CN106520520B - 用于在植物中生产蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在植物中瞬时表达目的蛋白质特别是有药物价值的蛋白质的方法。特别地，本发明提供了用于将土壤杆菌属细胞引入全部植物或植物器官内的改良方法。本发明的方法提供了许多植物个别或同时的有效土壤杆菌渗入，导致高于通过其他方法获得的重组蛋白质得率。该方法可以容易地依比例决定且自动化，以满足重组蛋白质的变化的需求。
Description
本申请是申请日为2011年7月15日、申请号为201180039815.5、发明名称为“用于在植物中生产蛋白质的方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用于在植物中瞬时表达目的蛋白质特别是有药物价值的蛋白质的方法。
重组蛋白质的大规模生产是转基因植物的重要应用。尽管许多植物能够成功地用于重组蛋白质生产，但少数系统具有在短时间段内生产大量重组蛋白质的潜力。
在植物细胞中的瞬时基因表达已作为快速工具开发，以产生少量给定蛋白质且用于测试遗传构建体。在植物细胞中瞬时生产蛋白质的方法包括例如以可表达方式的包含编码所需蛋白质的基因的核酸分子的粒子枪递送、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的包含可表达基因的二元载体递送、原生质体的电穿孔、和聚乙二醇介导的裸露DNA递送到植物原生质体内。
粒子轰击通常仅到达少数细胞，并且DNA必须到达细胞核用于转录完成，因此对于瞬时表达不是非常有效。
通过渗入递送的土壤杆菌属(土壤杆菌渗入(agro-infiltration))的使用可以将外源基因递送给明显更高数目的细胞。用于瞬时表达的土壤杆菌属渗入的原始系统通过Kapila等人，Plant Sci.122：101-108(1997)描述，并且开发用于快速测试被认为对于植物组织的疾病抗性有用的蛋白质的功能性。对于这个应用，蛋白质无需是纯化的或表征的，因为整个植物组织可以用于生物测定中。这个系统以后用于表达药学上重要的蛋白质(Vaquero等人，Mol.Biotechnol.5：209-21(1996))。然而，来自这个系统的生产是相对低的。
WO 99/48355公开了植物的遗传转化方法，其包括步骤：(a)将植物组织浸入包括感染性转化载体例如土壤杆菌属的介质中；(b)将对所述组织的压力减少至-10至-100kPa规格；(c)将所述压力维持10–60分钟，和(d)将所述压力升高至大气压或以上，其中允许选择转化载体，以鉴定其中转化载体整合到所述植物组织或细胞的基因组内的植物细胞或组织。进一步公开的是可以对植物材料实施减压和超压的交替循环，其中所述压力在10-500kPa(0.1-5巴)的范围中。
EP 1 662 002公开了土壤杆菌属介导的基因转导和转化的方法，其包括制备植物材料，用携带含有所需转基因的载体的土壤杆菌属感染植物材料。该方法的进一步部分是在制备植物材料的过程中，或在制备后但在用土壤杆菌属感染前，使植物材料加压。
WO 01/12828描述了包含真空室、用于生成真空的工具、和在真空生成工具和真空室之间的连接器、和进一步的用于附着或支持真空室内的植物的工具的仪器。
存在关于可以在短时间段内以商业规模生产大量重组蛋白质的系统和方法的需要，所述重组蛋白质例如用于预防大范围流行暴发或新出现的疾病的亚单位疫苗。
本发明提供了满足这个需要的工具和方法。特别地，在一个实施方案中，本发明提供了用于生产目的异源肽或蛋白质的方法，其包括：
(i)使全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触，其中所述土壤杆菌属细胞包含编码目的异源肽或蛋白质的可表达、特别是植物可表达构建体；
(ii)用一个或多个压力循环处理所述植物或植物部分、或多个植物或植物部分和土壤杆菌属细胞，由此所述土壤杆菌属细胞渗入全部植物或植物部分内，和
其中可表达构建体选择为提供目的异源肽或蛋白质的瞬时表达，并且压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加。
在本发明的特定实施方案中，将植物用一个或多个压力循环处理，其中全部包含压力相对于大气压的增加。
在特定实施方案中，压力/循环维持0.5秒–60秒的时期。
在一个实施方案中，本发明提供了用于将土壤杆菌属渗入植物或植物部分、或者多个植物或植物部分内的方法，其包括：
(i)使全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触；
(ii)用一个或多个压力循环处理所述植物或植物部分、或多个植物或植物部分和土壤杆菌属细胞，
其中可表达构建体选择为提供目的异源肽或蛋白质的瞬时表达，并且压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加。
在本发明的特定实施方案中，将植物用一个或多个压力循环处理，其中全部包含压力相对于大气压的增加。
在特定实施方案中，压力/循环维持0.5秒–60秒的时期。
在本发明的一个实施方案中，将全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分和土壤杆菌属细胞在封闭系统内用一个或多个压力循环处理，所述封闭系统特别是包含配置为接受全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分的室，和用于可调节地增加室中的气压和/或液压的工具的系统。
在本发明的一个实施方案中，室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的另一个实施方案中，室这样配置，从而使得仅植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，但对整个植物包括植物的地上部分以及地下部分实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的另外一个实施方案中，室这样配置，从而使得植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的一个实施方案中，在所述植物或植物部分与细菌细胞悬液中的土壤杆菌属细胞接触的同时，对全部和完整植物或全部和完整植物的部分施加包含一个或多个压力循环的压力处理。
在本发明的一个实施方案中，土壤杆菌属细胞的悬液包含至少1.0、特别是至少1.5、特别是至少2.0、特别是至少2.5、特别是至少3.0、特别是至少3.5、特别是至少4.0、特别是至少4.5的OD600。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含对全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分实施相对于大气压增加的压力，特别是对全部和完整植物或全部和完整植物的部分实施下述压力：至少0.5巴、特别是至少1.0巴、特别是至少1.5巴、特别是至少2.0巴、特别是至少2.5巴、特别是至少3.0巴、特别是至少3.5巴、特别是至少4.0巴、特别是至少4.5巴、特别是至少5.0巴、特别是至少5.5巴、特别是至少6.0巴、特别是至少7.0巴、特别是至少8.0巴、特别是至少9.0巴、特别是至少10.0巴、特别是至少11.0巴且特别是至少12.0巴。
允许细菌悬液最大限度渗入植物或植物部分内而不损害植物的最佳压力可以取决于在渗入方法中使用的植物物种而改变，并且在给定植物物种内，还取决于变种。最佳压力条件可以通过使用如本文在实施例中公开的测试系统通过本领域技术人员容易地测定。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少2个循环、特别是至少3个循环、特别是至少4个循环、特别是至少5个循环、特别是至少6个循环、特别是至少7个循环、特别是至少8个循环、特别是至少9个循环、特别是至少10个循环、特别是至少11个循环，其中所述循环中的至少一个或在特定实施方案中所有所述循环包含下述压力：至少0.5巴、特别是至少1.0巴、特别是至少1.5巴、特别是至少2.0巴、特别是至少2.5巴、特别是至少3.0巴、特别是至少3.5巴、特别是至少4.0巴、特别是至少4.5巴、特别是至少5.0巴、特别是至少5.5巴、特别是至少6.0巴，至少0.1秒/循环、特别是至少0.2秒/循环、特别是至少0.3秒/循环、特别是至少0.4秒/循环、特别是至少0.5秒/循环、特别是至少1秒/循环、特别是至少1.5秒/循环、特别是至少2.0秒/循环、特别是至少2.5秒/循环、特别是至少3.0秒/循环、特别是至少3.5秒/循环、特别是至少5.0秒/循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少2个循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少4个循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少5个循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少6个循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少7个循环。
在本发明的一个实施方案中，处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分的步骤包括至少8个循环。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少2.5巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少3.5巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少4.5巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少6巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少8巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力循环中的至少一个包含用至少12巴的压力处理全部植物或多个全部植物、或植物部分或多个植物部分。
在本发明的一个实施方案中，压力施加于0.5秒/循环–10秒/循环之间。
在本发明的一个实施方案中，压力施加于1秒/循环–5秒/循环之间。
在本发明的一个实施方案中，压力施加于0.5秒/循环–1秒/循环之间。
在本发明的一个实施方案中，用相对于大气压增加的压力处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少5个循环，在至少3.0巴的压力下，至少0.5秒/循环。
在本发明的一个实施方案中，用相对于大气压增加的压力处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少8个循环，在至少4.5巴的压力下，至少1秒/循环。
在本发明的一个实施方案中，用相对于大气压增加的压力处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少1个循环，在至少8.0巴的压力下，至少0.5秒/循环。
在本发明的一个实施方案中，用相对于大气压增加的压力处理全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分的步骤包括至少2个循环，在至少6.0巴的压力下，至少0.5秒/循环。
在本发明的一个实施方案中，使全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分与土壤杆菌属细胞接触的步骤包括(i)将植物或其部分浸泡到土壤杆菌属细胞的悬液中，其中所述悬液包含至少1.0、特别是至少1.5、特别是至少2.0、特别是至少2.5、特别是至少3.0、特别是至少3.5、特别是至少4.0、特别是至少4.5的OD600，(ii)使植物或其部分暴露于通过使用土壤杆菌属细胞的悬液生成的气溶胶，所述土壤杆菌属细胞的悬液包含至少1.0、特别是至少1.5、特别是至少2.0、特别是至少2.5、特别是至少3.0、特别是至少3.5、特别是至少4.0、特别是至少4.5的OD600。
在本发明的一个实施方案中，植物是处于发育阶段8、9或10的烟草属(Nicotiana)物种，特别是烟草(Nicotiana tabacum)物种。
在一个实施方案中，本发明提供了用于使土壤杆菌属渗入全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多个全部和完整植物或全部和完整植物的多个部分内，和/或用于生产异源肽或蛋白质的系统，其包含配置为接受全部植物、特别是全部和完整植物或植物的部分的室，和用于可调节地增加室中的气压和/或液压的工具。
在本发明的一个实施方案中，该系统包含压缩机和减压器。
在本发明的一个实施方案中，该系统包含多个入口、出口和导管用于提供在室的内部和外部之间的流体通道，其中流体的流动是调节的。
在本发明的一个实施方案中，室在内部包含有就雾化或气溶胶化液体而制作的多个喷嘴。
在本发明的一个实施方案中，室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的一个实施方案中，室这样配置，从而使得仅植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，但对整个植物包括植物的地上部分以及地下部分实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的一个实施方案中，室这样配置，从而使得植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
在本发明的一个实施方案中，室包含一个或多个开口，以允许植物的地上部分在插入或取出过程中的经过，所述开口衬有弹性密封，特别是弹性气力或液压密封。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如本文描述的系统用于将土壤杆菌属细菌渗入全部植物、特别是全部和完整植物或植物部分内和/或用于生产异源肽或蛋白质的用途。
定义
在本申请的范围内使用的技术术语和表达一般给予植物生物学有关领域中通常应用于其的含义。
所有下述术语定义应用于本申请的完全内容。单词“包含”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。单个步骤可以实现权利要求中叙述的几个特征的功能。与属性或值结合的术语“基本上”、“约”、“大约”等还特别分别定义确切的属性或确切的值。在给定数值或范围的背景中的术语“约”指在给定值或范围的20％内、10％内、5％内或2％内。
如在本发明内使用的“植物”指处于其发育的任何阶段的完整植物、基本上完整的植物、或多个完整或基本上完整的植物；全部植物、基本上全部的植物、或多个全部或基本上全部的植物，及其后代。为了本申请的目的，完整植物应理解为指包含基本上完整和闭合的维管系统的植物，其不显示由于损伤或损害的维管流体的排出。
如在本发明内使用的“植物部分”指植物的任何部分，包括插条、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物部分可以是植物的分离部分或全部和完整植物的部分。
“全部和完整植物的部分”意指这样的植物部分，即使与植物的剩余部分分开渗入，它也作为具有维管系统的植物的功能组分提供，其保持完全整合到完整植物的完整和闭合的维管系统内。
如在本发明内使用的“植物细胞”指植物的结构和生理学单位，包括花粉、胚珠和接合子。植物细胞可以以不含细胞壁的原生质体、分离的单细胞、培养细胞或作为高等组构单元的部分的细胞的形式，所述高等组构单元例如但不限于植物组织、植物器官或全部植物，包括全部和完整植物。
如在本发明内使用的“植物组织”意指组构成结构或功能单位的多个植物细胞。这包括在植物或培养物中的植物的任何组织。
如在本发明内使用的“植物器官”指植物的独特或分化部分，例如但不限于根、茎、叶、花、花部分、花芽、胚芽、种子或果实。这包括在植物或培养物中的植物的任何器官。
如在本发明内使用的“植物材料”指任何固体、液体或气体组合物或其组合，包括但不限于可得自在植物或培养物中的植物、其组织和器官的分泌物或提取物，包括叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、胚珠、接合子、种子、插条和植物的任何其他部分。
如在本发明内使用的“植物细胞培养物”包含植物细胞的培养物，例如但不限于原生质体、细胞培养细胞、在培养植物组织中的细胞、外植块中的细胞和花粉培养物。
如在本发明内使用的“烟草植物”指属于烟草属的物种的植物，包括但不限于烟草(Nicotiana tabacum或N.tabacum)。本发明的特定实施方案在本文中使用术语“烟草植物”进行描述，而不指定烟草，此类描述应解释为已特别包括烟草。
术语“多核苷酸”在本文中用于指核苷酸聚合物，其可以是未修饰或修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。相应地，多核苷酸可以是但不限于基因组DNA、互补DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA。此外，多核苷酸可以是单链或双链DNA，其为单链和双链区的混合物的DNA，包含DNA和RNA的杂交分子，或具有单链和双链区的混合物的杂交分子。此外，多核苷酸可以由包含DNA、RNA或两者的三链区组成。多核苷酸可以含有一个或多个修饰碱基，例如硫代磷酸酯(phosphothioate)，并且可以是肽核酸(PNA)。一般地，由本发明提供的多核苷酸可以由cDNA的分离或克隆片段、基因组DNA、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合装配。
术语“核苷酸序列”指核苷酸聚合物的碱基序列，包括但不限于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
如在本发明内使用的“基因序列”指核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，其编码多肽或生物活性RNA，并且包含仅编码蛋白质片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括位于编码序列上游或下游的对基因的表达具有调节功能的序列，和基因的内含子序列。
术语“启动子”指在基因的5'末端的核苷酸序列，其指导基因的转录起始。一般地，启动子序列对于驱动它与之可操作地连接的基因表达是必需但不一定足够的。在可表达基因构建体的设计中，将基因置于相对于启动子足够接近和处于合适方向，从而使得基因的表达受启动子序列控制。启动子优先置于基因上游且在转录起始位点一定的距离内，其大约是在启动子和它在其天然背景中控制的基因之间的距离。如本领域已知的，可以容许在这个距离中的一些变动，而无启动子功能的丧失。如本文使用的，术语“可操作地连接的”意指启动子以这样的方式与编码区连接，从而使得那个编码区的转录受那个启动子控制且调节。用于使启动子与编码区可操作地连接的方法是本领域众所周知的。
如本文使用的，“表达控制序列”包括启动子，并且可以包括但不限于：一种或多种增强子序列、转录终止序列、多腺苷酸化序列、3'或5'非翻译序列、内含子序列、核糖体结合位点、和可以稳定或在其他方面控制基因在植物细胞中的表达的其他序列。表达控制序列可以是内源的(即在植物宿主中天然发现的)或外源的(在植物宿主中未天然发现的)。外源表达序列可以是或不是植物序列，只要它们在所选条件下在植物细胞中起作用。
“异源基因”或“异源编码序列”指这样的基因或编码序列，其对于待转化或处理的植物是外源的或在待转化或处理的植物中未天然发现的，并且编码“异源多肽”或其生物活性片段。异源基因序列包括病毒、原核生物和真核生物序列。原核生物编码序列包括但不限于微生物序列、细菌序列或病毒序列(例如用于生产可以作为疫苗施用的抗原)。真核生物编码序列包括哺乳动物或人序列，但还可以包括来自非哺乳动物甚至其他植物的序列，包括但不限于前导或分泌信号序列、靶向序列等。在一个优选方面，异源基因核酸编码人蛋白质。术语“异源基因”或“异源编码序列”包括但不限于天然存在的、突变的、变体、化学合成的、基因组、cDNA、或此类序列的任何组合。提及“基因”包含编码生物活性蛋白质的全长基因或其片段。
如本文使用的，术语“异源肽”或“异源蛋白质”指由如上定义的“异源基因”或“异源编码序列”表达的肽，包括寡和多肽，或蛋白质。相应地，在植物中生产的“异源肽”或“异源蛋白质”对于植物是外源的或在植物中未天然发现的。“异源肽”或“异源蛋白质”可以是哺乳动物或人肽或蛋白质。“异源肽”或“异源蛋白质”甚至可以是植物肽或蛋白质，如果它是植物肽或蛋白质的变体或突变形式，或在生产植物物种、系或变种中未天然发现的肽或蛋白质。
如本文使用的，“T DNA边界”指包含能够由土壤杆菌属菌株的有毒基因产物识别的约25核苷酸长的序列的DNA片段，所述土壤杆菌属菌株例如根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)或毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)菌株，或其修饰或突变形式，并且对于将它与之连接的DNA序列转移至真核细胞优选植物细胞是足够的。这个定义包括但不限于来自野生型Ti质粒的所有天然存在的T-DNA边界，以及其任何功能衍生物，并且包括化学合成的T-DNA边界。在一个方面，根据本发明的表达构建体的编码序列和表达控制序列位于两个T-DNA边界之间。
术语“选择为提供瞬时表达”指表达构建体，其已特别通过去除稳定转化所需的常规二元载体的元件例如转化选择基因，特别设计用于在植物中的瞬时基因表达(参见例如，RP Hellens等人，Plant Methods 205，1：13)。
如本文使用的，术语“表面活性剂”指具有表面活性的试剂，其一般包含疏水部分和亲水部分(参见例如Bhairi，A Guide to the Properties and Uses of Detergents inBiological Systems，Calbiochem-Novabiochem Corp.1997)。
表面活性剂可以分类为阴离子、非离子、两性离子或阳离子型，取决于它们是否包含一个或多个荷电基团。阴离子型表面活性剂含有带负电的基团且具有净负电荷。非离子型表面活性剂含有不带电的极性基团且不具有电荷。这些表面活性剂一般是烯烃氧化物与烷基酚、或伯或仲醇的反应产物，或是氧化胺、氧化膦或二烷基亚砜(sulphoxide)。
可以适当地用于植物渗入系统中的表面活性剂例如公开于WO/2005/076766中。
特别地，示例性非离子型表面活性剂包括但不限于：叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 21)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween 40)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween 60)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单三油酸酯(Tween 85)、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)、三甘醇单月桂醚(Brij 30)、和脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20)。
两性离子型表面活性剂含有带正电的基团和带负电的基团，并且不具有净电荷。合适的两性离子型表面活性剂包括但不限于：甜菜碱例如羧基甜菜碱、磺基甜菜碱(也称为sultaines)、酰胺甜菜碱(amidobetaines)和磺基酰胺甜菜碱(sulfoamidobetaines)，此类可以包含C8-C18、优选C1o-C18、烷基甜菜碱、磺基甜菜碱、酰胺甜菜碱和磺基酰胺甜菜碱，例如月桂基酰胺丙基甜菜碱(LAB)型甜菜碱、n-烷基二甲基铵甲烷羧酸酯(DAMC)、n-烷基二甲基铵乙烷羧酸酯(DAEC)和n-烷基二甲基铵丙烷羧酸酯(DAPC)、n-烷基甜菜碱、n-烷基二甲基铵烷基磺酸酯、N-烷基二甲基铵乙烷磺酸酯(DAES)、n-烷基二甲基铵丙烷磺酸酯(DAPS)和n-烷基二甲基铵丁烷磺酸酯(DABS)、十六烷基二甲基铵丙烷磺酸酯、n-烷基酰胺甲烷二甲基铵甲烷羧酸酯、n-烷基酰胺甲烷二甲基铵乙烷羧酸酯、月桂胺丙基甜菜碱(LAB)、n-烷基酰胺甲烷二甲基铵甲烷磺酸酯、n-烷基酰胺乙烷二甲基铵乙烷磺酸酯和n-烷基酰胺丙烷二甲基铵丙烷磺酸酯、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-l-丙烷磺酸盐(CHAPS)和3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-2-羟基-l-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、磷脂(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二酰基磷脂酰胆碱、二烷基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、饱和与不饱和脂肪酸衍生物(例如乙酯、丙酯、胆固醇酯、辅酶A酯、硝基苯基酯、萘(naphtyl)酯、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、脂肪醇、脂肪醇乙酸酯等)、脂多糖、糖和鞘脂(shpingolipids)(例如神经酰胺、脑苷酯、半乳糖基甘油二酯、神经节苷脂、乳糖脑苷酯、溶血硫苷脂等)。
“阳离子型表面活性剂”在渗入条件下具有带正电的基团。合适的阳离子型表面活性剂包括但不限于：季胺或叔胺。示例性季胺表面活性剂包括但不限于西吡氯铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB；Calbiochem#B22633或Aldrich&num；85582-0)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC1；Aldrich&num；29273-7)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB，Sigma&num；D-8638)、十二烷基三甲基氯化铵(DTACI)、辛基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、十四烷基三甲基氯化铵(TTACI)、十二烷基乙基二甲基溴化铵(DEDTAB)、癸基三甲基溴化铵(D10TAB)、十二烷基三苯基溴化磷鎓(DTPB)、十八烷基三甲基溴化铵、司拉氯铵、油基二甲基苄基氯化铵(olealkonium chloride)、西曲氯铵、烷基三甲基磺酸甲酯铵、棕榈酰胺丙基三甲基氯化物、quaternium 84(Mackernium NLE；Mcintyre Group，Ltd.)、和小麦脂质环氧化物(Mackernium WLE；Mcintyre Group，Ltd.)。
示例性叔胺表面活性剂包括但不限于辛基二甲胺、癸基二甲胺、十二烷基二甲胺、十四烷基二甲胺、十六烷基二甲胺、辛基癸基二甲胺、辛基癸基甲胺、二癸基甲胺、dodecyhnethylamine、三乙酰基氯化铵、西曲氯铵、和烷基二甲基苄基氯化铵。其他类别的阳离子型表面活性剂包括但不限于：磷鎓、咪唑啉(imidzoline)和乙基化胺基。
阴离子型表面活性剂一般是有机硫酸盐和磺酸盐的水溶性碱金属盐。这些包括但不限于：月桂酸钾、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、甘油酯、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠等)。
可以另外使用共表面活性剂例如短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇。
可以使用任何上述表面活性剂的组合。上文未具体列出的表面活性剂进一步包含在本发明的范围内。
使用的表面活性剂的量将随着待处理的表面活性剂和植物组织的类型而改变(即在叶表面上覆盖的蜡的厚度等)。
一般地，表面活性剂以范围为0.005％-约1％体积的土壤杆菌属悬液的浓度使用。优选地，浓度范围为0.005％-约0.5％且更优选约0.005％-约0.05％。一般地，将使用比非离子型表面活性剂更低水平的离子型表面活性剂。
如本文使用的，术语“真空渗入”指允许致病菌例如土壤杆菌属穿透到细胞内或胞间隙内的方法，并且以研究在植物和致病菌之间的相互作用的方式。物理上，真空生成引起在植物组织中的细胞之间的空气隙减少的负大气压。真空的持续时间越长和压力越低，在植物组织内存在的空气隙越少。压力中的增加允许渗入介质包括感染性转化载体再定位到植物组织内。对于植物转化，真空可以在土壤杆菌属的存在下施加于植物部分一定时间段。
如本文使用的，术语“大气压”定义通过在地球大气中表面上的空气重量针对表面施加的力/单位面积。压力是对表面施加的力或重量/单位面积，并且以帕斯卡(Pa)测量。在表面上通过千克质量施加的压力等于9.8Pa。通过整个大气对地球的表面施加的压力是约100,000Pa。通常，大气压以毫巴(mb)引述。1mb等于100Pa，因此标准大气压是约1000mb。事实上，大气压的实际值取决于地点、海拔高度和天气条件而改变。在海平面上，通常观察到的值范围在970mb-1040mb之间。因为压力随着海拔高度而降低，所以在不同地点观察到的压力必须调整至相同水平，通常为海平面。
对在封闭容器中静止的封入流体施加的压力无丧失地传递给流体的每一个部分和容器的壁。对于静止的流体，在其中的两个点之间的压力中的差异取决于流体的密度和在两个点之间在深度中的差异。相应地，流体对浸入其内的所有主体施加压力，这等于在流体之上外部施加的压力加上来自液体重量的静态液压。
本文使用的技术和科学术语具有由本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有定义。本文参考本领域技术人员已知的多种方法。阐述对其作出参考的此类已知方法的出版物和其他材料通过引用整体合并入本文，如完全阐述一样。除非另有说明，本发明的实践将采用在本领域技术内的化学、分子生物学、微生物学和植物生物学的常规技术。
技术人员已知的任何合适材料和/或方法可以用于执行本发明：然而，描述了优选材料和/或方法。在下述说明书和实施例中提及的材料、试剂等可从商业来源获得，除非另有说明。
本发明涉及用于在植物中瞬时表达目的肽和/或蛋白质，特别是表达有药学价值的肽和/或蛋白质的系统和方法。特别地，本发明提供了用于将土壤杆菌属细胞引入全部和完整植物、或多个全部植物、或全部和完整植物的部分包括在植物学中的植物器官或组织内的方法。本发明的方法提供了许多植物个别或同时的有效土壤杆菌渗入，导致高于通过其他方法获得的那种的重组蛋白质得率。该方法可以容易地依比例决定且自动化，以满足重组蛋白质的变化的需求。
植物的土壤杆菌渗入目前根据这两种方法之一执行。
第一种方法使用填充土壤杆菌属细胞悬液的注射器，并且用细菌注射每片个别叶。将注射器置于叶的下侧上，并且将活塞轻轻推挤，从而使得细菌悬液扩展遍及叶。这种方法是费力的且不顺应按比例放大。
第二种方法涉及使用真空以帮助细菌通过植物的摄取。一般地，将植物颠倒置于室内，并且将它的叶整个浸入细菌悬液中。室中的压力达到几毫巴。空气最初通过真空从叶中退出，并且当空气再引入时，叶将液体往里拉。真空过程具有至少两个缺点，它是缓慢的，因为它花费数分钟将压力降低至希望的低压。真空对渗入植物生成特定不可忽略不计的应激，这导致具有难以从渗入过程恢复或经受住渗入过程的植物。
在一个方面，本发明提供了用于将土壤杆菌属细胞引入全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分，包括在植物学中的植物器官或植物组织内的改良方法。与本领域已知的使用真空或负压的方法不同，本发明的方法提供了正液压，或正和负液压的组合，以促进土壤杆菌属细胞渗入全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分，包括在植物学中的植物器官或植物组织。本发明还提供了用于将正液压递送至全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分，包括在植物学中的植物器官或植物组织的系统和工具，所述植物与或已与土壤杆菌属细胞接触。
根据本发明，当对全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分和细菌实施在封闭条件下用一个或多个压力循环的处理时，递送正液压。液压是在流体例如水或空气内的一些点上的压力。例如，在封闭条件下，其中包含的流体的容积是恒定的。在本发明的多个实施方案中，液压的详细说明指在固定容积的室内的气压。
当在其中实践本发明的方法的地点，液压超过封闭系统外的环境气压时，它被称为正压。当全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分，包括在植物学中的植物器官或植物组织和细菌已暴露于高于环境气压的靶压力时，提供正压或超压。术语超压和正压在本文中可互换使用。环境气压取决于在其中实践该方法的地点的海拔高度和在实践该方法时的天气条件而改变，并且可以通过本领域已知的技术和设备容易地测定。
许多单位可以用于表达压力的值。例如，巴是等于100千帕斯卡的压力单位，并且大致等于在海平面上在地球上的大气压。大气气压通常以毫巴给出，而标准海平面压力(1atm)定义为1013.25毫巴(hPa)，等于1.01325巴。
在本发明中有用的正压值因此可以依据环境气压的百分比值表达，例如但不限于110％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、350％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1050％、1110％、1150％、1200％或任何中间值，或大于前述的任何值。类似规定可以用于描述负压，其是低于环境气压的压力值。
正压可以备选地依据绝对值表达，例如但不限于1.1atm、1.5atm、2atm、2.5atm、3atm、3.5atm、4atm、4.5atm、5atm、5.5atm、6atm、6.5atm、7atm、7.5atm、8atm、8.5atm、9atm、9.5atm、10atm、10.5atm、11atm、11.5atm、12atm等等；或1.1巴、1.5巴、2巴、2.5巴、3巴、3.5巴、4巴、4.5巴、5巴、5.5巴、6巴、6.5巴、7巴、7.5巴、8巴、8.5巴、9巴、9.5巴、10巴、10.5巴、11巴、11.5巴、12巴，或任何中间值，或大于前述的任何值。当未提供空气气压用于在本文说明书中比较时，环境气压预期是在海平面上在地球上的标准大气压。
本文使用的术语“压力循环”指经过一段时间在压力中的一系列变化。在一个实施方案中，压力循环包含靶压力，即在给定时间段内待达到的压力。例如，在压力循环过程中，在室中的所需压力从与环境气压平衡起始，变成靶压力，并且返回环境气压。相应地，在本发明中使用的室可以通过增加压力超过大气空气起始压力循环，并且通过与大气空气平衡终止压力循环。
在本发明的多个实施方案中，起始压力和终止压力可以是不同的，并且可以各自不同于环境气压。例如，正气压的脉冲是单个压力循环。在特定实施方案中，压力循环可以包含多个靶压力，例如第一个靶压力、第二个靶压力、第三个靶压力等等。因此，不同压力循环可以各自具有不同起始压力和终止压力，和任何数目的不连续中间靶压力或从起始压力到终止压力的连续跃迁。
在本发明的方法中，可以施加多个不同的压力循环，并且各自可以施加一次或多次，例如但不限于二、三、四、五、六、七、八、九或十次。相应地，在本发明的方法中或甚至在压力循环中，随着时间过去的压力变动可以通过曲线图或波形表示，例如正弦波、矩形波、三角波或锯齿波、或接近前述之一的任何波形。
在本发明的多个实施方案中，依据持续时间或程度的液压的任何详细说明指施加于全部和完整植物、或多个全部植物、或全部和完整植物的部分的压力循环的总体持续时间和压力的峰值。例如，提及包含用至少4.5巴的压力处理全部植物或植物部分0.5秒的压力循环，意指施加于植物的压力的总体持续时间是0.5秒，其可以包括增加压力超过大气空气和通过与大气空气平衡终止压力循环的时期，具有4.5巴的峰值。
优选地，本发明的压力循环包含其为正压的靶压力。在特定实施方案中，本发明的方法不包含其为负压的靶压力。在其他实施方案中，本发明的方法包含其为正压的第一个靶压力以及其为负压的第二个靶压力。在其他实施方案中，本发明的方法包括其为负压的第一个靶压力以及其为正压的第二个靶压力。任选的休息期可以包括在本发明的方法中在压力循环之间。
此类休息期可以持续约0.01、0.05、0,1、0.2、0.3、0.4、0,5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5和直到10或更多秒。
在特定实施方案中，包含表达构建体的土壤杆菌属细胞渗入全部植物、或多个全部植物、特别是全部和完整植物或全部和完整植物的部分，包括在植物学中的植物器官或组织。在一个实施方案中，渗入在表面活性剂的存在下执行，包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子型表面活性剂。
可以使用的表面活性剂的非限制性例子是Triton X-100或Silwet L-77，显示对于植物的相对低毒性的强表面活性剂。
在使植物或植物组织在合适条件下温育后，所述条件允许在多个植物细胞中表达构建体表达目的肽或蛋白质，可以在植物或植物部分中例如植物器官或植物组织或在其细胞中检测到或定量蛋白质。在收获后，肽或蛋白质分离可以使用本领域常规方法执行。例如，可以将至少部分生物量匀浆化，并且将重组肽或蛋白质提取且进一步纯化。提取可以包含将匀浆物浸渍或浸入到合适溶剂中。纯化方法包括但不限于基于肽、蛋白质或蛋白质复合物的特定大小、待分类的肽或蛋白质的电泳迁移率、生物活性和/或净电荷，或基于标记分子在蛋白质中的存在的免疫亲和纯化和纯化程序。分离的肽或蛋白质的表征可以通过免疫测定或通过本领域已知的其他方法进行。例如，肽或蛋白质可以通过蛋白质印迹在SDS-PAGE凝胶上，或者当肽或蛋白质基本上纯化时通过考马斯蓝染色进行分析。
在本发明的另一个实施方案中，提供系统以处理全部植物、特别是全部和完整植物或植物部分例如植物器官或植物组织，其已在施加正液压后与土壤杆菌属细胞接触。本发明的系统包含用于接受全部植物、特别是全部和完整植物或植物部分例如植物器官或植物组织、或多个此类全部植物或植物部分的室，和用于递送正液压的工具。室可以通过本领域已知的任何材料制备，其维持用于本发明目的的限定形状且对于在本发明中使用的流体是不可渗透的。室包含多个入口和出口，包括可以通过其接受或取回全部植物或植物部分例如植物组织，并且调节室中的压力的至少一个开口。在特定实施方案中，室包含适合于与室密封衔接以关闭室的开口和盖，形成通过室或盖侧面的阀门开口的工具，和用于可释放地维持室和盖在密封衔接中以锁定位置的扣紧工具；和就阀门开口而言固定的至少一个弹性阀工具，用于提供在室内部和外部之间的流体通道。
系统可以任选提供多个全部植物或植物部分由其与土壤杆菌属细胞接触的工具。优选地，全部植物或植物部分与土壤杆菌属细胞的接触在其中递送正压的室中执行。正液压可以通过本领域已知的任何方法递送。
在一个实施方案中，本发明提供了全部和完整植物颠倒置于室内部，并且它的叶整个浸入包含土壤杆菌属细胞的液体中。经由入口阀通过减压器将室与压缩空气来源连接。室还包含安装在一个壁优选室的盖子上的解压阀。减压器和入口阀用于调节室中的压力，从而使得可以在室中获得一个或多个靶压力。例如，为了开始正压的递送，将室关闭，并且将入口阀切换到关，并且将减压器设为靶压力。在植物浸入液体中之后，将入口阀打开足以使室达到靶压力的第一个时间段，和当靶压力在室中维持时的第二个时间段。在时间段已过去后，将入口阀关闭，并且将解压阀打开，允许室返回环境气压。
在另一个实施方案中，本发明提供了置于室内的全部和完整植物，所述室包含在室侧面上的多个喷嘴和解压阀。喷嘴连接至共有歧管，其依次经由第一个入口阀连接至包含土壤杆菌属细胞的液体储库。压缩空气的来源通过减压器和第二个压力阀连接至喷嘴。减压器用于设置在室中获得的靶压力。例如，为了开始正压的递送，将室关闭，将入口阀、压力阀和解压阀都关闭，并且将减压器设为靶压力。随后，将入口阀和压力阀配合打开，从而使得包含细菌的液体通过压缩空气雾化或气溶胶化，并且通过喷嘴喷射到室内的植物上。将入口阀和压力阀、或压力阀打开足以使室达到靶压力的第一个时间段和当靶压力在室中维持时的第二个时间段。在时间段已过去后，将入口阀和/或压力阀关闭，并且将解压阀打开，允许室返回环境气压。
在本发明的其他实施方案中，考虑将液体液压(或水压)施加于封入容积的渗入介质，其中浸没全部和完整植物或全部和完整植物的部分。液体液压可以通过任何常规的工具供应，例如但不限于水压泵包括齿轮泵、叶轮泵和活塞泵。
除了上述设备外，本发明的系统可以进一步包含多个其他设备，例如阀(例如安全阀、止回阀、手动阀、自动阀、针形阀等，以及包含前述阀中的至少一种的组合)、滤器(例如细菌滤器、粒子滤器等及其组合)、传感器(例如压力、温度、流动、湿度、导电性、气体混合物、液面等，以及包含前述传感器中的至少一种的组合)、用于温度的控制器(例如加热器、热交换器、冷却器、干燥器等)、用于压力的控制器(例如压缩机等)、流动控制器(例如泵、扇、鼓风机等)、以及包含前述控制器中的至少一种的组合、和导管(例如流体导管、电导管等)、以及包含前述导管中的至少一种的组合。
除了上述设备外，本发明的系统可以任选进一步包含用于将多个全部植物或植物部分例如植物器官或植物组织从地点转运到室的工具，用于促进多个全部植物或植物组织与土壤杆菌属细胞的接触的工具，用于在室中接受多个全部植物或植物组织的工具，用于将多个全部植物或植物部分例如植物器官置于且再置于室中的工具，用于从室中取回多个全部植物或植物部分的工具。优选地，一种或多种前述工具是自动化机电系统，并且包括但不限于摩托化转运系统、工厂自动化系统、安全系统、过程控制系统、数据通信系统、数据贮存系统和计算系统。
在本发明的一个实施方案中，室包含用于接受且放置多个全部和完整植物在室内的工具，从而使得整个植物与包含土壤杆菌属细胞的渗入介质接触。特别地，多个植物这样放置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质中。在这个配置中，整个植物包括植物的地上部分以及地下部分与含有土壤杆菌属细胞的渗入介质接触。对浸没植物实施一个或多个压力循环，其中所述压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加，并且在特定实施方案中，压力维持在0.5秒–60秒之间的时期。在一个或多个压力循环过程中，将室关闭且密封，优选在其内不含空气或具有可忽略不计的空气，从而使得当压力施加到封入的渗入介质上时，由于来自室壁的抵抗力，室变得加压，并且基本上均匀的压力传递遍及含有浸没植物的室。在这个配置中，作用于浸没植物的压力与施加于系统的基本上相同。
在本发明的另一个实施方案中，室包含用于在室内接受且放置多个全部和完整植物的工具，从而使得仅部分植物变得与含有土壤杆菌属细胞的渗入介质接触。特别地，多个植物这样放置，从而使得植物的所有或部分地上部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质中，而植物的地下部分特别是植物的根不浸没到渗入介质中。在这个配置中，对整个植物包括地上部分以及地下部分实施一个或多个压力循环，其中所述压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加，并且在特定实施方案中，压力维持在0.5秒–60秒之间的时期。
图5显示了本发明的此类实施方案的例子。系统10含有具有盖子12的室11。具有盖子12，室11可以密封关闭。如图5中所示，在这个例子中，全部和完整植物13在室内颠倒提供，其中植物的地上部分整个浸入液体中。系统10还包含液体槽14，其通过导管15与室11连接。液体槽14包含与活塞17连接的柱塞杆16。当活塞17向下移动时，来自液体槽14的液体将通过导管15压缩到室11内。室11中的液面以及压力这样升高，从而使得植物的叶浸入且实施相对于大气压的压力。
在本发明的另外一个实施方案中，将多个植物这样置于室中，从而使得植物的所有或部分地上部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且实施一个或多个压力循环，其中所述压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加，并且在特定实施方案中，压力维持在0.5秒–60秒之间的时期。在这个配置中，植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。在一个或多个压力循环过程中，将室关闭且密封，优选在其内不含空气或具有可忽略不计的空气，从而使得当压力施加到封入的渗入介质时，由于来自室壁的抵抗力，室变得加压，并且基本上均匀的压力传递遍及含有植物的浸没地上部分的室。在这个配置中，作用于浸没植物的压力与施加于系统的压力基本上相同。
为了在室内部容纳全部和完整植物的地上部分，而地下部分置于室的外部，室的一个侧面一般为顶部可以包含一个或多个开口，以允许植物的地上部分在插入或取出过程中的经过。开口的尺度由于在开口中全部和完整植物的部分的存在而是可变的。开口衬有弹性密封，从而使得尽管开口的可变尺度，开口仍可以关闭。密封的弹性可以帮助保护植物部分不受机械损害。一般地，整个完整植物这样放置，从而使得由于密封的弹性，在主茎周围形成密封。弹性密封可以配置为彼此相对且针对彼此滑动以关闭开口，有效形成暂时的气密或防水连接。在压力循环过程中，室可以暂时加压，而渗入介质和植物的地上部分通过弹性密封封入。
此类实施方案的例子显示于图6中。图6是室20的示意性横断面视图。室20具有两个壁部分21、22，其借助于铰链23彼此连接。图6中的左图显示处于其打开状态的室20。在两个壁部分21、22的游离端，提供可膨胀密封24。图6的右图显示处于其关闭状态的室20，其中两个密封24是膨胀的，从而使得室是紧密密封的。
图7显示室26的透视示意性视图。左图中所示的室26处于其打开状态，其中两个可膨胀密封24彼此隔开。每个密封在盖子部分25的边缘上提供。盖子部分25可朝向彼此移动以及彼此远离，例如以滑动方式。一旦植物部分插入(参见图7中的右上图)，两个盖子部分25就在植物的茎周围关闭，并且密封24膨胀以便紧密密封室26。
本领域技术人员应当理解具有可移动盖子部分和纵向密封24的所示排列仅是示例性实施方案，并且其他配置由本发明包含。例如，代替具有圆柱状或管状形式，室26可以具有球形形式，具有用于接受植物的部分的圆形开口。沿着圆形开口的边缘，可以提供单个环状密封，其可膨胀至这样的程度，从而使得它在植物的茎周围关闭室的整个开口，以便提供气密或防水密封。
在特定实施方案中，本发明提供了弹性气力或液压密封，其中密封各自包含在充气压力下在其中引入压缩空气或惰性气体或水力流体的腔。充气压力引起否则空瘪的密封弹性扩充到密封和整个完整植物的部分之间的空隙内，有效形成暂时的气密或防水连接。在一个特定配置中，至少两个相对密封衬里在其中放置一个或多个整个完整植物的主茎的开口。在充气后，相对密封扩充到在它们之间的间隙内，直至它们彼此推撞，并且使植物的主茎陷入它们之间，以形成暂时的气密或防水连接。一旦去除密封充气压力，密封就返回其空瘪位置，有效释放室内部的压力。在一个实施方案中，考虑充气压力对弹性密封的施加和水压对室中的渗入介质的施加可以是连续的。优选地，充气压力对弹性密封的施加在水压施加之前，从而使得在室变得加压之前形成连接。
压缩空气通常用作充气介质，而在一些应用中，可以应用水力(液体)工具。充气密封提供在三个不同平面的通用配置：径向进入(radially in)、径向离开(radially out)和轴向。以跳闸形式的密封可以形成封闭末端、斜接末端和连续环。气力密封或液压密封可以由多种弹性体制成，包括硅酮、丁二烯苯乙烯(SBR)、氯丁二烯(Neoprene)、乙丙烯(EPDM)和氟代烃
本领域技术人员将认识到，通过具有广泛范围的电子部件例如硬件、软件、固件或事实上其任何组合的多个类型的机电系统；和可以赋予机械力或运动的广泛范围的部件例如刚体、弹簧或扭体、水力和电磁致动装置、或其任何组合，可以个别和/或共同实现本文描述的多个实施方案。因此，如本文使用的“机电系统”包括但不限于与换能器(例如致动器、发动机、压电晶体等)可操作地连接耦合的电路，具有至少一个不连续电路的电路，具有至少一个集成电路的电路，具有至少一个专用集成电路的电路，形成通过计算机程序配置的通用计算装置的电路(例如通过计算机程序配置的通用计算机，其至少部分执行本文描述的过程和/或装置，或通过计算机程序配置的微处理器，其至少部分执行本文描述的过程和/或装置)，形成存储装置(例如随机存储器形式)的电路，形成通讯装置的电路(例如调制解调器、通讯开关或光电设备)，和关于其的任何非电子类似物例如光学或其他类似物。
在多个实施方案中，包含具有一种或多种目的基因、特别是一种或多种异源目的基因的表达构建体的土壤杆菌属的细胞用于将一种或多种基因递送至全部和完整植物或植物部分，例如植物器官或植物组织，用于在植物或植物部分的细胞和/或细胞外间隙中的瞬时表达。一般地，合适的表达构建体包含：至少一个T-DNA边界序列、表达调节序列(例如可以是诱导型或组成型的启动子、其活性是组织特异性或有组织偏向的启动子)、和可操作地连接表达调节序列的目的基因。在特定实施方案中，表达构建体进一步包含处于合适启动子控制下的可选标记基因和进一步的表达调节序列。在特定实施方案中，表达构建体是包含一个或多个复制起点的载体的部分，至少一个复制起点适合于在土壤杆菌属物种中复制包含表达构建体的载体。
可以在本发明中使用的土壤杆菌属物种包括但不限于根瘤土壤杆菌、毛根土壤杆菌、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacte)、覆盆子土壤杆菌(Agrobacteriumrubi)、葡萄土壤杆菌(Argobacterium vitis)，但特别是根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。在一个实施方案中，至少一个土壤杆菌属菌株包含根瘤土壤杆菌。使用的土壤杆菌属物种可以是野生型(例如剧毒)或可转化态菌株。合适的土壤杆菌属菌株包括野生型菌株(例如根瘤土壤杆菌)，或其中一种或多种基因突变以增加转化率的菌株，例如由于突变型或嵌合virA或virG基因的存在，其中vir基因表达和/或其诱导改变的土壤杆菌属菌株(例如Chen和Winans，1991，J.Bacteriol.173：1139-1144；和Scheeren-Groot等人，1994，J.Bacteriol.176:6418-6246)，包含优选连接至多拷贝质粒的额外virG基因拷贝例如衍生自pTiBo542的超virG基因的土壤杆菌属菌株，如例如美国专利号6,483,013中描述的。其他合适的菌株包括但不限于根瘤土壤杆菌C58C1(Van Larebeke等人，Nature 252：169-170(1974))，A136(Watson等人，J.Bacteriol 123：255-264(1975))；LBA401 1(Klapwijk等人，J.Bacteriol 141：128-136(1980))，LBA4404(Hoekema等人，Nature 303：179-180(1983))；EHA101(Hood等人，J.Bac.168：1291-1301(1986))；EHA105(Hood等人，Trans Res.2：208-218(1993))；AGL1(Lazo等人，Bio/Technology 2：963-967(1991))；A281(Hood等人，同上(1986))。
各自表达不同基因的多重土壤杆菌属菌株可以用于生产个别蛋白质或异源多聚体蛋白质，或增强目的肽或蛋白质的得率。可以表达的不同基因的非限制性例子是编码病毒起源的沉默阻抑蛋白的基因。备选地或另外地，单个土壤杆菌属菌株可以包含多个序列，其包含不同目的基因，特别是异源目的基因。不同基因可以包含在单个核酸分子(例如单个载体)内，或可以在不同载体中提供。
本发明的方法可以用于许多植物物种的土壤杆菌属渗入和瞬时表达，包括但不限于：烟草(烟草属物种)、莴苣、苜蓿、绿豆、菠菜、蒲公英、菊莴、芝麻菜、苦苣、茅菜、菊苣、朝鲜蓟、玉蜀黍、马铃薯、稻、大豆、棉花、小粒谷类作物、小麦、大麦、高粱、甜菜、芥花、十字花科植物(Crucifera)(例如芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabidopsis))、浮萍和番茄。
合适的植物器官或组织一般可以是植物的任何部分。在一个优选方面，植物组织是叶组织。在一个方面，植物组织是来自植物的叶组织，其包含在至少一个尺度中至少约7-8cm的叶。
在多个实施方案中，选择植物物种、变种或甚至植物器官，其细胞包含消化异源蛋白质的无法检测或低水平的蛋白酶，例如在植物中表达的小于约5％、小于约1％、小于约0.1％的异源蛋白质在从表达异源蛋白质的核酸引入到至少大约蛋白质从植物组织中分离的时间的时间段过程中消化。蛋白酶水平可以使用本领域常规的方法进行测定，包括异源蛋白质表达的蛋白质印迹分析。
烟草属的示例性物种包括但不限于：非洲烟草(Nicotiana africana)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)、阿瑞特希烟草(Nicotiana arentsii)、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、Nicotiana bigelovii、Nicotiana corymbosa、德布尼烟草(Nicotianadebneyi)、高烟草(Nicotiana excelsior)、Nicotiana exigua、粘毛烟草(Nicotianaglutinosa)、古德斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)、野生烟草(Nicotiana gossei)、西烟草(Nicotiana hesperis)、因古儿巴烟草(Nicotiana ingulba)、金氏烟草(Nicotianaknightiana)、海滨烟草(Nicotiana maritima)、麦格隆熄丰烟草(Nicotianamegalosiphon)、摩西氏烟草(Nicotiana miersii)、内索菲拉烟草(Nicotiananesophila)、Nicotiana noctiflora、裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)、耳状烟草(Nicotiana otophora)、帕欧姆烟草(Nicotiana palmeri)、圆锥烟草(Nicotianapaniculata)、碧冬烟亚属(Nicotiana petunioides)、Nicotiana plumbaginifolia、Nicotiana repanda、莲座烟草(Nicotiana rosulata)、圆叶烟草(Nicotianarotundifolia)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana setchelli、斯托克通氏烟草(Nicotiana stocktonii)、东方烟草(Nicotiana eastii)、香甜烟草(Nicotianasuaveolens)、或三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)。希望地，第一种烟草植物是抱茎烟草、本氏烟草、Nicotiana bigelovii、德布尼烟草、高烟草、粘毛烟草、古德斯比氏烟草、野生烟草、西烟草、金氏烟草、海滨烟草、麦格隆熄丰烟草、裸茎烟草、圆锥烟草、Nicotianaplumbaginifolia、Nicotiana repanda、黄花烟草、香甜烟草或三角叶烟草。
烟草的示例性变种包括商业变种例如DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX 2A、Coker 319、Hicks、McNair、944(MN 944)、Burley 21、K149、Yaka JB 125/3、Kasturi Mawar、NC 297、Coker 371 Gold、Wislica、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21 x Hoja Parado的F4、系97、Samsun、PO1BU64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、KT 200、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY 160、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14.times.L8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、OXFORD207、`Perique`烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG17、RG 81、RG H4、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、SP 168、SP 172、SP 179、SP 210、SP220、SP G-28、SP G-70、SP H20、SP NF3、TN 86、TN 90、TN 97、TN D94、TN D950、TR(TomRosson)Madole、VA 309、VA 309或VA 359。
可以使用任何阶段的烟草植物，特别地烟草植物处于阶段6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在本发明的特定实施方案中，使用在阶段8、9或10的植物，其中植物具有约6.5cm-约16.5cm的平均高度。在阶段10，植物是5-6周龄，并且具有约15cm的高度，具有充分展开的叶和最大限度的一朵花开放。
鉴定范围为1–9量表的烟草中的关键生长阶段的备选系统公开于2009年2月的CORESTA Guide N°7中，“A Scale For Coding Growth Stages In Tobacco Crops”，TaskForce Growth Stages and Identification Keys for Tobacco，第1-15页，Centre deCo-operation pour les Recherches Scientifiques au Tabac.(http://www.coresta.org/Guides/Guide-No7-Growth-Stages_Feb09.pdf)。根据CORESTA系统，可以使用在生长阶段2–8中的植物，但特别是在生长阶段3–5中的植物。
具有大叶表面积的烟草植物是优选的。本发明的特别优点是已生长的植物可以用于本发明的方法中，或用作植物组织的来源。
本发明提供了使得能够利用在生长中的商业可获得的植物特别是烟草中的蛋白质生产的系统和方法，且提供在短时间段内取得用于治疗或预防用途的所需量重组异源肽或蛋白质的问题的新解决方案。
在本发明的一个方面，该方法包括将包含编码异源目的肽或蛋白质或其生物活性片段的序列的表达构建体引入全部植物或植物部分例如植物组织内，并且在植物或植物部分中瞬时表达蛋白质。编码序列可操作地连接至能够驱动编码序列在植物或植物部分的细胞和/或细胞外间隙中的转录的表达控制序列。优选地，表达构建体包含来自大肿瘤诱导(“Ti”)质粒的T-DNA的至少一个T边界序列。此外，优选地，表达构建体包含在能够在土壤杆菌属物种例如根瘤土壤杆菌的至少细胞中复制的载体内。在一个方面，全部植物或植物部分包含来自已生长的植物的叶组织。优选地，植物包含相对大的叶(例如在至少一个尺度中大于约7-8cm)，例如烟草)。
表达构建体可以是表达载体的部分，并且可以包括另外的所需序列例如细菌复制起点(土壤杆菌属和/或大肠杆菌(E.coli)复制起点)、在细菌例如土壤杆菌属和/或植物细胞中起作用的报道基因(例如GUS、GFP、EGFP、BFP、β-半乳糖苷酶及其修饰形式)和可选标记基因(例如抗生素抗性基因等)。为此，在本发明的方法中使用的外源DNA也可以包含标记基因，其表达允许在最初克隆阶段过程中转化细胞与非转化细胞的分开。此类标记基因一般编码允许在表型上区分转化细胞与非转化细胞的蛋白质。然而，根据本发明的瞬时蛋白质生产方法的优点是不需要标记基因从表达构建体/载体引入其内的植物组织中分离异源肽或蛋白质。
表达构建体可以进一步补充有沉默阻抑蛋白，特别是病毒沉默阻抑蛋白，包括但不限于PVX的p25蛋白质、烟草蚀纹病毒的P1-HcPro蛋白质、和番笳丛矮病毒的p19蛋白质。
如本文使用的，瞬时表达水平指表达至少约250微克、至少约500微克、至少约750微克、至少约1mg、至少约2mg、至少约3mg、至少约4mg、至少约5mg、至少约10mg、至少约15mg、至少约25mg、至少约50mg、至少约75mg、至少约100mg、至少约150mg、至少约200mg、至少约500mg、至少约1000mg、至少约1.5g、至少约2g、至少约2.5g、至少约5g、至少约7.5g、至少约10g、至少约15g或至少约20g/kg植物组织质量的能力。如本文使用的，“瞬时的”指足够长以允许蛋白质与合适的植物组织分离的时间段。优选地，蛋白质表达在表达构建体引入植物组织内至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天或至少约15天内处于合适的高水平。在一个方面，在表达构建体引入植物组织内3-7或5-10天内、且更优选3-5或5-7天内获得合适的高水平。
通过本发明的方法生产的重组蛋白质可以用作药物，并且可以就其效用作为营养物(nutraceutical)和药用化妆品表达，因为这些产品用于直接摄入、注射或应用(例如局部施用)于人。还可以表达对于类似管理的兽医产品生产有用的重组蛋白质。可以生产的示例性蛋白质包括但不限于：生长因子、受体、配体、信号分子；激酶、酶、激素、肿瘤抑制基因、血液凝固蛋白质、细胞周期蛋白质、代谢蛋白质、神经元蛋白质、心脏蛋白质、在特异性疾病状态中缺陷的蛋白质、抗体、抗原、对疾病提供抗性的蛋白质、抗微生物蛋白质、干扰素和细胞因子。
在一个方面，抗原编码序列包括用于诱导保护性免疫应答(例如如在疫苗制剂中)的序列。此类合适抗原包括但不限于微生物抗原(包括病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原等)；来自多细胞生物(例如多细胞寄生虫)的抗原；变应原；和与人或动物病理学(例如癌症、自身免疫病等)相关的抗原。在一个优选方面，病毒抗原包括但不限于：HIV抗原；用于赋予针对流感的保护性免疫应答的抗原；轮状病毒抗原；炭疽抗原；狂犬病抗原；等。疫苗抗原可以作为多价肽或多肽编码，例如包含在表达构建体中重复且任选通过一个或多个接头序列分离的不同或相同抗原编码序列。
本发明的方法还可以用于表达一种或多种基因，以再生产用于化学合成或用于工业过程的酶促途径。
本发明进一步通过参考下述非限制性附图、表和实施例进行描述。
图表简述
图1显示了包含压力室的超压系统设置的示意性视图。V1、V2、V3：阀；M1：压力计；S1：消音器。
图2显示了经过关于荧光应答值的实际范围的2D等高线图(PMF015)。
图3显示了经过关于荧光应答值的实际范围的2D等高线图(PMF132)。
图4显示了经过关于荧光应答值的实际范围的2D等高线图(PMF204)。
图5显示了在压力下用于将土壤杆菌属细菌渗入全部和完整植物内的系统的示意性视图。
图6显示了室20的示意性横断面视图。
图7显示了室26的透射示意性视图。
表1显示了关于在土壤杆菌属接种物制备内使用的组合物A91(携带用于荧光蛋白质TurboGFP的基因的菌株AGL1)和A17(携带关于p19沉默阻抑蛋白基因的AGL1菌株)的实验信息。
表2显示了关于在土壤杆菌属接种物制备内使用的组合物A91(携带用于荧光蛋白质TurboGFP的基因的菌株AGL1)和A17(携带关于p19沉默阻抑蛋白基因的AGL1菌株)的实验信息。
表3显示了关于在渗入实验内使用的参数的六种不同条件。
表4显示了关于在进一步的渗入实验内使用的参数的九种不同条件。
表5显示了在植物提取物(来自仅用不表达TurboGFP的A17渗入的N.b.叶样品的模拟提取物)中的TurboGFP对照蛋白质(rTurbo GFP，Evrogen #FP552)的标准稀释物。
表6显示了基于以μg GFP/g冷冻重量表示的GFP浓度在条件之间的差异分析，具有95％置信区间。
表7显示了基于以％TSP(“总可溶蛋白质”)表示的GFP浓度在条件之间的差异分析，具有95％置信区间。
表8显示了基于μg GFP/g渗入叶的冷冻重量在条件之间的差异分析，具有95％置信区间。
表9显示了基于mg GFP/植物在条件之间的差异分析，具有95％置信区间。
表10显示了基于以％TSP(“总可溶蛋白质”)浓度百分比的GFP浓度在条件之间的差异分析，具有95％置信区间。
表11显示了在最佳条件和参考中比较超压的ANOVA。
表12显示了对于最佳条件和参考具有个别95％置信区间的平均值。
前述说明书参考下述实施例将得到更全面理解。然而，此类实施例是实践本发明的示例性方法，并且不预期限制本发明的范围。
实施例
部分A：与用于转染本氏烟草的真空相比较，通过正压的土壤杆菌渗入的效率评价
实施例1:总体设置：
将植物用由A91(携带关于荧光蛋白质TurboGFP的基因的AGL1土壤杆菌属菌株)和A17(携带关于p19沉默阻抑蛋白基因的AGL1土壤杆菌属菌株)的混合物组成的细菌悬液渗入。
TurboGFP是从桡足动物羽小角水蚤(Pontellina plumata)(节肢动物门；甲壳类；颚足纲；桡足亚纲)[Shagin DA,等人，GFP-like proteins as ubiquitous metazoansuperfamily：evolution of functional features and structural complexity.MolBiol Evol.2004；21(5):841-50.]中克隆的绿色荧光蛋白CopGFP的改善变体。它具有亮绿色荧光(激发/发射最大值＝482/502nm)，其比其他绿色荧光蛋白的荧光更早可见。TurboGFP可从Evrogen(Evrogen Joint Stock Company；Miklukho-Maklaya str，16/10，117997，Moscow，俄罗斯)获得。
TurboGFP在渗入植物中的表达是
1)通过在渗入后两天到收获当天之间在蓝光下全部植物或脱落的渗入叶的成像有规律地监控和
2)在微板荧光阅读器中在提取后定量。
1.1真空渗入：真空渗入用具有30x30x30cm的内部尺度的Labconco真空室执行，所述真空室通过添加真空安全阀(5mm直径)和V-710Büchi泵(3.8m3/小时)+V-855调节器修饰。应用的真空参数如下：
-在3分钟内压力从大气下降到50微巴绝对值，
-在50微巴时的1分钟保持时间，
-在约3秒内的快速减压。
对于这个实验，通过在填充细菌悬液的1或2L烧杯中浸入地上部分一次渗入一个植物。
1.2超压：超压设置显示于图1中。通过连接至顶盖的专门固定器，将植物颠倒置于一个压力室(约10升的容积)内。固定器位置调整至使液体表面和固定器之间的清除率降到最低。一旦盖子关闭，将执行下述顺序以用正压处理植物和土壤杆菌属：
1.伴随手动球阀V2和V3关闭，将调节阀V1设为所需压缩气压。
2.将V2打开10秒，并且通过压力计M1监控在槽内部达到的压力。
3.将V2关闭，并且通过打开V3且通过消音器S1通风系统使槽回到大气压。
4.将盖子打开，从固定器中取出植物。
实施例2:土壤杆菌属接种物的制备
制备由A91(携带关于荧光蛋白质TurboGFP的基因的AGL1菌株)和A17(携带关于p19沉默阻抑蛋白基因的AGL1菌株)的混合物组成的6x浓缩接种物(表1和2)，并且贮存于4℃直至渗入当天。
表1
| 组成 | A91-A17 |
| 体积 | 3.3L |
| OD600nm | 1.926 |
| 浓度 | 6X |
| 待稀释成xL渗入溶液 | 16.7L |
| 渗入溶液组成 | 5mM MES，10mM MgCl2，pH5.6 |
| 甘油1 | A91.393 09.09.09 JBE |
| 甘油2 | A17.1 16.06.09 SRO |
| 最终OD600培养物1 | 3.3 |
| 最终OD600培养物2 | 3.1 |
表2
| 组成 | A91-A17 |
| 体积 | 2x 1L |
| OD600nm | 2.0 |
| 浓度 | 6X |
| 待稀释xL渗入溶液稀释 | 2x 5L |
| 渗入溶液组成 | 5mM MES，10mM MgCl2，pH5.6 |
| 甘油1 | A91.393 09.09.09 JBE |
| 甘油2 | A17.1 24.09.09 SRO |
| 最终OD600培养物1 | A91：2.27 |
| 最终OD600培养物2 | A17：2.25 |
在渗入起始前～1小时，将浓缩接种物在室温(～20℃)在渗入溶液(5mM MES，10mMMgCl2，pH5.6)中稀释至1x终浓度。1x终浓度对应于具有A91和A17的1:1比的最终OD600nm0.3。
对于第二个实验，在渗入溶液中制备1％(v/v)Triton X-100原液，并且当指定时，以1:100稀释度加入渗入槽中的接种物，以达到0.01％(v/v)的最终Triton X-100浓度。
实施例3:生物量生产
本氏烟草登记MIM植物在具有20小时光照、26℃/20℃日/夜温度和70％/50％日/夜相对湿度的温室中生长。当自然光在200W/m2(20小时光)下时，人工照明在02h00-22h00之间自动打开，使用15’000或20’000Lux照明系统，给予约100μmol/m2/s的PAR。使植物在石棉块(Grodan Delta Grow Blocks尺寸6.5)中生长。每2天应用通过地下灌溉的肥灌(Fert-irrigation)：在30分钟过程中25mm水。将施肥调整至EC 2.5mS/cm和pH 5.8。
实施例4:渗入参数
在渗入实验中，比较六种不同条件。使用的参数在表3中报道。
表3
| 次序 | 条件 | 靶压力[巴] | 保持时间[秒] | 重复数 | 植物# |
| 1 | 真空 | 0.05绝对值 | 60 | 6 | 1-6 |
| 2 | 超压 | 1 | 10 | 6 | 7-12 |
| 3 | 超压 | 2.5 | 10 | 6 | 13-18 |
| 4 | 超压 | 0.5 | 10 | 6 | 19-24 |
| 5 | 超压 | 1.5 | 10 | 6 | 25-30 |
| 6 | 超压 | 2 | 10 | 6 | 31-36 |
在第二个渗入实验中，比较九种不同条件。使用的参数在表4中报道。
表4
| 次序 | 条件 | 靶压力[巴] | 保持时间[秒] | 重复数 | 植物# |
| 1 | 注射器 | 未知 | - | 6 | 1-6 |
| 2 | 真空 | 0.05绝对值 | 60 | 6 | 7-12 |
| 3 | 超压 | 2.5 | 10 | 6 | 13-18 |
| 4 | 超压 | 1.5 | 10 | 6 | 19-24 |
| 5 | 超压 | 2.0 | 10 | 6 | 25-30 |
| 6 | 超压 | 3.5 | 10 | 6 | 31-36 |
| 7 | 超压 | 3.0 | 10 | 6 | 37-42 |
| 8 | 超压+0.01％Triton | 2.5 | 10 | 6 | 43-48 |
| 9 | 真空+0.01％Triton | 0.05绝对值 | 60 | 6 | 49-54 |
在起始渗入顺序前立即称重植物。在渗入结束时，将植物拿出室且在“滴水支架”中保持颠倒。重量测量分别在通风步骤完成后2和10分钟进行。在这两次测量之间，植物再次颠倒置于支架中，而在最后一次称重结束时，将它们置于恢复区中。在渗入前和后重量中的差异可以用作植物中渗入的接种物体积的指示物。
实施例5:恢复和温育条件
在渗入后，将植物置于S2区室中的温室木架上直至收获时。当需要时，使用滴灌系统将水和肥料施用于植物。在恢复和温育期过程中使用的环境条件例如施肥、光周期和温度与用于生长植物(参见上文)的环境条件相同。不存在植物的暗温育，因为先前已显示它不影响turboGFP表达。
实施例6:用于荧光成像的设置
通过在渗入后5或6天在蓝光下给植物拍照监控turbo GFP的瞬时表达。使用Dark阅读灯(HL32T Hand Lamp，Clare Chemical Research，USA)，其发出在turbo GFP的激发范围内的光(在482nm处的最大激发)。用配备由灯制造商提供的琥珀色滤光器的数码相机在暗环境中拍照。
实施例7:收获
随后将植物置于蓝光下，并且收集显示荧光的所有展开且渗入的叶。不收获仅在尖端显示荧光的在主和腋生枝的顶点上的叶。将收获的叶首先置于塑料布下用于荧光成像。随后将它们置于拉链袋中，并且转移至4℃直至收获完成时。随后将所有袋带回实验室且转移至-80℃直至叶加工用于分析时。
实施例8:荧光定量
使用咖啡磨/干冰法将每个袋的内容物磨碎成细粉，从而使得一个样品对应于从完全匀浆化的单个植物收获的所有渗入叶。在干冰上制备1.00g+/-0.05g冷冻重量的粉末的次级样品用于提取。通过共20秒的两个涡旋步骤随后为以20’000g离心15分钟，对于3mL提取缓冲液(50mM Tris碱；100mM NaCl；EDTA 1mM；0.2％Triton X-100；pH 7.5)以1g冷冻重量的比执行提取。将可溶提取物保持在冰上用于分析。
用Blue光学试剂盒(激发：490nm/发射：510-570nm)以荧光模式，通过在Modulus微板阅读器(Turner Biosystems)上的荧光测量测定提取物中的TurboGFP浓度(最大激发：482nm/最大发射502nm)。将提取物在提取缓冲液中1:100稀释，并且将200μL一式三份装载到黑色96孔板上。通过将不同量的TurboGFP对照蛋白质(rTurbo GFP，Evrogen #FP552)加入在提取缓冲液中1:100最终稀释的模拟提取物(来自仅用A17渗入且在与对于样品所述相同的条件下制备的N.b.叶样品的提取物)中制备标准曲线。来自1:100稀释的样品的荧光范围为在第一个实验中的0.4-1.3x10’000单位和在第二个实验中的1.4-2.5x10’000单位，其中在一式三份之间的变异系数(CV)<2％。
表5
作为TurboGFP浓度函数的荧光单位的标准曲线。由200μL的TurboGFP对照蛋白质(rTurbo GFP，Evrogen #FP552)在如表中所示制备的植物提取物(来自仅用不表达TurboGFP的A17渗入的N.b.叶样品的模拟提取物)中的标准稀释物，用Blue光学试剂盒以荧光模式通过在Modulus微板阅读器(Turner Biosystems)上阅读荧光获得这个曲线。每个稀释物一式三份阅读，并且计算平均值的标准误(SE)(<0.01x10’000荧光单位，不代表)。这个标准曲线用于定量由表达TurboGFP的渗入植物材料制备的可溶提取物中的TurboGFP浓度。
实施例9:总可溶蛋白质定量
通过在微板阅读器上在595nm处的吸光度测量，使用来自Pierce(#24236)的Coomassie-Plus Assay试剂测定提取物中的总可溶蛋白质。将提取物在超纯水中1:10或1:20稀释，并且将10μL一式三份装载到平底微板上。由以100-400μg/mL浓度范围的牛血清白蛋白(BSA)的系列稀释物制备标准曲线。当在一式三份之间的变异系数低于8％时，结果视为有效的。
结果
执行第一个渗入实验，以比较通过真空(50微巴绝对值)与范围为0.5巴–2.5巴的正压值的渗入效率(表3)。
首先通过查看正好在渗入后在叶区域上的接种物分布来评估渗入效率。当观察叶的轴外侧面时，渗入区域看起来是墨绿色的。在通过真空渗入的植物中，所有叶的几乎100％面积都是均匀渗入的。使用范围为0.5-1.5巴的正压渗入的植物显示接种物在叶区域上的非常不规则的分布。底部的叶更少过滤。使用范围为2.0-2.5巴的正压值渗入的植物显示更均匀的接种物分布，尽管渗入不像通过真空渗入的植物中一样完全。
使用范围为1.5巴–3.5巴(表4)的正压执行第二个实验，以改善在叶内部的接种物穿透。还测试了与2.5巴超压条件组合的对接种物添加0.01％Triton X-100。去污剂的添加已在几个植物系统中报道为增强渗入效率和土壤杆菌属介导的瞬时表达。使用三种对照条件：在50微巴通过真空渗入的植物，含或不含0.01％Triton X-100，和通过注射器。
在这个第二个实验中，使用的植物已达到更晚期的发育阶段(阶段10，平均16.5cm高度，与第一个实验中对应于阶段8的仅6.5cm相比较)，具有更展开的叶。植物一般比在第一个实验过程中更好地渗入，即使在使用的处于1.5巴的最低正压下。关于这点可能存在两个主要原因：1)由于实际原因，植物的尺寸使得更容易确保所有叶都完全浸入在超压槽中的接种物中，和2)由于在细胞间隙中具有更多空隙的叶组织结构，展开的叶可以更有效渗入，促进接种物的传播。检测到如首先在第一个实验中注意到的趋势，其中超压越高，渗入越均匀和完全。由3.0或3.5巴渗入的植物显示非常均匀的接种物分布，其看起来可与通过真空渗入的植物的那种比较。在这个阶段无法检测到使用0.01％Triton-X100的明确效应。
在渗入后的恢复和温育期过程中监控植物的表型。在收获时，在渗入叶中可见在叶绿素含量中的轻微下降(未定量)，即更淡的绿色，不依赖于用于渗入的条件。在任何渗入条件下未观察到其他应激相关征兆，例如枯萎、严重萎黄病或坏死。
通过将植物置于暗盒中在蓝光下，并且用琥珀色滤光器观察或成像来自TurboGFP的荧光，在温育期过程中(从渗入后2天到收获当天)有规律地监控在与A91和A17共渗入的植物中的TurboGFP表达。其中表达GFP的叶区域发出绿色荧光。由于来自植物组织的天然自身荧光，其中不表达GFP或表达低浓度GFP的叶区域看起来是红色的。
对于所有渗入条件，在渗入后2天时已可见低GFP表达，并且在渗入叶中随着时间增加，而与此同时，植物继续发育并且在仍未渗入的顶点上新展开的叶未显示GFP荧光，并且看起来是红色的。在第一个和第二个实验中(由于植物的尺寸未显示，全部植物的成像是技术上不可行的)，在不同条件下渗入的植物之间可见在GFP表达中的明确差异。
由在收获当天时获得的脱落叶图像可以更容易观察到这些差异。在第一个实验中，从使用最低超压(0.5-1.5巴)渗入的植物的叶观察到非常不规则模式的GFP荧光，具有来自底部叶的极弱荧光。由通过真空渗入的植物叶观察到比在任何正压条件(包括2.5巴的最高值)下渗入的植物叶更亮的GFP荧光。在使用小植物(平均6.5cm高度)的这个实验中，仅少量叶(一般4-6片)/植物在收获时显示GFP荧光，并且收集用于定量。
在来自得自对于每种植物收集的叶的冷冻粉末的总可溶蛋白质提取后执行定量。结果和统计分析(表6和7)明确显示在通过正压渗入的植物中的GFP表达显著低于通过真空渗入的植物中的那种，即使在这个实验中使用的最高超压下(2.5巴)。也出现一般趋势：使用的超压越高，在渗入叶中的GFP表达越高。
已注意到在第二个实验中使用的植物处于更晚期的发育阶段(阶段10，平均16.5cm高度)，并且一般比在第一个实验过程中更好地渗入。这通过有效表达TurboGFP的叶数目反映，且通过TurboGFP的更高得率/单位生物量对于每个植物收集，所述得率平均起来是在第一个实验中获得的得率的两倍。重要的是注意到从注射器渗入的植物收集更少材料，因为仅展开的叶可以通过这种方法渗入，导致比其他方法总体更少的渗入叶。定量数据(表8–10)指出在用3.0巴的超压渗入的植物中的TurboGFP表达与通过注射器或真空(不含Triton)渗入的植物中的那种并无显著不同。在用范围为2.0-3.0巴的压力值渗入的植物中的表达中的差异在统计上不显著。然而，在用1.5巴渗入的植物中观察到显著更低的GFP表达。对接种物添加0.01％Triton X-100导致在通过真空渗入的植物中在TurboGFP累积中显著但中等的增加(<15％增加/植物)。加入0.01％Triton X-100与以2.5巴的正压结合的效应不够明确。
表6.在条件之间的差异分析，具有95％的置信区间
使用每对斯氏t检验基于以μg GFP/g冷冻重量表示的GFP浓度的渗入条件分组，具有95％置信区间(不通过相同字母连接的水平是显著不同的)。
表7.在条件之间的差异分析，具有95％置信区间
使用每对斯氏t检验基于以％TSP表示的GFP浓度的渗入条件分组，具有95％置信区间(不通过相同字母连接的水平是显著不同的)。
表8.在条件之间的差异分析，具有95％置信区间
使用每对斯氏t检验基于微克GFP/g渗入叶的冷冻重量的渗入条件分组，具有95％置信区间(不通过相同字母连接的水平是显著不同的)。
表9.在条件之间的差异分析，具有95％置信区间
使用每对斯氏t检验基于mg GFP/植物的渗入条件分组，具有95％置信区间(不通过相同字母连接的水平是显著不同的)。
表10.在条件之间的差异分析，具有95％置信区间
使用每对斯氏t检验基于以TSP浓度百分比的GFP浓度的渗入条件分组，具有95％置信区间(不通过相同字母连接的水平是显著不同的)。
结论
当使用的生物量已达到目前用于土壤杆菌渗入的发育阶段时(阶段10，5-6周龄植物，约15cm的高度，充分展开的叶和最大限度的一朵花开放)，对于全部本氏烟草植物的土壤杆菌渗入在2.0-3.0巴之间的超压效率和重组TurboGFP的瞬时表达接近目前使用的真空渗入方法的那种。当使用1.5巴或更低的超压时，或当用于渗入的植物处于更年幼的发育阶段，即阶段8时，通过超压的渗入效率低于通过真空渗入的那种。
在渗入后的恢复和温育过程中未观察到就使用高达3.5巴正压的植物应激的可见征兆而言的不良反应。
考虑到使用为特定目的建造的设备的可能性，超压具有相当大地减少渗入循环时间的潜力，因为超压通过压缩空气带给槽并且渗入自身是几乎瞬时的(此处正压维持10秒)，而一个完整的真空循环花费平均4–5分钟。
对渗入溶液添加0.01％triton不改善在测试的2.5巴压力下通过超压的渗入效率。然而，这种去污剂在真空渗入过程中的相同条件下的使用导致在渗入叶中显著增加的GFP表达。
部分B：对于烟草使用正压的渗入
实施例10:程序和方法
对于三个烟草变种执行真空渗入和使用正压的本发明方法的直接比较。在这个实验中，使总共150个烟草植物(50个/每个烟草变种)在标准温室条件下发芽且生长：24℃和20小时光。烟草植物用土壤杆菌属培养物(Agl1)转化，所述Agl1含有与来自烟草病毒的沉默阻抑蛋白(SoS)组合的绿色荧光蛋白TurboGFP。真空渗入使用常用的条件组(50毫巴、60秒保持时间)和7种不同的正压条件应用。特别地，测试两种因素–正压值[1.5-4.5巴]和压力循环数目(“脉冲”)[1-8]，而压力保持时间/脉冲维持在1秒，以将总过程时间维持至其最小值。
在渗入后5天收获渗入植物，并且定性且定量分析GFP表达。通过在蓝光下给渗入后的叶拍照执行GFP的定量估计。用Blue光学试剂盒(激发：490nm/发射：510-570nm)以荧光模式，通过在Modulus微板阅读器(Turner Biosystems)上的荧光测量测定在叶中GFP丰度的定量分析。对于所有处理的植物，用打孔器从三片叶/植物(来自位置1-3的完全展开的叶，其中0代表枝条顶端分生组织)收集约80mg叶盘。将来自单个植物的三片叶的样品合并，随后在1mL GFP提取缓冲液(50mM Tris、1mM EDTA、100mM NaCl、0.2％Triton X-100，pH7.5)的存在下，在TissueLyser(Qiagen)中磨碎约2.5分钟。将10μL上清液用GFP提取缓冲液1:20稀释，并且定量荧光。使用由商业Evrogen tGFP蛋白质制备的标准曲线计算GFP浓度。通过将不同量的TurboGFP对照蛋白质(Turbo GFP，Evrogen #FP552)加入在提取缓冲液中1:40稀释的无GFP的叶提取物中制备标准曲线。
10.1结果
执行关于每个变种的分开双向ANOVA，以测试荧光平均值的同等，且检查是否存在相互作用和主效应的明显证据。没有关于0.05的α水平(关于I型误差的标准危险水平)的压力*脉冲相互作用的明显证据，但关于植物1和2的压力和脉冲主效应的明显证据，并且仅关于植物3的压力主效应。还计算相加模型，省略来自模型的相互作用项，但没有有关差异。植物1显示出在关于4.5巴的压力和8次脉冲的循环的荧光平均值之间明显更高的差异。
简单ANOVA用于比较来自最佳条件的荧光测量与使用真空方法获得的参考测量(参见表11)。关于植物2由在观察到的应答值(R2和调整的R2–参见表10)中的p值和变动量推断，存在与参考的统计上显著的差异。
表11
通过获得关于平均值之间的差异的置信区间进一步研究比较，其中家族误差率是0.05，以控制I型误差率。关于压力0.05(真空)和4.5(超压)的间隔都具有零作为终点，指出这些差异是显著的，其中超压这个特定情况下是最佳的。
表12
通过定性GFP定量证实上述观察，其中可以在视觉上察觉到更高的压力和增加的脉冲数导致更高的GFP表达。
显示于图2、3和4中的2D等高线图展示预测的荧光应答值，在应答等高线图中通过两种因素伸展超过与实验相同的范围(即无范围外预测)。
10.2结论
数据显示与通过使用真空方法获得的测量相比较，关于植物2在4.5巴的超压和8次脉冲的循环下明显更高的荧光测量。当增加压力和脉冲时，三个烟草变种显示增加的荧光测量，这得出增加压力和压力循环数目可以改善渗入效率的结论。
优选的实施方式：
1.一种用于生产目的异源肽或蛋白质的方法，其包括：
a)使全部和完整植物或全部和完整植物的部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触，其中所述土壤杆菌属细胞包含编码目的异源肽或蛋白质的可表达构建体；
b)用一个或多个压力循环处理所述全部和完整植物或全部和完整植物的部分和所述土壤杆菌属细胞，由此所述土壤杆菌属细胞渗入所述全部植物或植物部分内，
其中所述压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加，并且维持0.5秒–60秒的时期。
2.一种用于将土壤杆菌属细胞渗入全部和完整植物或全部和完整植物的部分内的方法，其包括：
a)使全部和完整植物或全部和完整植物的部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触；
b)用一个或多个压力循环处理所述全部植物或全部和完整植物的部分和所述土壤杆菌属细胞，
其中所述压力循环中的至少一个包含压力相对于大气压的增加，并且维持0.5秒–60秒的时期。
3.前述项目中任一项的方法，其中所述可表达构建体是植物可表达构建体，并且选择为提供所述目的异源肽或蛋白质的瞬时表达。
4.前述项目中任一项的方法，其中所述压力维持0.5秒–60秒的时期。
5.前述项目中任一项的方法，其中所述压力施加于所述全部和完整植物或全部和完整植物的部分，其中所述植物或植物部分与细菌细胞悬液中的土壤杆菌属细胞接触。
6.前述项目中任一项的方法，其中所述土壤杆菌属细胞的悬液包含至少1.0的OD600。
7.前述项目中任一项的方法，其中所述全部植物或植物部分和所述土壤杆菌属细胞在封闭系统内用一个或多个压力循环处理，所述封闭系统特别是包含配置为接受全部植物或植物部分的室，和用于可调节地增加室中的气压和/或液压的工具的系统。
8.项目7的方法，其中所述室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
9.项目7的方法，其中所述室这样配置，从而使得仅所述植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，但对整个植物包括植物的地上部分以及地下部分实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
10.项目7的方法，其中所述室这样配置，从而使得所述植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而所述植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
11.前述项目中任一项的方法，其中所述处理所述全部植物或植物部分的步骤包括
a)至少2个循环；或
b)至少3个循环；或
c)至少4个循环；或
d)至少8个循环。
12.前述项目中任一项的方法，其中所述压力循环中的至少一个包含用下述压力处理所述全部植物或植物部分
a)至少3.5巴；或
b)至少4.5巴；或
c)至少6.5巴；或
d)至少8巴；或
e)至少12巴。
13.前述项目中任一项的方法，其中所述压力施加于
a)0.5秒/循环-10秒/循环之间；或
b)1秒/循环-5秒/循环之间；或
c)0.5秒/循环-1秒/循环之间。
14.前述项目中任一项的方法，其中用相对于大气压增加的压力处理所述全部植物或植物部分的步骤包括
a)至少1个循环，在至少8巴的压力下，至少0.5秒/循环；或
b)至少2个循环，在至少6巴的压力下，至少0.5秒/循环；或
c)至少8个循环，在至少4.5巴的压力下，至少1秒/循环。
15.前述项目中任一项的方法，其中用相对于大气压增加的压力处理所述全部植物或植物部分的步骤包括至少8个循环，在至少4.5巴的压力下，至少1秒/循环。
16.前述项目中任一项的方法，其中使所述全部植物或植物部分与土壤杆菌属细胞接触的步骤包括
a)将所述植物或其部分浸泡到土壤杆菌属细胞的悬液中，其中所述悬液包含至少2.5的OD600，
b)使所述植物或其部分暴露于通过使用土壤杆菌属细胞的悬液生成的气溶胶，所述土壤杆菌属细胞的悬液包含至少2.5的OD600。
17.前述项目中任一项的方法，其中所述步骤包括
a)将所述植物或其部分浸没到封闭室中的土壤杆菌属细胞的悬液中，和
b)将液体液压施加于包含所述浸没植物或其部分的土壤杆菌属细胞的悬液。
18.前述项目中任一项的方法，其中所述植物是处于发育阶段8、9或10的烟草属物种，特别是烟草物种，其中所述植物具有约6.5cm-约16.5cm的平均高度。
19.前述项目中任一项的方法，其中施加的所有所述压力循环包含压力相对于大气压的增加。
20.前述项目中任一项的方法，其中在所述全部和完整植物或全部和完整植物的部分浸没到所述细菌细胞悬液中的同时，施加包含一个或多个压力循环的所述压力处理。
21.前述项目中任一项的方法，其中使多个植物或植物部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触，并且用一个或多个压力循环处理。
22.一种用于使土壤杆菌属细菌渗入全部和完整植物或全部和完整植物的部分内，和/或用于在全部和完整植物或全部和完整植物的部分中生产异源肽或蛋白质的系统，其包含配置为接受所述全部植物或植物部分的室，和用于可调节地增加所述室中的气压和/或液压的工具。
23.项目22的系统，其包含压缩机和减压器。
24.项目22的系统，其包含多个入口、出口和导管用于提供在所述室的内部和外部之间的流体通道，其中所述流体的流动是调节的。
25.项目22或24中任一项的系统，其中所述室在内部包含有就雾化或气溶胶化液体而制作的多个喷嘴。
26.项目22-25中任一项的系统，其中所述室这样配置，从而使得整个植物体包括其地上和地下部分都浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
27.项目22-25中任一项的系统，其中所述室这样配置，从而使得仅所述植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，但对整个植物包括植物的地上部分以及地下部分实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
28.项目22-25中任一项的系统，其中所述室这样配置，从而使得所述植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而所述植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
29.项目28的系统，其中所述室包含一个或多个开口，以允许所述植物的地上部分在插入或取出过程中的经过，所述开口衬有弹性密封。
30.项目29的系统，其中所述弹性密封是弹性气力或液压密封。
31.项目22–30中任一项的系统用于将土壤杆菌属细菌渗入全部植物或植物部分内和/或用于在全部植物或植物部分内生产异源肽或蛋白质的用途。
Claims (14)
1.一种用于使土壤杆菌属(Agrobacterium)细菌渗入全部和完整植物或全部和完整植物的部分内，和/或用于在全部和完整植物或全部和完整植物的部分中生产异源肽或蛋白质的系统，其包含
a)室，其包含
i)多个入口、出口和导管用于提供在所述室的内部和外部之间的流体通道，其中所述流体的流动是调节的；和
ii)一个或多个衬有弹性密封的开口，以及
b)压缩空气来源，以及
c)配置可调节地增加所述室中的气压和/或液压和/或水压的工具，
其中所述室配置为通过所述一个或多个开口接受植物的地上部分的全部或部分，其中所述弹性密封这样配置，使得由于所述密封的弹性，能够在所述植物的主茎周围形成密封，从而使所述植物的地上部分的全部或部分置于所述室的内部，而地下部分置于所述室的外部。
2.权利要求1所述的系统，其包含压缩机和减压器。
3.权利要求1所述的系统，其中所述室在内部包含有就雾化或气溶胶化液体而制作的多个喷嘴。
4.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述室这样配置，从而使得所述植物的地上部分的全部浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力，而所述地下部分置于所述室的外部。
5.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述室这样配置，从而使得所述植物的地上部分的全部或部分浸没到含有土壤杆菌属细胞的渗入介质内，并且暴露于在一个或多个压力循环中的压力，而所述植物的地下部分特别是植物根置于室的外部，从而使得它们不浸没到包含土壤杆菌属细胞的渗入介质中，并且不实施在一个或多个压力循环过程中施加的压力。
6.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述弹性密封配置为彼此相对且针对彼此滑动以关闭所述开口，有效形成暂时的气密或防水连接，从而在压力循环过程中，所述室能够暂时加压，而所述渗入介质和所述植物的地上部分通过弹性密封封入。
7.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述弹性密封是弹性气力或液压密封。
8.权利要求1–7中任一项的所述系统用于将土壤杆菌属细菌渗入植物的地上部分的全部或部分和/或用于在植物内生产异源肽或蛋白质的用途，所述用途包括：
a)使所述植物的地上部分的全部或部分与悬浮于流体中的土壤杆菌属细胞接触，其中所述土壤杆菌属细胞包含编码目的异源肽或蛋白质的可表达构建体；
b)用两个或更多个正压力循环处理所述植物的地上部分的全部或部分和所述土壤杆菌属细胞，由此所述土壤杆菌属细胞渗入所述植物。
9.权利要求8所述的用途，其中每个循环维持至少2.0巴的压力0.5秒-60秒的时期。
10.权利要求9所述的用途，其中所述可表达构建体是植物可表达构建体，并且选择为提供在所述植物中所述异源肽或蛋白质的瞬时表达。
11.权利要求10所述的用途，其中所述土壤杆菌属细胞的悬液包含至少1.0的OD600。
12.权利要求8-11所述中任一项的用途，其中所述植物是烟草(Nicotiana)物种。
13.权利要求12所述的用途，其中所述烟草植物处于发育阶段8、9或10，其中所述植物具有6.5cm-16.5cm的平均高度。
14.权利要求13所述的用途，其中所述烟草物种是烟草(Nicotiana tabacum)。
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