CN1571845A - 细胞渗透 - Google Patents

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CN1571845A CN02820801.3A CN02820801A CN1571845A CN 1571845 A CN1571845 A CN 1571845A CN 02820801 A CN02820801 A CN 02820801A CN 1571845 A CN1571845 A CN 1571845A
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Abstract

提供了一种渗透有细胞壁的活细胞的方法，包括：(a)加压与细胞表面接触的流体或凝胶；以及(b)减压流体或凝胶；以在细胞表面形成至少一个孔。

Description

细胞渗透
本发明涉及渗透有细胞壁的活细胞的方法以及将物质导入这种细胞的方法。
现代分子生物和生化中的许多方法需要将不同物质导入活细胞。外源DNA导入细胞通常导致基因型的可遗传变化，这定义为转染或转化。近来证明此技术是分子生物中最重要的技术之一，具体涉及遗传工程和蛋白质工程。此技术允许外源DNA在细胞中表达。这在研究基因转录中具有科学兴趣且有广泛的商业应用，包括在简便细胞类型中表达商业上有用基因产物。
最近对将蛋白质和药物导入活细胞而不损坏细胞有兴趣。发展这种技术时，一个要克服的显著问题是细胞膜普遍的不透性。细胞膜通常甚至对于小分子是不透的，除非它们有亲脂特性。
细胞膜不透性的问题在有细胞壁的细胞中增加。细胞一般通过提供另外进入的屏障来进一步限制物质进入细胞。原核生物细胞包膜可定义为细胞膜和细胞壁，如果外膜存在可加上外膜。革兰氏阴性细菌的肽聚糖细胞壁包括蛋白质和多糖，位于细菌内和外膜间的周质间隙中。另外的革兰氏阴性细菌外膜进一步降低细胞包膜的渗透性。革兰氏阳性细菌仅有单层膜(与革兰氏阴性细菌内膜类似)但一般细胞壁更厚。在真核生物细胞中，植物和真菌细胞的纤维素细胞壁包括半纤维素与果胶交织的纤维素微纤维。细胞壁提供的另外强度和渗透性减少指一些适于动物细胞(没有细胞壁)的转染方法不适于有细胞壁的细胞，如细菌、真菌和植物细胞。
设计了一些方法用于渗透细胞并从而能导入外源DNA或其它物质。早期方法包括使DNA结合颗粒如二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素或羟磷灰石以及加入能吸收含DNA颗粒的预处理细胞。用氯化钙处理，有时结合低温和随后的热激，常用于转化大肠杆菌。磷酸钙共沉淀提供将DNA导入哺乳动物细胞的一般方法。最近发展的方法使用负荷DNA的脂质体，可与细胞融合。称为电穿孔的进一步技术包括使细胞接受热激，热激引起细胞中的孔形成。在Biotechniques，17卷No.6 1994，118-1125页，Clarke等，揭示的方法用压紧-调节的过程将染料、蛋白质和质粒DN导入细胞。
当应用于有细胞壁的细胞时，上述方法的主要问题是外源物质的吸收效率很低或甚至完全不能检测。处理此问题的一种方法是去除细胞壁。去除细胞壁的原核和真核生物细胞一般称为原生质体。
原生质体一般比有细胞壁的细胞更易进行转化。例如，通过去除细胞壁可使革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)更易进行质粒DNA转化(Chang和Cohen，Mol.Gen.Genetics 168，111-115，1979)。生成植物细胞原生质体可通过用纤维素酶和果胶酶处理悬浮培养物、愈伤组织或完整组织。用质粒DNA转化酵母首先通过来自酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)(Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，1929-33，1978)的原生质球完成。
然而，用原生质体的一个劣势是将物质导入细胞后要再生细胞壁。再生培养基可以是营养复杂的，具体用于革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌。酵母球芽细胞需要在固体琼脂基质中再生，使随后的细胞恢复困难。整体上，再生细胞壁的过程缓慢且不方便。
即使通过上述方法将原生质体用于导入物质到细胞时，转染效率通常较低。此外，大部分细胞通过上面的处理来杀死。即使细胞壁的短期损伤使它更具渗透性，往往导致细胞死亡。这是与电穿孔相关的具体问题。此外，Clarke等的方法中仅有限数量的细胞可以单次处理转染。
WO 01/05994提供的转染方法包括低概率细胞死亡。此文献的方法主要针对用低压通过在细胞膜中形成孔来导入物质到细胞中，一般使用喷射技术。此文献是特别关于哺乳动物细胞的转染。具体的是，WO 01/05994的方法优选应用于动物细胞或原生质体，其中细胞壁在转染前必须去除。由于细胞壁或细胞包膜相关的渗透性受损，WO 01/05994所述方法不适于将物质导入含细胞包膜或细胞壁的细胞。
因此需要改进的方法用于渗透有细胞壁的细胞。此外，需要改进的方法将物质导入有细胞壁的细胞。
本发明目标是克服上述缺点并提供渗透有细胞壁的细胞的有效方法，从而使物质如核酸能进入细胞。因此，本发明提供方法用于渗透有细胞壁的活细胞，包括加压与细胞表面接触的流体或凝胶，随后减压流体或凝胶从而在细胞表面形成至少一个孔。
不受理论约束，认为流体或凝胶的压力变化导致细胞膜弯曲，从而在细胞膜中形成一个瞬时的孔。如果气泡由于减压形成，可通过它们形成瞬时的孔并完成转染。同样不受理论约束，认为细胞膜附近形成的气泡与膜本身相互作用可在膜中形成瞬时的孔。因此，在本发明一些实施方案中，优选的是减压流体或凝胶产生能在细胞表面形成至少一个孔的气泡。
在另一方面，本发明提供方法用于将物质导入有细胞壁的细胞，包括通过上述定义方法渗透活细胞的方法，其中至少一个孔促进物质进入细胞。
本发明方法有利地使细胞的细胞膜中形成瞬时的孔，从而增加细胞对一些物质的渗透性。细胞膜是围绕细胞质的质膜，在革兰氏阴性细菌中指位于细胞壁下的内膜。形成的孔不会显著减少大部分细胞的存活力，因此细胞死亡概率一般比一些现有技术方法如电穿孔低许多。此方法能渗透有细胞壁的细胞，不需如以原生质体为基础的方法那样完全去除细胞壁。此外，细胞壁不需如以原生质体为基础的方法那样在过程后再生。
根据本发明通过加压/减压过程获得令人惊讶的渗透性。因此本发明提供渗透有细胞壁的细胞的快速和有效方法。在本发明优选实施方案中，认为形成的气泡有助于在有细胞壁的细胞膜形成至少一个洞或孔。不受理论约束，认为这些实施方案中的气泡尺寸和它们的组成(根据流体或凝胶和气泡的组成)足够使气泡在细胞膜中形成。
在本发明所有实施方案中，细胞膜中的孔可包括细胞表面具体点的膜厚度减少或可包括从部分细胞表面完全去除细胞膜。如果孔大小增加细胞渗透性，它不特别受限制。优选的孔也应足够大从而有害地影响细胞功能。通过减少细胞膜对进入的屏障，孔优选促进外源物质导入细胞。
通常，渗透本发明细胞的方法使细胞渗透性增加到足够程度，从而外源物质如核酸可导入细胞而不需要进一步的处理以增加细胞渗透性。另外，在一些实施方法中，本发明方法可结合一种现有技术方法，如电穿孔或氯化钙处理以进一步提高方法的效率。
现在仅通过例子进一步描述发明，参考附图，其中：
图1显示根据本发明实施方案的设备示意图，其中1是入口，2是出口，3是压力计，4是压力舱，5是针形阀且6是压力舱内表面涂层，确定保持凝胶或流体的隔室；
图2显示根据本发明另外实施方案的设备示意图，其中1是入口，，2是出口，3是压力计，4是压力舱，5是针形阀且7是位于压力舱内表面附近的容器以形成保持凝胶或流体的隔室；
图3显示pGVT5基因构建物。
图4显示pJIT58基因构建物。
图5显示pAL156基因构建物。
图6显示pAL145基因构建物。
图7显示估计的转染酿酒酵母的细胞存活百分比。
图8显示酿酒酵母细胞在5MPa(50Barr)气穿孔(aeroporation)后的生长速度；
图9显示酵母细胞中细胞转染的百分比。
图10显示红色荧光蛋白(RFP)载体、pDsRed1-C1的限制性酶切图谱和多克隆位点(MCS)；
图11显示绿色荧光蛋白(GFP)载体、pEGFP-C1的限制性酶切图谱和多克隆位点(MCS)。
本发明更佳的实施方案包括在流体或凝胶介质中形成气泡。现在更详细讨论这些实施方案和其它方面。
在本方法中，惊讶的发现通常比大部分细胞更抗孔形成的有细胞壁的细胞可通过加压/减压过程来渗透。如上面所指，认为减压过程引起细胞壁结构中或细胞膜和细胞壁间的气泡形成。另外，认为气泡也可在细胞内部、细胞膜结合的周围形成。这些位点的气泡形成也许破坏细胞表面局部点的细胞膜。认为细胞的细胞壁保护细胞膜抗由气泡形成或细胞壁外部破裂引起的渗透。
认为其它将空气导入流体或凝胶以尝试渗透细胞的方法(如喷射)对渗透有细胞壁的细胞无效，因为它们不影响细胞膜和细胞壁间的区域，如通过压力变化或细胞膜和细胞壁间的气泡形成导致细胞膜足够弯曲。
认为本发明减压步骤形成的气泡具有充分能量(或表面张力)，与细胞相互作用(如接触细胞膜，具体是接触或很接近细胞膜时破裂)时在细胞膜中形成孔。认为气泡有足够小的半径很重要，从而它们的表面能量足以在细胞膜上穿孔。
尽管孔根据本发明方法在细胞表面形成，细胞存活或功能的任何减少通常低于现有技术方法。细胞中形成的孔是瞬时的，维持一段足够长时间的开放以使大分子如DNA和/或RNA流入细胞，但在影响细胞存活前重密封。例如，用本发明方法，细胞死亡小于25％且通常小于5％。
在电穿孔过程中，细胞死亡可高至90％。甚至在此过程直接效果下存活的细胞可能在之后的24小时死亡。通常电穿孔通过坏死导致50％的细胞直接死亡，接着在此过程后24小时通过细胞调亡引起大部分的剩余50％细胞死亡。使用本发明后，坏死和/或细胞调亡通常引起低细胞死亡概率。
气泡可通过减压过程在流体或凝胶中生成。减压一般包括降低流体或凝胶所受压力从而溶解气体的溶解度减少，可导致液体中气泡形成。不受理论约束，认为流体或凝胶中的细胞作为核用于形成气泡，从而气泡在细胞膜和细胞壁间形成和破裂。因此发明的优势是可在细胞膜附近形成具适当表面能量的气泡，用于渗透细胞、增加转染效率。另外如上所述，此方法由于所用压力变化如膜弯曲或变形可干扰细胞膜和/或细胞壁。这种干扰可导致细胞膜中弱点形成，依次引起膜暂时破裂。此破裂可采用膜中暂时孔、裂口或破处的形式，可转染选择的分子(如核酸分子)以进入细胞。
在本发明内容中，需要控制减压过程中形成的任何气泡的任意尺寸从而气泡能在细胞中形成暂时的孔(具体是与细胞表面接触时)。用减压和具体用气泡在细胞表面形成孔定义为‘气穿孔’。优选的是，任何气泡的尺寸可与细胞尺寸相比。例如，优选气泡半径范围从约三分之一的细胞半径到五倍的细胞半径。
根据本方法，加压步骤引起流体或凝胶中溶解的气体量增加。产生气泡的速度、气泡大小和气泡表面能量可通过改变减压步骤中压力减少的速度和程度来控制。
方法通常包括加压流体或凝胶并在起始压力保持流体或凝胶一段时间，随后降低压力，优选形成气泡。压力减少一般为0.5MPa(5Barr)或更高，通常在0.5-11MPa(5-110Barr)范围内。它优选在1-11MPa(10-110Barr)范围内，更优选2-11MPa(20-110Barr)，更加优选5-11MPa(50-110Barr)。在一些实施方案中，压力降低可以从2-8MPa(20-80Barr)，更优选3-8MPa(30-80Barr)，更加优选4-8MPa(40-80Barr)，最优选6-8MPa(60-80Barr)。减压步骤中压力减少越大，孔形成效率越高且因此转染效率越高。然而，减压步骤中压力下降也提高引起细胞死亡的细胞损伤频率。压力减少可根据细胞类型和所用气体最优化以确保孔在细胞中形成，从而可导入物质且同时最小化细胞存活的减少。认为形成的气泡表面能量可在细胞膜的孔形成中发挥作用。认为可通过上面优选范围之一的压力下降完成本发明来渗透大部分有细胞壁的细胞类型。使用更优选的压力范围一般趋向增加存活和转染的细胞比例。
如果需要，可选择起始压力以促进流体或凝胶中的初始气体溶解。起始压力一般是0.6MPa(6Barr)或更高，通常在0.6-11.1MPa(6-111Barr)范围内。它优选在1.1-11.1MPa(11-111Barr)范围内，更优选2.1-11.1MPa(21-111Barr)，更加优选5.1-11.1MPa(51-111Barr)。在一些实施方案中，压力降低可以从2.1-8.1MPa(21-81Barr)，更优选3.1-8.1MPa(31-81Barr)，更加优选4.1-8.1MPa(41-81Barr)，最优选6.1-8.1MPa(61-81Barr)。
使用的起始压力和压力减少可根据待渗透的细胞类型适当改变。在一个实施方案中，当细胞是水稻细胞时，在减压到大气压前使用2.1-3.1MPa(21-31Barr)的相对较低起始压力。在另一个实施方案中，当细胞是玉米细胞时，使用6.1-7.1MPa(61-71Barr)的更高起始压力。
如果没有不利地影响转染，保持在起始压力的气体时间长度无特别限制。通常，气体保持在起始压力1分钟或更长，更优选10分钟或更长。一般压力保持小于30分钟。在一些实施方案中，压力可保持5-20分钟，更优选10-20分钟，更加优选10-15分钟。最优选压力保持约15分钟。如果需要，可变化时间以改变流体或凝胶中初始溶解的气体量。只要需要，可维持流体或凝胶中气体的存在且可根据渗透细胞所用条件来确定，如所用气体、温度、压力以及细胞类型和待导入细胞的物质。将物质导入细胞的效率尤其对流体或凝胶受到增加压力的时间长度敏感。
压力通常低于大气压(约0.1MPa，1Barr)。压力优选迅速降低，如通过突然减压、通过使分离系统暴露于大气。这可通过(例如)仅打开连接容器的阀或龙头受影响，容器包括流体或凝胶。压力降低优选在小于30秒的间隔发生，更优选小于10秒，最优选小于1秒。
产生任何来自减压的气泡可连续发生一段时间或在由间隔分开的两个或更多脉冲中发生，在间隔中没有生成显著气泡。因此压力减少可在单个连续步骤中发生或压力减少可在一系列步骤中发生，例如由间隔分开的0.1-1MPa(1-10Barr)，其中压力恒定。
加压和减压循环可重复一次或更多。在一个实施方案中，使用2或3个加压/减压循环，但优选仅使用1个循环。
在脉冲中产生气泡的情况中，这种脉冲长度通常从1-10s。例如，脉冲长度可以从1-5s，由没有气体生成的类似长度段分开。可使用任何控制脉冲持续时间的方法。通常脉冲持续时间可通过编程方法控制。例如这种方法包括可编程的定时器，用于控制方法以改变流体或凝胶上的压力。
如果气体适于加压和减压流体或凝胶，用于本方法的气体不必须限于任何具体的气体。气体优选能形成与细胞相互作用的气泡以在细胞膜中形成暂时的孔。适当气体可选自广范围的气体，包括惰性气体、非惰性气体或一种或更多两种类型气体的混合物。气体优选是空气，然而也可使用氧、氮、甲烷和惰性气体如氦、氖和氩。此外，也可使用CO2，特别是需要维持具体水平的流体或凝胶pH。当使用CO2时，一般在另一种气体如空气中使用5-7％的体积浓度。气体不需是可溶的，但如果需要在流体或凝胶中形成气泡，在方法进行的条件下气体应该至少部分溶于流体或凝胶。
本方法优选在恒温进行，通常至37℃。优选在室温进行，如从5-30℃，优选从15-30℃。
本方法的加压和减压步骤在流体或凝胶中完成。如果可为细胞耐受，流体或凝胶中存在的离子不受特别限制。当细胞被渗透以促进物质如DNA进入时，物质在相同介质中导入，流体或凝胶也必须适于转染或其它导入过程。有适当渗透压的转染介质可用10倍浓度的Earle平衡盐溶液(EBSS)制成(Earle，W.R.，1934，Arch.Exp.Zell.Forsch.，16卷，116页)，EBSS含营养因子如碱基和所需稀释。
优选的是待导入的物质包含在流体或凝胶中。在此较佳实施方案中，将物质导入细胞的步骤几乎与减压步骤和(在一些实施方案中)流体或凝胶中形成气泡同时。然而，假如物质在细胞表面暂时的孔重密封前被导入，也可能当细胞表面产生暂时的孔时，物质可在减压后与细胞接触。
所用流体或凝胶优选是液体，更优选水液体。液体可包括缓冲液或细胞培养基。培养基的渗透压优选大于100mOsM。渗透压更优选从300-600mOsM。使用此范围内渗透压的液体趋向减少过程中的细胞裂解。
在另外使用凝胶的实施方案中，凝胶优选是含水凝胶。适当凝胶包含细胞培养基如琼脂凝胶。在此实施方案中，细胞通常在凝胶上培养。
培养基中的物质浓度没有特别限制且可根据需导入细胞的物质量来选择。方便的浓度是0.2-10×10-8M，更优选0.75-1.25×10-8M。
流体或凝胶的深度没有特别限制。流体或凝胶的深度通常为10cm或更小。
流体或凝胶中的细胞浓度没有特别限制。例如原核生物的浓度可以是1×109个细胞/ml。
待导入的物质可以是任何物质。物质优选是不能正常穿越细胞壁和/或细胞膜的物质。因此待导入的物质优选是亲水性物质，然而物质也可以是疏水性的。任何生物分子或任何大分子可导入细胞。物质一般具有100道尔顿或更大的分子量。在一个更佳实施方案中，物质是核酸如DNA或RNA(如基因、质粒、染色体、寡核苷酸或核苷酸序列)或其片断或者表达载体。另外，物质可以是生物活性分子如蛋白质、多肽、肽、氨基酸、激素、多糖、染料或药物剂如药物。
假如细胞有硬细胞壁且可存活，本发明方法根据细胞类型或样品大小可应用的细胞没有特别限制。细胞优选是活宿主细胞。这包括原核生物细胞和一些真核生物细胞，其中原核生物细胞壁是部分细胞包膜。因此适当细胞包含的细胞来自植物、真菌(包括丝状和非丝状真菌如酵母)和细菌，包括形成孢子的细菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。方法不需要形成原生质体，因此细胞壁优选是未处理的细胞，其中细胞壁在渗透过程前没有被去除、削弱、变薄或穿孔。
使用本发明的方法可转染细胞种群。这些细胞可以是例如细胞悬浮液形式或可以是固体表面或凝胶上的贴壁细胞。也可使用方法处理含细胞类型集合的细胞种群。
单独细胞类型的种群可用本方法渗透，或可处理完整组织、器官或生物体。在一个实施方案中细胞是花粉粒，而在另一个实施方案中渗透全植物。待处理的组织、器官或生物体可淹没在流体中，或者另外流体可仅接触组织、器官或生物体的部分表面。在一个实施方案中，流体喷射在器官表面如植物的叶。
适当组织类型包括可根据本发明方法转染或转化的细胞，细胞包括分裂组织、分解的叶细胞、叶盘、花粉、小孢子(＝未成熟花粉)、子叶、愈伤组织(calloustissue)、体细胞胚、胚物质和所有悬浮培养组织(＝含细胞壁的分解细胞)。
当细胞是植物组织时，细胞可以来自被子植物(包括单子叶植物或双子叶植物)或来自另一级的植物。
本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于玉米(Zea mays)、油菜(Brassica napus，Brassica rapa属)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryzasativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea属)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus属)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa属)、鳄梨(Persea Americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia interifolia)、杏仁(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树
优选的是，本发明的植物是农作物，例如谷类或豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯(tapioca)、水稻、高粱、稷、木薯(cassava)、大麦、豌豆和其它根、块茎或种子作物。重要的种子作物是含油种子油菜、糖用甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。本发明应用的园艺植物可包括莴苣、菊苣、芸苔植物以及石竹和天竺葵，芸苔植物包括甘蓝、花茎甘蓝和花椰菜。本发明可应用于烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊花、白杨、桉树和松树。
产子植物提供农艺上需要的感兴趣的种子，包括含油种子植物、产生谷类种子的植物和豆类植物。农艺上需要的种子包括谷物种子、如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、含油种子油菜、玉米、紫花苜蓿、棕榈和椰子等。豆类植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
本发明用于转化任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。适当的革兰氏阳性种类包括但不限于放射菌类如链霉菌(Streptomyces)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、枯草芽孢杆菌和双歧杆菌(Bifidobacter)属。适当的革兰氏阴性种类包括大肠杆菌(Escherichia coli)和幽门螺杆菌(Helicobaterpylori)。
用于本发明的减压方法没有特别限制。典型的减压方法包括保持流体或凝胶的可变化压力的密封舱以及改变舱中压力的方法。改变压力的方法通常是连接密封舱的压缩机(如压缩气体的汽缸)，用于增加舱中压力和/或压缩舱中气体。假如密封舱能含液体且能经受舱内和外侧间的压力差异，它的大小和性质没有特别限制。假如改变压力的方法能在舱内和外侧间产生压力差异，它不受特别限制。
减压方法可由编程方法控制。通常可编程的定时器用于控制减压方法有效性。
保存液体的容器在形状或构建的材料上没有特别限制，可用玻璃或、塑料或其它方便的材料制成。保存液体的容器优选是可密封的从而可改变压力，容器与改变容器中压力的方法相关。
尽管用于完成本发明方法的方式没有特别限制，优选使用下述设备。本发明的设备用于将物质导入有细胞壁的细胞，使用如上所述的方法，包括：
(a)导入气体的入口；
(b)入口进入的压力舱，舱具有显著的几何横截面；
(c)压力舱内的隔室，用于使细胞包含在流体或凝胶中；
(d)任选的压力计，用于监控压力舱中的压力；
(e)释放压力舱气体的出口；
其中，入口和出口包括在加压时分隔压力舱的阀。
入口和出口优选包括入口和出口管。假如导入的气体能加压通过入口的流体或凝胶且压力可通过出口释放，入口和出口的直径没有特别限制。优选的入口和/或出口直径为2-4mm。
在本发明内容中，涉及压力舱横截面的术语“几何”指横截面有显著统一的几何形状，即它是圆形(圆柱或球形压力舱)、正方形或直线(立方形或矩形压力舱)。优选的是，压力舱的几何横截面是柱状的。
在一个较佳实施方案中，使细胞包含在流体或凝胶中的隔室包括几乎压力舱全部内表面。在此实施方案中，压力舱内表面通常包括生理可接受的涂布或层，如PTFE(Teflon)、不锈钢或聚丙烯。在另外的实施方案中，使细胞包含在流体或凝胶中的隔室可包括位于压力舱内表面附近的容器。在这些实施方案中，优选的是容器由压力舱内表面支持。一般容器内表面包括生理可接受的涂布或层。在本发明内容中，这是指涂布或层对细胞存活不是很有害。这种涂布或层在本领域熟知。优选的是隔室的较低部分可与上部分离以使流体或凝胶和细胞充满隔室或容器。这也有利于清洁隔室和/或容器。隔室可通过螺杆机制或本领域已知的其它适当机制来集合或分解。
通常入口和/或出口中的阀包括针形阀，尽管阀的种类没有特别限制，它足以如需要的分离压力舱和控制其中的压力。
另一方面，本发明提供含细胞壁的渗透细胞，细胞可通过上述方法获得，其中细胞表面包括至少一个能促进物质进入细胞的孔。
细胞表面的孔优选包括细胞膜中的孔。通常使用本方法时，对细胞壁本身损害很小。因此细胞的细胞壁优选是充分完整的。在一个较佳实施方案中，孔的位置使至少50％细胞表面的细胞膜是充分完整的。更优选的是，至少70％细胞表面的细胞膜是充分完整的，最优选的是，至少90％细胞表面的细胞膜是充分完整的。细胞的细胞膜同样优选包括能进一步促进物质进入细胞的孔。
因为细胞壁不被本方法破坏，它不需再生。如果需要使用渗透细胞以导入物质，优选的是在与物质生成几乎同时或之后不久导入物质。另外，可保存渗透细胞，通常在-20℃或更低直到所需温度，随后解冻细胞并用于之后的过程。
本发明也提供减压方法的使用以渗透细胞和/或将物质导入细胞，其中细胞有细胞壁且减压方法用于通过2-11MPa(20-110Barr)的步骤降低应用于流体或凝胶的压力，流体或凝胶包含细胞。
在生命科学应用中本发明尤其有用，包括将具体基因导入活细胞和/或聚集用于表达和分析基因产物对细胞机制的效果。这种应用也包括生物活性蛋白的表达，这是通过将编码这些DNA产物的核酸导入活细胞以研究它们对细胞代谢的效果；蛋白质生成；和细胞形态。这些应用也扩展到细胞中药理上重要化合物的生成。
与已知方法相比，本方法非常有效。转染方法的效率取决于完成气体生成的时间长度。在一些情况中，可获得80％或更高、90％或更高或甚至约100％的效率。
现在仅通过例子关于下列具体实施方案进一步描述发明。
实施例
实施例1-酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces.pombe))的气穿孔法
生长于酵母膏真菌培养基(Oxoid)中的5×105个细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)在1，200rpm洗涤两次。随后沉淀重悬浮于1M山梨醇。重悬浮细胞转移到FACS管并加入0.5μg β-半乳糖苷酶DNA载体(pCMV-SPORT-β-gal，Invitrogen)或2.5μg TMR葡聚糖(分子量70,000)(Molecular Probes)。
管置于气穿孔器(Baskerville有限公司)中且调节压力在4-8MPa(40-80Barr)范围。细胞留在设备中用于10分钟的加压/减压循环，减压到大气压。
随后细胞从气穿孔器中取出并用(PBS)洗涤一次。细胞重悬浮于1ml液体培养基并在12小时后通过流式细胞仪或荧光显微镜(用聚-L-赖氨酸残基)分析。在TMR葡聚糖情况中，立即进行分析(为最小化光褪色)且不需重悬浮于培养基。
锥虫蓝染色确定活细胞比例达于85％。转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。这产生60-70％的转染效率。
实施例2-烟叶的气穿孔法
计算细胞培养物中的烟叶并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下再次离心。重悬浮沉淀并再次离心。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至6-8MPa(60-80Barr)间。细胞置于压力下10分钟。处理细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为70-80％。转染效率为55-60％。
实施例3-烟草根的气穿孔法
计算细胞培养物中的烟草根尖细胞并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下离心。重悬浮沉淀并以相同方式再离心一次。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至6-8MPa(60-80Barr)间。细胞处理10分钟。处理细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为55-60％。转染效率为45-50％。
实施例4-玉米叶的气穿孔法
计算细胞培养物中的玉米叶细胞并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下离心。重悬浮沉淀并以相同方式再离心一次。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至6-8MPa(60-80Barr)间。细胞置于压力下10分钟。处理细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为60-70％。转染效率为45-50％。
实施例5-玉米根的气穿孔法
计算细胞培养物中的玉米根细胞并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下离心。重悬浮沉淀并以相同方式再离心一次。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至6-8MPa(60-80Barr)间。细胞置于压力下10分钟。处理细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为55-60％。转染效率为45-50％。
实施例6-水稻叶的气穿孔法
计算细胞培养物中的水稻叶细胞并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下离心。重悬浮沉淀并以相同方式再离心一次。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至4-8MPa(40-80Barr)间。细胞置于压力下10分钟。处理细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为65-70％。转染效率为55-60％。
实施例7-小麦叶的气穿孔法
计算细胞培养物中的小麦叶细胞并补足所需浓度(0.2-0.5×105个细胞/ml)。细胞在750g离心5分钟，随后沉淀重悬浮于洗涤培养基(磷酸缓冲盐水，PBS)并在相同条件下离心。重悬浮沉淀并以相同方式再离心一次。
沉淀重悬浮于1ml转染培养基(MS培养基，Sigma，UK)并加入0.5μg DNA、2.5μgFITC-BSA或2.5μg TMR葡聚糖。气穿孔器与压缩空气汽缸相连，细胞悬浮液置于相同管中且放入气穿孔器的舱中。
关闭气穿孔器的盖且压力上升至6-8MPa(60-80Barr)间。细胞置于压力下10分钟。加压细胞后，压力释放到大气压。此加压循环重复3次。
随后细胞转移到微离心管。细胞用PBS洗涤一次，在适当培养基(MS完全培养基)中平板培养并在25℃培养。
接着在转染后5天分析细胞的存活和DNA表达。锥虫蓝染色用于测量活细胞数且转染效率通过发荧光的细胞数除以总细胞数来计算。活细胞百分比为60-70％。转染效率为20-25％。
实施例2到7的结果概括于下表1：
表1-气穿孔对细胞存活和不同植物组织转染效率的效果
    植物种类     存活百分比(％)     转染百分比(％)
    烟草(叶)     70-80     55-60
    烟草(根)     55-60     45-50
    玉米(叶)     60-70     45-50
    玉米(根)     55-60     45-50
    水稻(叶)     65-70     55-60
    小麦(叶)     60-70     20-25
*在烟草和玉米植物的情况中，使用高压(6-8MPa，60-80Barr)。
*在水稻植物的情况中，使用较低压力(4-8MPa，40-80Barr)。
与实施例2-7所述类似的方法可应用于其它植物种类，如大豆和棉花。
实施例8-使用高压气穿孔比较酿酒酵母和禾本科镰刀菌(Fusariumgraminearum)的转染
选择用于此例子的细胞是酵母酿酒酵母和丝状真菌禾本科镰刀菌，禾本科镰刀菌是用于产生称为Quorn(Trinci，1994)食品的菌蛋白真菌。此具体丝状真菌被证明难以用已知方法转染。
转染效率被细胞壁限制，必须克服此阻碍以使不同大小和形状的分子自由进入细胞内部。细胞壁的组成和厚度是在确定转染效率中必须考虑的重要因素。酵母酿酒酵母细胞壁所在区域具有25％的干细胞重量。此胞外质量对于支持结构作用很小但对于细胞保护和控制营养是必需的，它主要包括多糖和具高比例碳水化合物的糖蛋白。所有这些成分在禾本科镰刀菌细胞壁中发现但没有充分分析构成细胞壁的各成分百分比。在大部分丝状真菌中，称为几丁质的n-乙酰葡糖胺聚合物是细胞壁的主要成分。同样知道真菌的丝状壁一般厚于酵母细胞壁(Wainwright，1992)。
酿酒酵母的高压气穿孔
表2-有和没有pEGFP-C1时在4、5和6 MPa(40、50和60 Barr)气穿孔的酿酒酵母细胞的细胞存活和转染百分比
不同压力(Barr，0.1MPa)的细胞存活(％) 不同压力(Barr，0.1MPa)的转染(％)
    40     50     60     40     50     60
酿酒酵母没有GFP 100 98 96 -
酿酒酵母有GFP 100 98 91 57 76 65
如表2所示，与4MPa(40Barr)和6MPa(60Barr)气穿孔的细胞相比，转染在5MPa(50Barr)最有效，其中转染了76％的细胞。此结果表明在5MPa(50Barr)的高压气穿孔可在细胞壁中有效形成孔，从而使pEGFP-C1能进入细胞。
最高的存活百分比在4MPa(40Barr)获得，其中100％的细胞在气穿孔下存活。最低的存活百分比是在6MPa(60Barr)，其中91％的细胞存活。这些高存活百分比表明此过程似乎不杀死细胞或抑制它们的生长周期。在5MPa和6MPa(50和60Barr)气穿孔的细胞存活百分比高，在91-98％的范围中。
禾本科镰刀菌的高压气穿孔
转染在6MPa(60Barr)最有效。当菌丝体接受6MPa(60Barr)时观察到较好的荧光。
完成气穿孔时，切去薄的1cm2菌丝体片断并在6MPa(60Barr)气穿孔。荧光在此片断的全长中产生。
用1和2个循环高压气穿孔禾本科镰刀菌
在相同压力应用超过一个循环使发生的转染增加。这也在进行的类似实验中发现，其中在7MPa(70Barr)气穿孔并处理2个循环的禾本科镰刀菌与同样2个循环的更低压力相比，显示更好的荧光。
实施例9-植物和真菌悬浮细胞的气穿孔过程
用于细胞转染的大分子
用于转化的大分子是主要的荧光探针，因为它们可用荧光显微镜和流式细胞仪来检测。
此设计中使用的大分子是：
·TMR-葡聚糖(四甲基罗丹明葡聚糖(tetramethyl rhodomine dextran))(分子量70,000Da)
·GFP DNA载体(绿色荧光蛋白DNA)(4.76kb)(pEGFP)
·β-gal DNA(8.2kb)
TMR-葡聚糖
TMR-葡聚糖是共价连接TMR的多糖，TMR是荧光标记的反应物。使用分子量10,000、40,000和70,000和直径5.4nm的葡聚糖。TMR-葡聚糖广泛用作分子标记(Hougland，1996)。使用流式细胞仪时激发波长是546nm。
分析细胞
细胞用分光镜、电泳、流式细胞仪、光学和荧光显微镜来分析。
细胞生长的方法和条件
酵母细胞的生长条件
酿酒酵母和非洲粟酒裂殖酵母都生长于预先制备的麦芽汁琼脂(Oxoid)琼指平板上，在冷却培养箱中25℃生长48小时。随后用无菌牙签挑出菌落并用于接种酵母麦芽汁液体培养基(YME-10g葡萄糖、5g蛋白胨、3g酵母膏和3g麦芽汁并用双蒸水补至1升，然后高压灭菌)。接种的培养物在冷却定轨摇床中25℃生长到指数期，随后转染。
丝状真菌(禾本科镰刀菌)的生长条件
禾本科镰刀菌在马铃薯葡萄糖琼脂(Oxoid)上生长，这是通过在25℃传代培养固体培养基上1cm生物体7天。7天后麦芽汁或察氏肉汁液体培养基(Czapex doxliquid media)接种1cm镰刀菌块并在25℃生长5天。5天后镰刀菌通过有Whatman1号滤纸的无菌过滤漏斗来过滤。菌丝体切成约2cm的块，洗涤并转染。
转染和洗涤溶液
1M山梨醇用作转染培养基且1xPBS用作洗涤培养基。
用高压气穿孔的细胞转染方法
·计数细胞(约0.5-1×106个细胞/ml)
·在1ml无菌dd H2O中通过1300rpm离心5分钟(2次)来洗涤细胞
·用冰的1x磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤
·细胞重悬浮于1M山梨醇并转移到FACS管
·加入0.5μl大分子到溶液中
·管置于气穿孔器中并关闭舱
·关闭空气出口并调节所需压力
·打开空气入口并使加压发生15分钟
·通过关闭入口和打开出口使舱减压
·打开舱并取出FACS管
·在1300rpm旋转细胞，随后重悬浮于培养基并使细胞生长到指数期(如果使用葡聚糖，分析应该在气穿孔后立即进行。
·制备细胞用于分析
制备细胞用于转染后分析
通过荧光显微镜分析GST-转染细胞
·计数细胞
·用1xPBS洗涤
·重悬浮于2μl 1xPBS
·加入含细胞的溶液到聚-L-赖氨酸多孔载玻片。
·使载玻片保持20分钟
·通过吸气去除液体
·加入2μl 1xPBS到载玻片并保持5分钟
·去除PBS
·加入一滴DABCO到载玻片并仔细地将盖玻片置于载玻片上。
·荧光显微镜分析
通过流式细胞仪分析GFP-转染细胞
·用1xPBS在1300rpm洗涤细胞(两次)
·重悬浮于1M山梨醇并取出用于流式细胞仪分析
分析细胞中β-半乳糖苷酶的表达
分析通过在诊断载玻片上孵育处理的细胞来完成，载玻片用β-Gal缓冲液处理24小时并随后在相差下观察。
分析存活和转染百分比
存活百分比通过气穿孔前和后的生长曲线和使用锥虫蓝来获得。转染百分比用流式细胞仪计算。
转染结果
转染酵母细胞
用气穿孔器转染酿酒酵母和非洲粟酒裂殖酵母简单且有效。
空气使用3-4MPa(30-40Barr)的压力用于两种酵母细胞类型的气穿孔实验。所有细胞转染1个持续15分钟的循环。
有效的转染最佳在5MPa(50Barr)获得，转染百分比很高且存活百分比也高(表3和4)。
转染丝状真菌
丝状真菌的转染用3-7MPa(30-70Barr)(如6MPa，60Barr)的空气进行一个15分钟的循环。表明使用大于一个循环，这些细胞也在较高压力(7-8MPa，70-80Barr)转染。
比较气穿孔和正方形波电穿孔转染细胞(表3)表明气穿孔对这些细胞更有效。
表3-使用气穿孔(A)和没有气穿孔(NA)时酿酒酵母的转染效率和存活
不同压力(10xMPa/Barr)下的细胞转染％ 不同压力(10xMPa/Barr)下转染24小时后的细胞存活％
40  50  60  40  50  60
细胞+pEGFP(A) 58-64  65-72  58-66  97-100  96-98  94-98
仅细胞(NA) 0  0  0  -  -  -
仅细胞(A) 0  0  0  97-99  94-96  94-98
细胞+pEGFP(A) 52-68  60-69  54-56  98-100  94-96  94-98
细胞+β-gal(NA) 0  0  0  -  -  -
细胞+70KDex(A) 55-60  70-74  69-70  97-100  94-96  98-100
细胞+70KDex(NA) 0-0.5  0-0.5  0-1  -  -  -
表4-使用气穿孔(A)和没有气穿孔(NA)时非洲粟酒裂殖酵母的转染效率和存活
不同压力(10xMPa/Barr)下的估计细胞转染％ 不同压力(10xMPa/Barr)下转染24小时后的估计细胞存活％
40  50  60  40  50  60
细胞+pEGFP(A) 50-52  66-70  58-61  96-97  93-95  90-94
仅细胞(NA) 0  0  0  -  -  -
仅细胞(A) 0  0  0  95-97  91-94  90-91
细胞+pEGFP(A) 50-51  56-59  54-57  94-95  90-92  90-91
细胞+β-gal(NA) 0  0  0  -  -  -
细胞+70KDex(A) 66-68  68-70  54-56  95-97  92-93  89-94
表5-含pEGFP-C1载体的酵母细胞的电穿孔细胞存活和效率
    样品     电穿孔后的存活％ 转染的细胞％
12小时  24小时 48小时
非洲粟酒裂殖酵母+DNA载体 40-50  20-30 小于5  5.5-16
酿酒酵母+DNA载体 40-50  35-37 小于7  12.8-20
表6-当酵母细胞停止结合大分子时在4MPa(40Barr)气穿孔后的时间
时间(秒) 酿酒酵母 非洲粟酒裂殖酵母
20 是 是
40 是 是
60 是 是
90 是 否
120 否 否
表7-当酵母细胞停止结合大分子时在5MPa(50Barr)气穿孔后的时间
时间(秒) 酿酒酵母 非洲粟酒裂殖酵母
20 是 是
40 是 是
60 是 是
90 否 否
120 否 否
确定用高压气穿孔转染酵母在5MPa(50Barr)最有效。转染效率甚至在高压保持很高(表3和4；图9)而没有随着使用空气显著损失存活力。
非洲粟酒裂殖酵母和酿酒酵母的存活百分比甚至在气穿孔后48小时保持较高，表明此过程似乎不杀死细胞或抑制它们的生长周期(图8)。然而，用正方形波电穿孔转染显示系统似乎使细胞破裂，产生的百分比和存活较低(图7；表5)
这指示气穿孔转染酵母的效率比电穿孔高许多。为探测细胞壁中孔重密封所用时间而进行的试验显示在两种酵母中，孔在5MPa(50Barr)的重密封都远快于4MPa(40Barr)空气。用气穿孔进行的实验也显示镰刀菌正响应于6-7MPa(60-70Barr)的气穿孔。
工作显示气穿孔尽管是一种相当简单的方法，它是非常有效和非常有利的转染方法。
参考文献
Bell H.，Kimber W.L.，Li M.，Wittle I.R.，Neuroreport，9(5)，793-798页，1998
Fenton M.，Bone N.，Sinclair A.J.，Journal of Immunological Methods，212(1)，41-48页，1998
Mascarenhas L.，Stripecke R.，Case S.S.，Xu D.K.，Weinberg K.I.，KohnD.B.，Blood，92(10)，3537-3545页，1998
实施例10-NT1和BMS细胞培养物的气穿孔法
培养/维持NT1和BMS细胞培养物的材料和方法
BMS(Black Mexican Sweet)和玉米(Zea mays L.)细胞悬浮液获得自John InnesCentre(Norwich，UK)。BMS细胞悬浮液培养如前面Green C.E.(1997)《细胞培养领域农作物改进的前景》(Prospects for crop improvement in the field of cellculture)，Hort.Science 12：131-134所述。
NT1烟草(Nicotiana tabacum L.)细胞悬浮液获得自John Innes Centre(Norwich，UK)。NT1细胞悬浮液培养如前面Fromm M，Callis J.Taylor LP，WalbotV(1987)Methods Enzymol.153：351-366所述。
下列基因构建物在艾塞克斯大学(University of Essex)使用：
PJIT58(P.Mullineaux，JIC)       用于植物细胞转化(见图4)
PAL145(D.Lonsdale，JIC)         用于植物细胞转化(见图6)
PGVT5(V.Thole，JIC)             用于NT1烟草CS转化(见图3)
PAL156(D.Lonsdale，JIC)         用于BMS和水稻ECS转化(见图5)
所有上述基因构建物已公布并可获得自John Innes Centre(Norwich，UK)。
基因构建物细节提供在图谱中：
·gusA：来自大肠杆菌的葡糖苷酸酶基因
·bar：来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的Phosphinitricin乙酰转移酶基因
·nptII：来自大肠杆菌的新霉素磷酸转移酶基因
·内含子4：来自Zea mays噬菌体类型聚合酶基因的内含子4
·内含子ST-LS1：来自Solanum tuberosum ST-LS1基因的内含子2
·35S-P：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子
·Ubi-P：来自Zea mays的泛素1启动子+外显子1+内含子1
·nos-P：来自农杆菌(Agrobacterium)的胭脂碱合酶启动子
·35S-T：来自花椰菜花叶病毒的聚腺苷酸化序列
·S-T：来自Glycine max的聚腺苷酸化序列
·nos-T：来自农杆菌的胭脂碱合酶聚腺苷酸化序列
10a气穿孔前培养/维持和制备水稻胚胎细胞悬浮培养物
胚胎水稻愈伤组织的生成
成熟水稻种子(Oryza sativa L.)品种Nipponbare用于愈伤组织生成，使用来自Sivamini等，1996，Wang等，，1997和Bec等，1998的改进操作。去壳的种子用一半强度的商业漂白剂杀菌15分钟并用无菌蒸馏水冲洗涤三次。胚胎在解剖显微镜下无菌取出并在25℃暗处平板培养于NBm培养基(常量元素N6、微量元素B5、Fe-EDTA、30gl-1蔗糖、30gl-12，4-D 2mgl-1、300mgl-1干酪素水解物、500mgl-1L-谷氨酰胺、500mgl-1 L-脯氨酸、2.5gl-1Phytagel，pH5.8，高压灭菌后加入过滤-杀菌的维生素B5)3周。约1mm大小的松散胚胎半透明小球(U)与凝胶凝剂上原始胚胎分开。小球在新鲜NBm培养基上另外培养10天以产生胚结单位(ENU，Bec等，1998)。
胚胎细胞悬浮液(ECS)的生成
胚结单位(ENU)分散于250ml烧瓶中，烧瓶含40ml NBm液体培养基，在25℃暗处以100rpm摇。每周从各烧瓶中取出旧培养基且约500μl PCV细胞传代培养到新烧瓶中，新烧瓶含40ml NBm液体培养基。
用于气穿孔的水稻ECS制备
一周的水稻ECS通过1mm尼龙网过滤。等分滤液用于气穿孔(在实验30/7/02种，约50μl PCV水稻细胞在0.2、0.5或1ml NBm液体培养基中)。
参考文献
Sivamani，E.，Shen，P.，Opalka，N.，Beachy，R.N.和Fauquet，C.M.(1996)《用生物列举方法从印度产水稻种子中选择大量胚胎愈伤组织用于生成可繁殖的植物》(Selection of large quantities of embryogenic calli from rice seedsfor production of fertile plants using the biolistic method.15：322-327Bec，S.，Chen.，Ferriere，N.M.，Legave，T.，Fauquet，C.和Guideroni，E.1998.《微发射-调节基因转移到日本产水稻的胚胎愈伤组织的比较组织学：靶组织结构组成对基因型转化能力的影响》(Comparative Histology ofmicroprojectille-mediated gene transfer to embryonic calli in japonicarice(Oryza sativa L.)：influence of structural organization of target tissueon genotype transformation ability.Plant Science 138：177-190.Wang，M.B.，Upadhyaya，N.B.，Brettel，R.I.S.和Waterhouse，P.M.1997.《内含子-调节改进可选择标记基因用于使用农杆菌tumefaciens的植物转化》(Intron-mediated improvement of a selectable marker gene for planttransformation using Agrobacterium tumefaciens.J Genet&Breed 51：325-334.
10b用气穿孔转染悬浮BMS和NT1植物细胞
转染指一定范围的技术，用于将具体双链DNAs导入分裂的真核生物细胞，所用方法使它们能被核吸收和表达。
发现植物细胞的悬浮培养物可用高压气穿孔转染。
此例子描述了用高压气穿孔研究BMS和NT1细胞转染进行的工作。
转染过程
培养于合适培养基的BMS和NT1悬浮植物细胞用于实验。用如前所述1个循环15分钟的加压/减压到6-7MPa(60-70Barr)通过气穿孔转染细胞。
报道分子
不同的报道分子用于此实验。这些包括β-葡糖苷酸酶(用于BMS细胞的pAL145、RT18和用于NT1细胞的PJIT58、PGVT5。所有使用的质粒由John Innes Centre提供)。也使用绿色荧光蛋白载体(GFP)。
最后用气穿孔器使BMS和NT1悬浮植物细胞转染TMR-葡聚糖(分子量70,000)。
细胞培养
BMS细胞
这些培养在BMS悬浮细胞培养基中。细胞每周传代培养。10ml的培养物加50ml的新鲜培养基加入250ml烧瓶。细胞在25℃以150rpm摇。
NT1细胞
这些培养在NT1悬浮细胞培养基中。细胞每周以1∶50和1∶100的稀释传代培养。它们在25℃以125rpm摇，用箔遮光。
水稻胚胎细胞悬浮培养物
这些培养在NBm培养基中。细胞每周传代培养。它们在25℃暗处以1000rpm摇。
细胞分析
光学显微镜-明视场显微镜
明视场显微镜是光学显微镜领域最广泛使用的技术。通常，活的单个细胞或单层细胞在普通光学显微镜下几乎看不见。当通过染色补充时，明视场显微镜是一种有力的技术。
光学显微镜-荧光显微镜
荧光显微镜的基础是一些物质吸收一定波长范围的光且随后以光的形式发射。对于我们的研究，使用Olympus IM12显微镜。对于我们的荧光蛋白质，可使用标准的FITC滤光器。
结果
气穿孔器(B)在7MPa(70Barr)使用15分钟来使培养的BMS细胞转化GFP载体。在测试细胞中观察到显著的荧光。未处理的对照没有显示荧光。
用GFP载体转染培养的NT1细胞
细胞分别在6MPa(60Barr)和7MPa(70Barr)处理15分钟。在测试细胞中观察到显著的荧光。未处理的对照没有显示荧光。
用TMR-葡聚糖(分子量70,000)转染培养的BMS细胞
细胞在气穿孔器中7MPa(70Barr)处理15分钟。在测试细胞中观察到显著的荧光。未处理的对照没有显示荧光。
用TMR-葡聚糖(分子量70,000)转染培养的NT1细胞
细胞在气穿孔器中7MPa(70Barr)处理15分钟(1个循环)。在测试细胞中观察到显著的荧光。未处理的对照没有显示荧光。
用PGVT5载体(GUS)稳定转染培养的NT1细胞作为每次的预实验(即1个循环：6-7MPa(60-70Barr)15分钟)
在选择性培养基中培养约2周后、进一步在非选择性培养基中2和3周后拍摄的照片显示测试细胞中有显著的染色。
用TMR-葡聚糖和GFP转染培养的水稻胚胎培养物
测试的水稻胚胎细胞显示显著的蓝色。未处理的对照没有显示荧光。
实施例11-气穿孔转化后传代培养和选择细胞的材料和方法
气穿孔处理后，水稻ECS置于皮氏培养皿上的Whatman滤器上并在25℃暗处培养2天，皮氏培养皿含NBm固体培养基。
气穿孔后2天，过滤物在25℃暗处转移到选择性培养基(NBm固体培养基加5mg/l phosphinotrycin(PPT，选择pAL156)或100mg/l geneticin(选择pGVT5)2周。当包括PPT时将L-谷氨酰胺从所有培养基中去除。
转化后2周，各愈伤组织(生长自单独的ENU)分成2到5块。愈伤组织块在新鲜的以NBm为基础的选择性培养基上载培养3周。生长自单独ENU的抗性愈伤组织在2+3周选择后聚集在一起。
气穿孔后5周，抗性愈伤组织在25℃暗处转移到PRm前再生培养基(没有2，4-D的NBm固体培养基，但有2mg/l BAP、1mg/l NAA、5mg/l ABA加5mg/l PPT(选择pAL156)或100mg/l geneticin(选择pGVT5)9天。
气穿孔后6周，显示明显差异生长的愈伤组织随后在25℃亮处转移到再生培养基RNm(没有2，4-D的NBm固体培养基，但有3mg/l BAP、0.5mg/l NAA加5mg/lPPT(选择pAL156)或100mg/l geneticin(选择pGVT5)2-3周。仅一种植物从各原始ENU再生以确保各植物代表单独的转化。
气穿孔后8到9周，植物在MSR6固体培养基(Vain等，1998)上25℃亮处发育2-3周，MSR6固体培养基含5mg/l PPT(选择pRT19)或100mg/l geneticin(选择pGVT5)。
气穿孔后10到12周，转化的植物转移到人工气候室以生长到成熟和产生种子。
在选择过程中通过Jefferson方法(1987)和之后的组织化学GUS染色来监控水稻愈伤组织和植物中的GusA基因活性。用PCR和DNA印迹分析进行转化植物的分子分析。
参考文献
Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW(1987)《β-葡糖苷酸酶在高等植物中作为敏感和多功能融合标记》(β-glucuronidase as sensitive and versatilefusion marker in higher plants).EMBO J.6：3901-3907
Vain，P.，Worland，B.，Clarke，M.C.，Richard，G.，Beavis，M.，Liu，H.，Kohli，A.，Leech，M.，Snape，J.W.，Christou，P.和Atkinson，H.1998.《在转基因水稻植物中表达抗线虫的工程蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin-IΔd86)》(Expression of an engineered proteinase inhibitor(Oryzacystatin-IΔd86)for nematode resistance in transgenic rice plants).Theor.andAppl.Genet 96：266-271.
表8-NBm液体培养基
NBm液体-1L  NBm固体-1L
常量元素N6 100ml  100ml
微量元素B5 10ml  10ml
FE-EDTA 10ml  10ml
蔗糖 30g  30g
2，4-D 2mg  2mg
干酪素水解物 300mg  300mg
L-谷氨酰胺 500mg  500mg
L-脯氨酸 500mg  500mg
Phytagel ---  2.5g
补至体积 990ml  990ml
PH(用KOH) 5.8  5.8
高压灭菌后加
维生素B5(PH5.8，无菌) 10ml  10ml
常量元素N6贮存液(Chu等，1975)
用于1l
KNO3            28.3g
(NH4)2SO4    4.63g
CaCl22H2O       1.66g
MgSO47H2O      1.85g
KH2PO4         4g
补至体积1l
使用：100ml/l培养基
贮存：4℃，未灭菌
微量元素B5贮存液(Camborg等，1968)
用于500ml
H3BO3          150mg
MnSO4·4H2O      660mg
ZnSO4·7H2O      100mg
KI                  37.5mg
Na2MoO4·2H2O   12.5mg
CuSO4·5H2O      1.25mg(5ml的0.25mg/ml贮存液)
CoCl2·6H2O      1.25mg(4.5ml的0.28mg/ml贮存液)
补至体积500ml
使用：10ml/l培养基
贮存：4℃，未灭菌
维生素B5贮存液(Camborg等，1968)
用于500ml
盐酸硫胺素      500mg
盐酸维生素B6    50mg
烟酸            50mg
肌醇            5g
补至体积500ml
使用：10ml/l培养基
贮存：pH5.8，4℃，过滤灭菌，暗容器
参考文献
Camborg OL，Miller RA，Ojima K(1968)《大豆根细胞悬浮培养的必要条件》(Requirements of suspension cultures of soybean root cells).Exp CellRes.50：151-158
Chu CC，Wang CC，Sun CS Hus C，Yin KC，Chu CY，Bi FY(1975)《通过氮源比较实验建立另一种培养水稻的有效培养基》(Establishment of an efficientmedium for another culture of rice through comparative experiments on thenitrogen sources)Sci.Sin.(Pekin)18：659-668.
实施例12-用气穿孔稳定转染植物细胞
植物细胞的悬浮培养物可用高压气穿孔转染。然而，许多细胞本身表达不整合到宿主基因组的载体，这称为暂时表达。
产生外源基因稳定整合到宿主基因组的细胞需要从非转染细胞中选择转染细胞。这通常通过共转染到细胞中来完成，用于组成型表达赋予转染细胞抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因优选在与感兴趣外源基因相同的质粒载体上进行。一个普遍使用的选择方法是利用新霉素基因，此基因赋予受体细胞对G418硫酸盐的抗性。此报导描述了用高压气穿孔研究稳定转染所进行的工作。
转染过程
植物细胞悬浮液通过在MS或B5培养基中培养至少3天从碎烟草和玉米叶获得，它们用于所有实验。细胞如前所述用一个循环的加压/减压到7MPa(70Barr)通过气穿孔转染。
报道分子
四种不同类型的报道DNA载体用于植物细胞转染研究，这些包括β-葡糖苷酸酶(β-gal)、葡糖苷酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白载体(GFP)和红色荧光蛋白载体(RFP)。
GFP是有用的，因为它可不杀死细胞来检测。转化GFP基因的细胞表现出亮荧光。GFP是具小分子量的高稳定蛋白质且表现出很少的光褪色。此报道系统显示在多种生物系统中发挥作用，包括植物(Corbett，1995；Haseloff，1995；Kaether，1995；Wang，1994)。另一方面，RFP显示没有自身荧光。
GFP和RFP的优势是表达报道分子的细胞可通过荧光显微镜鉴定，这使细胞能用流式细胞仪来分类。载体都有新霉素基因，使得在培养中选择转染细胞容易。由于这个原因，第一个实验用2μg/ml浓度的GFP和RFP DNA载体完成。
细胞培养
转染后细胞立即在MS培养基中培养，但由于存在新霉素抗性基因而加入geneticin(G418)(Sigma)选择转染细胞。开始前，通过抗生素选择完成转染细胞的细胞死亡剂量-反应曲线。重要的是使用正确浓度的选择性培养基，此浓度正好足以在1-3天时间段杀死大部分未转染细胞。在我们的实验中，我们使用1000μg/ml的G418用于完全选择。细胞在此选择性培养基生长至少2-3周，按需要每3-4天改变培养基，随后细胞转移到非选择性培养基中以进一步生长。
细胞分析
荧光-活化的细胞分类
此技术可用于在细胞光散射特性和它们表达的具体表面分子基础上分离细胞。这些分子可用荧光染料标记的具体配基(如抗体)来检测。含细胞的微滴流穿过激光束。在小角和90°检测到光散射以及激光激发的荧光染料荧光。有光散射且荧光参数在预定界限中的细胞发生静电偏离用于收集。也可修改此技术用于使单个细胞偏离进入多孔平板的孔中。
荧光显微镜
细胞用明视场显微镜或荧光显微镜检测，使用Olympus IM12显微镜。对于两种荧光蛋白质，可使用标准的FITC滤光器。
结果
来自培养的烟叶细胞培养物稳定转染的GFP照片
培养的烟叶细胞用气穿孔来稳定转染GFP载体。在选择性培养基中培养2周后、在非选择性培养基中进一步培养2周后拍摄照片。未处理的对照没有显示荧光而转染细胞表现出显著的染色。
来自培养的玉米和烟叶细胞稳定转染的RFP照片
稳定转染培养的玉米和烟叶细胞。细胞用气穿孔转染RFP载体。在选择性培养基中培养2周后拍摄照片。未处理的对照没有显示荧光而转染细胞表现出显著的染色。
根据我们的实验很明显的是稳定转染可用气穿孔技术影响。转染GFP载体的烟叶细胞培养物成功地生长约4周：2周在选择性培养基中且后2周在非选择性培养基中。在GFP载体的情况中，玉米细胞中的RFP表达水平似乎比烟草低。
参考文献
Corbett，A.H.，Koepp，D.M.，Sclenstedt，G.，Lee，M.S.，Hoper，A.K.，Silver，P.A.(1995).《核输出需要的Ran/TC4 GTPase活化蛋白质Rnalp》(Rnalp，Ran/TC4 GTPase activating protein，is required for nuclearimport)J.Cell.Biol.130，1017-1026.
Haseloff，J.，Amos，B.(1995)《植物的GFP》(GFP in plants).TIG 11，328-329
Kaether，C.，Gerdes，H.H.(1995)《用绿色荧光蛋白显现分泌途径的蛋白质运输》(Visualization of protein transport along the secretory pathway usinggreen fluorescent protein).FBBS Lettt.369，267-271
Wang，S.X.，Hazelrigg，T(1994)《来自果蝇卵子生成中exu蛋白质空间分布的bcd mRNA定位指示》(Implications for bcd mRNA localization from spatialdistribution of exu protein in Drosophila oogenesis).Nature(London)369，400-403
实施例13-植物细胞的气穿孔
气穿孔方法用于植物细胞的不同制备，使用编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的DNA载体和编码红色荧光蛋白的pDsRed1-C1载体。培养3-5天的烟叶细胞可用GUS转染。在5-7MPa(50-70Barr)压力气穿孔玉米表明更高压力产生更高的转染水平。用红色荧光蛋白载体气穿孔烟草和玉米叶分别表现出45-55％和30-35％的明显转染水平。也建立了稳定转染GFP的烟草和玉米细胞培养物。
前面的工作用气穿孔转染植物细胞，TMR-葡聚糖、GFP和β-半乳糖苷酶载体用作报道分子。
植物实验用编码葡糖苷酸酶(GUS)的载体进行，载体具体设计用于在植物中表达，一个设计用于双子叶植物且另一个用于单子叶植物，两者都可从John InnesCentre(Norwich)获得。适于组织化学、分光光度和荧光分析的GUS试验底物可商业获得。
植物
烟草(N.tabacum)和玉米(Z.mays)植物在温室中生长约6-7周。所用植物组织是烟草和玉米叶(约1.0cm长)。
植物细胞样品
植物组织被消毒(Hall，1999)且随后精细地剁碎成1-2mm立方体。剁碎片断直接用于气穿孔或在皮氏培养皿中培养并在定轨摇床(140rpm)中24-26℃培养36-48小时，皮氏培养皿含10ml MS或B5培养基(Hall，1999)。
单细胞悬浮液制备自培养片断，这是通过用无菌筛(0.5-1.0mm筛孔)从细胞悬浮液中去除所有块状植物物质。剩余的细胞悬浮液在750g离心5分钟。离心后，沉淀重悬浮于合适培养基，接着25℃培养。所用培养基是添加4.5μM 2，4-D(Gamborg等，，1979)的MS培养基。细胞以2.5×103个细胞/ml的密度接种在10ml总体积中。植物细胞悬浮培养物在25℃维持于培养箱中。
载体
TMR-葡聚糖(70kDa)用于指示一个孔在细胞膜中产生。此分子直径约为5.4nm。
对于用GUS转化双子叶植物，使用pJIT58载体(5.2kb)(图4)，而对于用GUS转化单子叶植物，使用pAL145载体(6.98kb)(图6)。
表达红色荧光蛋白的PDsRed1-C1载体用于转染单子叶植物和双子叶植物(图10)。
植物细胞的气穿孔操作过程
FACS管内1.0ml体积MS培养基中的4×104个细胞悬浮液置于气穿孔器的压力舱，随后加压到7MPa(70Barr)15分钟，接着迅速减压。整个过程在室温(20-22℃)进行。气穿孔循环结束后，细胞从气穿孔器中取出并转移到微离心管。细胞在218xg 5分钟离心一次且沉淀重悬浮于1ml培养基。细胞悬浮液转移到24孔板并培养(25℃)48-72小时用于表达DNA。
植物细胞的显微镜分析
GUS染色(Gallagher S.R.，1992)
·5×104个转染细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤一次
·细胞转移到聚-L-赖氨酸覆盖的载玻片(载玻片用70％Z醇+6ml赖氨酸溶液洗涤1小时，随后用dd.H2O冲洗涤9次)。使细胞附着15分钟并去除过多的液体。
·细胞用固定剂(含2％甲醛和0.05％戊二醛的PBS)室温固定5分钟
·PBS洗涤一次
·加入X-Gluc(1mg/ml)到染色溶液且37℃过夜(16小时)孵育。
·用PBS仔细冲洗涤并对所有样品用相同焦距在倒置显微镜下观察
β-葡糖苷酸酶(GUS)活性裂解底物4-MUG(4-甲基繖形基β-D葡糖苷酸)(4-methylumbelliferyl β-D glucuronide)，导致荧光产物4-MU生成，4-MU可用紫外光显现。所用操作过程由Gallagher描述(1989)。
组织培养基中用MUG的非破坏试验
4-MUG似乎在短培养段(至2天)中没有毒性，发展了组织培养基中无毒性染色过程(Gould和Smith，1989)。由于来自培养植物组织的β-葡糖苷酸酶裂解入培养基，物质转移到培养基后可在用过的培养基中分析GUS表达。另外，悬浮培养物可直接染色而不破坏物质。
试验操作过程
·在含2mM 4-MUG的液体或琼脂培养基中培养物质2天
·30-37℃过夜培养。温度取决于启动子强度。
·转移到新培养基
·加入10-30μl 0.3M Na2CO3到组织
·紫外光下20分钟后评估染色
结果
植物组织样品中的转染模式
培养的烟草细胞悬浮液用气穿孔器转染GUS(pJIT58载体)且转染细胞用(A)X-gluc底物或(B)MUG底物显现。细胞在气穿孔器中处理一个15分钟的循环且所用压力为7MPa(70Barr)。
培养的玉米细胞悬浮液用气穿孔器转染GUS(pAL145载体)并用MUG底物显现。细胞在气穿孔器中处理一个15分钟的循环且所用压力为(A)5MPa(50Barr)、(B)6MPa(60Barr)和(C)7MPa(70Barr)。未处理对照没有显示荧光。
根据结果明显的是烟草细胞可用气穿孔方法转染GUS，使用荧光或非荧光底物。获得的转染水平估计为约2％。悬浮玉米细胞也用设计用于单子叶植物的载体转染。在压力范围5-7MPa(50-70Barr)气穿孔玉米表明更高压力产生更高的转染水平。
用下面DsRed1载体的转染实验所得结果表明在悬浮烟草细胞的情况中，气穿孔产生约50％的细胞转染，而获得的培养玉米细胞转染水平稍低，约为35％。
培养的烟叶细胞和培养的玉米叶细胞在培养5天后用DsRed1转染。气穿孔器中所用压力为7MPa(70Barr)且细胞处理一个15分钟的循环；所用气体是空气。未处理对照没有显示荧光。
优选压力是5-8MPa(50-80Barr)，用一个或更多15分钟循环以最大化转染和细胞产生。用GFP稳定转染的烟草和玉米叶细胞培养物能在非选择性培养基中生长至少一个4周时间段。
参考文献
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主编
实施例14-大肠杆菌转染
大肠杆菌细胞(E.coli细胞)的生长条件
大肠杆菌细胞首先在laurina肉汤(LB)中37℃冷却定轨摇床过夜生长，随后在LB琼脂平板上划线培养。
使用无菌牙签从平板中挑出一个单菌落用于转化，接种10ml LB培养基并37℃过夜生长。第二天早上，取出100μl细胞并加入另外的10ml培养基且培养2小时。
用高压气穿孔转染的方法
细胞用如下的气穿孔过程来转化：
·1x磷酸缓冲盐水(PBS)用作转染培养基并作为洗涤培养基
·计数细胞(约0.5-1×106个细胞/ml)
·在1ml无菌双蒸水中通过1300rpm离心5分钟(2x)来洗涤细胞
·用冰的1xPBS洗涤
·细胞重悬浮于冰的1xPBS并转移到FACS管
·加入0.5μl大分子到溶液中
·管置于气穿孔器舱中并关闭舱
·关闭空气出口并调节所需压力
·打开空气入口并使加压发生15分钟
·通过关闭入口和打开出口使舱减压
·从舱中取出FACS管
·在1300rpm旋转细胞，随后重悬浮于培养基使细胞生长到指数期(如果使用葡聚糖，分析应该在气穿孔后立即进行)。
·制备细胞用于分析
通过气穿孔转化大肠杆菌用一些可商业购得的载体进行。
TMR葡聚糖也用于这些实验。
气穿孔转化细胞的DNA分离
根据厂商说明用Quiagen的无内毒素微型试剂盒分离DNA。
结果
转化大肠杆菌用1xPBS成功进行。
转化后，细胞在选择性培养基中过夜生长并分离DNA。
表9-用不同载体和1xPBS作为转染培养基来转化大肠杆菌
所用载体 不同压力(Barr/0.1MPa)时在选择性培养基上形成菌落的效率40       50        60
 pEGFP-C1  xxxxx  xxxxx  xxxx
 pEGFP  xxxxx  xxxxx  xx
 pDsRED2-N1  xxxx  xxxxx  xxx
 pCMV-SPORT-β gal  xxxxx  xxxxx  xx
 pEYFP-C1  xxx  xx  x
 pEYFP-N1  xxx  xxxx  xx
代码：x      生长很差
      xx     生长较差
      xxx    生长好
xxxx    生长好到极好
xxxxx   生长极好
TMR葡聚糖也用于研究1xPBS作为转染培养基的转化
表10-在37℃冷却定轨摇床培养16小时后用1xPBS气穿孔转化细胞的观察
所用载体 抗生素平板类型 菌落 转化后LB选择性培养基中的细菌生长
pFGFP-C1 卡那霉素 是 是
pCMV-SPORT-β gal 氨苄青霉素 是 是
pDsRED2-N1 卡那霉素 是 是
pEYFP-C1 卡那霉素 是 是
pEYFP-N1 卡那霉素 是 是
pEGFP 氨苄青霉素 是 是
根据上述结果显然大肠杆菌转化是成功的。所有指示显示气穿孔方法适于导致DNA分离的细菌转化。
参考文献
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实施例15-枯草芽孢杆菌转染
材料
下列材料用于此实施例：
·0.4％PBS中的锥虫蓝
·无菌蒸馏水
·无菌1xPBS
·穿梭载体-JM110(pHB201)
·LB培养基
·气穿孔器
·枯草芽孢杆菌
·红霉素
枯草芽孢杆菌的生长和气穿孔
·用无菌一次性环将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基。37℃过夜培养
·挑出单菌落并接种10ml LB肉汤，在冷却定轨摇床中以185rpm过夜生长
·在早上用100μl过夜培养物接种新鲜的10ml LB肉汤。37℃培养2小时
·枯草芽孢杆菌在冰上冷却且并同时冷却MCC管
·取出1ml液体培养物并加入冷的MCC管，1000rpm旋转5分钟
·去除上清，随后加入1ml冰的无菌水并在1000rpm旋转(两次)
·去除上清并加入1ml冰的1xPBS，1000rpm旋转5分钟，随后去除上清并加入1ml冰1xPBS到细胞，然后加入0.5μl DNA，混合，接着加入冷的管
·管放入气穿孔器并加压舱15分钟
·减压并取出管
·从管中取出细胞并放回冷的MCC管
·如上所述洗涤细胞
·在1xPBS中洗涤，1000rpm 5分钟并去除上清
·加入1ml的温(37℃)LB培养基
·进行连续稀释(任选)
·在选择性培养基上平板培养，此情况中是红霉素
·37℃培养16小时
表11-气穿孔后在选择性和非选择性培养基上枯草芽孢杆菌的观察
    压力(Barr/0.1MPa)   细胞+DNA在抗生素上 细胞没有DNA在抗生素上 细胞+DNA在非选择性培养基上 细胞没有DNA在非选择性培养基上
    40     生长好     否     是     是
    50     生长好     否     是     是
    60     生长     否     是     是
上面表11的结果证明枯草芽孢杆菌在所有压力成功转染且具体是在4和5MPa(40-50Barr)，因为转染细胞能在含红霉素的培养基上生长，与非转染细胞相反。
实施例16-FITC-BSA转染的N.tabacum植物细胞的气穿孔
气穿孔转染FITC-BSA(1μg/ml)的N.tabacum(获得自叶肉组织(mesoplylltissue))植物细胞。细胞在气穿孔器中处理45分钟(3个循环)。第一个样品在空气存在时转染，而第二个在氧存在时转染。
样品测试都为阳性。在单独存在氧时进行气穿孔的情况中，所得表达高于存在空气时进行气穿孔所得表达。未处理对照没有显示荧光。
这证明在发明的一些实施方案中，用于气穿孔方法的气体溶解度越大，细胞转化越成功。

Claims (57)

1.一种渗透有细胞壁的活细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)加压与细胞表面接触的流体或凝胶；和
(b)减压流体或凝胶；
以在细胞表面形成至少一个孔。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，减压流体或凝胶产生的气泡能在细胞表面形成至少一个孔。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的压力减少是2MPa(20Barr)或更多。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的压力减少是2-11MPa(20-110Barr)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的压力减少是5-11MPa(50-110Barr)。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，流体或凝胶在步骤(b)中几乎减压到大气压(约1Barr)。
7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，细胞表面的孔包括细胞膜中的孔。
8.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，压力在步骤(b)中在小于10秒的间隔内减少。
9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，流体或凝胶在步骤(a)中加压10分钟或更长。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，流体或凝胶在步骤(a)中加压10-20分钟。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，流体或凝胶在步骤(a)中加压15分钟。
12.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，流体或凝胶包括含水液体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，流体或凝胶包括缓冲液或细胞培养基。
14.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，接触流体或凝胶的气体在流体或凝胶中的溶解度为1.0×10-4mol/l atm或更高，流体或凝胶受到加压。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，气体的溶解度为6.0×10-4mol/l atm或更高。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，气体选自空气、氧气、氮气、二氧化碳、甲烷、氦气、氖气和氩气。
17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法由单个加压和减压循环或多个加压和减压循环组成。
18.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，细胞是植物细胞、真菌细胞或细菌细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，细胞来自农作物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，农作物选自谷类或豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、水稻、高粱、稷、木薯、大麦、豌豆和其它根、块茎或种子作物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，种子作物选自含油种子油菜、糖用甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，植物细胞来自园艺植物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，园艺植物选自莴苣、菊苣、芸苔植物、石竹、天竺葵、烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊花、白杨、桉树和松树，芸苔植物包括甘蓝、花茎甘蓝和花椰菜。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，细胞来自选自含油种子植物、产生谷类种子的植物和豆类植物的产子植物。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，含油种子植物选自棉花、大豆、红花、向日葵、含油种子油菜、玉米、紫花苜蓿、棕榈和椰子。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，产生谷类种子的植物选自玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦和其它产生谷类种子的植物。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，豆类植物选自瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆和鹰嘴豆。
28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其特征在于，细胞来自植物细胞，植物细胞选自玉米(Zea mays)、油菜(Brassica napus，Brassica rapa属)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea属)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus属)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa属)、鳄梨(Persea Americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia interifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于，细菌细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，细胞选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、禾本科镰刀菌(F.graminearum)、非洲粟酒裂殖酵母(S.prombe)、Z.mays和N.tabacum。
31.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，细胞形成部分细胞聚簇。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，聚簇是胚胎聚簇。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，细胞是小孢子。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，细胞是花粉小孢子。
35.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，流体或凝胶的温度直至37℃。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，温度是15-30℃。
37.一种将物质导入有细胞壁的细胞的方法，其特征在于，方法包括如上述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个孔促进物质进入。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，流体或凝胶包含所述物质。
39.如权利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述物质选自生物分子或大分子。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述物质选自核酸，包括DNA、cDNA、RNA或mRNA。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，核酸包括基因、质粒、染色体、寡核苷酸、核苷酸序列、核酶或其片断或表达载体。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，物质包括生物活性分子，包含蛋白质、多肽、肽、氨基酸、激素、多糖、染料和药物剂如药物。
43.如权利要求37-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述物质具有100道尔顿或更高的分子量。
44.一种通过权利要求1-43中任一项所述方法获得的有细胞壁的渗透细胞，其特征在于，细胞表面包括至少一个能促进物质进入细胞的孔。
45.如权利要求44所述的渗透细胞，其特征在于，孔包括细胞膜中的孔。
46.如权利要求44或45所述的渗透细胞，其特征在于，细胞的细胞壁几乎完整。
47.减压方法在渗透细胞和/或将物质导入细胞中的应用，其特征在于，细胞有细胞壁，减压方法用于通过2MPa(20Barr)或更高的步骤降低应用于流体或凝胶的压力，流体或凝胶包含细胞。
48.一种将物质导入有细胞壁的细胞的设备，其特征在于，使用权利要求1-43中任一项所述的方法，设备包括：
(a)导入气体的入口；
(b)入口进入的压力舱，舱具有显著的几何横截面；
(c)压力舱内的隔室，用于使细胞包含在流体或凝胶中；
(d)任选的压力计，用于监控压力舱中的压力；和
(e)释放压力舱气体的出口；
其中，入口和出口包括在加压时分隔压力舱的阀。
49.如权利要求48所述的设备，其特征在于，入口和出口包括入口和出口管。
50.如权利要求49所述的设备，其特征在于，入口管和/或出口管直径是2-4mm。
51.如权利要求48-50中任一项所述的设备，其特征在于，压力舱的几何横截面几乎是柱状的。
52.如权利要求48-51中任一项所述的设备，其特征在于，使细胞包含在流体或凝胶中的隔室包括几乎压力舱全部内表面。
53.如权利要求52所述的设备，其特征在于，压力舱内表面包括生理可接受的涂层。
54.如权利要求48-51中任一项所述的设备，其特征在于，使细胞包含在流体或凝胶中的隔室包括位于压力舱内表面附近的容器。
55.如权利要求54所述的设备，其特征在于，容器由压力舱内表面支持。
56.如权利要求54或55所述的设备，其特征在于，容器内表面包括生理可接受的涂层。
57.如权利要求48-56中任一项所述的设备，其特征在于，入口和/或出口中的阀包括针形阀。
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