WO2020116353A1 - 細胞に物質を導入する装置 - Google Patents

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WO2020116353A1
WO2020116353A1 PCT/JP2019/046860 JP2019046860W WO2020116353A1 WO 2020116353 A1 WO2020116353 A1 WO 2020116353A1 JP 2019046860 W JP2019046860 W JP 2019046860W WO 2020116353 A1 WO2020116353 A1 WO 2020116353A1
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cells
substance
cell
maximum pressure
pressure
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PCT/JP2019/046860
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和宏 寺居
洋 宮▲崎▼
透 北口
裕子 坂口
克哉 三木
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株式会社ダイセル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/12—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present disclosure relates to an apparatus for introducing a substance into cells in vitro.
  • Typical methods for introducing substances into cells include classical methods such as electroporation, lipofection, and gene gun (gene gun), as well as methods such as microinjection, plasma injection, and laser injection.
  • Patent Document 1 a method using a pressure change is known. Specifically, it is a method of introducing a substance into an animal cell by repeating the step of pressurizing the animal cell and the step of subsequently reducing the pressure. Further, in a state where the substance to be introduced into the cell is present in the vicinity of the cell, a droplet having a diameter equivalent to a predetermined sphere which does not contain the substance to be introduced into the cell is collided with the cell without using the electrospray, and the substance is introduced into the animal cell. There is a method of introduction (Patent Document 2). Both methods are useful, but as a technique for introducing a substance into cells, a technique that is highly efficient and can be easily performed in a short time is constantly being demanded.
  • An object of the present disclosure is at least to provide an apparatus capable of highly efficiently introducing substances into cells in vitro in a short time.
  • a device for introducing a substance into a cell in vitro comprising: A storage unit for storing a solution containing cells and substances, and a drive unit for pressurizing the solution,
  • the pressurization is an apparatus in which the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 2.0 milliseconds or less.
  • the device according to [1], wherein the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 0.05 milliseconds or more.
  • the apparatus according to [1] or [2], wherein the maximum pressure is 0.10 MPa or more.
  • a method for producing a cell into which a substance is introduced in vitro comprising: In a storage unit that stores a solution containing cells and a substance, including a step of applying pressure to the solution,
  • the pressurization is a method in which the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 2.0 milliseconds or less.
  • the method according to [9] wherein the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 0.05 milliseconds or more.
  • the method according to [9] or [10] wherein the maximum pressure is 0.10 MPa or more.
  • the present disclosure has at least the effect that the substance can be introduced into the cell with high efficiency and in a short time.
  • One embodiment is an apparatus for introducing a substance into a cell in vitro, comprising: a storage unit that stores a solution containing the cell and the substance; and a drive unit that pressurizes the solution, the pressurization comprising: It is an apparatus in which the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 2.0 milliseconds or less.
  • the same device may be referred to as the “device of the present embodiment”.
  • the region into which a substance is introduced in a cell may be the cytoplasm or the cell nucleus, but a preferred embodiment is the cell nucleus.
  • the aspect in which the region into which the substance is introduced is the cell nucleus means that the substance is introduced into the cytoplasm by the device of the present embodiment, and the substance is introduced into the cytoplasm from the cytoplasm to the cell nucleus. It does not refer to the mode in which the substance migrates, but refers to the mode in which the substance is directly introduced into the cell nucleus by the operation of the device of the present embodiment.
  • the cells into which the substance is introduced are not particularly limited and may be prokaryotic cells or eukaryotic cells, but one preferred embodiment is eukaryotic cells.
  • eukaryotic cells may be an animal cell or a plant cell
  • a preferred embodiment is an animal cell.
  • it may be an adherent cell or a floating cell.
  • it may be a cell line or a primary culture cell.
  • the animal from which the animal cells are derived is not particularly limited, and examples thereof include those derived from the cells handled by research institutions. For example, humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters (eg Chinese hamsters etc.), Drosophila, monkeys (eg African green monkeys etc.) and the like can be mentioned.
  • the plant from which the plant cell is derived is not particularly limited, and examples thereof include seed plants, ferns, moss plants, and algae.
  • the seed plant may be angiosperms or gymnosperms, and the angiosperms may be monocotyledons or dicotyledons.
  • the substance in this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include biomolecules.
  • the biomolecule is not particularly limited as long as it functions in the cell when introduced into the cell.
  • the biomolecule may be a natural product or an artificially synthesized one.
  • a nucleic acid or a derivative thereof; a nucleoside, a nucleotide, or a derivative thereof; an amino acid, a peptide, a protein, or a derivative thereof; a lipid or a derivative thereof; a saccharide or a derivative thereof; a metal ion; a low-molecular compound or a derivative thereof; an antibiotic; Vitamin or its derivative etc. are mentioned.
  • a nucleic acid it may be DNA or RNA.
  • the DNA may be DNA containing a gene. When a DNA containing a gene is introduced into the cytoplasm and/or cell nucleus of the cell, it is expected that the gene can be expressed by culturing cells into which the gene has been introduced.
  • the substance may be in a free form or a form fixed to a carrier such as nanoparticles, as long as the substance is stably present and has no adverse effect such as disrupting the cells themselves or the function of the cells to be introduced. It may be modified, and its aspect including the solvent is not particularly limited.
  • the substance when it is a DNA containing a gene, it may be a DNA designed such that the gene is contained in an expression cassette or expression vector. Furthermore, for example, the gene may be placed under the control of a promoter suitable for the type of cell into which the DNA is introduced. That is, for example, when the substance is a biomolecule, it may be prepared using a known genetic engineering technique or the like in any of the embodiments.
  • a molecule that fluoresces itself is used as the substance of this embodiment, or a substance labeled with a fluorescent molecule is used, and the fluorescence intensity is used as an index for analysis.
  • Known methods can be mentioned.
  • the pressurization of the solution containing cells and substance takes 2.0 milliseconds or less from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure.
  • the above-mentioned pressure is the pressure inside the housing portion.
  • the measuring method is not particularly limited, for example, in the case of measuring using the injector described in the examples below, it can be measured by the method described in the "method of measuring the internal pressure of the housing" section below. ..
  • the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 2.0 milliseconds or less in a preferable aspect, 1.0 millisecond or less in another preferable aspect, and yet another preferable aspect. Is 0.5 milliseconds or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is usually larger than 0, for example, 0.05 milliseconds or more.
  • the maximum pressure is 0.10 MPa or more in a preferred embodiment, 0.20 MPa or more in another preferred embodiment, and 0.35 MPa or more in yet another preferred embodiment.
  • it is expected that the cells will be deformed when the substance is introduced into the cells and the substance will be efficiently introduced.
  • it is 35 MPa or less in one preferable aspect, 34 MPa or less in another preferable aspect, and 33 MPa or less in yet another preferable aspect. If it exceeds 35 MPa, the cells may be killed, and if it is 35 MPa or less, it is expected that the substance can be introduced into the cells without killing the cells.
  • the device of the present embodiment contains a gas in its container because the efficiency of substance introduction into cells is increased.
  • the gas can be exemplified by air.
  • nitrogen, oxygen, ozone, carbon dioxide, hydrogen, and carbon monoxide can be illustrated, and the mixed gas of any 2 or more types can be illustrated.
  • the gas is a gas containing no microorganisms.
  • the air may be generally used air, and its composition is not particularly limited. For example, a mixed gas of about 80% nitrogen and about 20% oxygen can be mentioned.
  • the ratio of the volume of the gas to the volume of the containing portion is not particularly limited as long as the substance introduction into cells is not hindered, and in one preferable aspect, it is 10% or more, and in another preferable aspect, 20% or more, 30% or more in yet another preferred embodiment, 40% or more in yet another preferred embodiment, 50% or more in yet another preferred embodiment, and yet another preferred one. In an aspect, it is 60% or more, in yet another preferable aspect, it is 70% or more, in yet another preferable aspect, it is 80% or more, and in yet another preferable aspect, it is 90% or more. On the other hand, the upper limit is, for example, 95% or less.
  • the structure and material of the container that contains the solution containing cells and substances are not particularly limited as long as they can withstand pressurization. In a preferable aspect, the same is true when the containing portion further contains a gas.
  • the structure and material of the drive unit are not particularly limited.
  • the pressurization may be, for example, the pressure generated when the pressure of the compressed gas is released, or the pressure generated by the combustion of the explosive charged by the ignition device. Further, it may be a pressure using electric energy of a piezoelectric element or the like or mechanical energy of a spring or the like as pressurizing energy, or may be a pressure using pressurizing energy generated by appropriately combining energies of these forms. ..
  • the explosive includes, for example, explosive (ZPP) containing zirconium and potassium perchlorate, titanium hydride and perchloric acid.
  • Powders containing potassium THPP
  • powders containing titanium and potassium perchlorate TiPP
  • powders containing aluminum and potassium perchlorate APP
  • powders containing aluminum and bismuth oxide ABO
  • aluminum and molybdenum oxide AMO
  • the explosive containing aluminum and copper oxide ACO
  • the explosive containing aluminum and iron oxide AFO
  • the explosive consisting of a plurality of combinations thereof may be used. ..
  • As a characteristic of these explosives even if the combustion product is a gas in a high temperature state, it does not contain a gas component at a normal temperature, so that the combustion product immediately after ignition is condensed.
  • An example of the device of this embodiment is an injector.
  • the solution containing cells and substances is not initially stored in the container, but the solution is introduced into the container through the nozzle having the ejection port. Store by aspiration.
  • the syringe part is configured to be removable.
  • the solution may be stored and then the gas may be sucked, or the solution may be stored by first sucking the gas. Good.
  • the ejection port at the tip of the nozzle is sealed so that the solution containing cells and the substance is not ejected.
  • the sealing member and the sealing method are not particularly limited as long as the solution containing the cells and the substance is prevented from being ejected.
  • the containing portion contains gas
  • the gas is sealed so as not to be ejected.
  • the sealing member and the sealing method are not particularly limited as long as the solution containing the cells and the substance is prevented from being ejected.
  • a syringe 1 (needleless syringe) will be described below as an example of an injector with reference to the drawings. It should be noted that each configuration and the combination thereof in each embodiment are examples, and addition, omission, replacement, and other changes of the configuration can be appropriately made without departing from the spirit of the present invention. The present invention is not limited by the embodiments, but only by the scope of the claims. This also applies to the examples described later. It should be noted that the terms “distal end side” and “proximal end side” are used as terms representing the relative positional relationship in the longitudinal direction of the syringe 1.
  • the “distal end side” represents a position closer to the distal end of the syringe 1 described later, that is, a position closer to the ejection port 31a, and the “proximal end side” is a direction opposite to the “distal end side” in the longitudinal direction of the syringe 1, That is, the direction on the drive unit 7 side is shown.
  • the present example is an example of using the combustion energy of the explosive ignited by the ignition device to pressurize the containing portion that contains the solution containing the cells and the substance, but the present embodiment is not limited to this. is not.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a syringe 1, and is also a cross-sectional view of the syringe 1 taken along its longitudinal direction.
  • the syringe 1 includes a syringe assembly 10 in which a subassembly including a syringe portion 3 and a plunger 4 and a subassembly including a syringe body 6, a piston 5 and a driving portion 7 are integrally assembled. , And is attached to the housing (syringe housing) 2.
  • the syringe assembly 10 is configured to be detachable from the housing 2.
  • the container 32 formed between the syringe part 3 and the plunger 4 included in the syringe assembly 10 is filled with a solution containing cells and substances, and the syringe assembly 10 is provided with It is a unit that is thrown away each time it is introduced.
  • the housing 2 side includes a battery 9 that supplies electric power to an igniter 71 included in the drive unit 7 of the syringe assembly 10. Power is supplied from the battery 9 to the electrode on the housing 2 side and the electrode on the drive unit 7 side of the syringe assembly 10 via wiring when the user presses the button 8 provided on the housing 2. Will be held between.
  • the shape and position of the electrodes on the housing 2 side and the electrodes on the drive section 7 side of the syringe assembly 10 are designed so that they automatically contact each other when the syringe assembly 10 is mounted on the housing 2.
  • the housing 2 is a unit that can be repeatedly used as long as the battery 9 has power that can be supplied to the drive unit 7. In the housing 2, when the battery 9 runs out of power, only the battery 9 may be replaced and the housing 2 may be continuously used.
  • the ejection port 31a at the tip of the nozzle 31 is sealed by the sealing portion 43 so that the solution containing the cells and the substance is not ejected.
  • the sealing portion 43 is fixed to the cap 41.
  • the cap 41 is fixed to the syringe unit 3 via the fixing unit 42.
  • Another embodiment of the present disclosure is a method for producing a cell into which a substance has been introduced in vitro, which comprises a step of applying pressure to the solution in a containing portion containing a solution containing the cell and the substance.
  • the pressurization is a method in which the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure is 2.0 milliseconds or less.
  • the injector described in FIG. 1 was used as a device for introducing a substance into cells, and the substance was introduced into the container of the injector.
  • the time from the start of pressurization until the pressure reached the maximum pressure and the maximum pressure were measured as follows.
  • the container was filled with 100 ⁇ l of distilled water (the ratio of the volume of the gas to the volume of the container was 0) and attached to the injector.
  • the nozzle tip of the container and the piezoelectric element (M60-1L-M3 manufactured by Muller) were connected via a jig made of Teflon (registered trademark) resin.
  • the piezoelectric element signals were acquired by a digital oscilloscope (Tektronics, TBS2102).
  • the timing of data acquisition by the digital oscilloscope was controlled by the trigger signal from the device power supply.
  • the time from the start of pressurization until the pressure reached the maximum pressure was calculated from the initial operation time of the device and the time at which the maximum peak was shown. Since the maximum pressure is digitally output as a numerical value, the maximum value among them is adopted.
  • the pressure obtained by the measuring method is equivalent to the pressure inside the containing portion, and the pressure obtained by the measuring method can be regarded as the pressure inside the containing portion.
  • Table 1 shows the average value of the time from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure, and the minimum value (*1) and the maximum value (*2) of the maximum pressure. ..
  • HEK293 cell Human embryonic kidney cell 293 (HEK293 cell) was subcultured by the day before the test, specifically, 37°C, carbon dioxide 5 Subculture was carried out in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (Nacalai Tesque) containing 10% fetal bovine serum and penicillin-streptomycin. The cells were collected using TrypLE Express (GIBCO) and adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells/100 ⁇ l with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • a Cy3-labeled plasmid DNA solution (Mirus) (1.25 ⁇ g) was added to 100 ⁇ l of the cell suspension and mixed well to prepare a solution containing HEK293 cells and Cy3-labeled plasmid DNA. 100 ⁇ l of the solution was sucked into the container of the injector and sucked from the nozzle of the injector (the ratio of the volume of gas to the volume of the container is 0).
  • the injector was used as a device for introducing Cy3-labeled plasmid DNA into cells, and is the injector described in FIG.
  • the injector is set to a condition of ZPP of 110 mg, and on the nozzle side of the accommodating portion, the ignition operation is performed in a state where the inside of the accommodating portion is sealed by the cap being firmly attached. I went.
  • a solution containing Cy3-labeled plasmid DNA is introduced into HEK293 cells.
  • the pressure applied to the solution containing HEK293 cells and Cy3-labeled plasmid DNA is 0.135 milliseconds from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure, and the maximum pressure is (* 1) 29.30 MPa, (*2) 32.03 MPa.
  • the container was removed from the injector, and the content was recovered by pushing it out into a 1.5 ml tube through a nozzle.
  • Cells were pelleted by centrifugation at 1200 xg for 3 minutes and slides made using DAPI-containing mounting medium (Invitrogene). By observing with a fluorescence microscope (Keyence), the number of nuclei of DAPI-stained cells and the number of nuclei of cells in which DAPI and Cy3 were merged were visually counted to calculate the transfection rate of Cy3 into the nucleus. ..
  • Examples 2, 3, and 4 The conditions were the same as in Example 1 except that the amount of explosive was changed as shown in Table 2. The results are shown in Table 2 together with the results of Example 1.
  • the Cy3 labeled plasmid DNA can be introduced into the cell nucleus of HEK293 cells (adhesive cells) by using the injector as the device of this embodiment. From this, it is understood by those skilled in the art that, when a DNA containing a gene is used as a substance, the gene can be expressed by culturing cells into which the gene has been introduced.
  • Example 5 Introduction of dextran into cell lines (adhesive cells) HEK293 cells were subcultured in the same manner as in Example 1, and the cells were collected. The cells were adjusted to an appropriate cell concentration (5 to 10 ⁇ 10 5 cells/30 ⁇ l) with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM). To 30 ⁇ l of the cell suspension, 5 ⁇ l, ie 100 ⁇ g, of fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) (4.5 kDa) (SIGMA aldrich) dissolved in 20 ⁇ g/ ⁇ l with PBS was added and mixed well, and HEK293 cells were mixed. And a solution containing FITC-dextran were prepared.
  • FITC-dextran fluorescein isothiocyanate-dextran
  • the injector was used as a device for introducing FITC-dextran into cells, and is the injector described in FIG. 1 as in Example 1.
  • the injector was set to a ZPP condition of 45 mg, and the nozzle side of the container was ignited with the cap tightly attached to keep the inside of the container sealed. I went.
  • a solution containing FITC-dextran was introduced into HEK293 cells.
  • the pressure applied to the solution containing HEK293 cells and FITC-dextran is 0.091 milliseconds from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure, and the maximum pressure is (*1 ) 9.380 MPa, (*2) 14.06 MPa.
  • the container was removed from the injector, and the content was recovered by pushing it out into a 1.5 ml microtube through a nozzle.
  • 500 ⁇ l of PBS was added and mixed well, and the mixture was centrifuged at 1200 ⁇ g for 3 minutes. This was repeated twice more to wash the cells.
  • Triton X-100 Nacalai Tesque
  • w/v 0.2% Triton X-100 solution
  • a vortex Scientific Industries
  • 150 ⁇ l of the supernatant was collected and placed in one well of MICRO WELL PLATE (Azuwan). An additional 150 ⁇ l was taken and placed in another well.
  • the fluorescence intensity was measured as follows. That is, FITC fluorescence was measured with a corona multi-grating microplate reader (HITACHI) using a filter having an absorption wavelength of 480 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm.
  • HITACHI corona multi-grating microplate reader
  • Example 5 The same procedure as in Example 5 was performed except that the ignition operation by the injector was not performed.
  • the fluorescence intensity (a.u.) of Comparative Example 5 was 76, whereas the fluorescence intensity (a.u.) of Example 5 was 321.5. From this fact, it was confirmed that FITC-dextran can be introduced into the cells of the established cell line (adhesive cell) by using the injector as the device of the present embodiment.
  • Examples 6 and 7 The conditions were the same as in Example 5 except that the amount of explosive was changed as shown in Table 3. The results are shown in Table 3 together with the results of Example 5.
  • Example 8 Same as Example 5 except for the following. That is, the cell concentration was adjusted to 10 ⁇ 10 5 cells/100 ⁇ l with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM). To 100 ⁇ l of the cell suspension, 5 ⁇ l of fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) (4.5 kDa) (SIGMA aldrich) dissolved in 20 ⁇ g/ ⁇ l with PBS was added, that is, 100 ⁇ g, and mixed well. A solution containing cells and FITC-dextran was prepared. 100 ⁇ l of the solution was sucked up from the nozzle of the injector into the container of the injector (the volume ratio of gas to the volume of the container is 0).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the amount of explosive was changed to 15 mg.
  • the pressure applied to the solution containing HEK293 cells and FITC-dextran is 0.063 milliseconds from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure, and the maximum pressure is (*1 ) 0.350 MPa, (*2) 0.470 MPa.
  • Example 5-1 Introduction of dextran into cell of cell line disrupted cell line (adhesive cell) HEK293 cells were subcultured in the same manner as in Example 1 to recover the cells. The cells were adjusted to 10 ⁇ 10 5 cells/30 ⁇ l with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FITC-dextran was introduced into the cells by using the Triton X-100 to open a hole in the cell membrane, which is the partition wall inside and outside the cell, before the operation using the injector. Even when introduced, it created a situation in which it did not remain intracellular.
  • Example 5 If the fluorescence intensity of this reference example is significantly smaller than the fluorescence intensity obtained in Example 5, the substance introduction is due to the operation using the injector, and the results of Example 5 and Comparative Example 5 Is shown from another side. 30 ⁇ l of the cell suspension was sucked into the container of the injector from the nozzle of the injector (the ratio of the volume of gas to the volume of the container is 0). The injector is the injector described in FIG. 1, as in Example 1.
  • FITC-dextran fluorescein isothiocyanate-dextran
  • SIGMA aldrich fluorescein isothiocyanate-dextran
  • the pressure applied to the solution containing HEK293 cells and FITC-dextran is 0.129 milliseconds from the start of pressurization until the pressure reaches the maximum pressure, and the maximum pressure is (*1 ) 17.58 MPa, (*2) 19.53 MPa. Then, the container was removed from the injector, and the content was recovered by pushing it out into a 1.5 ml microtube through a nozzle. Then, the cells were washed and the fluorescence intensity was measured in the same manner as in Example 5.
  • Reference Example 5-1 The procedure of Reference Example 5-1 was repeated, except that the ignition operation by the injector was not performed.
  • Example 9 Introduction of dextran into cells of primary cells (floating cells) Spleen tissues were collected from living mice (BALB/c, 8 weeks old, female, CLEA Japan, Inc.) by a conventional method, and washed twice with PBS. did. The cells were further transferred to PBS in 10 cm dish (FALCON), and cells were collected from the tissue using UV-sterilized tweezers. The total amount of the cell suspension was transferred to a 15 ml conical tube (FALCON) and allowed to stand for 2 minutes, and the supernatant was transferred to another 15 ml conical tube (FALCON).
  • FALCON 15 ml conical tube
  • FALCON 15 ml conical tube
  • the pellet was resuspended in 10 ml of PBS and the same centrifugation was performed.
  • the pellet was resuspended in 1 ml of PBS, the number of cells was counted, and the cells were adjusted to an appropriate cell concentration (10 ⁇ 10 5 cells/100 ⁇ l) with PBS.
  • the same procedure as in Example 5 was carried out except that the condition of ZPP was 75 mg. Therefore, under these conditions, the pressure applied to the solution containing mouse spleen cells and FITC-dextran was 0.129 milliseconds from the start of pressurization until the pressure reached the maximum pressure, and the maximum pressure was (*1) 17.58 MPa, (*2) 19.53 MPa.
  • Example 9 The procedure of Example 9 was repeated, except that the ignition operation by the injector was not performed.
  • Example 10 Introduction of plasmid DNA into cell of established cell line (adhesive cell) HEK293 cells were collected in the same manner as in Example 1 and 100 ⁇ l, 70 ⁇ l, 50 ⁇ l containing 5.5 ⁇ 10 5 cells , 30 ⁇ l or 10 ⁇ l of cell suspension was prepared. DMEM containing 2.5 ⁇ g of Cy3-labeled plasmid DNA was used for cell suspension. The solution was sucked up from the nozzle of the injector into the container of the injector. When the ratio of the volume of gas to the volume of the containing portion was 0%, the whole amount of the cell suspension was sucked up.
  • the injector was used as a device for introducing Cy3-labeled plasmid DNA into cells, and is the injector described in FIG.
  • the injector is set to have a ZPP of 75 mg, and the ignition operation is performed on the nozzle side of the accommodating portion in a state where the cap is firmly attached and the interior of the accommodating portion is sealed. I went.
  • a solution containing Cy3-labeled plasmid DNA is introduced into HEK293 cells. Then, the container was removed from the injector, and the content was recovered by pushing it out into a 1.5 ml microtube through a nozzle. Then, 500 ⁇ l of PBS (phosphate buffered saline, Nacalai Tesque) was added and mixed well, followed by centrifugation at 1200 ⁇ g for 3 minutes. This was repeated twice more to wash the cells. The pellet was resuspended with 200 ⁇ l of PBS and mixed well by pipetting.
  • PBS phosphate buffered saline, Nacalai Tesque
  • single cells are screened with a round tube with a cell strainer cap (FALCON), and the cells are separated using a filter that detects Cy3 fluorescence with a flow cytometer BD FACS CantII (BD), and the Cy3 labeled plasmid is used.
  • the intracellular transfection rate of DNA was calculated.
  • Example 10 The procedure of Example 10 was repeated, except that the ignition operation by the injector was not performed.
  • Example 11 Introduction of dextran into cell lines (adhesive cells) DMEM containing 100 ⁇ g of fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) (4.5 kDa) was used for cell suspension. Except for the above, the same procedure as in Example 10 was performed. In the flow cytometer, cells were separated using a filter that senses FITC fluorescence, and the intracellular transfection rate of FITC-dextran (4.5 kDa) was calculated.
  • FITC-dextran fluorescein isothiocyanate-dextran
  • Example 11 The procedure of Example 11 was repeated, except that the ignition operation by the injector was not performed.
  • Example 12 The conditions were the same as in Example 11 except that the amount of explosive was changed to 45 mg.
  • Example 12 The procedure of Example 12 was repeated, except that the ignition operation by the injector was not performed. This is a test example substantially the same as Comparative Example 11.

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Abstract

本開示の課題は、少なくとも、インビトロでの細胞への物質の導入を、高効率で、短時間に簡便に行うことができる装置の提供にあり、該課題を、インビトロで細胞に物質を導入する装置であって、細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部と、該溶液に対する加圧のための駆動部を備え、該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、装置で解決する。

Description

細胞に物質を導入する装置
　本開示は、インビトロで細胞に物質を導入する装置に関する。
　細胞へ物質を導入する代表的な手法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃（ジーンガン）などの古典的な手法のほか、マイクロインジェクションやプラズマインジェクション、レーザーインジェクション等の手法がある。
　最近開発された手法として、例えば、圧力変化を利用する手法が知られている（特許文献１）。具体的には、動物細胞を加圧する工程と、続いて減圧する工程を繰り返して、動物細胞内に物質を導入する手法である。
　また、細胞内導入物質が細胞の近傍に存在する状態で、細胞内導入物質を含まない所定の球相当直径の液滴を、エレクトロスプレーを用いずに細胞に衝突させて動物細胞内に物質を導入する手法がある（特許文献２）。
　いずれの手法も有用であるが、細胞への物質の導入技術として、高効率で、短時間に簡便に行うことができる技術が絶えず求められている。
特開２０１１－６７１７６号公報 特開２０１０－２５２６４４号公報
　本開示の課題は、少なくとも、インビトロでの細胞への物質の導入を、高効率で、短時間に簡便に行うことができる装置の提供にある。
〔１〕インビトロで細胞に物質を導入する装置であって、
　細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部と、該溶液に対する加圧のための駆動部を備え、
　該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、装置。
〔２〕前記加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０５ミリ秒以上である、〔１〕に記載の装置。
〔３〕前記最大圧力が０．１０ＭＰａ以上である、〔１〕又は〔２〕に記載の装置。
〔４〕前記最大圧力が０．３５ＭＰａ以上である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の装置。
〔５〕前記最大圧力が３５ＭＰａ以下である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の装置。
〔６〕前記最大圧力が３３ＭＰａ以下である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の装置。
〔７〕前記収容部が気体を含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の装置。
〔８〕前記物質が遺伝子を含むＤＮＡである、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の装置。
〔９〕物質が導入された細胞をインビトロで作製する方法であって、
　細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部において、該溶液に対して加圧をする工程を含み、
　該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、方法。
〔１０〕前記加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０５ミリ秒以上である、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記最大圧力が０．１０ＭＰａ以上である、〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記最大圧力が０．３５ＭＰａ以上である、〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記最大圧力が３５ＭＰａ以下である、〔９〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記最大圧力が３３ＭＰａ以下である、〔９〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記収容部が気体を含む、〔９〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記物質が遺伝子を含むＤＮＡである、〔９〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
　本開示は、少なくとも、細胞への物質の導入を、高効率で、短時間に簡便に行うことができるという効果を奏しうる。
一実施態様に係る注入器の概略構成を示す図である。
　ある実施態様は、インビトロで細胞に物質を導入する装置であって、細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部と、該溶液に対する加圧のための駆動部を備え、該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、装置である。以下、同装置を「本実施態様の装置」と記載することがある。
　細胞において物質が導入される領域は、その細胞質でも細胞核でもよいが、好ましい一態様は細胞核である。ここで、物質が導入される領域が細胞核である態様とは、本実施態様の装置によって物質が細胞質に導入された後の培養（例えば、１日間や２日間の培養など）によって細胞質から細胞核へ該物質が移行する態様ではなく、本実施態様の装置の稼働により物質が細胞核に直接導入される態様をいう。
　本実施態様において物質が導入される細胞は特に制限されず、原核細胞でも真核細胞でもよいが、好ましい一態様は真核細胞である。また、動物細胞でも植物細胞でもよいが、好ましい一態様は動物細胞である。また、接着系細胞でもよく、浮遊系細胞でもよい。さらに、株化細胞でもよく、初代培養細胞でもよい。
　動物細胞が由来する動物は特に制限されず、例えば研究機関等で扱われている細胞が由来する動物が挙げられる。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター（例えば、チャイニーズハムスターなど）、ショウジョウバエ、サル（例えば、アフリカミドリザルなど）などが挙げられる。
　植物細胞が由来する植物は特に制限されず、例えば種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類等が挙げられる。種子植物は被子植物でも裸子植物でもよく、被子植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。
　本実施態様における物質とは特に制限されず、例えば生体分子が挙げられる。生体分子としては、細胞に導入された際に該細胞において機能するものであれば特に制限されない。また、該生体分子は天然物であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、核酸又はその誘導体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はそれらの誘導体；アミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はそれらの誘導体；脂質又はその誘導体；糖類又はその誘導体；金属イオン；低分子化合物又はその誘導体；抗生物質；ビタミン又はその誘導体等が挙げられる。核酸であれば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡは、遺伝子を含むＤＮＡであってもよい。遺伝子を含むＤＮＡである場合、その導入先は細胞の細胞質及び／又は細胞核であるから、該遺伝子が導入された細胞を培養等することで該遺伝子を発現させられると期待される。
　物質は、その物質が安定して存在し、また、導入される細胞自体又は細胞の機能を破壊するなどの悪影響がなければ、遊離の形態でもナノ粒子等の担体に固定されている形態でもよく、修飾されていてもよく、溶媒を含め、その態様は特に限定されない。
　物質が遺伝子を含むＤＮＡである場合には、発現カセットや発現ベクターに該遺伝子が含まれた形態で設計されたＤＮＡであってもよい。さらに、例えば、ＤＮＡが導入される細胞の種類に適したプロモーターの制御下に遺伝子が配置されていてもよい。
　すなわち、例えば、物質が生体分子である場合には、いずれの態様においても公知の遺伝子工学的手法等を用いて準備すればよい。
　細胞へ導入された物質の割合を解析する方法の例としては、蛍光を発する分子そのものを本実施態様の物質として用いることや、蛍光分子で標識した物質を用いて、蛍光強度を指標にして解析する公知の方法が挙げられる。
　細胞と物質とを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である。
　ここで、前記圧力とは収容部内の圧力のことである。その測定方法は特に制限されないが、例えば、後述の実施例に記載した注入器を用いて測定する場合には、後述の「収容部内圧の測定方法」欄に記載した方法で測定することができる。
　加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間は、好ましい一態様では２．０ミリ秒以下であり、別の好ましい一態様では１．０ミリ秒以下であり、さらに別の好ましい一態様では０．５ミリ秒以下である。前記時間が上記範囲内であると、物質を効率的に細胞へ導入できると期待される。また、その下限は特に制限されないが、通常０より大きく、例えば０．０５ミリ秒以上である。
　また、前記最大圧力は、好ましい一態様では０．１０ＭＰａ以上であり、別の好ましい一態様では０．２０ＭＰａ以上であり、さらに別の好ましい一態様では０．３５ＭＰａ以上である。０．１０ＭＰａ以上であると、細胞への物質の導入に際して細胞が変形し、効率的に物質が導入されると期待される。　
　また、好ましい一態様では３５ＭＰａ以下であり、別の好ましい一態様では３４ＭＰａ以下であり、さらに別の好ましい一態様では３３ＭＰａ以下である。３５ＭＰａを超えると、細胞を死滅させる可能性があり、３５ＭＰａ以下であると、細胞を死滅させずに細胞へ物質を導入できると期待される。
　本実施態様の好ましい一態様では、本実施態様の装置は、細胞への物質導入の効率が大きくなることからその収容部が気体を含む。前記気体としては、空気が例示できる。また、窒素、酸素、オゾン、二酸化炭素、水素、一酸化炭素が例示でき、これらのうちのいずれか二種以上の混合気体が例示できる。
　また、好ましい一態様では、前記気体は、微生物等を含まない気体である。
　前記空気は、一般的に用いられる空気であってよく、その組成は特段限定されない。例えば、約８割の窒素と約２割の酸素の混合気体が挙げられる。
　本実施態様において、前記収容部の容積に対する前記気体の体積の割合は、細胞への物質導入が妨げられない限り特に限定されず、好ましい一態様では１０％以上であり、別の好ましい一態様では２０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では３０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では４０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では５０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では６０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では７０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では８０％以上であり、さらに別の好ましい一態様では９０％以上である。一方で、上限は、例えば９５％以下である。
　細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部の構造や材料は、加圧に耐えられるものであれば特に制限されない。好ましい一態様において、収容部がさらに気体を含む場合も同様である。
　駆動部の構造や材料は特に制限されない。加圧は、例えば、圧縮ガスの圧力が解放される際に生じる圧力によってもよいし、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力によってもよい。また、圧電素子等の電気的エネルギーやばね等の機械的エネルギーを加圧エネルギーとして利用した圧力によってもよく、これらの形態のエネルギーを適宜組み合わせることで生成した加圧エネルギーを利用した圧力によってもよい。
　加圧として、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力を用いる態様を採用する場合、火薬としては、例えば、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスを含む火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンを含む火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅を含む火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄を含む火薬（ＡＦＯ）のうち何れか一つの火薬、又はこれらのうち複数の組み合わせからなる火薬であってもよい。これらの火薬の特徴としては、その燃焼生成物が高温状態では気体であっても常温では気体成分を含まないため、点火後燃焼生成物が直ちに凝縮を行う。
　本実施態様の装置の例としては注入器が挙げられる。以下、その詳細を説明する。
　本実施態様の装置の例としての注入器では、収容部には当初から、細胞と物質とを含む溶液が収容されているのではなく、射出口を有するノズルを介して該溶液を収容部内に吸引することにより収容する。このように、収容部への充填操作を必要とする構成を採用することで、所望の細胞と所望の物質とを含む溶液を収容することが可能となる。そのため、該注入器では、シリンジ部は着脱可能に構成されている。尚、気体を収容部内に収容する場合には、該溶液を収容した後に気体を吸引することにより収容してもよいし、先に気体を吸引することにより収容した後に該溶液を収容してもよい。また、ノズル先端の射出口は、細胞と物質とを含む溶液が射出されないように封止される。封止部材や封止方法は、細胞と物質とを含む溶液が射出されないようにされれば、特に制限されない。収容部が気体を含む態様においては、細胞と物質とを含む溶液に加えて気体も射出されないように封止される。封止部材や封止方法は、細胞と物質とを含む溶液が射出されないようにされれば、特に制限されない。
　以下に、図面を参照して注入器の例として、注射器１（無針注射器）について説明する。なお、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本発明は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。このことは、後述する実施例についても同様である。なお、注射器１の長手方向における相対的な位置関係を表す用語として、「先端側」及び「基端側」を用いる。当該「先端側」は、後述する注射器１の先端寄り、すなわち射出口３１ａ寄りの位置を表し、当該「基端側」は、注射器１の長手方向において「先端側」とは反対側の方向、すなわち駆動部７側の方向を表している。また、本例示は、点火装置によって点火される火薬の燃焼エネルギーを用いて、細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部を加圧する例示であるが、本実施態様はこれに限定されるものではない。
（注射器１の構成）
　図１は、注射器１の概略構成を示す図であり、注射器１のその長手方向に沿った断面図でもある。注射器１は、シリンジ部３とプランジャ４とで構成されるサブ組立体と、注射器本体６とピストン５と駆動部７とで構成されるサブ組立体とが一体に組み立てられた注射器組立体１０が、ハウジング（注射器ハウジング）２に取り付けられることで構成される。
　上記の通り、注射器組立体１０は、ハウジング２に対して脱着自在となるように構成されている。注射器組立体１０に含まれるシリンジ部３とプランジャ４との間に形成される収容部３２には細胞と物質とを含む溶液が充填され、そして、当該注射器組立体１０は、細胞への物質の導入を行う度に使い捨てられるユニットである。一方で、ハウジング２側には、注射器組立体１０の駆動部７に含まれる点火器７１に電力供給するバッテリ９が含まれている。バッテリ９からの電力供給は、ユーザがハウジング２に設けられたボタン８を押下する操作を行うことで、配線を介してハウジング２側の電極と、注射器組立体１０の駆動部７側の電極との間で行われることになる。なお、ハウジング２側の電極と注射器組立体１０の駆動部７側の電極とは、注射器組立体１０がハウジング２に取り付けられると、自動的に接触するように両電極の形状および位置が設計されている。またハウジング２は、バッテリ９に駆動部７に供給し得る電力が残っている限りにおいて、繰り返し使用することができるユニットである。なお、ハウジング２においては、バッテリ９の電力が無くなった場合には、バッテリ９のみを交換しハウジング２は引き続き使用してもよい。また、ノズル３１の先端の射出口３１ａは、細胞と物質とを含む溶液が射出されないように封止部４３により封止される。封止部４３は、キャップ４１に固定されたものである。また、キャップ４１は、固定部４２を介してシリンジ部３に固定されたものである。
　本開示の他の実施態様は、物質が導入された細胞をインビトロで作製する方法であって、細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部において、該溶液に対して加圧をする工程を含み、該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、方法である。
　その詳細は、既に説明したインビトロで細胞に物質を導入する装置の説明を援用する。
　以下に実施例を記載するが、いずれの実施例も、限定的な意味として解釈される実施例ではない。
　以下の実施例では、まず、収容部の容積に対する気体の体積の割合が０である場合の実施例を記載し、その後に、収容部が気体を含む場合の実施例を記載する。
［収容部内圧の計測方法］
　以下の実施例では、細胞に物質を導入する装置として、図１に記載された注入器を用い、該注入器の収容部内で物質への導入を行った。加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間と、該最大圧力の測定は次のようにして行った。
　収容部に蒸留水１００μｌを充填し（収容部の容積に対する気体の体積の割合は０である。）、注入器に装着した。テフロン（登録商標）樹脂で作製した冶具を介して収容部のノズル先端と圧電素子（Muller社製、M60-1L-M3）を連結した。圧電素子信号はデジタルオシロスコープ（Tektronics製、TBS2102）によって取得した。デジタルオシロスコープによるデータ取得のタイミングはデバイス用電源からのトリガー信号によって制御した。デバイスの初動時間と最大ピークを示した時間より、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間を算出した。また、最大圧力は、数値でデジタル出力されるため、その中で最大の値を採用した。尚、該測定方法により得られる圧力は収容部内の圧力と同等であり、該測定方法により得られる圧力をもって収容部内の圧力とすることができる。
　結果を表１に示す。尚、いずれの測定も独立して２～３回行ったものである。表１は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間についてはその平均値を、最大圧力については、その最小値（※１）と最大値（※２）を示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例１］株化細胞（接着系細胞）の細胞核内へのプラスミドＤＮＡ導入
　ヒト胎児腎細胞２９３（HEK293細胞）は試験前日までに継代培養し、詳細には、３７℃、二酸化炭素５％でウシ胎児血清１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン入りダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（ナカライテスク）で継代培養した。TrypLE Express (GIBCO)を用いて細胞を回収し、５×１０５細胞／１００μｌとなるようにダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で調整した。
　細胞懸濁液１００μｌに、Cy3標識プラスミドＤＮＡ溶液（Mirus）を１．２５μｇ加えてよく混和し、HEK293細胞とCy3標識プラスミドＤＮＡとを含む溶液を準備した。注入器の収容部に該溶液を１００μｌ、該注入器のノズルより吸い上げた（収容部の容積に対する気体の体積の割合は０である。）。ここで、該注入器は、Cy3標識プラスミドＤＮＡを細胞に導入する装置として用いたものであり、図１に記載された注入器である。本実施例では、該注入器はＺＰＰが１１０ｍｇの条件にセットされたものであり、収容部のノズル側では、キャップがしっかりと装着されることで収容部内が密封状態にされた状態で点火操作を行った。これにより、HEK293細胞にCy3標識プラスミドＤＮＡを含む溶液が導入される。この条件では、HEK293細胞とCy3標識プラスミドＤＮＡとを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．１３５ミリ秒であり、該最大圧力が、（※１）２９．３０ＭＰａ、（※２）３２．０３ＭＰａである。
　その後、注入器から収容部をはずし、その内容物を１．５ｍｌチューブにノズルより押し出すことで回収した。1200×ｇで３分間遠心分離して細胞をペレットにし、DAPI含有封入剤（Invitrogene）を用いてスライドを作製した。蛍光顕微鏡（キーエンス）にて観察し、DAPI染色された細胞の核の数および、DAPIとCy3がマージしている細胞の核の数を目視にてカウントしてCy3の細胞核内導入率を算出した。
［実施例２、実施例３、実施例４］
　表２に示すように火薬量を変更すること以外は、実施例１と同様の条件で行った。その結果を、実施例１の結果も併せて表２に示す。
　この事実から、注入器を本実施態様の装置として用いて、HEK293細胞（接着系細胞）の細胞核内へのCy3標識プラスミドＤＮＡの導入ができることが確認できた。また、このことから、物質として、遺伝子を含むＤＮＡを用いた場合には、該遺伝子が導入された細胞を培養等することで該遺伝子を発現させられることは当業者であれば理解できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例５］株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのデキストラン導入
　実施例１と同様の方法でHEK293細胞を継代培養し、細胞を回収した。適当な細胞濃度（５～１０×１０５細胞／３０μｌ）となるようにダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で調整した。
　細胞懸濁液３０μｌに、PBSで２０μｇ／μｌに溶解したフルオレセインイソチオシアナート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン）（４．５ｋＤａ）（SIGMA aldrich）を５μｌ、すなわち１００μｇ分を加えてよく混和し、HEK293細胞と、ＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液を準備した。注入器の収容部に該溶液３０μｌを、該注入器のノズルより吸い上げた（収容部の容積に対する気体の体積の割合は０である。）。ここで、該注入器は、ＦＩＴＣ－デキストランを細胞に導入する装置として用いたものであり、実施例１と同様に、図１に記載された注入器である。本実施例では、該注入器はＺＰＰが４５ｍｇの条件にセットされたものであり、収容部のノズル側では、キャップがしっかりと装着されることで収容部内が密封状態にされた状態で点火操作を行った。これにより、HEK293細胞にＦＩＴＣ－デキストランを含む溶液が導入される。この条件では、HEK293細胞とＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０９１ミリ秒であり、該最大圧力が、（※１）９．３８０ＭＰａ、（※２）１４．０６ＭＰａである。
　その後、注入器から収容部をはずし、その内容物を１．５ｍｌマイクロチューブにノズルより押し出すことで回収した。
　その後、PBSを５００μｌ加えてよく混和し、1200×ｇで３分間遠心分離した。これをさらに２回反復して細胞の洗浄を行った。
　PBSで０．２％に調製したTriton X-100（ナカライテスク）（ｗ／ｖ）（０．２％Triton X-100溶液）５００μｌでペレットを懸濁し、ボルテックス（Scientific Industries）で１５秒間よく混和した。その後、室温で１０分間静置し、細胞膜を破壊した。22,400×ｇで１５分間遠心分離し、上清１５０μｌを分取し、MICRO WELL PLATE（アズワン）の１ウェルに入れた。さらに１５０μｌを分取し、別の１ウェルに入れた。
　次のようにして蛍光強度の測定を行った。すなわち、コロナマルチグレーティングマイクロプレートリーダー（HITACHI）で、吸収波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍのフィルターを用いてFITCの蛍光を測定した。
　尚、ブランクには０．２％ Triton X-100溶液を使用した。
［比較例５］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、実施例５と同様にした。
　比較例５の蛍光強度（a.u.）が７６だったのに対し、実施例５の蛍光強度（a.u.）は３２１．５であった。この事実から、注入器を本実施態様の装置として用いて、株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのＦＩＴＣ－デキストランの導入ができることを確認できた。
［実施例６、実施例７］
　表３に示すように火薬量を変更すること以外は、実施例５と同様の条件で行った。その結果を、実施例５の結果も併せて表３に示す。
［実施例８］
　次を除いて実施例５と同様にした。すなわち、細胞濃度を、１０×１０５細胞／１００μｌとなるようにダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で調整した。その細胞懸濁液１００μｌに、PBSで２０μｇ／μｌに溶解したフルオレセインイソチオシアナート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン）（４．５ｋＤａ）（SIGMA aldrich）を５μｌ、すなわち１００μｇ分を加えてよく混和し、HEK293細胞と、ＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液を準備した。注入器の収容部に該溶液１００μｌを、該注入器のノズルより吸い上げた（収容部の容積に対する気体の体積の割合は０である。）。また、火薬量を１５ｍｇに変更した。この条件では、HEK293細胞とＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０６３ミリ秒であり、該最大圧力が、（※１）０．３５０ＭＰａ、（※２）０．４７０ＭＰａである。
［比較例６～８］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、それぞれ、実施例６～８と同様にした。
　その結果を、表３に示す。この事実から、注入器を本実施態様の装置として用いて、株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのＦＩＴＣ－デキストランの導入ができることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［参考例５－１］細胞膜を破壊した株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのデキストラン導入
　実施例１と同様の方法でHEK293細胞を継代培養し、細胞を回収した。１０×１０５細胞／３０μｌとなるようにダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で調整した。
　本参考例では実施例５と異なり、注入器を用いた操作の前に、Triton X-100を用い、細胞内外の隔壁である細胞膜に穴を開けておくことで、ＦＩＴＣ－デキストランが細胞内に導入されても、細胞内に留まれない状況を作り出した。実施例５で得られた蛍光強度に対し、本参考例の蛍光強度が顕著に小さければ、物質導入が注入器を用いた操作によるものであることが、実施例５及び比較例５の結果とは別の側面から示される。
　注入器の収容部に細胞懸濁液３０μｌを、該注入器のノズルより吸い上げた（収容部の容積に対する気体の体積の割合は０である。）。該注入器は、実施例１と同様に、図１に記載された注入器である。さらに2% Triton X-100を３μｌ吸い上げ約５分間静置した後、PBSで２０μｇ／μｌに溶解したフルオレセインイソチオシアナート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン）（４．５ｋＤａ）（SIGMA aldrich）を５μｌ、すなわち１００μｇ分を加えてよく混和した。
　本実施例では、該注入器はＺＰＰが７５ｍｇの条件にセットされたものであり、収容部のノズル側では、キャップがしっかりと装着されることで収容部内が密封状態にされた状態で点火操作を行った。この条件では、HEK293細胞とＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．１２９ミリ秒であり、該最大圧力が、（※１）１７．５８ＭＰａ、（※２）１９．５３ＭＰａである。
　その後、注入器から収容部をはずし、その内容物を１．５ｍｌマイクロチューブにノズルより押し出すことで回収した。
　その後、実施例５と同様にして細胞を洗浄し、蛍光強度の測定を行った。
［参考例５－２］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、参考例５－１と同様にした。
［参考例５－３］
　Triton X-100で細胞膜を破壊する処理をせずに、注入器を用いて点火操作を行った試験例であり、実施例７と実質的に同一の試験例である。
［参考例５－４］
　Triton X-100で細胞膜を破壊する処理をせずに、注入器を用いて点火操作も行わなかった試験例であり、比較例７と実質的に同一の試験例である。
　結果を表４に示す。この事実から、注入器を本実施態様の装置として用いて、株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのＦＩＴＣ－デキストランの導入ができることが確認できた。
　また、参考例５－２と参考例５－４では、Triton X-100処理の有無にかかわらず、蛍光強度に顕著な差がないことが確認された。一方、参考例５－１の結果から、点火操作を行う場合であっても、Triton X-100を用いて細胞内外の隔壁である細胞膜に穴を開けておくことで、蛍光強度は、参考例５－２や参考例５－４のように、参考例５－３と比べて顕著に小さくなることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例９］初代細胞（浮遊系細胞）の細胞内へのデキストラン導入
　生体マウス（BALB/c、8週齢、メス、日本クレア）より常法により脾臓組織を採取し、PBSで２回洗浄した。さらに１０ｃｍ　ｄｉｓｈ（FALCON）中でPBSに移し、ＵＶ滅菌済みピンセットを用いて組織から細胞を回収した。細胞懸濁液の全量を１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）に移して２分間静置し、上清を別の１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）に移した。１０００×ｇで５分間遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのPBSで再懸濁して同様の遠心分離を行った。ペレットを１ｍｌのPBSで再懸濁し、細胞数を計測して適当な細胞濃度（１０×１０５細胞／１００μｌ）となるようにPBSで調整した。
　その後は、ＺＰＰが７５ｍｇという条件にしたこと以外は実施例５と同様の方法で行った。従って、この条件では、マウス脾臓細胞とＦＩＴＣ－デキストランとを含む溶液に対する加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．１２９ミリ秒であり、該最大圧力が、（※１）１７．５８ＭＰａ、（※２）１９．５３ＭＰａである。
［比較例９］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、実施例９と同様にした。
　その結果、比較例９の蛍光強度（a.u.）が６７．５だったのに対し、実施例９の蛍光強度（a.u.）が３１７．５であった。
　この事実から、注入器を本実施態様の装置として用いて、初代細胞（浮遊系細胞）の細胞内へのＦＩＴＣ－デキストランの導入ができることが確認できた。
　これ以降は、収容部が気体を含む場合の実施例を記載する。
［実施例１０］株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのプラスミドＤＮＡ導入
　実施例１と同様にしてHEK293細胞を回収し、５．５×１０５個の細胞を含む１００μｌ、７０μｌ、５０μｌ、３０μｌ又は１０μｌの細胞懸濁液を調製した。細胞の懸濁にはCy3標識プラスミドＤＮＡを２．５μｇ含むDMEMを使用した。注入器の収容部に該溶液を、該注入器のノズルより吸い上げた。収容部の容積に対する気体の体積の割合が０％である場合は、前記細胞懸濁液を全量吸い上げた。一方で、収容部の容積に対する気体の体積の割合が０％である場合以外は、前記細胞懸濁液をその容量分だけ吸い上げた後、通常の実験室内の空気を充填するように１００μｌの目盛りまでプランジャを引き上げた。すなわち、収容部の容積に対する気体の体積の割合は、それぞれ、０％、３０％、５０％、７０％、９０％である。ここで、該注入器は、Cy3標識プラスミドＤＮＡを細胞に導入する装置として用いたものであり、図１に記載された注入器である。本実施例では、該注入器はＺＰＰが７５ｍｇの条件にセットされたものであり、収容部のノズル側では、キャップがしっかりと装着されることで収容部内が密封状態にされた状態で点火操作を行った。これにより、HEK293細胞にCy3標識プラスミドＤＮＡを含む溶液が導入される。
　その後、注入器から収容部をはずし、その内容物を１．５ｍｌマイクロチューブにノズルより押し出すことで回収した。
　その後、PBS（リン酸緩衝生理食塩水、ナカライテスク）を５００μｌ加えてよく混和し、1200×ｇで３分間遠心分離した。これをさらに２回反復して細胞の洗浄を行った。
　２００μｌのPBSでペレットを再懸濁し、ピペッティングにてよく混和した。その後、セルストレイナー・キャップ付ラウンドチューブ（FALCON）にて単一細胞をふるい分け、フローサイトメーターBD FACS CantII（BD社）にてCy3の蛍光を感知するフィルターを用いて細胞を分離し、Cy3標識プラスミドＤＮＡの細胞内導入率を算出した。
［比較例１０］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、実施例１０と同様にした。
　結果を表５に示す。この事実から、収容部が空気を含むことによって、しかも収容部の容積に対する空気の体積の割合が大きくなるにつれて、HEK293細胞（接着系株化細胞）の細胞内へのCy3標識プラスミドＤＮＡの導入をより効率よくできることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
［実施例１１］株化細胞（接着系細胞）の細胞内へのデキストランの導入
　細胞の懸濁に、１００μｇのフルオレセインイソチオシアナート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン）（４．５ｋＤａ）を含むDMEMを使用したこと以外は、実施例１０と同様にした。またフローサイトメーターではFITCの蛍光を感知するフィルターを用いて細胞を分離し、ＦＩＴＣ－デキストラン（４．５ｋＤａ）の細胞内導入率を算出した。
［比較例１１］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、実施例１１と同様にした。
［実施例１２］
　火薬量を４５ｍｇに変更したこと以外は、実施例１１と同様の条件で行った。
［比較例１２］
　注入器による点火操作を施さなかったこと以外は、実施例１２と同様にした。比較例１１と実質的に同一の試験例である。
　結果を表６に示す。この事実から、収容部が空気を含むことによって、しかも収容部の容積に対する空気の体積の割合が大きくなるにつれて、HEK293細胞（接着系株化細胞）の細胞内へのＦＩＴＣ－デキストランの導入をより効率よくできることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　１・・・・注射器
　２・・・・ハウジング
　３・・・・シリンジ部
　４・・・・プランジャ
　５・・・・ピストン
　６・・・・注射器本体
　７・・・・駆動部
　８・・・・ボタン
　９・・・・バッテリ
　１０・・・・注射器組立体
　３１・・・・ノズル部
　３１ａ・・・射出口
　３２・・・・収容部
　４１・・・・キャップ
　４２・・・・固定部
　４３・・・・封止部
　７１・・・・点火器

Claims (16)

  1. 　インビトロで細胞に物質を導入する装置であって、
    　細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部と、該溶液に対する加圧のための駆動部を備え、
    　該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、装置。
  2. 　前記加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０５ミリ秒以上である、請求項１に記載の装置。
  3. 　前記最大圧力が０．１０ＭＰａ以上である、請求項１又は２に記載の装置。
  4. 　前記最大圧力が０．３５ＭＰａ以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の装置。
  5. 　前記最大圧力が３５ＭＰａ以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載の装置。
  6. 　前記最大圧力が３３ＭＰａ以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の装置。
  7. 　前記収容部が気体を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の装置。
  8. 　前記物質が遺伝子を含むＤＮＡである、請求項１～７のいずれか１項に記載の装置。
  9. 　物質が導入された細胞をインビトロで作製する方法であって、
    　細胞と物質とを含む溶液を収容する収容部において、該溶液に対して加圧をする工程を含み、
    　該加圧は、加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が２．０ミリ秒以下である、方法。
  10. 　前記加圧開始から圧力が最大圧力に到達するまでの時間が０．０５ミリ秒以上である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記最大圧力が０．１０ＭＰａ以上である、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記最大圧力が０．３５ＭＰａ以上である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記最大圧力が３５ＭＰａ以下である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記最大圧力が３３ＭＰａ以下である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記収容部が気体を含む、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記物質が遺伝子を含むＤＮＡである、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。
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