CN1064893A - 水解角蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水解角蛋白的方法,在该方法中(a)
用含有亚硫酸根离子的水溶液处理固态角蛋白成分
以生成变性的角蛋白,(b)用蛋白酶水解生成角蛋白
水解液。在约60-100℃时进行预处理,并持续约
10分钟到4小时。由此获得的水解液经进一步处理
后可用作饲料添加剂或产生用于化妆品的寡聚肽。
Description
本发明涉及水解角蛋白的方法,该方法包括将固态角蛋白物质在含有亚硫酸根离子的水溶液中进行预处理以形成变性的角蛋白,并用蛋白酶进行水解以形成角蛋白水解物。本发明中所述的含有角蛋白的物质是指羽毛,头发,羊毛,鬃毛、马鬃、触须,分趾蹄,和蹄。从工业意义上说,这些物质中的大多数,如羽毛和头发,其本身几乎是没有利用价值的,并且虽然在自然界中它们也可被分解,但如果这样大批量地浪费也是一个问题。
利用本发明的方法,可将角蛋白水解成动物能够利用的水解产物,水解产物中富含用作饲料的蛋白。
利用水解物可以生产给定长度的寡聚肽,它可以用作化妆品成分尤其是用于处理和清洗皮肤和头发。
人们知道,如果用物理方法进行处理,就是说,加热,例如在146℃,345kpa压力下加热30到70分钟可以促进含有角蛋白的副产品,如羽毛和头发的水解和软化。这个被称为变性的过程可引起角蛋白结构的变化,使提供给角蛋白化学性持久结构的硫桥键打开,靠酶(包括动物的消化酶)的作用可将已变性的角蛋白水解成可利用的更小的成分即肽。
该分法的弊端是部分损毁了某些氨基酸并产生了人造氨基酸如:羊毛硫氨酸,从而降低了所制造的产品的质量。
另一方面,本领域内技术人员熟知利用化学处理也可以打开硫桥键并且将蛋白质切成小的成分就是说,切割成肽。在≤2.0~4.0pH,沸点温度时处理角蛋白2~20小时可打开角蛋白的硫桥键并将蛋白质分解成多肽,寡聚肽,甚至游离氨基酸。
同样地,在强碱性范围,沸点温度或更高温度时处理2小时以上产生如上所述的同样结果。
化学处理的弊端是部分或甚至全部损毁某些氨基酸并且在水解物中产生极不均匀大小的肽。化学水解,尤其是在碱性条件下,产生可能是具有毒副作用的人造氨基酸,羊毛硫氨酸和赖氨基丙氨酸(Lysinoalanine)。
借助在温和条件下进行的角蛋白的酶促水解和必要的预处理两种方法,可获得上面描述的方法所没有的许多优点。
酶促水解要求变性的角蛋白,就是说,天然角蛋白经过这种处理其中所有或只有一部分硫桥打开,从而使蛋白水解酶或角蛋白水解酶能水解角蛋白中的肽键并将它分解成肽。
预处理即变性可以用上文中描述的物理方法即热处理,或在酸性或碱性条件下的化学方法进行,或者是在更温和条件下采用与水解相结合的其他化学方法。
在德国专利NO.2705669中描述的角蛋白酶促水解反应例子中,在水溶性混合物中处理头发和羊毛,其量约为于物质的7%,变性作用是在1.5到2.0pH,在≥80℃下至少进行4小时。然后用水洗涤含有角蛋白的物质即毛发和羊毛。
在另一个德国专利NO.3305305中,变性过程使用氧化亚硫酸分解法,其中角蛋白的胱氨酸与亚硫酸盐形成角蛋白半胱氨酸磺酸盐以及角蛋白半胱氨酸。在亚硫酸和硫代硫酸盐,例如四硫代硫酸盐存在下,上述产生的角蛋白半胱氨酸被氧化成角蛋白半胱氨酸磺酸盐。总反应如下:
Bailey &-Cole在出版物J-Biol。Chem.234,17133-1739,1959中也提供了同样的反应。正如上述专利所公开,预处理按如下方式进行:在3.5升水中用约27%NaHSO3和约24%Na2S4O6;PH=9以及约40℃条件下处理经切割过的100g羊毛(其浓度低于3%)。处理时间是15小时。处理后用足够的水洗涤羊毛。
在温和条件下实际水解反应是在变性以及用蛋白酶冲洗后进行的。
按照德国专利NO.2705669的公开进行的水解过程,方法如下。将经过预处理的含有角蛋白的物质即毛发或羊毛混合到95升水中的混合物中(浓度约7%)。温度维持在50~55℃,pH维持在9.5。搅拌混合物。将一定量的尿素及硫酸铵加入到该混合物中。用氨水控制pH。水解时间为10到20小时。至于酶,可用芽孢杆菌蛋白酶。在完全水解后立即将混合物加热到95℃以便破坏酶活性。过滤水解产物,将溶液干燥。水解产物的平均分子量是1000到3000。
将按照德国专利NO.3305305中公开的水解过程进行预处理的头发在3升酶溶液中混合,(浓度3.4%)。用氨磺调节pH到9,将温度维持于40℃。至于酶,可用商品蛋白酶。始终不停地搅拌混合物。水解反应时间是3小时。在水解进行完全后,过滤水解产物,并分离得到的成分。将滤液冻干(冷冻干燥)。水解产物中大部分肽的分子量在1100到7500范围内。
长期以来人们把含有角蛋白的副产品如羽毛,头发,鬃毛,马鬃,触须,分趾蹄以及蹄看作是几乎没有利用价值的或者是难于处理的废物。现已发现角蛋白的氨基酸成分是有用的,尤其是含硫的氨基酸可用于提高动物饲料蛋白的营养以及增加饲料的种类。另一方面,角蛋白含有的氨基酸相同于人的皮肤和头发中的氨基酸组成,因为它们至少部分由角蛋白组成。因此,角蛋白水解产物是一种用于清洗头发和皮肤的合适的和有利的化妆品成分。由此产生的一个问题是怎样将角蛋白水解为合适长度水溶性的或部分水溶性的多聚或寡聚肽,在这些肽中原始氨基酸组成没有变化,并且可以在动物的消化道中消化,另一方面,这些肽适用于化妆品工业生产。
在研究生产所需的水解产物这一论题以及我们的尝试中,我们发现了在上面所提到的专利中存在某些没有解决的问题,在申请人已知的其它文件中也没有解决这些问题。令人惊奇的是,我们已发现可在排除有害的浪费和散发的情况下较经济地解决这些严重的问题,例如在预处理和水解阶段的水溶液混合物中存在少量含有角蛋白的物质,在水解后以及处理结束后的产品中的高盐含量,在酸性条件下最后加热后释放出二氧化硫(SO2),以及从足够浓度的水解中直接获得的特定大小的多聚和寡聚肽。
因此本发明的主要特征如权利要求1的特征部分的内容所阐述。因而我们明白如果温度提高到60℃,可以在不产生不利的副作用的情况下加速亚硫酸盐的水解。那么可使预处理时间从四小时以上缩短至低于1小时。
正如本发明所述,酶促角蛋白水解的第一部分,即:角蛋白的变性,也就是说,打开硫桥,是用化学方法进行的。将含有角蛋白的物质如羽毛和头发在合适的切割机中切割成3至6mm时是最成功的。将经过切割的材料在反应器中尽可能地与水混合。优选的是该混合物中经切割物质的干物质含量占约5~15%。将亚硫酸盐例如以Na2SO3的形式加入混合物中得到亚硫酸盐水解物。亚硫酸盐含量可在干物质的5~25%范围内变化并且主要依赖于需要水解的程度,以及所用的处理温度和时间而定。加入一种约为干物质的0~20%的潜在的氧化物例如氯化铜,优选的是硫代硫酸盐,以进行氧化亚硫酸盐水解,改变由酶处理产生的水解程度。根据一个实施例,混合物的pH调节在6-9范围内,较好的是6.5到8.0范围。在制备饲料时用NaOH,较好的是用KOH和/或H2SO4调节pH。温度调至60~100℃,处理时间从10分钟到4小时,优选的是10~60分钟。百分数以w/w计。
第二阶级包括实际的酶处理即水解步骤。由于羽毛或头发不需要清洗该步骤可在预处理使用的同一反应器中完成。如果干物质含量合适,可在预处理后直接开始水解。连续搅拌该混合物。优选的是将pH控制在6~8.5范围。根据所用的酶将温度按排在55~80℃。对于酶可利用一种蛋白酶或几种蛋白酶的混和物,其最适pH值是中性或弱碱性,并且尽可能地具有抗热性。合适的酶是由细菌(如:芽孢杆菌),霉菌(如曲霉)以及植物和动物产生的由不同制造商提供的商品中性和碱性蛋白酶,或其他合适的蛋白水解酶。除了上面的要求外选择一种酶或一种酶混合物还需考虑最后产品的肽链长度。配制的酶的量主要依靠所需要的活性大小而定。活性量主要是由反应物量所需水解时间而定。所需要的水解时间越短,反应物浓度越大则所需活性量越大。
在预处理级段后,紧接着进行水解得到的最后产品即水解产物中含有的干物质的量很少以至于没有许多用处,因而必须浓缩。达到这个目的最好的办法是按照多次分批的原则在水解反应进行过程中直接加入经过预处理和经过过滤的羽毛。加入次数可以是1-3次。由于预处理后,羽毛和头发的混合物容易搅拌,因而一次加入一批是可行的。后面追加的羽毛批量的处理较好的是在过滤前面批量的羽毛的滤液中进行。因此,由于在处理时不是所有的反应物都被耗尽,在下一步的处理中仅加入所要求的反应物量中失去的部分即可,例如Na2SO3和Na2S4O6。这种方法是较为可取的,因为该实验中最后产品中的盐含量少,只占干物质的3~8%,而一次性投料的水解产物中盐占10~15%,并且在加热处理最后产品时酸中产生的SO2量也很低。将其余批量的投料延后加入还可以提高水解过程中混合物的流动性和可搅拌性。按照这种方法,可使最后产品中获得15~25%的干物质含量。
如果已知酶活性量以及其它因素,则根据所需要的水解程度即可确定水解时间。已证明最合适的水解时间是4至8小时。由于仅在第一批投料时加入全部“计算出”的酶的量,而在其他批量投料时只需加入前面量的一半,因而多次投料的水解法可以强化酶的使用。
水解后,根据从该混合物中减少的亚硫酸盐的量的多少以及预期转变为角蛋白半胱氨酸(角蛋白-S-)的角蛋白半胱氨酸磺酸盐(角蛋白-S-SO-3)的量的多少,从水解速率确定水解液用H2SO4调节的pH为2~5pH。确定pH后,将混合物加热到70-100℃,加热15~45分钟,以便释放SO2。最优选的是,SO2的释放在预处理反应器中进行,使SO2转变成Na2SO3,它可用于下面的预处理步骤。
加热用作动物饲料的水解液,最好是将pH调节2.5~4.5并将它与饲料混合。从而使水解液溶于胃蛋白酶-盐酸,测定溶解的/总蛋白的量为80~85%。在多次分批投料试验的水解液中盐(Na2SO4)的含量是干物质的3~8%,干物质的含量为15~25%,而在一次性投料的水解液中盐的含量是干物质的10~15%,干物质的含量5~10%。
如果用一定大小的寡聚肽制备角蛋白水解液,下面的方法很适合即将刚进行水解或处理完的水解液的pH调至7到9加热水解液至80-90℃一段时间,然后冷却。在这段时间里,在低pH值时沉淀的蛋白质又重新溶解。然后过滤掉固体部分。将滤液进行微过滤,因此得到无菌的滤液。根据测定所需要的肽的大小,选择超过滤膜片的分离度。如一个例子,用10,000分离度的滤膜将无菌滤液进行超过滤。在该例子中,渗透液含有小于10,000道尔顿的肽。由此获得的渗透液又可通过一个膜片进行超滤。由此获得角蛋白水解液,其中肽的大小是1,000到10,000,同时也将水解液浓缩到预期的浓度。浓缩过程的同时,也洗掉了低于1000道尔顿的肽以及其他化合物和盐。在水解液处理结束后,在酸中加热,半胱氨酸磺酸盐寡聚肽转变成单独的半胱氨酸并释放出SO2。在超过滤的同时,洗涤浓缩物,降低盐含量。在碱性和氧化条件下肽的半胱氨酸之间重新形成硫桥。经过超过滤使最后产品的浓度稳定。通过冷冻干燥,喷雾干燥或真空干燥的方法将浓缩物干燥而得到干燥的最终产品。
下面的实施例阐述上文中描述的发明
实施例1
在一个2,000升反应器中将215kg经过切割的羽毛(干燥约为60kg)混合成均匀的735升混合物。将4.8kg Na2SO3加入到该混合物中,pH调至7.5。将混合物加热到95℃在加热的同时不停地搅拌,该过程持续40分钟。
经过上述处理后,将混合物冷却至60℃,并将PH调至8.0,并用KOH保持该PH值。至于水解过程中使用的酶,可用细菌产生的蛋白水解酶(Maxatase,Gist-Brocades,Netherlands)。不停地搅拌混合物,以便进行充分混合。水解过程持续6小时。然后用H2SO4将PH调至4.0。同时,将约25升/分钟的过滤空气通入反应器。按这种方法产生的SO2通入第二个反应器,在该反应器中以Na2SO3的形式溶于水中。经过热处理后,将水解液冷却到60℃,装入塑料容器中。
干物质的水解液中粗蛋白占80.5%,灰分占14.5%,胃蛋白酶盐酸的溶解度(可溶性/总蛋白)是82%
实施例2
将干物质含量为28%的1.0kg经切割的羽毛在水中混合,将28.0g Na2SO3和23.0g Na2S4O6加入该混合物中。将pH调至8.0。将混和物加热到80℃,并且不停地搅拌30分钟。
经过上述处理后将混合物冷却至65℃,pH调至7.0,用NaOH保持该pH值。至于酶,可以利用木瓜蛋白酶(Profix,Biocon,Ireland),需要的酶的量是按照水解时间只需4小时而推算出的。在水解过程中剧烈地搅拌该混合物。水解后,混合物的PH值保持在7.0,并在90℃加热一段时间以破坏酶活性。然后将混合物冷却至35℃,过滤掉该混和物中的固体成分,用分离数为10,000的膜片超过滤到透明滤液。过滤期间,只有极小部分浓缩,因此,经过过滤后其大部分留在渗透液中。在随后的步骤中,将由此获得的渗透液用超过滤法浓缩,洗涤,其滤膜的分离数是1,000。洗涤浓缩物直到除去所有渗透过的肽,盐的浓度为原来的十分之一。
最后,由于水解液得到浓缩,因而最后产品是一种半液状的透明度很好的溶液。将上面溶液的部分放于小瓶中冷冻干燥。
实施例3
将1.5kg切割过的猪髦混合于5升水中。在该混合物中加入40.0克NaHSO3和10.0克Na2S4O6。将PH调至6.5,并将混合物加热至90℃并在90℃维持30分钟。变性后,将混合物冷却到60℃,将pH调至7.0并用KOH维持该pH值。所使用的酶是含有三分之二细菌蛋白酶(Alealase,Novo,Denmark)和三分之一木瓜蛋白酶(Profrx,Biocon,Ireland)的混合物。将它们分别加入。加入的酶混和物的量是水解持续4小时所需的量。在整个水解过程中混合发毛混合物。
在thel完全水解后,将混合物的pH仍维持在7.0。加热该混合物一段时间至90℃,以使酶失活,再冷却至35℃,按实施例3中的方法处理水解液得到最后产品。
实施例4
将1.0kg经过切割的羽毛(干物质占27%)混合入3升水中,加入这么多的水使总体积为5.0升。高效率地搅拌该混合物。向混和物中加入30.0克Na2SO3,将PH调至7.5。加热混和物至95℃,并保持30分钟。变性后,将混和物冷却至60℃,过滤掉该溶液中的固体部分。贮存该固体部分用于水解。将经过滤的溶液即滤液重新加到反应器中,加入第二批1.0kg重的同样的羽毛和水,使混合物的总体积为5.0升。搅拌该混和物并加入15.0克的Na2SO3,因为滤液中含有游离的SO-3。按照第一批加料时采用的同样方法热处理和过滤该混和物。第二批料的滤液重新加回到反应器中,将第三批料,1.0千克与前面相同的羽毛和同样多的水加入,使混和物的最后体积是5.0升。加入Na2SO3,与第二批加料时采用的同样方法进行处理。
将已变性的羽毛进行水解,将第三次投料后处理得到的滤液1.0升加到反应器中,通过有效的搅拌将由过滤分离出的同一批料中羽毛的固体部分加入。为确保充分混合,加入0.5升同样的滤液,将pH调至7.5,并用NaOH维持在该pH值。至于酶可用商品蛋白酶(Alcalase,Novo,Denmark)加入酶的量足够水解4小时所需的量。在水解反应进行1小时后,加入过滤出的第二批预处理的羽毛的固体部分。在同样条件下继续水解。加入第二批投料时酶量一半的酶。在这最后一次加料后,继续水解4小时。在水解后,按实施例1中的方法处理水解液,所不同的是,利用空气流通的方法没有移走SO2。在结束水解后,干物质含量为19%,干物质中灰分含量为8.5%。
Claims (18)
1、一种水解角蛋白的方法,其中固体角蛋白成分是
(a)在含有亚硫酸根离子的水溶液中预处理成为变性的角蛋白,
(b)用蛋白酶水解成角蛋白水解液,
其特征在于其中的预处理是在6~9pH,约60~100℃时进行,持续时间约为10分钟到4小时,以及
其中步骤(b)中的水解反应是按照将变性的角蛋白成分分批加到水解反应物中方式进行的。
2、根据权利要求1的方法,其特征在于预处理过程是在6.5~8pH时进行。
3、根据权利要求1或2的方法,其特征在于预处理(a)是在75~100℃时进行。
4、根据权利要求1,2或3的方法,其特征在于预处理过程持续约10至60分钟。
5、根据权利要求1,2,3或4的方法,其特征在于预处理(a)是在含有亚硫酸根离子即含有亚硫酸钠Na2SO3的水溶液中进行。
6、根据前面任一权利要求的方法,其特征在于亚硫酸钠的量是在占角蛋白成分干重的5~25%范围内。
7、根据权利要求1,2或3所述的方法,其特征在于预处理(a)是在含有亚硫酸根离子即含有亚硫酸钠Na2SO3以及一种碱金属硫代硫酸盐,优选的是四硫代硫酸盐的水溶液中进行。
8、根据前面任一项权利要求的方法,其特征在于进行预处理(a),使含有亚硫酸根离子的水溶液中其角蛋白成分的干物质含量约为5~15%重量的百分比。
9、根据前面任一项权利要求的方法,其特征在于上述阶段(a)中含有亚硫酸根离子的水溶液被用于几次投料次数中的角蛋白成分的预处理。
10、根据前面任一项权利要求所述的方法,其特征在于步骤(a)的混和物预处理结束后按同样方法处理步骤(b)的水解。
11、根据前面任一项权利要求所述的方法,其特征在于在步骤(b)中使用的蛋白酶是一种酶或酶的混合物,其最适PH是中性或弱碱性,并且具有抗热性。
12、根据权利要求10的方法,其特征在于该酶是由细菌(如芽孢杆菌),霉菌(如曲霉),植物或动物产生的一种中性和/或碱性蛋白酶。
13、根据前面任一项权利要要所述的方法,其特征在于水解阶段(b)的温度约为55~80℃。
14、根据前面任一项权利要求的方法,其特征在于水解步骤(b)的PH值是约6~8.5。
15、根据前面任一项权利要求所说的方法,其特征在于还包括步骤(c),在该步骤中用硫酸H2SO4将步骤(b)中水解的混合物的PH调至约2~5,并加热至约70~100℃,加热15~45分钟。
16、根据前利要求15所说的方法,其特征在于步骤(d1)中加热由步骤(c)中获得的混和物,其中pH为约2.5~4.5的范围,它可作为蛋白添加剂与动物饲料混合。
17、根据权利要求1~14所说的方法,其特征在于在步骤(d2)中将步骤(b)中得到的混合物的PH值升至约7~9,并加热一段时间至约80~90℃,过滤掉潜在的固体成分以制备给定长度的寡聚肽如化妆用的混合物。
18、根据权利要求17所说的方法,其特征在于在步骤(d1)中释放出的SO2和一种碱一起进行步骤(a)以制备亚硫酸盐。
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