CN104759269A - 一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，步骤包括：将氧化石墨烯和去离子水搅拌混匀，得到混合溶液；将上述混合溶液超声、冷却，然后雾化成气溶胶液滴后通过石英管，并用聚四氟乙烯PTFE滤膜收集，干燥，即得石墨烯微球；制备以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质；本发明利用该亲和分离介质从木瓜粉中大量分离纯化木瓜蛋白酶；测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数；本发明该方法快速、简便、分离量大、提取的酶活性好、纯度高，适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物分离材料的制备领域，特别涉及一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法。
背景技术
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。广泛地应用于食品行业，如啤酒的澄清和肉质的嫩化以及皮革、纺织、日化和制药工业。木瓜蛋白酶的纯化大部分是采用沉淀法，但是这种方法仍然混有其他的蛋白酶，不能达到制药工业的需求。
目前，分离纯化木瓜蛋白酶的方法包括粗分离和精制分离，其中粗分离包括盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等，精制分离包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、疏水层析以及共价层析等。尽管这些方法都有一定的优点，但都存在操作繁琐、样品活性回收率低、纯化效果不理想等缺点，尤其是从大体积的稀溶液中提取少量的生物活性物质时。
亲和色谱技术的应用可使蛋白质纯化倍数提高，而且具有选择特异性好、压降小、耗时短、生物大分子在分离过程中变性几率小、允许较快的加料速度、可以重复利用有效降低成本等特点，更易实现规模化纯化分离。
石墨烯(Graphene)，是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格的新型二维平面材料，特殊的单原子层结构决定了其丰富和新奇的物理性质。它几乎是完全透明的，只吸收2.3％的光；导热系数高达5300W/m·K，高于碳纳米管和金刚石，常温下其电子迁移率超过15000cm2/V·s，碳原子的排列与石墨单元子层排列相同。石墨烯目前是世界上已知材料中最薄的，厚度只有0.335nm。石墨烯中的每个碳原子都与相邻的3个碳原子相连，其C—C键长约为0.142nm，每个晶格内有3个σ键，因此成为史上最牢固材料之一。
与其他分离介质相比，石墨烯作为生物分离介质具有更大的优势：第一：具有超大的表面积(理论值2630m2/g)，因此具有更大的理论吸附容量；第二：合成方法简单，易于规模放大。不需要任何特殊装置可从非常便宜、常见的原料—石墨获得；第三：大的π共轭结构，能够与含有芳香环的生物分子发生较强的π-π堆积作用；第四：相对柔软，易于键合与其它分离载体材料。因此，石墨烯是一种制备简单，成本低，吸附容量大的吸附材料，可有效吸附含有芳香环的多环芳烃、环境有机污染物和生物分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用先进的亲和色谱技术快速提纯木瓜蛋白酶的方法，该方法快速、简便、分离量大、提取的酶活性好，纯度高，适用于规模化生产。
本发明的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，包括：
(1)将氧化石墨烯和去离子水搅拌混匀，得到混合溶液；然后将混合溶液超声、冷却后雾化成气溶胶液滴后通过石英管，并用聚四氟乙烯PTFE滤膜收集，干燥，得到石墨烯微球；
(2)将上述石墨烯微球浸入Reactive Blue 4染料溶液中，50-60℃条件下，保温30-50min后，加入NaCl溶液，恒温振荡反应30-40min，然后升高水浴温度至65-80℃，加入Na2CO3溶液，继续恒温振荡反应4-5h，洗涤，即得以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质。
所述步骤(1)中氧化石墨烯摩尔含氧量44.55wt.％～46.88wt.％，混合溶液中氧化石墨烯质量浓度为0.025wt％～0.05wt％。
所述步骤(1)中磁力搅拌器下搅拌速率为1000r/min～1500r/min，搅拌时间为20-24h。
所述步骤(1)中超声在超声机中进行，超声时间为8-10h，超声机内水的温度为20-30℃。所述步骤(1)中雾化的振荡频率1.7MHz～2.1MHz；PTFE膜的孔径为0.05μm-0.1μm。
所述步骤(1)中在N2和抽滤真空泵驱动下通过石英管；石英管的温度为400℃～450℃；石英管采用电炉恒温加热。
所述步骤(1)中干燥为室温下干燥6～8h，然后放入真空干燥器中60～70℃干燥12-24h。
所述步骤(1)中石墨烯微球的比表面积426m2/g～842m2/g，直径范围为0.1μm～0.5μm,直径随着氧化石墨烯质量分数增加而增大，质量分数一定时，随着温度的增大而减小。
所述步骤(1)中石墨烯微球的直径范围为0.1μm～0.5μm，直径随着氧化石墨烯质量分数增加而增大，质量分数一定时，随着温度的增大而减小。
所述步骤(2)Reactive Blue 4染料溶液是指5.0mg/ml～15.0mg/ml，优选8.0mg/ml～12.0mg/ml；
所述的NaCl溶液是指质量分数为15％～20％NaCl溶液。
所述步骤(2)的Na2CO3溶液是指质量分数为15％～20％Na2CO3溶液；
所述步骤(2)中洗涤为分别用热的去离子水，甲醇溶液，NaCl溶液，尿素溶液和去离子水洗涤。
所述体积百分浓度为10％的甲醇溶液，2M的NaCl溶液，6M的尿素溶液。
所述以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质应用于分离纯化木瓜酶，具体为：含有木瓜粉的Tris－HCl缓冲液，上样于石墨烯微球分离介质，Tris－HCl缓冲液冲洗后，用NaSCN溶液洗脱，得到木瓜蛋白酶；然后测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。
所述的Tris－HCl缓冲液是指0.05M～1M，pH为8.0～8.5的Tris－HCl缓冲液。
所述的含有木瓜粉的Tris－HCl缓冲液中木瓜粉的浓度是10.0～15.0mg/ml。
所述中的Tris－HCl缓冲液浓度为0.05M、pH＝8.5。
所述的NaSCN溶液的浓度为1M、pH＝6.0。
有益效果
(1)本发明方法操作简单，耗时较少，可获得粒径可控的石墨烯微球，适用于规模化生产；
(2)本发明所使用的原材料廉价易得，所制得的可控的石墨烯微球具有比表面积大，吸附容量高，具有应用其做后续相关实验分析的潜力；
(3)本发明的方法操作简单，耗时较少，石墨烯微球生物分离介质用于酶纯化的纯化倍数和酶活性较高；
(4)样品来源方便，便于大规模提取纯化。
附图说明
图1氧化石墨烯溶液质量分数0.025wt％，石英管加热温度为400℃制备的石墨烯微球电镜照片；
图2氧化石墨烯溶液质量分数0.05wt％，石英管加热温度为400℃制备的石墨烯微球电镜照片；
图3氧化石墨烯溶液质量分数0.05wt％，石英管加热温度为450℃制备的石墨烯微球电镜照片；
图4为利用石墨烯微球分离介质从木瓜粉中分离纯化木瓜蛋白酶的吸附洗脱曲线：(a)木瓜蛋白酶的吸附(b)杂质的洗涤；(c)木瓜蛋白酶的洗脱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将氧化石墨烯(摩尔含氧量44.55％)加入到去离子水中组成混合溶液，混合液中氧化石墨烯质量浓度为0.025wt％。在磁力搅拌器下搅拌20小时，转速为1200r/min；
(2)将混合溶液放入超声机中，超声波振荡10小时后，使氧化石墨烯薄片足够分散，于冰水中冷却，超声机内水的温度20℃；
(3)将混合溶液置于雾化器内，使其雾化成气溶胶液滴，在N2和抽滤真空泵驱动下缓慢通过加热到400℃的石英管，末端用孔径为0.05um的PTFE滤膜收集；
(4)将收集到的膜室温下干燥6h，然后放入真空干燥器中60℃干燥24h，即得粒径可控的石墨烯微球。
依照以上步骤所得到不同粒径大小的石墨烯微球的电镜照片如图1，粒径大小为100nm，比表面积为842m2/g。
实施例2
(1)将氧化石墨烯(摩尔含氧量44.55％)加入到去离子水中组成混合溶液，混合液中氧化石墨烯质量浓度控制为0.05wt％。在磁力搅拌器下搅拌20小时，转速为1200r/min；
(2)将混合溶液放入超声机中，超声波振荡10小时后，使氧化石墨烯薄片足够分散，于冰水中冷却，超声机内水的温度20℃；
(3)将混合溶液置于雾化器内，使其雾化成气溶胶液滴，在N2和抽滤真空泵驱动下缓慢通过加热到400℃的石英管，末端用0.1um PTFE滤膜收集；
(4)将收集到的膜室温下干燥6h，然后放入真空干燥器中60℃干燥24h，即得粒径可控的石墨烯微球。
依照以上步骤所得到不同粒径大小的石墨烯微球的电镜照片如图2，粒径大小为500nm，比表面积为426m2/g。
实施例3
(1)将氧化石墨烯(摩尔含氧量46.88％)加入到去离子水中组成混合溶液，混合液中氧化石墨烯质量浓度控制为0.05wt％。在磁力搅拌器下搅拌20小时，转速为1200r/min；
(2)将混合溶液放入超声机中，超声波振荡10小时后，使氧化石墨烯薄片足够分散，于冰水中冷却，超声机内水的温度20℃；
(3)将混合溶液置于雾化器内，使其雾化成气溶胶液滴，在N2和抽滤真空泵驱动下缓慢通过加热到450℃的石英管，末端用0.1um PTFE滤膜收集；
(4)将收集到的膜室温下干燥6h，然后放入真空干燥器中60℃干燥24h，即得粒径可控的石墨烯微球。
依照以上步骤所得到不同粒径大小的石墨烯微球的电镜照片如图3，粒径大小为300nm，比表面积为637m2/g。
实施例4
以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质的制备，具体步骤如下：
上述实施例2得到的石墨烯微球浸入浓度为10mg/ml的Reactive Blue 4染料溶液中，60℃保温30-50min后，加入质量分数为20％NaCl溶液，恒温振荡反应30-40min，然后升高水浴温度至80℃，加入质量分数为25％Na2CO3溶液，继续恒温振荡反应4-5h，分别用热的去离子水，体积分数为10％的甲醇溶液，2M NaCl溶液，6M尿素溶液和去离子水充分洗涤，直到洗涤液呈无色为止，得到以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球生物分离介质，保存于双蒸水中。
实施例5
以干酪素为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下：
取0.1ml的酶液，加入0.7ml的0.05M Tris－HCl缓冲液(pH 8.0)，再加入0.2ml的木瓜蛋白酶激活剂(上述缓冲液内含0.5M的L－cysteine和0.02M的EDTA，pH8.0)35℃保温恒定，加入同样预热的1％(W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制)1.0ml，35℃反应15min，加入3.0ml 5％三氯乙酸(TCA)溶液终止反应(对照组实验先加TCA后加底物)。静置，8000转/分离心20min，取滤液于280nm波长下比色。
实施例6
利用石墨烯微球分离介质从木瓜粉溶液中分离纯化木瓜蛋白酶，具体步骤如下：
20.0mg石墨烯微球装入6.0ml的空柱子，作为分离介质，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05M、pH为8.5的Tris－HCl缓冲液平衡15min，流速为1.0ml/min，随后以蠕动泵送入35ml的10mg/ml的土豆汁通过柱子，然后以0.05M、pH 8.5的Tris－HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质；最后以1M的NaSCN的洗脱液(pH 6.0)进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。其吸附洗脱曲线见图4，横坐标为溶液体积，纵坐标为蛋白在A280处的吸光度，并测试酶活力和蛋白质含量，经计算，一次纯化倍数为48.31倍。
表1 石墨烯微球分离介质从木瓜粉中提取木瓜蛋白酶
Claims (15)
1.一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，包括：
(1)将氧化石墨烯和去离子水搅拌混匀，得到混合溶液；然后将混合溶液超声、冷却后雾化成气溶胶液滴后通过石英管，并用聚四氟乙烯PTFE滤膜收集，干燥，得到石墨烯微球；
(2)将上述石墨烯微球浸入Reactive Blue 4染料溶液中，50-60℃条件下，保温30-50min后，加入NaCl溶液，恒温振荡反应30-40min，然后升高水浴温度至65-80℃，加入Na2CO3溶液，继续恒温振荡反应4-5h，洗涤，即得以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质。
2.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中氧化石墨烯摩尔含氧量44.55％～46.88％，混合溶液中氧化石墨烯质量浓度为0.025wt％～0.05wt％。
3.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中搅拌速率为1000r/min～1500r/min，搅拌时间为20-24h；超声时间为8-10h，超声温度为20-30℃。
4.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中雾化的振荡频率1.7MHz～2.1MHz；PTFE膜的孔径为0.05μm-0.1μm。
5.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中在N2和抽滤真空泵驱动下通过石英管；石英管的温度为400℃～450℃；石英管采用电炉恒温加热。
6.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中干燥为室温下干燥6～8h，然后放入真空干燥器中60～70℃干燥12-24h。
7.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中石墨烯微球的比表面积426m2/g～842m2/g；直径范围为0.1μm～0.5μm。
8.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中Reactive Blue 4染料溶液的浓度为5.0mg/ml～15.0mg/ml；NaCl溶液的质量百分浓度为15％～20％；Na2CO3溶液的质量百分浓度为15％～20％。
9.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中洗涤为分别用热的去离子水，甲醇溶液，NaCl溶液，尿素溶液和去离子水洗涤。
10.根据权利要求9所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述甲醇溶液的体积百分浓度10％，NaCl溶液的摩尔浓度为2M，尿素溶液的摩尔浓度为6M。
11.根据权利要求1所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：以Reactive Blue 4为配基的石墨烯微球分离介质应用于分离纯化木瓜酶，具体为：含有木瓜粉的Tris－HCl缓冲液，上样于石墨烯微球分离介质，Tris－HCl缓冲液冲洗后，用NaSCN溶液洗脱，得到木瓜蛋白酶；然后测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。
12.根据权利要求11所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述的Tris－HCl缓冲液是指0.05M～1M，pH为8.0～8.5的Tris－HCl缓冲液。
13.根据权利要求11所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述含有木瓜粉的Tris－HCl缓冲液中木瓜粉的浓度是10.0～15.0mg/ml。
14.根据权利要求12所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述中的Tris－HCl缓冲液浓度为0.05M、pH＝8.5。
15.根据权利要求11所述的一种粒径可控的石墨烯微球生物分离介质的制备方法，其特征在于：所述的NaSCN溶液的浓度为1M、pH＝6.0。
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