WO2015034042A1 - 植物を用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
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- C12N2770/16051—Methods of production or purification of viral material
Definitions
- the present invention relates to a method for efficiently producing useful proteins using plants.
- Patent Document 1 describes a method for producing influenza virus-like particles (VLP) such as H1 protein by cultivating Nicotiana benthamiana infected with transformed Agrobacterium in a greenhouse.
- Patent Document 2 discloses a method for producing a peptide or protein by infecting a plant with transformed Agrobacterium under a specific pressure condition.
- Example 3 a plant used for infection is added to natural light. It is described that it was cultivated using supplementary artificial light.
- Non-Patent Document 1 describes a method for expressing hemagglutinin, which is an antigenic protein of influenza vaccine, by infecting a benthamiana tobacco cultivated with light of a white fluorescent lamp with transformed Agrobacterium.
- Patent Document 3 describes a method for cultivating a leaf vegetable plant using only red light having a peak wavelength of 600 to 700 nm.
- Patent Document 1 describes that a protein is expressed using a plant cultivated under a condition in which artificial light is added to natural light, but there is no description about the wavelength of the artificial light, and the plant cultivation process. The wavelength of the light source in is not studied.
- Non-Patent Document 1 in order to improve the expression level of protein, the plant expression conditions after the Agrobacterium infection are examined, but in the cultivation process, plants grown with white fluorescent lamps are used, which is preferable. There are no studies on the light source. Moreover, patent document 3 aims at cultivation of a plant, and there is no description about protein production using a plant.
- the present invention aims to improve conditions for cultivating plants when producing useful proteins using plants, and to improve the production efficiency of useful proteins.
- red light in the wavelength region of 600 nm to 700 nm
- the present inventors have found that the protein expression efficiency and the expression level can be improved, and completed the present invention.
- the gist of the present invention is as follows.
- a method for producing useful proteins using plants A process of cultivating the plant (cultivation process), A step of infecting the plant after the cultivation step with Agrobacterium having a polynucleotide encoding a useful protein (infection step); and Including a step of expressing a useful protein in the plant after the infection step (expression step), Cultivating the plant under irradiation conditions including light energy in a wavelength region of 600 nm to 700 nm at a ratio of 50% or more with respect to light energy in a wavelength region of 400 nm to 800 nm in at least a part of the cultivation process.
- a method for producing a useful protein A method for producing a useful protein.
- the plant is cultivated under irradiation conditions including at least 75% of light energy in the wavelength region of 600 nm to 700 nm with respect to light energy in the wavelength region of 400 nm to 800 nm in at least a part of the cultivation process.
- a method for producing a useful protein according to [1], wherein [3] The method for producing a useful protein according to [1] or [2], further comprising a step of purifying and recovering the useful protein after the expression step.
- [5] The method for producing a useful protein according to any one of [1] to [4], wherein the plant is Bensamiana tobacco.
- a plant cultivated under a condition containing light (red light) in a wavelength region of 600 nm to 700 nm in a certain ratio or more improves protein expression efficiency, so that protein can be produced efficiently. Can do.
- proteins can be accumulated at a high concentration in plants, so the purification load is reduced in the protein purification process, and the production cost is reduced. The effect is great.
- the structure of plasmid pGFP / MM444 is shown.
- the structure of plasmid p19 / MM444 is shown. It is the graph which showed the relationship of the GFP yield with respect to a red ratio as the comparative example 1 (fluorescent lamp) was set to 100%.
- the LC / MS analysis result of the extract (filtrate) of Bensamiana tobacco grown in Example 1 (red light 100%) and Comparative Example 1 (fluorescent lamp) is shown.
- the left shows the benthamiana tobacco cultivated in Comparative Example 1 (fluorescent lamp), the right shows the benthamiana tobacco cultivated in Example 1 (red light 100%), and the top and bottom show that the same analysis was performed twice.
- the structure of plasmid pGBA1 / MM444 is shown.
- the structure of plasmid pNVCP / MM444 is shown.
- the method for producing a useful protein using a plant according to the present invention comprises a step of cultivating a plant (cultivation step), and then a step of infecting the plant with Agrobacterium having a polynucleotide encoding the useful protein (infection). Step) and a step of cultivating the plant after the infection step to express the useful protein (expression step).
- the plant that can be used in the present invention is a plant that is infected with Agrobacterium and is not particularly limited as long as it is a plant that expresses a useful protein.
- Examples include dicotyledonous plants and monocotyledonous plants.
- dicotyledonous plants include solanaceous plants such as tobacco, potato, tomato, etc., cruciferous plants such as arugula, komatsuna, mizuna, mustard, white lizard, etc., asteraceae plants such as chicory, endive, artichoke, etc.
- a leguminous plant alfalfa, mungbean, soybean and the like are exemplified, spinach, sugar beet and the like are used as a red crustaceae plant, perilla, basil and the like are exemplified as a family Lamiaceae, and bees and the like are exemplified as a celery family.
- monocotyledonous plants include gramineous plants such as rice, wheat, barley and corn, and examples of mallowaceae include cotton and the like.
- solanaceous plants are preferable, and tobacco is more preferable.
- Tobacco includes Nicotiana tabacum, N. benthamiana, H. tobacco (N. alata), N. glauca, N. longiflora, Nicotiana persica, Nicotiana rustica (N. rustica), Nicotiana sylvestris (N. sylvestris) and the like.
- Bensamiana cigarette Preferred is Bensamiana cigarette.
- the useful protein is not particularly limited as long as it is a protein used for medical or industrial purposes.
- it is a protein for medical use.
- medical proteins include peptides, vaccines, antibodies, enzymes, hormones (preferably peptide hormones), and more specifically, viral proteins used as vaccines, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin and other hematopoietic factors, interferons, cytokines such as interleukin (IL) -1 and IL-6, monoclonal antibodies or fragments thereof, tissue plasminol Examples include gene activator (TPA), urokinase, serum albumin, blood coagulation factor VIII, leptin, insulin, stem cell growth factor (SCF) and the like.
- TPA gene activator
- urokinase serum albumin
- VLP virus-like particles
- a VLP component protein may be a single protein or may include one or more proteins.
- the virus include influenza virus, norovirus, human immunodeficiency virus (HIV), human hepatitis C virus (HCV), human hepatitis B virus (HBV), etc.
- Influenza hemagglutinin is a constituent protein of VLP of influenza virus.
- Examples of (HA) protein and norovirus VLP-constituting protein include Norwalk virus capsid protein (NVCP).
- Industrial proteins are proteins used in food, feed, cosmetics, fibers, detergents, chemicals, etc., and examples include peptides, enzymes, and functional proteins. Specific examples include protease, lipase, cellulase, amylase, peptidase, luciferase, lactamase, collagen, gelatin, lactoferrin, jellyfish green fluorescent protein (GFP) and the like.
- the plant is irradiated with light energy at a wavelength of 600 to 700 nm at a ratio of 50% or more with respect to light energy at 400 to 800 nm (spectral irradiance: W / m 2 / nm) It has at least a part of the process of cultivating a plant under the irradiation conditions contained in.
- any plant production system may be used as long as the plant can be cultivated under the above conditions, and is not particularly limited.
- a semi-closed or closed plant factory is preferable, and a closed plant factory is more preferable.
- Examples of the semi-closed type include horticultural facilities and solar type plant factories.
- the closed plant factory means a plant factory not exposed to sunlight, and is a system for cultivating plants in a space where temperature, humidity, carbon dioxide concentration, wavelength of artificial light, irradiation time, and the like are controlled.
- a closed plant factory it is possible to control light, so that there is an effect that the quality of the plant and the substance produced by the plant is stabilized, and an effect that infection of pathogenic bacteria contained in the outside air can be prevented.
- cultivation environment conditions such as temperature, humidity, and airflow is possible, and the effects of improving the growth rate of plants in the cultivation process and the expression of useful proteins in the expression process are obtained.
- the closed plant factory includes an environment-controlled room, a plant cultivation container shelf installed in the environment-controlled room for placing a plant cultivation container, and a plant body disposed in the vicinity of the plant cultivation container shelf. Illustrated is a system including illumination that closely irradiates light. Plant cultivation container shelves can be arranged in multiple stages.
- the plant cultivated in the cultivation process preferably has a plant height (cm) of 2 cm or more, more preferably 3 cm or more, and preferably 25 cm or less, more preferably 15 cm or less. .
- a plant height is within the above-mentioned range, it is advantageous for improving STY (space time yield) of the closed plant factory by increasing the number of cultivation shelves.
- STY space time yield
- the plant height is less than or equal to the upper limit, the ratio of leaves in the entire above-ground part of the plant increases, and leaves per plant strain. The amount of harvested can be increased, and a sufficient amount of protein can be secured.
- the "plant height" here means the length from the lower end of the above-ground part to the growth point, and is obtained by measuring the length of the plant height after excising the underground part of the plant immediately after harvesting. it can.
- the plant cultivated in the cultivation process preferably has an above-ground fresh weight (g) of 3 g or more, more preferably 10 g or more, and preferably 100 g or less, and 70 g or less. Is more preferable.
- a plant having an above-ground fresh weight within the above-mentioned range has a high growth rate, and it is preferable to use a plant in such a high growth rate because the production efficiency of useful proteins is improved.
- the plant cultivated in the cultivation process preferably has a leaf weight (g) of 2.5 g or more, more preferably 7.5 g or more, and preferably 80 g or less, and 60 g or less. More preferably.
- a plant having a leaf weight within the above-mentioned range has a high growth rate, and it is preferable to use a plant in such a high growth rate because the production efficiency of useful proteins is improved.
- the cultivation conditions are not particularly limited as long as the conditions are suitable for plant growth and useful protein production.
- the cultivation can be performed under the following conditions.
- the temperature in the plant factory is usually 10 ° C or higher, preferably 15 ° C or higher, and is usually 40 ° C or lower, preferably 37 ° C or lower.
- the humidity in the plant factory is usually 40% or more, preferably 50% or more, and usually 100% or less, preferably 95% or less.
- the carbon dioxide concentration in the plant factory is usually 300 ppm or more, preferably 500 ppm or more, and usually 5000 ppm or less, preferably 3000 ppm or less.
- the light source used in the cultivation process is not particularly limited as long as it can satisfy the above-mentioned light energy conditions, but sunlight, fluorescent lamp, LED, cold cathode fluorescent lamp (CCFL, HEFL), inorganic / organic EL, etc. Can be illustrated.
- a fluorescent lamp, LED, and a cold cathode fluorescent lamp are mentioned, More preferably, LED is mentioned.
- the LED is preferable because it has high light conversion efficiency and power saving as compared with an incandescent bulb and an HID lamp. It is also preferable in that the amount of heat rays that cause leaf burning damage to plants is small.
- wavelength region For each wavelength, 400 to 500 nm was classified as blue light (B), 501 to 600 nm as green light (G), 601 to 700 nm as red light (R), and 701 to 800 nm as far red light (FR).
- B blue light
- G green light
- R red light
- FR far red light
- This wavelength region is used for convenience when classifying the wavelength in the visible region by the color of the light and performing an operation such that the boundary with the adjacent wavelength region does not overlap.
- a region is simply described as 600 nm to 700 nm, it may include wavelengths at both ends thereof.
- the light energy at a wavelength of 600 to 700 nm is usually 50% or more, preferably 75% or more, more preferably with respect to the light energy at a wavelength of 400 to 800 nm (spectral irradiance; W / m 2 / nm).
- Plants are cultivated under irradiation conditions including 90% or more.
- the light energy can be measured using a spectroradiometer (Specbos 1211; manufactured by Fibravo). It is preferable to use a plant cultivated in the above range for the infection process because the protein expression efficiency of the plant is improved and the protein yield is increased.
- the ratio of far-red light having a wavelength of 700 to 800 nm in the irradiated light because the plant height of the resulting plant tends to be lowered.
- the ratio of light energy (spectral irradiance: W / m 2 / nm) in red light (R) having a wavelength of 601 to 700 nm and light energy in far red light (FR) having a wavelength of 701 to 800 nm ( FR / R) is preferably cultivated under a light source of 0.25 or less, more preferably 0.20 or less, still more preferably 0.15 or less, and far red light (FR) having a wavelength of 701 to 800 nm. May not be included.
- the ratio of leaves in the entire above-ground part of the plant increases, and leaves per plant strain
- the amount of harvested can be increased, and a sufficient amount of protein can be secured.
- an increase in the weight ratio of leaves that are easy to handle in the purification step can reduce the purification load, and as a result, it is preferable because proteins can be easily secured.
- it becomes advantageous to STY improvement of a plant factory by multi-stage cultivation shelf it is preferable.
- the conditions of light energy it is not necessary for the conditions of light energy to be the above conditions over the entire period of the cultivation process.
- the cultivation process is divided into the first half and the second half, and the light energy conditions are the above conditions only in the second half.
- a plant may be cultivated under the above conditions only for a certain period of time.
- the period of 1% or more of the whole cultivation period is preferable, and the period of 20% or more is more preferable.
- the light energy condition in the period when the light energy condition is not the above condition among the entire period of the cultivation process and this period may be cultivated under sunlight in an open plant factory. .
- the plant obtained by cultivating under the above conditions has a reduced ability to defend against Agrobacterium infection and an increased infection efficiency as compared with a normal plant.
- Factors that decrease the defense ability of plants include, for example, in the case of tobacco, a decrease in the amount of nicotine contained in the plant body and a decrease in polysaccharides that constitute the cell wall. Nicotine is a kind of alkaloid and plays a role of protecting the plant body from the outside world. The cell wall forms a barrier function from the outside world.
- the expression efficiency of target protein improves by cultivating on the said conditions by suppressing the production of the specific protein contained in a plant.
- protease is mentioned. Suppression of protease production reduces the degradation of the target protein, resulting in improved expression efficiency.
- the plant obtained in the cultivation process of the present invention can efficiently infect Agrobacterium, and the polynucleotide introduced using Agrobacterium in the infection process expresses the protein with high efficiency. It becomes possible. As a result, it is considered that the expression efficiency and expression level of the target useful protein can be improved. This effect can be expected regardless of the type of useful protein.
- a plant in a cultivation process, it is preferable that a plant is cultivated under the cycle whose light irradiation time is 10 hours or more and less than 24 hours per day, or is cultivated under continuous light. Among these, it is more preferable to grow under continuous light. The above range is preferable because the plant growth rate is accelerated and the cultivation period until harvesting is shortened.
- the irradiation time of light is 10 hours or more and less than 24 hours per day” is not necessarily continuous irradiation. For example, when the irradiation time is 20 hours per day, continuous irradiation of 10 hours or more is performed. You may do it twice a day.
- the light irradiated here may be pulsed light.
- Pulsed light is obtained by blinking an LED or the like at short intervals of 1 microsecond to 1 second.
- the irradiation time includes the time when the LED is not turned on, and is the total of the irradiation time of the pulsed light per day.
- the cultivation method of the plant in the cultivation process is not particularly limited as long as it is a method suitable for plant growth and production of useful proteins, but is preferably cultivated using a hydroponic cultivation system.
- a hydroponic culture system it is preferable not to use a natural fixed medium (soil), and specifically, cultivation using an artificial solid medium, hydroponics, and cultivation by a spray method are preferred.
- hydroponics is more preferable because of the multi-stage cultivation shelf, recycling of nutrient solution, and easy management of fertilizer components and pH.
- Hydroponics includes NFT (Nutrient Film Technology) and DFT (Deep). Flow Technique).
- the bare-root method in which the roots are exposed in the nutrient solution is preferable. This is because roots can freely grow in the water and increase the contact area with the nutrient solution, so that a sufficient amount of moisture and nutrients can be absorbed.
- the cultivation days in the cultivation process are usually 5 days or more, preferably 7 days or more, more preferably 10 days or more, and usually 35 days or less, preferably 28 days or less, more preferably 21 days or less. .
- transplantation may be performed as necessary.
- the transplanting period is preferably 6 to 15 days after cultivation.
- the seedling raising process refers to a process until a plant seedling is germinated and grown in an artificial environment for a certain period of time and then transplanted to the cultivation process.
- Conditions such as temperature and humidity in the seedling raising process can be the same as the conditions in the cultivation process.
- light irradiation conditions may be normal conditions using sunlight, fluorescent lamps, LEDs, cold cathode fluorescent lamps (CCFL, HEFL), inorganic / organic EL, etc. It is preferable to grow plants under a cycle in which the irradiation time is 12 hours or more and 24 hours or less per day.
- the “light irradiation time of 12 hours or more and 24 hours or less per day” is not necessarily continuous irradiation. For example, when the irradiation time is 20 hours per day, continuous irradiation of 10 hours or more is performed. You may do it twice a day.
- the plant obtained in the cultivation process is infected with Agrobacterium having a polynucleotide encoding a useful protein.
- the polynucleotide encoding a useful protein is a polynucleotide encoding a target useful protein.
- the target useful protein is a protein exemplified as a useful protein.
- As the polynucleotide a natural sequence that has been appropriately mutated or modified within the range in which the intended useful protein can be obtained may be used.
- the polynucleotide is operably linked downstream of an appropriate promoter, and the resulting polynucleotide construct is introduced into a plant cell by the Agrobacterium method. That's fine.
- the promoter include, but are not limited to, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin promoter, the elongation factor 1 ⁇ promoter, the corn ubiquitin promoter, and the like.
- a binary vector or an intermediate vector containing T-DNA (transfer DNA) derived from Agrobacterium Ti plasmid or Ri plasmid can be used (Nucl. Acids Res. 12 (22): 8711-8721 (1984), Plasmid, 7, 15-29 (1982)).
- Specific examples of binary vectors include pBI vectors (for example, pRiceFOX), pPZP vectors (Plant Molecular Biology 25 (6): 989-94. (1994)), pCAMBIA vectors (vector backbone: pPZP vector), pSMA systems A vector (Plant ⁇ ⁇ Cell Reports 19: 448-453. (2000)) can be mentioned, but is not limited thereto.
- a transient expression method using these vectors can be used (Journal of Virological Methods, 105: 343-348 (2002)).
- infection with Agrobacterium is preferably performed under reduced pressure conditions, and it is more preferable to use the transient expression method based on vacuum described by PlantPlanScience, 122, 1: -101-108 (1997)).
- the Agrobacterium containing the polynucleotide construct becomes tissue, eg leaves, parts of the plant's ground structure (including stems, leaves and flowers), other parts of the plant (stems , Roots, flowers), or into the space between whole plant cells.
- Agrobacterium After passage through the epidermis, Agrobacterium infects and transfers the polynucleotide into the cell.
- the polynucleotide is transcribed as an episome and the mRNA is translated, resulting in production of the protein of interest in the infected cell, but passage of the polynucleotide within the nucleus is transient.
- the plant after the infection step is cultivated to express the useful protein.
- the cultivation conditions in the expression step are not particularly limited as long as the useful protein can be efficiently expressed. Conditions such as temperature and humidity in the expression step can be the same as the conditions in the cultivation step. Moreover, the normal conditions using sunlight, a fluorescent lamp, LED, a cold cathode fluorescent lamp (CCFL, HEFL), inorganic / organic EL, etc. are employable as light irradiation conditions.
- the cultivation days in the expression step are preferably 3 days or more, more preferably 4 days or more, and preferably 14 days or less, more preferably 10 days or less.
- the useful protein accumulated in the plant is preferably recovered from the plant. It is preferable to obtain a fraction containing a useful protein from a plant and purify the useful protein by an appropriate method.
- the polynucleotide encoding the useful protein may contain a tag sequence for purification.
- Example 1 Preparation of transformed Agrobacterium 1.1 Expression plasmids
- GFP jellyfish green fluorescent protein
- a kanamycin resistance expression cassette (comprising a promoter of a nopaline synthase gene, a kanamycin resistance gene, and a terminator of a nopaline synthase gene) of a plant binary vector pMM444 (Japanese Patent Laid-Open No. 9-313059)
- the hygromycin resistance expression cassette (cauliflower mosaic virus 35S promoter, castor catalase gene first intron, hygromycin resistance gene, and nopaline synthase gene terminator) was replaced.
- the plasmid thus obtained was further added to a GUS expression cassette derived from pIG221 (Plant Cell Physiol., 31, 805 (1990)) (cauliflower mosaic virus 35S promoter, castor catalase gene first intron, ⁇ -
- An EGFP gene expression plasmid was prepared by introducing an EGFP expression cassette in which the ⁇ -glucuronidase gene of the glucuronidase gene and nopaline synthase gene terminator was replaced with the EGFP gene (pEGFP-N3: Clontech) This plasmid is referred to as “pGFP / MM444.”
- the structure is shown in FIG. In FIGS. 1, 2, 5 and 6, the meanings of symbols indicating genes and their control regions are as follows.
- 35SP Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter int: castor catalase gene first intron Nost: Nopaline synthase terminator SpecR: Spectinomycin resistance gene TcR: Tetracycline resistance gene HmR: Hygromycin resistance gene OripBR322: pBR322 ori OripRK2: pRK2 ori BL: T-DNA left border BR: T-DNA right border
- p19 / MM444 The structure is shown in FIG.
- the P19 gene has a function of enhancing the expression of the EGFP gene, and this p19 / MM444 was subjected to co-expression with pGFP / MM444.
- Agrobacterium tumefaciens AGL1 Rhizobium radiobacter ATCC BAA-101; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA20108, USA) strain (obtained transformed Agrobacterium, GFP-Agrobacterium, Called P19-Agrobacterium).
- the glycerol stock of transformed Agrobacterium (GFP-Agrobacterium, P19-Agrobacterium) prepared in 1.2 above is inoculated in LB medium, Culture was performed. After culturing, the cells were collected by centrifugation, and the obtained cells were suspended in an infiltration buffer [5 mM MES, 10 mM MgCl 2 , pH 5.6] to obtain a concentrated bacterial solution. The obtained concentrated cells are added to 4 L of infiltration buffer so that the OD600 of 1: 1 mixed solution of GFP-Agrobacterium and P19-Agrobacterium is 0.8, and adjusted to pH 5.6. Agrobacterium solution for infection process (for GFP / P19 co-expression) was used.
- the urethane mat used for raising seedlings in 2.2 was separated one by one and transplanted to a cultivation (first half) panel (W600mm ⁇ D300mm 30 holes).
- the planting (first term) panel after transplanting was set in a cultivation device, and cultivated for 9 days by a deep flow technique (DFT system).
- DFT system deep flow technique
- the plant body was taken out from the cultivation (early) panel and planted in a cultivation (late) panel (W600mm ⁇ D300mm 6 holes).
- a panel for cultivation (late stage) after transplantation was set in a cultivation apparatus and cultivated for 7 days (28 days after sowing) by the DFT method.
- the environmental conditions are controlled as follows, and the illumination is adjusted so that the light energy at a wavelength of 600 to 700 nm is 100% with respect to the light energy in the wavelength region of 400 to 800 nm (spectral irradiance: W / m 2 / nm).
- the plants were irradiated.
- the liquid fertilizer conditions were controlled to the same conditions as the cultivation (previous term) except that the electrical conductivity (EC) was changed to 4.0 mS / cm among the liquid fertilizer conditions.
- V-3P vacuum desiccator
- Example 1 In Example 1, in 2.4 cultivation (late stage), the light energy at a wavelength of 600 to 700 nm with respect to the light energy in the wavelength region of 400 to 800 nm of illumination is 80% (Example 2) and 60% (Example 3). The experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that the plant was irradiated with light having a wavelength of 400 to 500 nm except that the light was set to 50% (Example 4). Table 1 shows the ratios obtained by averaging the measurement results of the three strains and setting the value of the three-wavelength fluorescent lamp (Comparative Example 1) to 100%.
- Example 1 In Example 1, in 2.4 cultivation (late stage), an experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the illumination was a three-wavelength fluorescent lamp “Lupica Line” (Mitsubishi Electric Corporation). The measurement results of the three strains were averaged, and this value was taken as 100% and the results are shown in Table 1.
- Example 2 In Example 1, in 2.4 cultivation (late stage), the light energy of the wavelength of 600 to 700 nm with respect to the light energy of the wavelength region of 400 to 800 nm of illumination is set to be 30%, otherwise 400 The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the plant was irradiated with light having a wavelength of ⁇ 500 nm (blue light: B). The measurement results of the three strains were averaged, and the ratio when the value of the three-wavelength fluorescent lamp (Comparative Example 1) is 100% is shown in Table 1.
- FIG. 3 a graph of GFP yield is shown in FIG. 3, and the weight of leaves at the end of the cultivation process is shown in Table 2. As shown in Tables 1 and 2 and FIG. 3, although the weight of the leaves at the end of the cultivation process was almost the same in the examples and comparative examples, the light in the wavelength region of 600 nm to 700 nm ( It was found that in the examples where the ratio of red light: R) was 50% or more, the yield of GFP was significantly improved.
- Example 5 Preparation of transformed Agrobacterium 1.1 Expression plasmid
- GBA1 glucocerebrosidase
- hydrolase used as a therapeutic enzyme for Gaucher disease
- the himanocatalase gene By substituting the GBA1 gene for the first intron and the P19 gene region, a human-derived GBA1 gene expression plasmid was prepared (hereinafter this plasmid is referred to as “pGBA1 / MM444”, the structure of which is shown in FIG. 5).
- transformed Agrobacterium for infection process In place of GFP-Agrobacterium and P19-Agrobacterium, transformed Agrobacterium prepared in 1.2 above (GBA1-Agrobacterium and P19-Agrobacterium) Agrobacterium solution for infection process (for GBA1 / P19 co-expression) was obtained in the same manner as 1.3 in Example 1 except that a glycerol stock of bacteria was used. Further, except that the concentrated cells of P19-Agrobacterium were added to 4 L of the infiltration buffer so that the OD600 was 0.4 and adjusted to pH 5.6, the same as 1.3 in Example 1. Thus, an Agrobacterium solution for infection process (for P19 expression) was obtained.
- Agrobacterium infection in plants and plant collection Agrobacterium solution for infection process (for GBA1 / P19 co-expression) obtained in 1.3 above, and Agrobacterium solution for infection process (for P19 expression) Agrobacterium-infected to infected leaves were collected in the same manner as 3.1-3.3 in Example 1 except that each of these was used.
- GBA1 enzyme activity was measured as follows. In 396 ⁇ l of reaction buffer [60 mM phosphate / citrate buffer (pH 5.5), 0.15% Triton X-100, 0.4% sodium taurocholate, 4 mM p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside], 4 ⁇ l of the above 4 The crude extract obtained in 1 was added, and the mixture was stirred and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, 100 ⁇ l of 0.1M 2-amino-2-methyl-1-propanol was added to stop the reaction.
- the absorbance value at 405 nm was measured using a Wallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences).
- a 0.2% (w / v) p-nitrophenol solution (Wako Pure Chemical Industries) was serially diluted.
- the amount of reaction product ( ⁇ mol / g-TSP) per total soluble protein measured in 4.1 was calculated.
- the average value of the quantification results of the three strains in the P19-expressing Agrobacterium-infected leaves was used as the background of the endogenous enzyme (glucosidase) of Bensamiana tobacco.
- Example 6 In Example 5, in 2.4 cultivation (late stage), the light energy at a wavelength of 600 to 700 nm with respect to the light energy in the wavelength region of 400 to 800 nm of illumination is set to 50%, otherwise 400 The experiment was performed in the same manner as in Example 5 except that the plant was irradiated with light having a wavelength of ⁇ 500 nm. The average value of the quantification results of the three strains in the P19-expressing Agrobacterium-infected leaves was used as the background of the endogenous enzyme (glucosidase) of Bensamiana tobacco.
- Example 5 In Example 5, in 2.4 cultivation (late stage), an experiment was performed in the same manner as in Example 5 except that the illumination was a three-wavelength fluorescent lamp “Lupica Line” (Mitsubishi Electric Corporation). The average value of the quantification results of the three strains in the P19-expressing Agrobacterium-infected leaves was used as the background of the endogenous enzyme (glucosidase) of Bensamiana tobacco. On the other hand, after averaging the quantitative results of the 4 strains in the GBA1-P19 co-expressing Agrobacterium-infected leaves, the background value by the endogenous enzyme was subtracted to obtain the GBA1 reaction product amount. This value was taken as 100% and the results are shown in Table 3.
- Example 7 1. Preparation of transformed Agrobacterium 1.1 Expression plasmids Norwalk virus capsid protein (NVCP) expression was examined using two types of p19 / MM444 used in Example 1 and the following expression plasmids.
- NVCP Norwalk virus capsid protein
- pNVCP / MM444 Of the p19 / MM444 P19 expression cassette used in Example 1 (consisting of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the first intron of the castor catalase gene, the P19 gene, and the terminator of the nopaline synthase gene), the himanocatalase gene
- An NVCP gene expression plasmid derived from Norwalk virus was prepared by substituting the region of the first intron and the P19 gene with the NVCP gene (hereinafter, this plasmid is referred to as “pNVCP / MM444”. The structure is shown in FIG. )
- transformed Agrobacterium for infection process instead of GFP-Agrobacterium and P19-Agrobacterium, transformed Agrobacterium prepared in 1.2 above (NVCP-Agrobacterium and P19-Agrobacterium) Agrobacterium solution for infection process (for NVCP / P19 co-expression) was obtained in the same manner as in Example 1, 1.3, except that a glycerol stock of bacteria was used.
- NVCP expression level 4.1 Preparation of crude extract The NVCP / P19 co-expressing Agrobacterium-infected leaves cryopreserved in 3 above were transferred to a mortar and ground in liquid nitrogen. Then, NVCP extraction buffer twice the fresh sample weight [25 mM Tris-HCl (pH 6.6), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.4 ⁇ g / ml sodium pyrosulfite, 0.1% Triton X-100, 1 tablet / 50 ml Complete protein extraction was performed by adding complete protease inhibitor EDTA-free (Roche) and suspending vigorously.
- NVCP quantification was performed by Western blotting as follows. To the above crude extract diluted 20 times with PBS, add an equal volume of SDS-PAGE sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 350 mM DTT, 25% glycerol, 0.01% BPB), 95 ° C., 5 minutes Then, heat denaturation treatment was performed to prepare a sample for electrophoresis. 10 ⁇ l of the electrophoresis sample was applied to a sample well of Mini-PROTEAN TGX Gel (10%, 15-well comb, BIO-RAD), and electrophoresis was performed at 200 V constant voltage for 35 minutes.
- SDS-PAGE sample buffer 62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 350 mM DTT, 25% glycerol, 0.01% BPB
- Trans-Blot Turbo Transfer Pack (Mini format 0.2 ⁇ m PVDF, BIO-RAD), set in Trans-Blot Turbo Transfer System (BIO-RAD), and membrane transfer is performed at 25V constant voltage for 7 minutes. Went.
- the transferred PVDF membrane was reacted with 1.25 ⁇ g / ml anti-norovirus GI.1 mouse monoclonal antibody [P2B2] (Abcam) for 1 hour at room temperature, washed with TBS-T, and then 0.13 ⁇ g / ml anti-mouse IgG (H + L), AP Conjugate (Promega) was allowed to react at room temperature for 1 hour.
- Example 8 In Example 7, in 2.4 cultivation (late stage), the light energy of the wavelength of 600 to 700 nm is set to 50% with respect to the light energy of the wavelength region of 400 to 800 nm of illumination, and otherwise 400 The experiment was performed in the same manner as in Example 7 except that the plant was irradiated with light having a wavelength of ⁇ 500 nm. Table 4 shows the ratios obtained by averaging the quantitative results of the four strains and setting the value of the three-wavelength fluorescent lamp (Comparative Example 4) to 100%.
- Example 7 in 2.4 cultivation (late stage), an experiment was performed in the same manner as in Example 7 except that the illumination was a three-wavelength fluorescent lamp “Lupica Line” (Mitsubishi Electric Corporation). The results of quantification of the four strains were averaged and this value was taken as 100%.
- Example 1 400 light energy of wavelengths in the ⁇ 500 nm is 42% against 20% of the light energy of a wavelength of 501 ⁇ 600 nm, adjusted so that the optical energy at a wavelength of 601 ⁇ 700 nm is 38%, was added
- the plant biomass was adjusted in the same manner as in Example 1 except that far-red light (FR) having a wavelength of 701 to 800 nm was irradiated.
- the ratio (FR / R) between the light energy in the far-red light (FR) having a wavelength of 701 to 800 nm and the light energy in the red light (R) having a wavelength of 601 to 700 nm is 1 (Reference Example 1) or 0 (Reference), respectively.
- Example 2 was set.
- Example 5 shows the GFP yield when the measurement results of 4 strains were averaged and the plant height and the value of the three-wavelength fluorescent lamp (Comparative Example 5) were taken as 100%.
- the plant height tends to increase when irradiated with light in the wavelength range of 701 to 800 nm (far red light: FR) in the cultivation process.
- FR far red light
Abstract
本発明の、植物を用いて有用タンパク質を製造する方法は、植物を栽培する工程（栽培工程）、前記栽培工程後の植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程（感染工程）、及び、前記感染工程後の植物に有用タンパク質を発現させる工程（発現工程）を含み、前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする。
Description
本発明は植物を用いて有用タンパク質を効率よく製造する方法に関する。
近年、植物を用いたタンパク質の製造方法は、複雑なタンパク質の発現が可能、低コストでの大量生産が可能、分離精製が容易、安全性が保障されている等の理由により、注目されている。植物を用いたタンパク質の製造方法としては、以下に記載の方法が知られている。
特許文献１には、形質転換アグロバクテリウムを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）を温室で栽培することによってＨ１タンパク質などのインフルエンザウイルス様粒子（VLP）を生産する方法が記載されている。
特許文献２には、植物に形質転換アグロバクテリウムを特定の圧力条件の下で感染させてペプチドまたはタンパク質を生産する方法が開示され、実施例３では、感染に用いる植物を、自然光に加えて、補光の人工光を使用して栽培したことが記載されている。
非特許文献１には、白色蛍光灯の光で栽培されたベンサミアナタバコに形質転換アグロバクテリウムを感染させてインフルエンザワクチンの抗原タンパクであるヘマグルチニンを発現させる方法が記載されている。
特許文献３には、葉菜類の植物をピーク波長６００～７００ｎｍの赤色光のみを用いて栽培する方法が記載されている。
特許文献１には、形質転換アグロバクテリウムを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）を温室で栽培することによってＨ１タンパク質などのインフルエンザウイルス様粒子（VLP）を生産する方法が記載されている。
特許文献２には、植物に形質転換アグロバクテリウムを特定の圧力条件の下で感染させてペプチドまたはタンパク質を生産する方法が開示され、実施例３では、感染に用いる植物を、自然光に加えて、補光の人工光を使用して栽培したことが記載されている。
非特許文献１には、白色蛍光灯の光で栽培されたベンサミアナタバコに形質転換アグロバクテリウムを感染させてインフルエンザワクチンの抗原タンパクであるヘマグルチニンを発現させる方法が記載されている。
特許文献３には、葉菜類の植物をピーク波長６００～７００ｎｍの赤色光のみを用いて栽培する方法が記載されている。
Environ.Control.Biol., 2012,50(4),375-381
上記のように、植物を用いてタンパク質を生産する技術は知られていたが、その生産効率を向上させるための条件検討は十分になされてはいなかった。
すなわち、特許文献１では、植物の栽培工程における光源の種類についての記載が無く、また、光源の波長に関する具体的な記載もなく、植物の栽培工程における光源については検討がなされていない。
特許文献２では、自然光に人工光を追加した条件下で栽培した植物を使用してタンパク質を発現させることについて記載されているものの、該人工光の波長については一切記載がなく、植物の栽培工程における光源の波長に関しては検討がなされていない。
非特許文献１では、タンパク質の発現量向上のために、アグロバクテリウム感染後の植物の発現条件の検討を実施しているものの栽培工程では白色蛍光灯で栽培した植物を使用しており、好ましい光源に関する検討はなされていない。
また、特許文献３は植物の栽培を目的とするものであり、植物を用いたタンパク質の生産については何ら記載がない。
すなわち、特許文献１では、植物の栽培工程における光源の種類についての記載が無く、また、光源の波長に関する具体的な記載もなく、植物の栽培工程における光源については検討がなされていない。
特許文献２では、自然光に人工光を追加した条件下で栽培した植物を使用してタンパク質を発現させることについて記載されているものの、該人工光の波長については一切記載がなく、植物の栽培工程における光源の波長に関しては検討がなされていない。
非特許文献１では、タンパク質の発現量向上のために、アグロバクテリウム感染後の植物の発現条件の検討を実施しているものの栽培工程では白色蛍光灯で栽培した植物を使用しており、好ましい光源に関する検討はなされていない。
また、特許文献３は植物の栽培を目的とするものであり、植物を用いたタンパク質の生産については何ら記載がない。
このように、植物によるタンパク質の一過性発現において、栽培工程で用いられる光源は自然光や白色蛍光灯が用いられており、一定割合以上の６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（赤色光）を含む光源を用いて栽培している報告はこれまでにない。
以上より、本発明は、植物を用いて有用タンパク質を製造する際の植物を栽培する条件を改良し、有用タンパク質の製造効率を向上させることを目的とする。
以上より、本発明は、植物を用いて有用タンパク質を製造する際の植物を栽培する条件を改良し、有用タンパク質の製造効率を向上させることを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（「いわゆる赤色光」、以下単に「赤色光」という場合がある。）を一定割合以上含む条件で栽培した植物をタンパク質の一過性発現に用いることで、タンパク質の発現効率および発現量を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
[１] 植物を用いて有用タンパク質を製造する方法であって、
前記植物を栽培する工程（栽培工程）、
前記栽培工程後の植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程（感染工程）、及び、
前記感染工程後の植物に有用タンパク質を発現させる工程（発現工程）を含み、
前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、有用タンパク質を製造する方法。
［２］ 前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを７５％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、[１]に記載の有用タンパク質を製造する方法。
[３] 前記発現工程の後に前記有用タンパク質を精製し回収する工程をさらに含むことを特徴とする、[１]または[２]に記載の有用タンパク質を製造する方法。
[４] 前記有用タンパク質が、医療用タンパク質であることを特徴とする、[１]～[３]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[５] 前記植物が、ベンサミアナタバコであることを特徴とする、[１]～[４]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[６] 前記栽培工程において、前記植物を閉鎖型植物工場内で栽培することを特徴とする、[１]～[５]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[７] 前記栽培工程において、光エネルギーの光源としてＬＥＤを用いることを特徴とする、[１]～[６]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[８] [１]～[７]のいずれかに記載の方法で製造される酵素又はウイルス様粒子。
[１] 植物を用いて有用タンパク質を製造する方法であって、
前記植物を栽培する工程（栽培工程）、
前記栽培工程後の植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程（感染工程）、及び、
前記感染工程後の植物に有用タンパク質を発現させる工程（発現工程）を含み、
前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、有用タンパク質を製造する方法。
［２］ 前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを７５％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、[１]に記載の有用タンパク質を製造する方法。
[３] 前記発現工程の後に前記有用タンパク質を精製し回収する工程をさらに含むことを特徴とする、[１]または[２]に記載の有用タンパク質を製造する方法。
[４] 前記有用タンパク質が、医療用タンパク質であることを特徴とする、[１]～[３]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[５] 前記植物が、ベンサミアナタバコであることを特徴とする、[１]～[４]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[６] 前記栽培工程において、前記植物を閉鎖型植物工場内で栽培することを特徴とする、[１]～[５]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[７] 前記栽培工程において、光エネルギーの光源としてＬＥＤを用いることを特徴とする、[１]～[６]のいずれかに記載の有用タンパク質を製造する方法。
[８] [１]～[７]のいずれかに記載の方法で製造される酵素又はウイルス様粒子。
本発明の方法によれば、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（赤色光）を一定の割合以上含む条件で栽培した植物は、タンパク質の発現効率が向上することから、効率良くタンパク質を生産することができる。加えて、光条件の調整で生育量を増大させるような従来技術と異なり、植物内に高濃度にタンパク質を蓄積できることから、タンパク質の精製工程において、精製負荷が軽減され、製造コストの削減の点で効果が大きい。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の、植物を用いて有用タンパク質を製造する方法は、植物を栽培する工程（栽培工程）、次いで、該植物に該有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程（感染工程）、及び、感染工程後の植物を栽培して該有用タンパク質を発現させる工程（発現工程）を含む。
本発明で用いることのできる植物としては、アグロバクテリウムに感染する植物であり、有用タンパク質を発現する植物であればよく、特に限定されない。例えば、双子葉植物と単子葉植物が挙げられる。具体的には、双子葉植物ではナス科植物として、タバコ、ジャガイモ、トマト等が、アブラナ科植物として、ルッコラ、コマツナ、ミズナ、カラシナ、シロイズナズナ等が、キク科植物として、チコリ、エンダイブ、アーティチョーク等が、マメ科植物として、アルファルファ、リョクトウ、ダイズ等が、アカザ科植物としてホウレンソウ、テンサイ等が、シソ科植物としてシソ、バジル等が、セリ科植物としてミツバ等が例示される。単子葉植物としてはイネ科植物として、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等が、アオイ科植物としてはワタ等が例示される。中でも、ナス科植物が好ましく、タバコがより好ましい。
タバコとしては、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナアタバコ（N. benthamiana）、ハナタバコ（N. alata）、キダチタバコ（N. glauca）、ナガバナタバコ（N. longiflora）、ニコチアナ・ペルシア（N. persica）、ニコチアナ・ルスチカ（N. rustica）、ニコチアナ・シルベストシス（N. sylvestris）などが挙げられる。好ましくは、ベンサミアナアタバコである。
タバコとしては、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナアタバコ（N. benthamiana）、ハナタバコ（N. alata）、キダチタバコ（N. glauca）、ナガバナタバコ（N. longiflora）、ニコチアナ・ペルシア（N. persica）、ニコチアナ・ルスチカ（N. rustica）、ニコチアナ・シルベストシス（N. sylvestris）などが挙げられる。好ましくは、ベンサミアナアタバコである。
本発明において、有用タンパク質とは、医療用や産業用に用いられるタンパク質であれば特に限定はされない。好ましくは、医療用タンパク質である。
医療用タンパク質としては、ペプチド、ワクチン、抗体、酵素、ホルモン（好ましくはペプチドホルモン）などが例示され、より具体的には、ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）－１やＩＬ－６等のサイトカイン、モノクローナル抗体またはその断片、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが例示される。
医療用タンパク質としては、ペプチド、ワクチン、抗体、酵素、ホルモン（好ましくはペプチドホルモン）などが例示され、より具体的には、ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）－１やＩＬ－６等のサイトカイン、モノクローナル抗体またはその断片、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが例示される。
ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質として好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構成タンパク質が挙げられる。ＶＬＰの構成タンパク質は単一のタンパク質でもよいし、１つ以上のタンパク質を含んでもよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などが挙げられ、インフルエンザウイルスのＶＬＰの構成タンパク質としてはインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、ノロウイルスのＶＬＰ構成タンパク質としてはNorwalk virus capsid protein（ＮＶＣＰ）などが例示される。
産業用タンパク質とは、食品、飼料、化粧品、繊維、洗剤、化学品などに用いられるタンパク質であり、ペプチド、酵素、機能性タンパク質が例示される。具体的には、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ルシフェラーゼ、ラクタマーゼ、コラーゲン、ゼラチン、ラクトフェリン、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などが例示される。
以下、本発明の製造方法の各工程について説明する。
＜栽培工程＞
本発明は、詳細は後述するが、前記植物を、波長４００～８００ｎｍにおける光エネルギー（分光放射照度；Ｗ／ｍ２／ｎｍ）に対して、波長６００～７００ｎｍの光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で植物を栽培する工程を少なくとも一部に有することを特徴とする。
栽培工程では植物を、上記条件下で栽培することができれば、いずれの植物生産システムを用いてもよく、特に限定されない。栽培時の光エネルギーの調整のしやすさから、半閉鎖型、または閉鎖型の植物工場が好ましく、閉鎖型植物工場がより好ましい。半閉鎖型としては、園芸施設、太陽光型植物工場などが例示される。
本発明は、詳細は後述するが、前記植物を、波長４００～８００ｎｍにおける光エネルギー（分光放射照度；Ｗ／ｍ２／ｎｍ）に対して、波長６００～７００ｎｍの光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で植物を栽培する工程を少なくとも一部に有することを特徴とする。
栽培工程では植物を、上記条件下で栽培することができれば、いずれの植物生産システムを用いてもよく、特に限定されない。栽培時の光エネルギーの調整のしやすさから、半閉鎖型、または閉鎖型の植物工場が好ましく、閉鎖型植物工場がより好ましい。半閉鎖型としては、園芸施設、太陽光型植物工場などが例示される。
ここで、閉鎖型植物工場は、太陽光が当たらない植物工場を意味し、温度、湿度、二酸化炭素濃度、人工光の波長および照射時間などが制御された空間で植物を栽培するシステムである。閉鎖型植物工場を用いることにより、光の制御が可能なので、植物およびそれが生産する物質の品質が安定するという効果や、外気に含まれる病原菌の感染を防ぐことができるという効果がある。さらに、温度、湿度、気流などの栽培環境条件の精密制御が可能となり、栽培工程における植物の生長速度、及び発現工程における有用タンパク質の発現が向上するという効果が得られるので好ましい。
閉鎖型植物工場としては、環境制御された部屋と、該環境制御された部屋内に設置され植物栽培容器を載置する植物栽培容器棚と、該植物栽培容器棚の近接部に配され植物体に光を近接照射する照明を含むシステムが例示される。植物栽培容器棚は複数段に配置可能である。
栽培工程で栽培される植物は、その草丈（ｃｍ）が２ｃｍ以上であることが好ましく、３ｃｍ以上であることがより好ましく、また、２５ｃｍ以下であることが好ましく、１５ｃｍ以下であることがより好ましい。草丈が、上述の範囲内であると、栽培棚の多段化により閉鎖型植物工場のＳＴＹ（space time yield）向上に有利である。
また、植物内に高濃度のタンパク質を蓄積できる植物を用いた場合には、植物の草丈が上限値以下であると、植物の地上部全体における葉の割合が高くなり、植物１株当たりの葉の収穫量が増え、十分な量のタンパク質を確保することができる。また、精製工程で取り扱いが容易な葉の重量割合が増えることで精製負荷を低減することができ、その結果、容易にタンパク質を確保することができるので好ましい。
なお、ここでいう「草丈」とは、地上部の下端から生長点までの長さを意味し、収穫直後の植物の地下部を切除した後、草丈の長さを測定することにより求めることができる。
また、植物内に高濃度のタンパク質を蓄積できる植物を用いた場合には、植物の草丈が上限値以下であると、植物の地上部全体における葉の割合が高くなり、植物１株当たりの葉の収穫量が増え、十分な量のタンパク質を確保することができる。また、精製工程で取り扱いが容易な葉の重量割合が増えることで精製負荷を低減することができ、その結果、容易にタンパク質を確保することができるので好ましい。
なお、ここでいう「草丈」とは、地上部の下端から生長点までの長さを意味し、収穫直後の植物の地下部を切除した後、草丈の長さを測定することにより求めることができる。
栽培工程で栽培される植物は、その地上部新鮮重量（ｇ）が３ｇ以上であることが好ましく、１０ｇ以上であることがより好ましく、また、１００ｇ以下であることが好ましく、７０ｇ以下であることがより好ましい。地上部新鮮重量が、上述の範囲内である植物は生長速度が速く、このような生長速度の速い時期にある植物を用いると、有用タンパク質の生産効率が向上するので好ましい。
栽培工程で栽培される植物は、その葉重量（ｇ）が２．５ｇ以上であることが好ましく、７．５ｇ以上であることがより好ましく、また、８０ｇ以下であることが好ましく、６０ｇ以下であることがより好ましい。葉重量が、上述の範囲内である植物は、生長速度が速く、このような生長速度の速い時期にある植物を用いると、有用タンパク質の生産効率が向上するので好ましい。
栽培条件は、植物の生育および有用タンパク質の生産に適した条件であれば特に制限されないが、例えば、以下の条件で栽培することができる。
植物工場内の温度は、通常１０℃以上、好ましくは１５℃以上であり、また、通常４０℃以下、好ましくは３７℃以下である。
植物工場内の湿度は、通常４０％以上、好ましくは５０％以上であり、また、通常１００％以下、好ましくは９５％以下である。
植物工場内の二酸化炭素濃度は、通常３００ｐｐｍ以上、好ましくは５００ｐｐｍ以上であり、また、通常５０００ｐｐｍ以下、好ましくは３０００ｐｐｍ以下である。
栽培工程において使用される光源としては、上記光エネルギーの条件を満たしうるものであれば特に制限されないが、太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を例示することができる。好ましくは、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプが挙げられ、さらに好ましくはＬＥＤが挙げられる。ＬＥＤは、白熱電球、ＨＩＤランプと比較して、光変換効率が高く省電力であるので好ましい。また、植物に葉焼け障害を引き起こす熱線の放出量が小さい点でも好ましい。
光は、波長ごとに４００～５００ｎｍを青色光（Ｂ）、５０１～６００ｎｍを緑色光（Ｇ）、６０１～７００ｎｍを赤色光（Ｒ）、７０１～８００ｎｍを遠赤光（ＦＲ）と分類した。
なお、この波長領域は、可視領域の波長を光の色で分類し、隣接する波長領域との境界が重複しないような操作を行う場合に便宜的に用いるものであって、赤色光を含む波長領域を単に、６００ｎｍ～７００ｎｍと記載するときは、これらの両端の波長を含んでもよいものとする。
栽培工程においては、波長４００～８００ｎｍにおける光エネルギー（分光放射照度；Ｗ／ｍ２／ｎｍ）に対して、波長６００～７００ｎｍの光エネルギーを通常５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上の割合で含む照射条件下で植物が栽培される。ここで、光エネルギーは分光放射計（Ｓｐｅｃｂｏｓ １２１１；ファイブラボ製）などを用いて測定できる。上述の範囲にして栽培した植物を感染工程に用いると、植物のタンパク発現効率が向上し、タンパク質収量が増加するので好ましい
なお、この波長領域は、可視領域の波長を光の色で分類し、隣接する波長領域との境界が重複しないような操作を行う場合に便宜的に用いるものであって、赤色光を含む波長領域を単に、６００ｎｍ～７００ｎｍと記載するときは、これらの両端の波長を含んでもよいものとする。
栽培工程においては、波長４００～８００ｎｍにおける光エネルギー（分光放射照度；Ｗ／ｍ２／ｎｍ）に対して、波長６００～７００ｎｍの光エネルギーを通常５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上の割合で含む照射条件下で植物が栽培される。ここで、光エネルギーは分光放射計（Ｓｐｅｃｂｏｓ １２１１；ファイブラボ製）などを用いて測定できる。上述の範囲にして栽培した植物を感染工程に用いると、植物のタンパク発現効率が向上し、タンパク質収量が増加するので好ましい
また、栽培工程においては、照射する光のうち波長７００～８００ｎｍの遠赤光の割合を低減させると、得られる植物の草丈が低くなる傾向があり好ましい。具体的には、波長６０１～７００ｎｍの赤色光（Ｒ）における光エネルギー（分光放射照度；Ｗ／ｍ２／ｎｍ）と、波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）における光エネルギーとの割合（ＦＲ／Ｒ）が、０．２５以下となる光源下で栽培することが好ましく、より好ましくは０．２０以下、さらに好ましくは０．１５以下であり、波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）を含まなくてもよい。
植物内に高濃度のタンパク質を蓄積できる植物を用いる場合に、上記ＦＲ／Ｒ値を０．２５以下とすることにより、植物の地上部全体における葉の割合が高くなり、植物１株当たりの葉の収穫量が増え、十分な量のタンパク質を確保することができる。また、精製工程で取り扱いが容易な葉の重量割合が増えることで精製負荷を低減することができ、その結果、容易にタンパク質を確保することができるので好ましい。また、栽培棚の多段化により植物工場のＳＴＹ向上に有利となるので好ましい。
なお、栽培工程の全期間にわたって、光エネルギーの条件を上記の条件とする必要はなく、例えば、栽培工程を前半と後半に分けて後半のみ光エネルギーの条件を上記の条件とするなど、栽培工程のうちの一定期間のみ上記の条件下で植物を栽培してもよい。この場合、上記の条件下とする期間としては、全栽培期間の１％以上の期間が好ましく、２０％以上の期間がより好ましい。
栽培工程の全期間のうち、光エネルギーの条件を上記の条件としない期間の光エネルギーの条件については特に制限はなく、この期間は開放型植物工場で太陽光のもと、栽培してもよい。
栽培工程の全期間のうち、光エネルギーの条件を上記の条件としない期間の光エネルギーの条件については特に制限はなく、この期間は開放型植物工場で太陽光のもと、栽培してもよい。
上記条件下で栽培して得られた植物は、通常の植物に比べてアグロバクテリウム感染に対する防御能力が低下し、感染効率が増大すると推測される。その結果、一過性発現における目的タンパク質の発現効率が向上したと考えられる。植物の防御能低下の要因としては、例えば、タバコの場合、植物体に含まれるニコチン量の減少や細胞壁を構成する多糖類の減少が挙げられる。ニコチンはアルカロイドの一種であり、植物本体を外界から守る役割を担っている。細胞壁は、外界からのバリア機能を成す。赤色光照射により、植物のニコチン代謝量や細胞壁に含まれる多糖類の生成量が減少したことで、アグロバクテリウムに感染しやすくなったものと推測される。
また、上記条件下で栽培することで、植物に含まれる特定のタンパク質の生産が抑制されることで、目的タンパク質の発現効率が向上すると考えられる。例えば、プロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼ生産が抑制されることで目的タンパク質の分解が減少し、結果として発現効率が向上する。
上述のことから、本発明の栽培工程で得られた植物は効率よくアグロバクテリウム感染を行うことができ、感染工程でアグロバクテリウムを用いて導入されたポリヌクレオチドが高効率でタンパク質を発現することが可能となる。その結果、目的とする有用タンパク質の発現効率および発現量を向上させることができると考えられる。この効果は、有用タンパク質の種類を問わず期待できる。
また、上記条件下で栽培することで、植物に含まれる特定のタンパク質の生産が抑制されることで、目的タンパク質の発現効率が向上すると考えられる。例えば、プロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼ生産が抑制されることで目的タンパク質の分解が減少し、結果として発現効率が向上する。
上述のことから、本発明の栽培工程で得られた植物は効率よくアグロバクテリウム感染を行うことができ、感染工程でアグロバクテリウムを用いて導入されたポリヌクレオチドが高効率でタンパク質を発現することが可能となる。その結果、目的とする有用タンパク質の発現効率および発現量を向上させることができると考えられる。この効果は、有用タンパク質の種類を問わず期待できる。
また、栽培工程において、植物は、光照射の時間が一日当たり１０時間以上２４時間未満であるサイクル下で栽培されるか、または、連続光下により栽培されることが好ましい。中でも、連続光下により栽培されることがより好ましい。上述の範囲にすると、植物生長速度が加速され、収穫までの栽培期間が短縮されるので好ましい。なお、「光の照射時間が１日あたり１０時間以上２４時間未満」とは、必ずしも連続照射でなくてもよく、例えば、照射時間が１日あたり２０時間の場合、１０時間以上の連続照射を１日に２回行なってもよい。
なお、ここで照射する光は、パルス光であってもよい。パルス光は、１マイクロ秒～１秒間の短い間隔でＬＥＤ等を点滅させることにより得られるものであり、このようなパルス光を用いることにより、生理学上植物が光を必要としない時間には光を当てず、光を必要とする時間だけ光を当てることができるので光合成速度を上昇させ、電力コストを抑えることができる。この場合の照射時間は、ＬＥＤが点灯していない時間も照射時間に含むこととし、1日当たりのパルス光照射した時間の合計とする。
なお、ここで照射する光は、パルス光であってもよい。パルス光は、１マイクロ秒～１秒間の短い間隔でＬＥＤ等を点滅させることにより得られるものであり、このようなパルス光を用いることにより、生理学上植物が光を必要としない時間には光を当てず、光を必要とする時間だけ光を当てることができるので光合成速度を上昇させ、電力コストを抑えることができる。この場合の照射時間は、ＬＥＤが点灯していない時間も照射時間に含むこととし、1日当たりのパルス光照射した時間の合計とする。
栽培工程における植物の栽培方法は、植物の生育および有用タンパク質の生産に適した方法であれば特に制限されないが、養液栽培システムを用いて栽培されることが好ましい。養液栽培システムの好ましい例としては、天然の固定培地（土）を使わないことが好ましく、具体的には、人工の固形培地を用いた栽培、水耕栽培、噴霧法による栽培が好ましい。これらの中でも栽培棚の多段化や、養液のリサイクル、肥料成分およびｐＨの管理が容易であることから水耕栽培がより好ましく、水耕栽培としては、NFT（Nutrient Film Technique）、DFT（Deep Flow Technique）等が挙げられる。水耕栽培の中でも、根が養液中でむき出しの状態となるbare-root法が好ましい。根は水の中を自由に伸び、養液との接触面積が増大することで、十分な量の水分と養分を吸収できるため、一般に土壌栽培に比べ生育が旺盛になるからである。
また、栽培工程における栽培日数は、通常５日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは１０日以上であり、また、通常３５日以下、好ましくは２８日以下、より好ましくは２１日以下である。
栽培工程においては、必要に応じて、移植を行なってもよい。移植の時期としては、栽培後６日～１５日の間に行なうことが好ましい。
なお、本発明の製造方法においては、栽培工程の前に育苗工程を行うことが好ましい。育苗工程とは、植物の苗を一定期間人工的な環境下で発芽・育成させ、その後栽培工程に移植するまでの工程をいう。該育苗工程における温度、湿度等の条件は上記栽培工程における条件と同様の条件とすることができる。また、光照射の条件も太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を用いた通常の条件を採用することができるが、育苗工程においては、光照射の時間が一日当たり１２時間以上２４時間以下であるサイクル下で植物を育苗することが好ましい。なお、「光の照射時間が１日あたり１２時間以上２４時間以下」とは、必ずしも連続照射でなくてもよく、例えば、照射時間が１日あたり２０時間の場合、１０時間以上の連続照射を１日に２回行なってもよい。
＜感染工程＞
感染工程では、前記栽培工程で得られた植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる。
感染工程では、前記栽培工程で得られた植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる。
有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、目的とする有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドのことである。目的とする有用タンパク質とは、有用タンパク質として例示したタンパク質のことである。ポリヌクレオチドとしては、天然型の配列に、目的とする有用タンパク質が得られる範囲内で、適宜、変異や改変を加えたものを用いてもよい。
有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物内で過剰発現させるには、該ポリヌクレオチドを適当なプロモーターの下流に機能的に連結し、得られたポリヌクレオチド構築物をアグロバクテリウム法によって植物細胞に導入すればよい。上記プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーターやElongation factor 1βプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
アグロバクテリウム法を行う際は、アグロバクテリウムのTiプラスミドやRiプラスミド由来のT-DNA（transfer DNA）を含むバイナリーベクターまたは中間ベクターを用いることができる（Nucl. Acids Res. 12(22):8711-8721 (1984), Plasmid, 7, 15-29 (1982)）。バイナリーベクターの具体例として、pBI系ベクター（例えば、pRiceFOX）、pPZP系ベクター（Plant Molecular Biology 25(6): 989-94. (1994)）、pCAMBIA系ベクター（ベクター骨格：pPZPベクター）、pSMA系ベクター（Plant Cell Reports 19: 448-453. (2000)）を挙げることができるが、これらに限定されない。
該ポリヌクレオチド構築物を発現させるためには、これらのベクターを用いた一過性発現方法を使用することができる（Journal of Virological Methods, 105:343-348 (2002)）。また、アグロバクテリウムによる感染は減圧条件下で行うことが好ましく、Plant Science, 122, 1: 101-108 (1997)）によって記載された真空に基づく一過性発現方法を使用することがより好ましい。アグロ接種またはアグロインフィルトレーションにより、ポリヌクレオチド構築物を含むアグロバクテリウムは、組織、例えば、葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）、または全草の細胞間の空間に入り込む。表皮の通過後に、アグロバクテリウムは感染し、細胞へとポリヌクレオチドを移行させる。ポリヌクレオチドはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染した細胞中で対象となるタンパク質の産生をもたらすが、核の内部でのポリヌクレオチドの継代は一過性である。
＜発現工程＞
発現工程では感染工程後の植物を栽培して該有用タンパク質を発現させる。発現工程での栽培条件は有用タンパク質が効率よく発現できる条件であれば特に制限されないが、該発現工程における温度、湿度等の条件は上記栽培工程における条件と同様の条件とすることができる。また、光照射の条件も太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を用いた通常の条件を採用することができる。発現工程における栽培日数は、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上であり、また、好ましくは１４日以下、より好ましくは１０日以下である。
発現工程では感染工程後の植物を栽培して該有用タンパク質を発現させる。発現工程での栽培条件は有用タンパク質が効率よく発現できる条件であれば特に制限されないが、該発現工程における温度、湿度等の条件は上記栽培工程における条件と同様の条件とすることができる。また、光照射の条件も太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を用いた通常の条件を採用することができる。発現工程における栽培日数は、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上であり、また、好ましくは１４日以下、より好ましくは１０日以下である。
＜有用タンパク質回収工程＞
発現工程において、植物内に蓄積した有用タンパク質は植物から回収されることが好ましい。植物から有用タンパク質を含む画分を取得し、有用タンパク質を適当な方法により精製することが好ましい。なお、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは精製のためのタグ配列を含んでもよい。
発現工程において、植物内に蓄積した有用タンパク質は植物から回収されることが好ましい。植物から有用タンパク質を含む画分を取得し、有用タンパク質を適当な方法により精製することが好ましい。なお、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは精製のためのタグ配列を含んでもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
[実施例１]
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
GFP（クラゲ緑色蛍光タンパク質）発現の検討には、以下の２種類の発現プラスミドを用いた。
植物バイナリーベクターpMM444（特開平9-313059号公報）のカナマイシン耐性発現カセット（ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）を、ｐIZI（特開平７－２７４７５２）由来のハイグロマイシン耐性発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター）に置換した。このようにして得られたプラスミドに、さらに、pIG221（Plant Cell Physiol., 31, 805(1990)）由来のGUS発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、β-グルクロニダーゼ遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のβ-グルクロニダーゼ遺伝子をEGFP遺伝子（pEGFP-N3：クローンテック社製）に置換したEGFP発現カセットを導入し、EGFP遺伝子発現プラスミドを作製した（以下、このプラスミドを「pGFP／MM444」と称する。その構造を図1に示す）。
なお、図１、２、５及び６において、遺伝子やその制御領域を示す記号の意味は、以下のとおりである。
35SP: カリフラワーモザイクウィルス 35S プロモーター
int: ヒマ カタラーゼ遺伝子 第一イントロン
Nost: ノパリンシンターゼ ターミネーター
SpecR: スペクチノマイシン耐性遺伝子
TcR: テトラサイクリン耐性遺伝子
HmR：ハイグロマイシン耐性遺伝子
OripBR322: pBR322 ori
OripRK2:pRK2 ori
BL: T-DNA left border
BR: T-DNA right border
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
GFP（クラゲ緑色蛍光タンパク質）発現の検討には、以下の２種類の発現プラスミドを用いた。
植物バイナリーベクターpMM444（特開平9-313059号公報）のカナマイシン耐性発現カセット（ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）を、ｐIZI（特開平７－２７４７５２）由来のハイグロマイシン耐性発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター）に置換した。このようにして得られたプラスミドに、さらに、pIG221（Plant Cell Physiol., 31, 805(1990)）由来のGUS発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、β-グルクロニダーゼ遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のβ-グルクロニダーゼ遺伝子をEGFP遺伝子（pEGFP-N3：クローンテック社製）に置換したEGFP発現カセットを導入し、EGFP遺伝子発現プラスミドを作製した（以下、このプラスミドを「pGFP／MM444」と称する。その構造を図1に示す）。
なお、図１、２、５及び６において、遺伝子やその制御領域を示す記号の意味は、以下のとおりである。
35SP: カリフラワーモザイクウィルス 35S プロモーター
int: ヒマ カタラーゼ遺伝子 第一イントロン
Nost: ノパリンシンターゼ ターミネーター
SpecR: スペクチノマイシン耐性遺伝子
TcR: テトラサイクリン耐性遺伝子
HmR：ハイグロマイシン耐性遺伝子
OripBR322: pBR322 ori
OripRK2:pRK2 ori
BL: T-DNA left border
BR: T-DNA right border
また、pGFP／MM444におけるハイグロマイシン耐性発現カセットを削除し、ついで、EGFP発現カセットのEGFP遺伝子をtomato bushy stunt virus由来のP19遺伝子に置換することでP19遺伝子発現プラスミドを作製した
（以下、このプラスミドを「p19/MM444」と称する。その構造を図２に示す
）。なお、P19遺伝子はEGFP遺伝子の発現を強化する働きがあり、このp19/MM444は、pGFP／MM444との共発現に供した。
（以下、このプラスミドを「p19/MM444」と称する。その構造を図２に示す
）。なお、P19遺伝子はEGFP遺伝子の発現を強化する働きがあり、このp19/MM444は、pGFP／MM444との共発現に供した。
１．２ アグロバクテリウムの形質転換と形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックの調製
上述のプラスミド（pGFP／MM444、p19/MM444）をそれぞれ、エレクトロポレーション法（Mattanovich et al.1989）によってアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens AGL1： Rhizobium radiobacter ATCC BAA-101; American Type Culture Collection （ATCC）, Manassas, VA20108,USA）株に導入した（得られた形質転換アグロバクテリウムを、以下、それぞれ、GFP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する）。
上述のプラスミド（pGFP／MM444、p19/MM444）をそれぞれ、エレクトロポレーション法（Mattanovich et al.1989）によってアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens AGL1： Rhizobium radiobacter ATCC BAA-101; American Type Culture Collection （ATCC）, Manassas, VA20108,USA）株に導入した（得られた形質転換アグロバクテリウムを、以下、それぞれ、GFP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する）。
形質転換アグロバクテリム（GFP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウム）を、カルベニシリン２５μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地（SIGMA-ALDRICH社製）にて培養後、グリセロール を加えて最終的にグリセロール濃度を30%となるよう調整し、－80℃で保存することで各形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックとした。
１．３ 感染工程用形質転換アグロバクテリウムの調製
上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（GFP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックをＬＢ培地に植菌して、培養を行った。
培養後、遠心することで集菌し、得られた菌体をインフィルトレーションbuffer［5 mM MES、10 mM MgCl2、pH5.6］に懸濁して濃縮菌液を得た。得られた濃縮菌体をGFP-アグロバクテリウムとP19-アグロバクテリウムの１：１混合菌液のOD600が0.8となるように4 Lのインフィルトレーションbufferに加えて、pH5.6に調整し、感染工程用アグロバクテリウム菌液（GFP・P19共発現用）とした。
上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（GFP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックをＬＢ培地に植菌して、培養を行った。
培養後、遠心することで集菌し、得られた菌体をインフィルトレーションbuffer［5 mM MES、10 mM MgCl2、pH5.6］に懸濁して濃縮菌液を得た。得られた濃縮菌体をGFP-アグロバクテリウムとP19-アグロバクテリウムの１：１混合菌液のOD600が0.8となるように4 Lのインフィルトレーションbufferに加えて、pH5.6に調整し、感染工程用アグロバクテリウム菌液（GFP・P19共発現用）とした。
２．植物バイオマスの調製
２．１ 播種
播種用液体肥料(大塚ハウスS1号（大塚アグリテクノ株式会社）0.78g/L、大塚ハウス2号（大塚アグリテクノ株式会社）0.25g/L、pH5.0)を 水耕栽培用ウレタンマット（江松化成 W587.5mm×D282mm×H28mm：12×2マス 穴径φ9mm）にしみこませ、育苗トレー(W600mm×D300mm×H300mm)に収め、ベンサミアナタバコ（Nictiana benthamiana）種子を播種した。
２．１ 播種
播種用液体肥料(大塚ハウスS1号（大塚アグリテクノ株式会社）0.78g/L、大塚ハウス2号（大塚アグリテクノ株式会社）0.25g/L、pH5.0)を 水耕栽培用ウレタンマット（江松化成 W587.5mm×D282mm×H28mm：12×2マス 穴径φ9mm）にしみこませ、育苗トレー(W600mm×D300mm×H300mm)に収め、ベンサミアナタバコ（Nictiana benthamiana）種子を播種した。
２．２ 育苗
播種後の植物を人工気象器(NC-410HC) (日本医化器械製作所)にて室温２８℃、１６時間昼／８時間夜の光サイクルにて１２日間生育させた。
播種後の植物を人工気象器(NC-410HC) (日本医化器械製作所)にて室温２８℃、１６時間昼／８時間夜の光サイクルにて１２日間生育させた。
２．３ 栽培（前期）
２．２で育苗に用いたウレタンマットを1マスずつ分離し、栽培（前期）用パネル（W600mm×D300mm 30穴）に移植した。移植後の栽培（前期）用パネルを栽培装置にセットし、湛液方式（deep flow technique, DFT方式）にて９日間栽培した。環境条件および液体肥料条件は以下のとおりに制御した。
２．２で育苗に用いたウレタンマットを1マスずつ分離し、栽培（前期）用パネル（W600mm×D300mm 30穴）に移植した。移植後の栽培（前期）用パネルを栽培装置にセットし、湛液方式（deep flow technique, DFT方式）にて９日間栽培した。環境条件および液体肥料条件は以下のとおりに制御した。
《環境条件》
- 温度：28℃
- 相対湿度：60～80％
- CO2濃度：400ppm
- 照明：平均光合成光量子束密度(PPFD)：140μmol/m2・秒、24h連続照射、三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）
- 温度：28℃
- 相対湿度：60～80％
- CO2濃度：400ppm
- 照明：平均光合成光量子束密度(PPFD)：140μmol/m2・秒、24h連続照射、三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）
《液体肥料条件》
液体肥料は、肥料Ａ液（大塚ハウスＳ1号150g/L、大塚ハウス5号（大塚アグリテクノ株式会社）2.5 g/L）、肥料Ｂ液（大塚ハウス2号100g/L）をそれぞれ脱塩素水に溶解し、等量に混合して使用した。ｐＨ調整にはｐＨ調整剤ダウン（大塚アグリテクノ株式会社）および４％ＫＯＨ水溶液を用いた。液体肥料の電気伝導度（electrical conductivity, ＥＣ）およびpHは「らくらく肥料管理機3」（株式会社セムコーポレーション）を用いてＥＣ：２．３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．０になるように調整した。
液体肥料は、肥料Ａ液（大塚ハウスＳ1号150g/L、大塚ハウス5号（大塚アグリテクノ株式会社）2.5 g/L）、肥料Ｂ液（大塚ハウス2号100g/L）をそれぞれ脱塩素水に溶解し、等量に混合して使用した。ｐＨ調整にはｐＨ調整剤ダウン（大塚アグリテクノ株式会社）および４％ＫＯＨ水溶液を用いた。液体肥料の電気伝導度（electrical conductivity, ＥＣ）およびpHは「らくらく肥料管理機3」（株式会社セムコーポレーション）を用いてＥＣ：２．３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．０になるように調整した。
２．４ 栽培（後期）
栽培（前期）用パネルより植物体を取り出し、栽培（後期）用パネル（W600mm×D300mm 6穴）に定植した。移植後の栽培（後期）用パネルを栽培装置にセットし、DFT方式にて7日間（播種後28日間）栽培した。環境条件は以下のとおり制御し、照明は４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギー（分光放射照度：W/m2/nm）に対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが１００％になるように調整して植物に照射した。
液体肥料条件は、液体肥料条件のうち電気伝導度（EC）を４．０ｍＳ／ｃｍに変更したこと以外は、栽培（前期）と同様の条件に制御した。
栽培（前期）用パネルより植物体を取り出し、栽培（後期）用パネル（W600mm×D300mm 6穴）に定植した。移植後の栽培（後期）用パネルを栽培装置にセットし、DFT方式にて7日間（播種後28日間）栽培した。環境条件は以下のとおり制御し、照明は４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギー（分光放射照度：W/m2/nm）に対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが１００％になるように調整して植物に照射した。
液体肥料条件は、液体肥料条件のうち電気伝導度（EC）を４．０ｍＳ／ｃｍに変更したこと以外は、栽培（前期）と同様の条件に制御した。
《環境条件》
- 温度：30℃
- 相対湿度：60～80％
- CO2濃度：2000ｐｐｍ
- 照明：平均PPFD：140μmol/m2・秒、24ｈ連続照射、LED照明ユニット「３LHシリーズ」（株式会社日本医化器械製作所）
- 温度：30℃
- 相対湿度：60～80％
- CO2濃度：2000ｐｐｍ
- 照明：平均PPFD：140μmol/m2・秒、24ｈ連続照射、LED照明ユニット「３LHシリーズ」（株式会社日本医化器械製作所）
３．植物へのアグロバクテリウム感染及び植物の採集
３．１ Vacuum Infiltration（真空浸潤法）による感染
上記２．４で得られた播種後28日目のベンサミアナタバコを逆さにしてビーカー中のアグロバクテリウム菌液（上述の１．３で調製したもの）に全ての葉が完全に液中に浸るように沈めた。
その後、該ビーカーを真空デシケーター (FV-3P) (東京硝子器械株式会社) に入れ 19-40Torrに1分間静置し、減圧した。その後、バルブを一気に開放して復圧をおこなった。
復圧終了後、植物を正立に戻し、液体肥料(EC:2.1～2.2mS/cm、pH5.5)の入った丸型容器 (丸型V式容器V-6) (アズワン) に植えた。
３．１ Vacuum Infiltration（真空浸潤法）による感染
上記２．４で得られた播種後28日目のベンサミアナタバコを逆さにしてビーカー中のアグロバクテリウム菌液（上述の１．３で調製したもの）に全ての葉が完全に液中に浸るように沈めた。
その後、該ビーカーを真空デシケーター (FV-3P) (東京硝子器械株式会社) に入れ 19-40Torrに1分間静置し、減圧した。その後、バルブを一気に開放して復圧をおこなった。
復圧終了後、植物を正立に戻し、液体肥料(EC:2.1～2.2mS/cm、pH5.5)の入った丸型容器 (丸型V式容器V-6) (アズワン) に植えた。
３．２ 感染葉の栽培（発現工程）
感染後の栽培は人工気象器(LH-410SP) (日本医化器械製作所) を用いて行った。光源として、ＬＥＤ照明ユニット (3LH-256) (日本医化器械製作所) を用い、１６時間昼／８時間夜の光サイクルで、平均ＰＰＦＤ１５０μｍｏｌ／ｍ２・秒にて栽培した。温度は、２５℃昼／２０℃夜のサイクルとした。また、相対湿度は６０～８５％とした。
感染後の栽培は人工気象器(LH-410SP) (日本医化器械製作所) を用いて行った。光源として、ＬＥＤ照明ユニット (3LH-256) (日本医化器械製作所) を用い、１６時間昼／８時間夜の光サイクルで、平均ＰＰＦＤ１５０μｍｏｌ／ｍ２・秒にて栽培した。温度は、２５℃昼／２０℃夜のサイクルとした。また、相対湿度は６０～８５％とした。
３．３ 栽培された感染葉の採集
６日間かけて上述の栽培工程を行ったアグロバクテリウム感染ベンサミアナタバコは、葉柄を含めずに全ての葉を収穫し，－８０℃にて保管した。
６日間かけて上述の栽培工程を行ったアグロバクテリウム感染ベンサミアナタバコは、葉柄を含めずに全ての葉を収穫し，－８０℃にて保管した。
４．GFP発現量の測定
４．１ 粗抽出液の調製
３．３で凍結保存したGFP・P19共発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、サンプル新鮮重量の６倍量のＧＦＰアッセイ用抽出バッファー（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton-X100 (pH7.25)）を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液１ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のGFP定量に用いた。
４．１ 粗抽出液の調製
３．３で凍結保存したGFP・P19共発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、サンプル新鮮重量の６倍量のＧＦＰアッセイ用抽出バッファー（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton-X100 (pH7.25)）を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液１ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のGFP定量に用いた。
４．２ GFP定量
ＧＦＰ蛍光の検出にはWallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences) を用いて４８５ｎｍの励起光によって生じる５０７ｎｍの発光を検出した。定量には段階希釈したＧＦＰスタンダード (rAcGFP1 Protein：タカラバイオ社製) を用いた。測定サンプルはＧＦＰ用抽出バッファーで５倍希釈し、１００μＬずつ、９６－ｗｅｌｌ マイクロプレート (Nunc フルオロヌンクプレート：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製) に分注し、測定を行い、新鮮重当たりのＧＦＰ発現量（mg/kg-FW）、株当たりのＧＦＰ発現量（mg）を算出した。３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（下記比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
ＧＦＰ蛍光の検出にはWallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences) を用いて４８５ｎｍの励起光によって生じる５０７ｎｍの発光を検出した。定量には段階希釈したＧＦＰスタンダード (rAcGFP1 Protein：タカラバイオ社製) を用いた。測定サンプルはＧＦＰ用抽出バッファーで５倍希釈し、１００μＬずつ、９６－ｗｅｌｌ マイクロプレート (Nunc フルオロヌンクプレート：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製) に分注し、測定を行い、新鮮重当たりのＧＦＰ発現量（mg/kg-FW）、株当たりのＧＦＰ発現量（mg）を算出した。３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（下記比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
[実施例２～４]
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、８０％（実施例２）、６０％（実施例３）、５０％（実施例４）になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例１と同様に実験を行った。それぞれ３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、８０％（実施例２）、６０％（実施例３）、５０％（実施例４）になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例１と同様に実験を行った。それぞれ３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
[比較例１]
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例１と同様に実験を行った。３株の測定結果を平均し、この値を１００％として結果を表１に示した。
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例１と同様に実験を行った。３株の測定結果を平均し、この値を１００％として結果を表１に示した。
[比較例２]
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、３０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光（青色光：Ｂ）を加えることで植物に照射した以外は実施例１と同様に実験を行った。３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
実施例１で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、３０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光（青色光：Ｂ）を加えることで植物に照射した以外は実施例１と同様に実験を行った。３株の測定結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例１）を１００％とした場合の割合を表１に示した。
また、ＧＦＰ収率のグラフを図３に、栽培工程終了時の葉の重量を表２にそれぞれ示した。表１および２、並びに図３に示すように、栽培工程終了時の葉の重量が実施例および比較例のものは、ほぼ同じであったにもかかわらず、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（赤色光：Ｒ）の割合が５０％以上である実施例ではＧＦＰの収率が顕著に向上することが分かった。
[ニコチン含有量の検討]
実施例１（赤色光１００％）、および比較例１（蛍光灯）で栽培したベンサミアナタバコについて、それぞれ、葉4.5gからアセトニトリル30mLで抽出を行った。これを水で5倍希釈して限外ろ過を行なった。ニコチンとアナバシンは分子式が同じであり(C10H14N2, MW162.12)、エレクトロスプレーイオン化ではm/z163（＝[M+H]+）を生成する。これをMS/MS分析すると、構造の似通ったニコチンとアナバシンは同じプロダクトイオン(m/z163→130,117,80等)を生成する。従って、SRM （m/z163/117）によりニコチンとアナバシンを選択的に検出することができる。タバコ葉の抽出ろ液についてLC/MS/MS分析（SRM、m/z163/117）した結果、図４に示すように、アナバシンとニコチンに相当する２つのピークを6.6分と6.8分に検出できた。ニコチンに相当する6.8分のピーク強度は、実施例１（図４右）では6.6 e4cps.(n数2の平均値)、比較例１（図４左）では7.6 e4 cps.(n数2の平均値)となった。また、6.6分のアナバシンに相当するピークは同等であることもわかった。
以上より、実施例１で栽培したベンサミアナタバコのニコチン含有量が、比較例１（蛍光灯）の場合に比べ、10%程度減少したことが判明した。
実施例１（赤色光１００％）、および比較例１（蛍光灯）で栽培したベンサミアナタバコについて、それぞれ、葉4.5gからアセトニトリル30mLで抽出を行った。これを水で5倍希釈して限外ろ過を行なった。ニコチンとアナバシンは分子式が同じであり(C10H14N2, MW162.12)、エレクトロスプレーイオン化ではm/z163（＝[M+H]+）を生成する。これをMS/MS分析すると、構造の似通ったニコチンとアナバシンは同じプロダクトイオン(m/z163→130,117,80等)を生成する。従って、SRM （m/z163/117）によりニコチンとアナバシンを選択的に検出することができる。タバコ葉の抽出ろ液についてLC/MS/MS分析（SRM、m/z163/117）した結果、図４に示すように、アナバシンとニコチンに相当する２つのピークを6.6分と6.8分に検出できた。ニコチンに相当する6.8分のピーク強度は、実施例１（図４右）では6.6 e4cps.(n数2の平均値)、比較例１（図４左）では7.6 e4 cps.(n数2の平均値)となった。また、6.6分のアナバシンに相当するピークは同等であることもわかった。
以上より、実施例１で栽培したベンサミアナタバコのニコチン含有量が、比較例１（蛍光灯）の場合に比べ、10%程度減少したことが判明した。
[実施例５]
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
医療用酵素であり、ゴーシェ病の治療薬として使われる加水分解酵素であるグルコセレブロシダーゼ (GBA1)の発現を検討した。GBA1発現検討には、実施例１で用いたp19/MM444と以下の発現プラスミドの２種類を用いた。
実施例１で用いたp19/MM444のP19発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、P19遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のうち、ヒマノカタラーゼ遺伝子の第一イントロンとP19遺伝子の領域をGBA1遺伝子に置換することで、ヒト由来のGBA1遺伝子発現プラスミドを作製した(以下、このプラスミドを「pGBA1/MM444」と称する。その構造を図５に示す)
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
医療用酵素であり、ゴーシェ病の治療薬として使われる加水分解酵素であるグルコセレブロシダーゼ (GBA1)の発現を検討した。GBA1発現検討には、実施例１で用いたp19/MM444と以下の発現プラスミドの２種類を用いた。
実施例１で用いたp19/MM444のP19発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、P19遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のうち、ヒマノカタラーゼ遺伝子の第一イントロンとP19遺伝子の領域をGBA1遺伝子に置換することで、ヒト由来のGBA1遺伝子発現プラスミドを作製した(以下、このプラスミドを「pGBA1/MM444」と称する。その構造を図５に示す)
P19遺伝子はGBA1遺伝子の発現を強化する働きがあるため、p19/MM444をpGBA1/MM444との共発現に供した。
１．２ アグロバクテリウムの形質転換と形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックの調製
pGFP／MM444の代わりに上述のプラスミドpGBA1／MM444を用いたこと以外は、実施例１の１．２と同様にして形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックを作成した。得られた形質転換アグロバクテリウムは、それぞれ、GBA1-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する。
pGFP／MM444の代わりに上述のプラスミドpGBA1／MM444を用いたこと以外は、実施例１の１．２と同様にして形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックを作成した。得られた形質転換アグロバクテリウムは、それぞれ、GBA1-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する。
１．３ 感染工程用形質転換アグロバクテリウムの調製
GFP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウムの代わりに、上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（GBA1-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックを用いたこと以外は、実施例１の１．３と同様にして感染工程用アグロバクテリウム菌液（GBA1・P19共発現用）を得た。
また、P19-アグロバクテリウムの濃縮菌体を、OD600が0.4になるように4Lのインフィルトレーションbufferに加えて、pH5.6に調整したこと以外は、実施例１の１．３と同様にして、感染工程用アグロバクテリウム菌液（P19発現用）を得た。
GFP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウムの代わりに、上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（GBA1-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックを用いたこと以外は、実施例１の１．３と同様にして感染工程用アグロバクテリウム菌液（GBA1・P19共発現用）を得た。
また、P19-アグロバクテリウムの濃縮菌体を、OD600が0.4になるように4Lのインフィルトレーションbufferに加えて、pH5.6に調整したこと以外は、実施例１の１．３と同様にして、感染工程用アグロバクテリウム菌液（P19発現用）を得た。
２．植物バイオマスの調製
実施例１の２．１～２．４と同様にして、ベンサミアナタバコの播種～栽培を実施した。
実施例１の２．１～２．４と同様にして、ベンサミアナタバコの播種～栽培を実施した。
３．植物へのアグロバクテリウム感染及び植物の採集
上記１．３で得られた感染工程用アグロバクテリウム菌液（GBA1・P19共発現用）、および感染工程用アグロバクテリウム菌液（P19発現用）のそれぞれを用いたこと以外は、実施例１の３．１～３．３と同様にして、アグロバクテリウム感染～感染葉の採集を実施した。
上記１．３で得られた感染工程用アグロバクテリウム菌液（GBA1・P19共発現用）、および感染工程用アグロバクテリウム菌液（P19発現用）のそれぞれを用いたこと以外は、実施例１の３．１～３．３と同様にして、アグロバクテリウム感染～感染葉の採集を実施した。
４．GBA1発現量の測定
４．１ 粗抽出液の調製
上記３で凍結保存したGBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉、あるいは、P19発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、それぞれについて、サンプル新鮮重量の２倍量のGBA1抽出用バッファー [20mM Tris-HCl (pH7.2), 20mM EDTA, 20mM L-アスコルビン酸, 1% Triton X-100, １錠/50ml コンプリート プロテアーゼインヒビター EDTA-free（ロシュ）]を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のGBA1酵素活性測定に用いた。
これら粗抽出液中の全可溶性タンパク質濃度は、Bio-Rad社Protein assayを用いたBradford法により、牛血清アルブミン (BSA) を標準タンパク質として測定した。
４．１ 粗抽出液の調製
上記３で凍結保存したGBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉、あるいは、P19発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、それぞれについて、サンプル新鮮重量の２倍量のGBA1抽出用バッファー [20mM Tris-HCl (pH7.2), 20mM EDTA, 20mM L-アスコルビン酸, 1% Triton X-100, １錠/50ml コンプリート プロテアーゼインヒビター EDTA-free（ロシュ）]を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のGBA1酵素活性測定に用いた。
これら粗抽出液中の全可溶性タンパク質濃度は、Bio-Rad社Protein assayを用いたBradford法により、牛血清アルブミン (BSA) を標準タンパク質として測定した。
４．２ GBA1酵素活性測定
GBA1の発現量を確認するためにGBA1の酵素活性を測定した。GBA1酵素活性測定は以下のように行った。
396μlの反応バッファー [60mM リン酸/クエン酸塩緩衝液（pH 5.5）, 0.15% Triton X-100, 0.4% タウロコール酸ナトリウム, 4mM p-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシド] に、4μlの上記４．１で得た粗抽出液を添加して、撹拌後、37℃で2時間反応させた。反応後、100μlの0.1M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールを添加し、反応を停止させた。
GBA1酵素活性により生成するp-ニトロフェノール量を定量するため、Wallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences) を用いて、405nmの吸光値を測定した。なお、定量スタンダードには、0.2%(w/v) p-ニトロフェノール溶液（和光純薬）を段階希釈したものを用いた。
各サンプルについて、４．１で測定した全可溶性タンパク質量当たりの反応生成物量（μmol/g-TSP）を算出した。P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1の反応生成物量とした。GBA1の反応生成物量はGBA1の発現量と相関するため、該反応生成物量をGBA1発現量と仮定して、以下実施例６、比較例３との比較を行った。
三波長蛍光灯の値（下記比較例３）を１００％とした場合の割合を表３に示した。
GBA1の発現量を確認するためにGBA1の酵素活性を測定した。GBA1酵素活性測定は以下のように行った。
396μlの反応バッファー [60mM リン酸/クエン酸塩緩衝液（pH 5.5）, 0.15% Triton X-100, 0.4% タウロコール酸ナトリウム, 4mM p-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシド] に、4μlの上記４．１で得た粗抽出液を添加して、撹拌後、37℃で2時間反応させた。反応後、100μlの0.1M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールを添加し、反応を停止させた。
GBA1酵素活性により生成するp-ニトロフェノール量を定量するため、Wallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences) を用いて、405nmの吸光値を測定した。なお、定量スタンダードには、0.2%(w/v) p-ニトロフェノール溶液（和光純薬）を段階希釈したものを用いた。
各サンプルについて、４．１で測定した全可溶性タンパク質量当たりの反応生成物量（μmol/g-TSP）を算出した。P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1の反応生成物量とした。GBA1の反応生成物量はGBA1の発現量と相関するため、該反応生成物量をGBA1発現量と仮定して、以下実施例６、比較例３との比較を行った。
三波長蛍光灯の値（下記比較例３）を１００％とした場合の割合を表３に示した。
[実施例６]
実施例５で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、５０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例５と同様に実験を行った。
P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1の反応生成物量とした。
三波長蛍光灯の値（比較例３）を１００％とした場合の割合を表３に示した。
実施例５で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、５０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例５と同様に実験を行った。
P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1の反応生成物量とした。
三波長蛍光灯の値（比較例３）を１００％とした場合の割合を表３に示した。
[比較例３]
実施例５で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例５と同様に実験を行った。P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1反応生成物量とした。この値を１００％として結果を表３に示した。
実施例５で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例５と同様に実験を行った。P19発現アグロバクテリウム感染葉における3株の定量結果の平均値をベンサミアナタバコの内在酵素(グルコシダーゼ)によるバックグラウンドとした。一方、GBA1・P19共発現アグロバクテリウム感染葉における４株の定量結果を平均した後、前記内在酵素によるバックグラウンドの値を引いて、GBA1反応生成物量とした。この値を１００％として結果を表３に示した。
表３に示される通り、栽培工程における６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（赤色光：Ｒ）の割合が５０％以上である実施例５、６では、栽培工程で蛍光灯を用いた比較例３に比べて、ＧＢＡ１の発現が２倍以上向上し、ＧＢＡ１の収率が顕著に向上することが分かった。
[実施例７]
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
Norwalk virus capsid protein（NVCP）発現の検討には、実施例１で用いたp19/MM444と以下の発現プラスミドの２種類を用いた。
実施例１で用いたp19/MM444のP19発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、P19遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のうち、ヒマノカタラーゼ遺伝子の第一イントロンとP19遺伝子の領域をNVCP遺伝子に置換することで、Norwalk virus由来のNVCP遺伝子発現プラスミドを作製した(以下、このプラスミドを「pNVCP/MM444」と称する。その構造を図６に示す)
１．形質転換アグロバクテリウムの調製
１．１ 発現プラスミド
Norwalk virus capsid protein（NVCP）発現の検討には、実施例１で用いたp19/MM444と以下の発現プラスミドの２種類を用いた。
実施例１で用いたp19/MM444のP19発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、P19遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のうち、ヒマノカタラーゼ遺伝子の第一イントロンとP19遺伝子の領域をNVCP遺伝子に置換することで、Norwalk virus由来のNVCP遺伝子発現プラスミドを作製した(以下、このプラスミドを「pNVCP/MM444」と称する。その構造を図６に示す)
P19遺伝子はNVCP遺伝子の発現を強化する働きがあるため、p19/MM444をpNVCP/MM444との共発現に供した。
１．２ アグロバクテリウムの形質転換と形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックの調製
pGFP／MM444の代わりに上述のプラスミドpNVCP／MM444を用いたこと以外は、実施例１の１．２と同様にして形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックを作成した。得られた形質転換アグロバクテリウムは、それぞれ、NVCP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する。
pGFP／MM444の代わりに上述のプラスミドpNVCP／MM444を用いたこと以外は、実施例１の１．２と同様にして形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックを作成した。得られた形質転換アグロバクテリウムは、それぞれ、NVCP-アグロバクテリウム、P19-アグロバクテリウムと称する。
１．３ 感染工程用形質転換アグロバクテリウムの調製
GFP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウムの代わりに、上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（NVCP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックを用いたこと以外は、実施例１の１．３と同様にして感染工程用アグロバクテリウム菌液（NVCP・P19共発現用）を得た。
GFP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウムの代わりに、上記１．２で作成した形質転換アグロバクテリウム（NVCP-アグロバクテリウムおよびP19-アグロバクテリウム）のグリセロールストックを用いたこと以外は、実施例１の１．３と同様にして感染工程用アグロバクテリウム菌液（NVCP・P19共発現用）を得た。
２．植物バイオマスの調製
実施例１の２．１～２．４と同様にして、ベンサミアナタバコの播種～栽培を実施した。
実施例１の２．１～２．４と同様にして、ベンサミアナタバコの播種～栽培を実施した。
３．植物へのアグロバクテリウム感染及び植物の採集
上記１．３で得られたアグロバクテリウム菌液（NVCP・P19共発現用）を用いたこと以外は、実施例１の３．１～３．３と同様にして、アグロバクテリウム感染～感染葉の採集を実施した。
上記１．３で得られたアグロバクテリウム菌液（NVCP・P19共発現用）を用いたこと以外は、実施例１の３．１～３．３と同様にして、アグロバクテリウム感染～感染葉の採集を実施した。
４．NVCP発現量の測定
４．１ 粗抽出液の調製
上記３で凍結保存したNVCP・P19共発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、サンプル新鮮重量の２倍量のNVCP抽出用バッファー [25mM Tris-HCl(pH6.6), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.4μg/ml ピロ亜硫酸ナトリウム, 0.1% Triton X-100, １錠/50ml コンプリート プロテアーゼインヒビター EDTA-free（ロシュ）] を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のウエスタンブロット法によるNVCP定量に供試した。
これら粗抽出液中の全可溶性タンパク質濃度は、Bio-Rad社Protein assayを用いたBradford法により、牛血清アルブミン (BSA) を標準タンパク質として測定した。
４．１ 粗抽出液の調製
上記３で凍結保存したNVCP・P19共発現アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、サンプル新鮮重量の２倍量のNVCP抽出用バッファー [25mM Tris-HCl(pH6.6), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.4μg/ml ピロ亜硫酸ナトリウム, 0.1% Triton X-100, １錠/50ml コンプリート プロテアーゼインヒビター EDTA-free（ロシュ）] を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のウエスタンブロット法によるNVCP定量に供試した。
これら粗抽出液中の全可溶性タンパク質濃度は、Bio-Rad社Protein assayを用いたBradford法により、牛血清アルブミン (BSA) を標準タンパク質として測定した。
４．２ NVCP定量
NVCP定量は以下のようにウエスタンブロット法により行った。
PBSで20倍希釈した上記粗抽出液に、等量のＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 350mM DTT, 25% グリセロール, 0.01% BPB）を加え、95℃, 5分間、熱変性処理を行い、電気泳動用サンプルを調製した。10μlの電気泳動用サンプルをMini-PROTEAN TGX Gel（10%, 15-well comb, BIO-RAD）のサンプルウェルにアプライし、200V定電圧で35分間、電気泳動を行った。泳動後のゲルをTrans-Blot Turbo Transfer Pack（Mini format 0.2μm PVDF, BIO-RAD）に挟み込み、Trans-Blot Turbo Transfer System（BIO-RAD）にセットして、25Ｖ定電圧で7分間、膜転写を行った。
転写後のPVDF膜を1.25μg/mlの抗ノロウイルスGI.1マウスモノクローナル抗体[P2B2]（Abcam）と室温で1時間反応させ、TBS-Tで洗浄後、0.13μg/mlの抗マウスIgG(H+L), AP Conjugate（Promega）と室温で1時間反応させた。検出試薬には、Western Lightning CDP-Star Chemiluminescence Reagent（Perkin-Elmer）を用い、シグナルの撮影ならびに定量解析には、ImageQuant LAS500, ImageQuant TL software （GE Healthcare）をそれぞれ使用した。
各サンプルについて、４．１で測定した全可溶性タンパク質量当たりのNVCP相対値を算出した。４株の定量結果を平均し、三波長蛍光灯の値（下記比較例４）を１００％とした場合の割合を表４に示した。
NVCP定量は以下のようにウエスタンブロット法により行った。
PBSで20倍希釈した上記粗抽出液に、等量のＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 350mM DTT, 25% グリセロール, 0.01% BPB）を加え、95℃, 5分間、熱変性処理を行い、電気泳動用サンプルを調製した。10μlの電気泳動用サンプルをMini-PROTEAN TGX Gel（10%, 15-well comb, BIO-RAD）のサンプルウェルにアプライし、200V定電圧で35分間、電気泳動を行った。泳動後のゲルをTrans-Blot Turbo Transfer Pack（Mini format 0.2μm PVDF, BIO-RAD）に挟み込み、Trans-Blot Turbo Transfer System（BIO-RAD）にセットして、25Ｖ定電圧で7分間、膜転写を行った。
転写後のPVDF膜を1.25μg/mlの抗ノロウイルスGI.1マウスモノクローナル抗体[P2B2]（Abcam）と室温で1時間反応させ、TBS-Tで洗浄後、0.13μg/mlの抗マウスIgG(H+L), AP Conjugate（Promega）と室温で1時間反応させた。検出試薬には、Western Lightning CDP-Star Chemiluminescence Reagent（Perkin-Elmer）を用い、シグナルの撮影ならびに定量解析には、ImageQuant LAS500, ImageQuant TL software （GE Healthcare）をそれぞれ使用した。
各サンプルについて、４．１で測定した全可溶性タンパク質量当たりのNVCP相対値を算出した。４株の定量結果を平均し、三波長蛍光灯の値（下記比較例４）を１００％とした場合の割合を表４に示した。
[実施例８]
実施例７で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、５０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例７と同様に実験を行った。
４株の定量結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例４）を１００％とした場合の割合を表４に示した。
実施例７で、２．４栽培（後期）において、照明の４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対する６００～７００ｎｍの波長の光エネルギーが、５０％になるように設定して、それ以外は４００～５００ｎｍの波長の光を加えることで植物に照射した以外は実施例７と同様に実験を行った。
４株の定量結果を平均し、三波長蛍光灯の値（比較例４）を１００％とした場合の割合を表４に示した。
[比較例４]
実施例７で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例７と同様に実験を行った。４株の定量結果を平均し、この値を１００％として結果を表４に示した。
実施例７で、２．４栽培（後期）において、照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は実施例７と同様に実験を行った。４株の定量結果を平均し、この値を１００％として結果を表４に示した。
表４に示される通り、栽培工程における６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光（赤色光：Ｒ）の割合が５０％以上である実施例７、８では、栽培工程で蛍光灯を用いた比較例４に比べて、NVCPの発現が１．２～１．７倍に向上し、NVCPの収率が顕著に向上することが分かった。
[参考例１、２]
実施例１の２．４栽培(後期)において、照明（LED照明ユニット「3LHシリーズ」）のＰＰＦＤを４０μmol/m2・秒にして、４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギー（分光放射照度：W/m2/nm）に対する４００～５００ｎｍの波長の光エネルギーが４２％、５０１～６００ｎｍの波長の光エネルギーが２０％、６０１～７００ｎｍの波長の光エネルギーが３８％になるように調整し、加えて波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）を照射したこと以外は、実施例１と同様にして栽培を実施し、植物バイオマスの調整を行った。波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）における光エネルギーと、波長６０１～７００ｎｍの赤色光（Ｒ）における光エネルギーとの割合（ＦＲ／Ｒ）は、それぞれ１(参考例１)または０(参考例２)になるように設定した。栽培終了時にウレタンの上面から植物の生長点までの長さを草丈(cm)として測定した。
さらに、実施例１の３．２ 感染葉の栽培（発現工程）において、照明のＰＰＦＤを１００μｍｏｌ／ｍ２・秒にて栽培したこと以外は、実施例１と同様にして植物へのアグロバクテリウム感染及び植物の採集を行った。
それ以外の工程については、実施例１と同様に実験を行った。
それぞれ４株の測定結果を平均し、草丈と三波長蛍光灯の値（比較例５）を１００％とした場合のＧＦＰ収率を表５に示した。
実施例１の２．４栽培(後期)において、照明（LED照明ユニット「3LHシリーズ」）のＰＰＦＤを４０μmol/m2・秒にして、４００～８００ｎｍの波長領域の光エネルギー（分光放射照度：W/m2/nm）に対する４００～５００ｎｍの波長の光エネルギーが４２％、５０１～６００ｎｍの波長の光エネルギーが２０％、６０１～７００ｎｍの波長の光エネルギーが３８％になるように調整し、加えて波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）を照射したこと以外は、実施例１と同様にして栽培を実施し、植物バイオマスの調整を行った。波長７０１～８００ｎｍの遠赤光（ＦＲ）における光エネルギーと、波長６０１～７００ｎｍの赤色光（Ｒ）における光エネルギーとの割合（ＦＲ／Ｒ）は、それぞれ１(参考例１)または０(参考例２)になるように設定した。栽培終了時にウレタンの上面から植物の生長点までの長さを草丈(cm)として測定した。
さらに、実施例１の３．２ 感染葉の栽培（発現工程）において、照明のＰＰＦＤを１００μｍｏｌ／ｍ２・秒にて栽培したこと以外は、実施例１と同様にして植物へのアグロバクテリウム感染及び植物の採集を行った。
それ以外の工程については、実施例１と同様に実験を行った。
それぞれ４株の測定結果を平均し、草丈と三波長蛍光灯の値（比較例５）を１００％とした場合のＧＦＰ収率を表５に示した。
[比較例５]
参考例で２．４栽培(後期)における照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は参考例１～２と同様に実験を行った。４株の測定結果を平均し、GFP収率はこの値を１００％として結果を表５に示した。
参考例で２．４栽培(後期)における照明が三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）であること以外は参考例１～２と同様に実験を行った。４株の測定結果を平均し、GFP収率はこの値を１００％として結果を表５に示した。
表５に示される通り、栽培工程において７０１～８００ｎｍの波長領域の光（遠赤光：ＦＲ）を照射すると草丈が高くなる傾向があり、ＦＲ／Ｒが１以上の参考例１では、顕著に草丈が高くなり、植物の地上部における葉の割合が低くなった。それにより、植物１株当たりの葉の収穫量が減ったり、茎の割合が増えて精製負荷が向上すると考えられる。また、高さ方向に多段で栽培するような植物工場での栽培には不向きであることが分かった。
Claims (8)
- 植物を用いて有用タンパク質を製造する方法であって、
前記植物を栽培する工程、
前記栽培工程後の植物に、有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程、及び、
前記感染工程後の植物に有用タンパク質を発現させる工程を含み、
前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを５０％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、有用タンパク質を製造する方法。 - 前記栽培工程の少なくとも一部において、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長領域の光エネルギーに対して、６００ｎｍ～７００ｎｍの波長領域の光エネルギーを７５％以上の割合で含む照射条件下で前記植物を栽培することを特徴とする、請求項１に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 前記発現工程の後に前記有用タンパク質を精製し回収する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 前記有用タンパク質が、医療用タンパク質であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 前記植物が、ベンサミアナタバコであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 前記栽培工程において、前記植物を閉鎖型植物工場内で栽培することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 前記栽培工程において、光エネルギーの光源としてＬＥＤを用いることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の有用タンパク質を製造する方法。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で製造されることを特徴とする酵素又はウイルス様粒子。
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| KR910007612B1 (ko) | 1990-01-10 | 1991-09-28 | 한국과학기술연구원 | 사람 인슈린 단백질을 생산하는 담배 및 그의 제조방법 |
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- 2014-09-05 JP JP2015535526A patent/JP6358257B2/ja active Active
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- 2016-03-04 US US15/061,466 patent/US10125370B2/en active Active
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