)搜索ncbi(NCBInr)数据库，获得蛋白鉴定信息。

为比较加热和不加热对蛋白质样品的测试结果的影响，将标准蛋白质样品溶解在蛋白裂解液中所得的上样液在100℃加热不同时间，然后进行凝胶电泳分析。

采用BPP法分别从盐角草根(图1，A)、盐芥叶片(图1，B)、血液(图2，A)、宫颈癌Hela细胞(图2，B)和大肠杆菌(图2，C)中提取蛋白，凝胶上的蛋白条带清晰而且分子量范围跨度大从不足14kDa到超过了97kDa。从1到14泳道指在100℃依次变性0s，10s，30s，1min，1.5min，3min，4min，5min，8min，10min，15min，30min，45min和1h的蛋白图谱，变性时间小于5分钟时，泳道上的蛋白条带清晰没有拖尾效应(图1，1-8泳道；图2，1-8泳道)，然而热变性时间超过5分钟，蛋白图谱发生变化且出现拖尾现象(图1，9-14泳道；图2，9-14泳道)。总的来说，变性时间超过10分钟以上的样品条带拖尾效应明显(图1，11-14泳道；图2，11-14泳道)。

盐角草根蛋白随着变性强度的增加，其主条带逐渐弥散甚至消失(图1，A)。高丰度蛋白条带，如Rubisco活化酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)大亚基(RLU)，在随后的MALDI-TOF质谱中发现加热10分钟以上降解明显(图1，A)。Rubisco活化酶是植物中普遍存在的高丰度蛋白，在叶片和绿色组织中占可溶性蛋白的50％。在1-DE图谱有一条大约50kDa的蛋白条带，这是许多植物物种都具有的典型叶蛋白组分(Rossignol et al.，2006；Schiltz et al.，2004)。其它分子量介于97kDa至14kDa的主要蛋白带的改变与Rubisco相似。盐芥叶片蛋白的1-DE图谱呈现出了与盐角草蛋白相似的变化，如果加热时间超过10分钟一条分子量约为60kDa主蛋白条带就会消失(图1，B)。

从人体血液(图2，A)和Hela细胞(图2，B)中提取的蛋白，随着变性时间的延长其主要条带逐渐变得弥散尤其是在高分子量区域。可是分子量为66kDa的蛋白条带(图中用箭头标出)却随着变性温度的增强而变大，通过质谱鉴定这个蛋白是人血清蛋白(HSA)。与其他样品相比较，发现大肠杆菌的蛋白获(图2，C)更能耐受高温，即使加热1小时仍可观察到主带，但是低分子量区域的条带表现出拖尾效应(图2，C)。

上述结果说明，标准蛋白样品经100℃加热是没有必要的，甚至可以说是不利的。因此，建议如果溶解蛋白的裂解液中含有高浓度的尿素，就应该去掉加热变性这一步，因为这样可以减少SDS-PAGE蛋白条带的拖尾效应。

实施例2

将标准磷酸化酶B，兔肌动蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂与牛血清白蛋白样品按1∶1∶1∶2的比例混匀，按其在蛋白裂解液中的质量体积浓度为1.0～5.0μg/μl，然后将其溶解在裂解液中，裂解液的含有下述组分：7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，13mM DTT，室温放置2小时。分装每管20μl约含蛋白30μg，再加入到10μl 3×Laemmli标样缓冲液，3×Laemmli标样缓冲液含有以下组分：625mMpH为6.8的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl、2％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)、5％(v/v)β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚蓝，PCR仪中100℃加热不同时间。

SDS-PAGE使用的是16厘米平板凝胶，分离胶为12.5％聚丙烯酰胺、浓缩胶为4％聚丙烯酰胺，然后将上述混合溶液常温保存，使用时不加热直接进行凝胶电泳SDS--PAGE分析即可，16℃、30mA条件下进行电泳4小时，凝胶上蛋白的分子量以标样蛋白作为标样来确定，检测结果如附图3所示。

凝胶采用考马斯亮蓝进行染色(Wang et al.，2007)，图像使用BandScan软件(版本5.0)按用户操作说明书对其进行分析。

蛋白质的鉴定用MALDI TOF(Wang et al.，2007a；Wang et al.，2009)。将获得的胰蛋白酶肽段信息通过Mascot软件(Version 2.2)搜索ncbi(NCBInr)数据库，获得蛋白鉴定信息。

为比较加热和不加热对蛋白质样品的测试结果的影响，将上述标准蛋白质样品溶解在蛋白裂解液中所得的上样液在100℃加热不同时间，然后进行凝胶电泳分析。

结果如图3所示，在图3(A)中，从1到14泳道指在100℃依次变性0s，10s，30s，1min，1.5min，3min，4min，5min，8min，10min，15min，30min，45min和1h的蛋白图谱，在图3(B)中，从1到14泳道指在室温放置1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，14天，18天，21天，30天和60天后电泳结果，箭头所指的B9和B10表示通过MS鉴定的蛋白条带。

蛋白带随变性强度的增加而变得逐渐弥散，100℃加热超过3分钟样品条带弥散的越来越明显，尤其是66kDa的BSA(图3，A)。加热时间超过10分钟，HAS和BSA的分子量变高达到了90kDa(图2，A；图3，A)。虽然还不清楚为什么增加HAS和BSA的变性时间会使分子量变大，但是本研究的实验结果说明如果蛋白标样中含66kDa的BSA蛋白，那么估算60kDa左右的蛋白分子量就不准确了，估算的值要比它的实际值低。

上述结果揭示在做SDS-PAGE前将溶解于裂解液中的蛋白高温变性是不必要的，甚至可以说是不利的。纯化的标样蛋白样品内含磷酸化酶B，兔肌动蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂与牛血清白蛋白溶解在裂解液(7M尿素，2M硫脲，体积百分含量为2％CHAPS，13mM DTT)中，再加入到三分之一体积的3×Laemmli标样缓冲液，混合后在室温下放置二个月，进行SDS-PAGE电泳，蛋白条带仍清晰、无明显拖尾(图3，A)。特别是BSA混合物即使在室温下放置30天，其分子量仍然精确(图3，A，泳道13和14)。根据我们的研究结果，我们认为将标样蛋白直接溶解在高浓度尿素的裂解液中作为SDS-PAGE的蛋白标样是一种更简便的方法。

实施例3

取从采用BPP法从盐角草根中提取的蛋白质，按其在蛋白裂解液中的质量浓度为1.0～5.0μg/μl加入蛋白裂解液，蛋白裂解液的组成为：7M尿素、体积百分含量为1.5％的CHAPS和14mM DTT，然后将上述混合溶液常温保存，不加热直接进行凝胶电泳分析即可。

采用BPP法从盐角草根中提取的蛋白质的过程参考实施例1。

实施例4

取市售的兔肌动蛋白，按其在蛋白裂解液中的质量浓度为1.0～5.0μg/μl，然后将其溶解在裂解液中，蛋白裂解液的组成为：7M尿素、体积百分含量为2％CHAPS，13mM DTT，放置数天后，再加入占兔肌动蛋白和蛋白裂解液总体积2/5的3×Laemmli标样缓冲液，3×Laemmli标样缓冲液含有下述组分：625mMpH为6.8的Tris-HCl、2％(w/v)SDS、5％(v/v)β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚蓝，不加热直接进行凝胶电泳分析。

实施例1-4中，除采用上述含尿素的蛋白裂解液外，还可采用本领域常规的含尿素的蛋白裂解液。

以下通过试验说明热变性对质谱鉴定的影响

为了进一步研究热变性对质谱鉴定的影响，我们从不同物种SDS-PAGE切取了10条典型的蛋白条带，这些条带在图中已用箭头和B1-B10的数字标出(图1-3)，通过MALDI-TOF质谱对这些蛋白进行鉴定分析，在表格中详细列出了这些蛋白的信息(图1-3)。总体来说，Mascot分数随着高温处理时间的延长而降低。变性强度增加相匹配的肽段数和总搜索肽段数减少，因此导致待鉴定蛋白的氨基酸覆盖率降低(表1)。

如图所示，延长高温处理时间有两条带分子量变高(图2，A；图3，A)。将未加热蛋白样品(B5和B9)和加热10分钟样品(B6和B10)切胶做MS鉴定。这些蛋白经鉴定都是血清蛋白(B5和B6来源于人为HSA；B9、B10来源于牛为BSA)。未加热的蛋白样品与加热样品相比，得到Mascot分数更高。未加热HAS的Mascot搜索分数、氨基酸覆盖率、匹配肽段数和总肽段数分别为195、41、35和68(表1，B5)，当其在100℃加热10分钟这些参数分别降到108、32、25和61(表1，B9)。BSA蛋白同样获得了相似的结果，未加热样品的上述参数分别为177、321、29和74(表1，B9)，加热10分钟后这些值大大降低(表1，B10)。盐角草根RLU蛋白的电泳结果也一样，未加热和加热10分钟的蛋白Mascot搜库分数分别为142和91(表1，B1、B2)有人认为，蛋白质样品中含有尿素，就不被加热，以避免尿素分解导致电荷非均质化而凝集(Gorg et al.，2004)。我们的研究结果给这一说法提供了充分的证据，而且我们还发现高温变性将对后续的质谱实验产生严重的干扰。基于这些研究发现，我们推测高温变性可能会改变胰蛋白酶的催化位点从而导致正确的酶解多肽数减少。

加热10分钟消失的3条蛋白条带(B3，B7和B8)经鉴定分别是：Ca²⁺-ATP酶(gi：110741169)，热休克蛋白70-8(gi：123647)，和谷胱甘肽S-转移酶(gi：46947348)(表1，B3、B7和B8)。有趣的是，从盐芥叶片中提取的蛋白(图1，B，B4)加热时间超过10分钟会出现1条新的条带，这条带质谱鉴定的Mascot分数很高，是拟南芥的过氧化氢酶(gi：79318278)。这个蛋白带可能是过氧化氢酶的亚基热变性得来的。

上述结果表明，热变性不仅改变了蛋白质的图谱、使条带弥散，而且严重干扰蛋白后续的质谱实验，因此建议将来的SDS-PAGE避免使用高温变性。

结论

通过上述试验发现，溶解在裂解液中的蛋白样品过热变性后可以使SDS-PAGE凝胶上的蛋白图谱发生明显改变，产生拖尾效应。用从盐角草根、盐芥叶片、人血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌中提取的蛋白进行实验，证实了蛋白在100℃变性时间超过10分钟，可使条带变得模糊甚至丢失。鉴定出来的10个典型蛋白条带表明热变性不仅能改变蛋白图谱是条带弥散，还能对后续的质谱分析产生严重的干扰，因此建议如果蛋白溶解在含有高浓度尿素的裂解液中，做SDS-PAGE时不应将蛋白高温变性。基于上述研究结果，直接将标样蛋白溶解在蛋白裂解液中，这种蛋白标样在室温下可以长时间放置，如2个月以上，方便了使用和运输。

以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种蛋白标样的制备方法，其特征在于：将标准蛋白样品溶于含尿素的蛋白裂解液中并在常温下保存，即得上样时不需加热可直接进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白标样；

所述的蛋白裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～3M硫脲、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT；

或所述的蛋白裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT。

2.根据权利要求1所述的蛋白标样的制备方法，其特征在于：所述的蛋白标样的质量体积浓度为1.0～5.0μg/μL。

3.根据权利要求1所述的蛋白标样的制备方法，其特征在于：上样前加入占标准蛋白样品和含尿素的蛋白裂解液总体积的1/4～1/2的3×Laemmli标样缓冲液。

4.根据权利要求3所述的蛋白标样的制备方法，其特征在于：所述的3×Laemmli标样缓冲液含有下述组分：625mM pH为6.8的Tris-HCl、2％(w/v)SDS、5％(v/v)β-巯基乙醇、10％(v/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚蓝。

5.根据权利要求1所述的蛋白标样的制备方法，其特征在于：所述的标准蛋白样品为兔肌肉磷酸化酶B、牛血清蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、兔肌动蛋白和蛋清溶菌酶中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的蛋白标样的制备方法，其特征在于：所述的标准蛋白样品为从盐角草根、盐芥叶片、血液、宫颈癌Hela细胞和大肠杆菌中提取的蛋白的一种或几种。

7.权利要求1-6中任一项采用的含尿素的蛋白裂解液，其特征在于：

所述的蛋白裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～3M硫脲、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT；

或所述的蛋白裂解液含有下述组分：7～9M尿素、1～2％(v/v)CHAPS和12～15mM DTT。 

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