CN106455494A - 用于蘑菇栽培的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于栽培蘑菇的方法，该方法包括将培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合；一种用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的方法和一种用于蘑菇栽培的酶组合物及其用途。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及用于栽培蘑菇的方法并且特别地涉及通过降解或转化纤维素材料的酶用于提高蘑菇产量的方法、和用于蘑菇栽培的酶组合物及其用途。
相关领域描述
“蘑菇”是一个通用术语，是指许多种类的真菌(特别是可食用的那些种类)的一种子实体。在许多国家，蘑菇被大规模加工、生产和消费。亚洲占全球蘑菇消费的大部分市场份额，紧随其后的是北美洲和欧洲。近年来全球蘑菇市场已经显示出显著的增长，并且对未来也显示出有吸引力的市场潜力。
木质纤维素材料通常被用作用于蘑菇栽培的培养材料。木素纤维素材料的转化具有以下优势：大量原料现成可得，而且可以理想地避免燃烧或填埋材料。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物已经被用作用于蘑菇栽培的培养材料。有效和可持续地使用木质纤维素材料是以高经济价值栽培蘑菇的关键因素。然而，低生物转化效率限制了蘑菇的产量。
CN 101974436 A公开了扩展青霉W4菌株，其保藏号为CGMCC No.4077。它可以被作用于蘑菇栽培的真菌配制品中的一个组分。它可以缩短生物转化时间，并且满足在低温环境中针对少量培养材料的家庭作坊的需要。
在本领域中有利的是，提供一种用于生长蘑菇的改进方法，特别是用于生长具有高产量的蘑菇的改进方法。
发明概述
本发明涉及用于栽培蘑菇的方法，该方法包括：(a)提供一种培养材料，以及
(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
本发明还涉及用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的方法，该方法包括：(a)提供一种培养材料，以及(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
本发明进一步涉及一种酶组合物，优选地是用于降解或转化用于蘑菇栽培的纤维素材料的酶组合物及其用途。
附图简要说明
图1示出了栽培草菇(Volvariella volvacea)蘑菇的流程图。
图2示出了栽培金针菇(Flammulina velutipes)蘑菇的流程图。
图3示出了栽培双孢菇(Agaricus bisporus)蘑菇的流程图。
图4示出了栽培杏鲍菇(Pleurotus eryngii)蘑菇的流程图。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”是指一种羧酸酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化来自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯、和对硝基苯基乙酸酯的乙酰基的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEENTM 20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5、25℃下每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞公司(Bray,Co.Wicklow,Ireland)以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加州，美国)进行阿拉伯糖分析来测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指一种α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解成D-葡糖醛酸酯和醇。出于本发明的目的，根据德弗里斯(de Vries)，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量。
淀粉酶：术语“淀粉酶”是指催化淀粉和其他直链和支链寡糖和多糖的内-水解的酶。它包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、以及γ-淀粉酶(EC 3.2.1.3)。
辅助活性(Auxiliary Activity)9：术语“辅助活性9”或“AA9”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208:15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)6:1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20:1051-1061)的多肽。根据亨利萨特(Henrissat)，1991，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；以及亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，生物化学杂志316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。
AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下与具有无纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)相比，由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg的总蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w AA9多肽蛋白组成，在适合的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)和适合的pH(如4-9，例如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5)下持续1-7天。
可以使用CELLUCLASTTM 1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦德(Bagsvaerd)，丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来测定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一方面中，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(例如，根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一方面中，该β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，如在WO 02/095014中描述的，在米曲霉中重组产生的)。
AA9多肽增强活性还可通过以下来确定：在40℃下将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO4、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小时，接着测定从PASC释放的葡萄糖。
还可以根据WO 2013/028928测定高温组合物的AA9多肽增强活性。
AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilumvar.coprophilum:production,purification and some biochemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶活性”在本文中定义为过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶活性(EC1.11.1.6)，该酶催化2H2O2转化为O2+2H2O。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025来确定过氧化氢酶活性。一个单位的过氧化氢酶活性等于在测定条件下催化1微摩尔的过氧化氢进行氧化的酶的量。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新见解(Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，里氏木霉纤维二糖水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？(Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient oncrystalline cellulose？)，生物化学学会学报(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(vanTilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。
出于本发明的目的，通过测量在下述条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS(或其他预处理的纤维素材料)中纤维素在适合的温度(例如，50℃、55℃、或60℃)持续3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行的糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5、25℃下，每分钟能够释放1μmol的对硝基酚根阴离子的酶的量。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”是指一种或多种(例如，若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham)，Y.微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases)，微生物学新见(CurrentOpinion In Microbiology)，2003，6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不局限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中可得到这些酶以及碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可以根据高斯和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指一种1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠(pH 6)缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0μ摩尔天青蛋白。
发明详述
栽培蘑菇的方法
本发明涉及用于栽培蘑菇的方法，该方法包括：(a)提供一种培养材料，以及(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
用于栽培蘑菇的方法在本领域中是已知的，参见例如，常(Chang)S T、邱(Yau)CK，一种用于室内栽培草菇的简单技术(A simple technique for indoor cultivation ofstraw mushroom)，蘑菇新闻(Mushroom news)，1970，18:9-11；和常(Chang)S、迈尔斯(Miles)P G，可食用蘑菇及其培养(Edible mushrooms and their cultivation.)，《可食用蘑菇及其培养》1989，345。通常，用于接种的蘑菇菌种体的生产是蘑菇栽培的一个初始阶段。典型地，这种由大量的籽粒或壳的制剂组成。这些籽粒或壳是堆肥的(并且有时针对木腐蘑菇进行灭菌)并且然后用特定物种的所希望的蘑菇的菌丝体进行接种。然后允许该蘑菇菌丝体在这些籽粒或壳上增殖直到单独的籽粒或壳被活蘑菇组织完全覆盖。在工业中，产生的蘑菇菌丝体覆盖的籽粒或壳已知为菌种体。
该菌种体的种植是蘑菇生长的第二阶段。在适当温度和环境条件下，制备该菌种体将要种植于其中的培养材料，并衰老到适当阶段。尽管现代培养材料来自不同的来源，但培养材料传统上包括来自马棚或其他类似堆肥的清洁物。小心地选择和处理该培养材料是必需的，这样使得它具有良好的营养含量并且不包含过度的量的酸或不同化学和生物抑制剂(如高氨含量)。高浓度的化学品如酸或氨将阻碍这些蘑菇的生长并降低该操作的效率。实际种植由以下组成：分布该菌种体遍及填充有该培养材料的床，以这样一种方式使得包含于床上的该培养材料是合理地与每个菌种体可及的。为了达到此目的，典型地将这些菌种体均匀分布在该培养材料表面并且然后机械地混合到该培养材料中。
一旦所述菌种体已经被种植，允许它在控制的环境条件下增殖并且生长直到它是被“包围”的并且然后继续增殖直到菌丝体准备用于完成。用于这样的营养生长的必需的时间量取决于精确环境条件、特定类型的蘑菇和该培养材料床的营养含量。
在该营养期已经持续适当长度的时间之后，针对一些蘑菇进行已知为装箱的操作。包围包括铺展一薄层土壤在培养材料床上。使土壤保持潮湿。因此，使该床温度短期降低。这种温度降低具有以下效果：引起该蘑菇菌丝体至结果实或“收获”并因此通过覆土发送实际的蘑菇。
蘑菇作物的最终阶段是实际的结果实或“收获”。在这一阶段，这些成熟真菌发送被销售为蘑菇的子实体。当每个具体真菌菌落已经达到适当阶段时，它将长出果实。整个床上结果实的实际时间框架有所不同。
基于蘑菇生长所需要的培养材料，蘑菇可以大致分为木腐真菌和草腐真菌。通常使用林地或木头作为主要养分的木腐蘑菇，包括但不限于杏鲍菇、香菇、黑木耳、平菇、灵芝以及猴头菇。草腐蘑菇通常吸收腐草例如水稻秸秆或小麦秸秆中的有机质作为主要养分。草腐蘑菇包括，但不局限于双孢菇、草菇以及鸡腿菇(Copyinds comatus)。草腐蘑菇菌丝体可以在蔗糖和葡萄糖上生长，并且腐烂农业残余物、家畜和家禽粪肥以及木腐真菌的真菌残余物作为碳源。
在一个优选方面中，本发明的这些方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与包含纤维素酶和半纤维素酶的酶组合物进行混合。
在一个优选方面中，本发明的这些方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
在一个优选方面中，本发明涉及用于蘑菇栽培的方法，这些方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与酶进行混合，以及
(c)对该混合的培养材料进行堆肥。
在另一个优选方面中，本发明的方法进一步包括使该堆肥的培养材料进行第二次堆肥。
在一个优选方面中，本发明的这些方法包括
用蘑菇菌丝体接种该培养材料并且允许该蘑菇菌丝体发育成为蘑菇；并且任选地再生该蘑菇。
在另一方面中，本发明涉及用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的多种方法，这些方法包括：(a)提供一种培养材料，以及(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
在一个优选方面中，本发明涉及用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的多种方法，这些方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与包含纤维素酶和半纤维素酶的酶组合物进行混合。
在一个优选方面中，本发明涉及用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的多种方法，这些方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
在一个优选方面中，本发明涉及用于蘑菇栽培的纤维素酶以及半纤维素酶的用途。
在一个优选方面中，本发明涉及纤维素酶以及半纤维素用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的用途。
蘑菇的培养材料
蘑菇的培养材料取决于蘑菇的品种。但是通常，该培养材料包括纤维素材料。
术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝、糠和木材。纤维素材料可以是但不限于农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见例如维塞劳格尔(Wiselogel)等人，1995，生物乙醇手册(Handbook on Bioethanol)(查尔斯E.怀曼(Charles E.Wyman)，编著)，pp.105-118，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(Bioresource Technology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695-719；马塞尔(Mosier)等人，1999，“木质纤维素的生物转化的最近进展”，生物化学工程/生物技术进展(Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology)，斯卡皮尔(T.Scheper)，总编辑，第65卷，第23-40页，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选方面中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面中，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包括纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一方面中，该纤维素材料是农业残余物。在另一方面中，该纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一方面中，该纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一方面中，该纤维素材料是废纸。在另一方面中，该纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。
在另一方面中，该纤维素材料是芦竹。在另一方面中，该纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面中，该纤维素材料是竹子。在另一方面中，该纤维素材料是玉米芯。在另一方面中，该纤维素材料是玉米纤维。在另一方面中，该纤维素材料是玉米秸秆。在另一方面中，该纤维素材料是芒草。在另一方面中，该纤维素材料是橘皮。在另一方面中，该纤维素材料是稻草。在另一方面中，该纤维素材料是柳枝稷。在另一方面中，该纤维素材料是小麦秆。
在另一方面中，该纤维素材料是山杨。在另一方面中，该纤维素材料是桉树。在另一方面中，该纤维素材料是冷杉。在另一方面中，该纤维素材料是松树。在另一方面中，该纤维素材料是杨树。在另一方面中，该纤维素材料是云杉。在另一方面中，该纤维素材料是柳树。
在另一方面中，该纤维素材料是海藻纤维素。在另一方面中，该纤维素材料是细菌纤维素。在另一方面中，该纤维素材料是废棉。在另一方面中，该纤维素材料是棉短绒。在另一方面中，该纤维素材料是滤纸。在另一方面中，该纤维素材料是锯末。在另一方面中，该纤维素材料是棉花种子的外壳。在另一方面中，该纤维素材料是是谷物的籽粒。
在另一方面中，该纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语“水生生物质(Aquatic Biomass)”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
在另一个优选方面中，该纤维素材料可以选自下组，该组由以下各项组成：农业残余物、草本材料、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、糠和木材；优选地，芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、橙皮、稻秸、柳枝稷、小麦秸秆、桉树、冷杉、松树、杨树、云杉、柳树、藻类纤维素、细菌纤维素、废棉、棉短绒、锯末、棉花种子的外壳、谷物的籽粒、以及滤纸。
可以按原样使用纤维素材料或可使用本领域已知的常规方法将纤维素材料进行预处理。在一个优选方面中，根据本发明，在该纤维素材料与一种酶混合之前使其经受“机械预处理”。“机械预处理”是指各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
除了该纤维素材料，该培养材料还可以包括对蘑菇的生长有利的任何物质，例如，粪肥、淀粉、石膏、糖、尿素、过磷酸钙、碳酸钙和/或石灰。
酶和酶组合物
酶组合物可包含任何可用于降解或转化纤维素材料的蛋白。所述组合物可包含一种酶作为主要酶组分，例如单组分组合物，或多种酶。该组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
在一方面中，用于降解或转化纤维素材料的酶包含一种或多种(例如，若干种)具有纤维素分解活性和/或半纤维素分解活性的酶。
在一个实施例中，该酶包含纤维素酶，并且进一步包含一种或多种(例如，若干种)选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一方面中，该纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面中，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
在另一个实施例中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一方面中，该酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一方面中，该酶组合物包括选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如，若干种)酶。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶。在另一方面中，该酶组合物包括纤维二糖水解酶。在另一方面中，该酶组合物包括β-葡糖苷酶。在另一方面中，该酶组合物包括具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括纤维二糖水解酶以及具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括β-葡糖苷酶以及具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一方面中，该酶组合物包括纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一方面中，该酶组合物包括内切葡聚糖酶、纤维二塘水解酶、β-葡糖苷酶、以及具有增强纤维素分解活性的多肽。
在另一个实施例中，该酶组合物包括乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括乙酰木聚糖酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一方面中，该酶组合物包括阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一方面中，该酶组合物包括香豆酸酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括阿魏酸酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一方面中，该酶组合物包括葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一方面中，该酶组合物包括葡糖醛酸酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括甘露聚糖酶。在另一方面中，该酶组合物包括甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一方面中，该酶组合物包括木聚糖酶。在一个优选方面中，该木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一方面中，该酶组合物包括木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个实施例中，该酶组合物包括酯酶。在另一方面中，该酶组合物包括棒曲霉素。在另一方面中，该酶组合物包括过氧化氢酶。在另一方面中，该酶组合物包括漆酶。在另一方面中，该酶组合物包括木质素分解酶。在一个优选方面，该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是H2O2产生酶。在另一方面中，该酶组合物包括果胶酶。在另一方面中，该酶组合物包括过氧化物酶。在另一方面中，该酶组合物包括蛋白酶。在另一方面中，该酶组合物包括膨胀蛋白。在一个优选方面中，该酶组合物包括酸性纤维素酶(包括酸性内纤维素酶和酸性外纤维素酶)。在一个优选方面中，该酶组合物包括酸性纤维素酶(包括酸性内纤维素酶和酸性外纤维素酶)、和β-葡糖苷酶。在另一个优选方面中，该酶组合物包括酸性纤维素酶、中性纤维素酶、和β-葡糖苷酶。在另一个优选方面中，该酶组合物包括酸性纤维素酶、酸性半纤维素酶(包括木聚糖内切酶)、内纤维素酶、外纤维素酶和β-葡糖苷酶。在另一个优选方面中，该酶组合物包括酸性纤维素酶、中性纤维素酶、酸性半纤维素酶(包括木聚糖内切酶)、内纤维素酶、外纤维素酶和β-葡糖苷酶。
在本发明的方法中，可以在堆肥或接种之前或期间添加该一种或多种酶。具有纤维素分解活性的这些酶和具有半纤维素分解活性的这些酶可以同时或顺序添加。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，若干种)组分可以是一种细胞的天然蛋白质，将该细胞用作重组地表达该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)其他组分的宿主细胞。该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以作为单组分来产生，然后将其合并以形成该酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
在本发明的方法中使用的酶可以处于任何适于使用的形式，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化的或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶可为干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体、或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加如糖、糖醇或其它多元醇等稳定剂和/或乳酸，对液体酶制剂进行稳定化。
这些酶的最佳量取决于若干因素，包括但不限于，组分纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、培养材料中的纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、以及pH。
在一个优选方面中，酶对培养材料的有效量是每g培养材料约0.005mg至约100mg、优选约0.01mg至约50mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.1mg至约15mg、甚至更优选约0.1mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约10mg酶蛋白。
在一个优选方面中，纤维素酶对培养材料的有效量是每g培养材料约0.005mg至约50mg、优选约0.01mg至约40mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.25mg至约15mg、甚至更优选约0.5mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约5mg纤维素酶。
在一个优选方面中，半纤维素酶对培养材料的有效量是每g培养材料约0.001mg至约50mg、优选约0.005mg至约40mg、更优选约0.01mg至约25mg、更优选约0.05mg至约20mg、更优选约0.05mg至约15mg、甚至更优选约0.075mg至约10mg、并且最优选约0.1mg至约5mg半纤维素酶。
在另一个优选方面中，半纤维素酶对纤维素酶的有效量是每g纤维素酶约0.005g至约1.0g、优选约0.005g至约0.75g、更优选约0.01g至约0.75g、更优选约0.05g至约0.5g、更优选约0.075g至约0.5g、甚至更优选约0.1g至约0.5g、并且最优选约0.1g至约0.3g半纤维素酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及适用于纤维素材料的降解的其他蛋白质/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽(在下文统称为“具有酶活性的多肽”)可以源自或获自任何适合的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还意指该酶可能已在宿主生物中采用在此所描的方法重组产生，其中重组产生的酶对于宿主生物是原生的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如，若干个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。原生酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属、热解纤维素菌属、热酸菌属、热裂菌属(Thermobifidia)、或海洋芽孢杆菌属多肽，或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单孢菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、或脲原体属多肽。
在一方面中，该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一方面中，该多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
在另一方面中，该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、或浅青紫链霉菌多肽。
该具有酶活性的多肽也可以是一种真菌多肽，并且更优选地是一种酵母多肽，例如具有酶活性的念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或更优选地是一种丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属具有酶活性的多肽。
在一方面中，多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在一方面中，该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌、热带金孢子菌、粪状金孢子菌、狭边金孢子菌、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌、褐薄金孢子菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、一种真菌(Thielavia albomyces)、一种真菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳、一种真菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、一种真菌(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、耐热梭孢壳、太瑞斯梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉多肽、或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
也可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是重组组分，即，通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。优选宿主是异源宿主(酶对于宿主而言是异源的)，但是在某些条件下，宿主还可以是同源宿主(酶对于宿主而言是原生的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。
在一方面中，该一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶包括商业纤维素分解酶制剂。适用于在本发明中使用的商业化纤维素分解酶制剂的实例包括例如CtecCtec3(诺维信公司)、CTec CTec2(诺维信公司)、CTec(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、NOVOZYMTM 188(诺维信公司)、CELLUZYMETM(诺维信公司)、CEREFLOTM(诺维信公司)、以及ULTRAFLOTM(诺维信公司)、ACCELERASETM(杰能科公司(Genencor Int.))、LAMINEXTM(杰能科公司)、SPEZYMETM CP(杰能科公司)、NL(DSM)；S/L 100(DSM)、ROHAMENTTM 7069W(罗姆公司(GmbH))、LDI(并矢国际公司(Dyadic International，Inc.))、LBR(并矢国际公司)、或150L(并矢国际公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、以及Puradax HA和Puradax EG(杰能科公司)。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利号5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228，GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(NucleicAcids Research)18:5884)；川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
有用于本发明中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。
有用于本发明中的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于米曲霉β-葡糖苷酶、烟曲霉菌β-葡糖苷酶、巴西青霉IBT 20888β-葡糖苷酶、黑曲霉β-葡糖苷酶、以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
可以根据WO 2002/095014获得米曲霉β-葡糖苷酶。可以根据WO 2005/047499获得烟曲霉β-葡糖苷酶。可以根据WO 2007/019442获得巴西青霉β-葡糖苷酶。可以根据丹(Dan)等人，2000，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275:4973-4980获得黑曲霉β-葡糖苷酶。可以根据川口(Kawaguchi)等人，1996，基因(Gene)173:287-288获得棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一方面中，β-葡糖苷酶是根据WO 2008/057637获得的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。
其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶披露于使用根据以下的分类的许多糖基水解酶家族中：亨利萨特·B.(Henrissat B.)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；以及亨利萨特·B.和贝洛赫·A.(Bairoch A.)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696。
可用在本发明中的其他纤维素分解酶描述于以下中：EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利号4,435,307、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、美国专利号5,686,593、美国专利号5,691,178、美国专利号5,763,254、以及美国专利号5,776,757。
在本发明的这些方法中，可以使用任何淀粉酶。在具体的实施例中，用于根据本发明的用途的淀粉酶具有α-淀粉酶活性，即，催化寡糖和多糖中1,4-α-糖苷键的内水解。α-淀粉酶以随机方式作用于，例如淀粉、糖原和相关的多糖和寡糖，释放α-构型中的还原基团。
在一个优选实施例中，本发明的淀粉酶是α-淀粉酶(系统名：1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。在另外的实施例中，本发明的淀粉酶属于EC 3.2.1.-基团的淀粉酶类，如EC3.2.1.1(α-淀粉酶)、EC 3.2.1.2(β-淀粉酶)、EC 3.2.1.3(葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶、或葡糖淀粉酶)、EC 3.2.1.20(α-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.60(葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶)、EC 3.2.1.68(异淀粉酶)、EC 3.2.1.98(葡聚糖1,4-α-麦芽己糖酶)、或EC3.2.1.133(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶)。
出于本发明的目的，优选的淀粉酶是包含于以下商业产品中的淀粉酶：BAN、Stainzyme、Termamyl 2X、Termamyl SC、Natalase、以及Duramyl(全部来自诺维信)。根据本发明使用的更具体的淀粉酶实例是包含于商业的Validase BAA和Validase HT产品中(来自Valley Research)的淀粉酶。用于根据本发明的用途的淀粉酶的又进一步具体实例是在以下商品中包含的淀粉酶：Clarase、DexLo、GC 262SP、G-Zyme G990、G-Zyme G995、G-ZymeG997、G-Zyme G998、HTAA、Optimax 7525、Purastar OxAm、Purastar ST、Spezyme AA、Spezymeα、Spezyme BBA、SpezymeδAA、Spezyme DBA、Spezyme Ethyl、Spezyme Fred(GC521)、Spezyme HPA、Spezyme Extra、和Ultraphlow(所有都来自杰能科公司(Genencor))；Validase HT340L、Valley Thin 340L(所有都来自Valley Research)；Avizyme 1500、Dextro 300L、Kleistase、Maltazyme、Maxamyl、Thermozyme、Thermatex、Starzyme HT 120L、Starzyme Super Conc、和Ultraphlo。
在本发明的方法中，可以使用具有纤维素分解增强活性的任何AA9多肽。
在第一个方面中，所述具有纤维素分解增强活性的AA9多肽包含以下基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中X是任何氨基酸，X(4,5)是处于4个或5个连续位置的任何氨基酸，并且X(4)是处于4个连续位置的任何氨基酸。
包括以上提到的基序的多肽可以进一步包括：
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，
其中X是任何氨基酸，X(1,2)是处于1个位置或2个连续位置的任何氨基酸，X(3)是处于3个连续位置的任何氨基酸，并且X(2)是处于2个连续位置的任何氨基酸。在以上基序中，采用可接受的IUPAC单一字母氨基酸缩写。
在一个优选方面中，所述具有纤维素分解增强活性的AA9多肽进一步包括H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选方面中，所述具有纤维素分解增强活性的AA9多肽进一步包括[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选方面中，所述具有纤维素分解增强活性的AA9多肽进一步包括H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
在第二个方面中，所述具有纤维素分解增强活性的AA9多肽具有以下基序：
[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，
其中x是任何氨基酸，x(4,5)是处于4个或5个连续位置的任何氨基酸，并且x(3)是处于3个连续位置的任何氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
有用于本发明的方法中的具有纤维素分解增强活性的AA9多肽的实例包括但不限于来自土生梭孢壳霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131、以及WO 2011/035027)的具有纤维素分解增强活性的多肽、来自金黄色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)的具有纤维素分解增强活性的多肽、来自里氏木霉(WO 2007/089290)的具有纤维素分解增强活性的多肽、来自嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、以及WO2009/085868)的具有纤维素分解增强活性的多肽、来自烟曲霉(WO 2010/138754)的具有纤维素分解增强活性的多肽；以及来自嗜松青霉(WO 2011/005867)、嗜热子囊菌属菌种(WO2011/039319)、青霉菌属种(WO 2011/041397)、以及甲壳嗜热子囊菌(WO 2011/041504)的具有纤维素分解增强活性的多肽。
在一个实施例中，该一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适于在本发明中使用的商业化半纤维素分解酶制剂的实例包括例如SHEARZYMETM(诺维信公司)、HTec(诺维信公司)、HTec2(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、HC(诺维信公司)、木聚糖酶(杰能科公司)、XY(杰能科公司)、XC(杰能科公司)、TX-200A(AB酶公司(ABEnzymes))、HSP 6000木聚糖酶(DSM)、DEPOLTM 333P(生物催化剂有限公司(BiocatalystsLimit)，威尔士，英国)、DEPOLTM 740L。(生物催化剂有限公司，英国威尔士)以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士)。
有用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉木聚糖酶(WO 2006/078256)、嗜松青霉菌(WO2011/041405)、青霉菌属种(WO 2010/126772)、土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/079210)以及褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(WO 2011/057083)。
可用于本发明的方法中的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、埃默森踝节菌(SwissProt登录号Q8X212)、以及粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。
有用于本发明的方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(WO 2010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(WO 2010/014880)、粗糙链孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)、以及土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/042846)。
有用于本发明的方法中的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于：特异腐质霉DSM 1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙链孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)、以及费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
有用于本发明的方法中的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的阿拉伯呋喃糖苷酶：黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)、以及巨多孔菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)。
有用于本发明的方法中的α-葡萄糖醛酸酶的实例包括但不限于来自以下各项的α-葡萄糖醛酸酶：棒曲霉(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO 2010/014706)、黄灰青霉(WO 2009/068565)、埃默森篮状菌(UniProt登录号Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
有用于本发明的方法中的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域已知的程序发酵上面指出的微生物菌株来产生(参见例如，Bennett(班尼特)，J.W.和LaSure(拉素尔)，L.(编辑)，More GeneManipulations in Fungi(《真菌中的更多基因操作》)，Academic Press(学术出版社)，加州，1991)。适合的培养基可以从商业供应商获得，或可以根据已公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适合于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见，例如，贝利·J.E.(Bailey,J.E.)和奥利斯·D.F.(Ollis,D.F.)，生物化学工程基础(Biochemical Engineering Fundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的培养细胞的任何方法。所以，可以将发酵理解为包括摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵培养基回收并且通过常规程序纯化。
蘑菇
多种蘑菇可以受益于本发明，并且本发明不限于任何特定的蘑菇种类或其菌株。在一个优选方面中，该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、茶树菇、黑木耳、毛木耳(Auricularia polytricha)、平菇、灵芝、金针菇、猴头菇、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇(Pleurotus nebrodensis)、滑菇(Pholiotanameko)、银耳、以及鸡腿菇。在另一个优选方面中，该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、黑木耳、平菇、灵芝、猴头菇、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇以及鸡腿菇。在另一个优选方面中，该蘑菇是草腐蘑菇，如双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇以及鸡腿菇。在另一个优选方面中，该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇属、田头菇属(Agrocybe)、木耳属(Auricularia)、侧耳属、灵芝属、火菇属(Flammulina)、猴头菌属、玉蕈属(Hypsizygus)、伞菌属、草菇属、鳞伞属(Pholiota)、银耳属、以及鸡腿菇属(Copyinds)。在另一个优选方面中，该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：草菇属、火菇属、伞菌属以及侧耳属。在另一个优选方面中，该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：草菇、金针菇、双孢菇以及杏鲍菇。
本发明在下面各段中进行了进一步的定义：
[1].一种用于栽培蘑菇的方法，该方法包括：
(a)提供一种培养材料，以及
(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶，更优选地，与具有纤维素分解活性和/或半纤维素分解活性的酶进行混合。
[2].如段落1所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和任选地一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[3].如段落2所述的方法，其中该酶以每g培养材料约0.005mg至约100mg、优选约0.01mg至约50mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.1mg至约15mg、甚至更优选约0.1mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约10mg酶的量与该培养材料进行混合。
[4].如段落1-3中任一项所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和半纤维素酶，优选内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。
[5].如段落4所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
[6].如段落4或5所述的方法，其中该纤维素酶以每g培养材料约0.005mg至约50mg、优选约0.01mg至约40mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.25mg至约15mg、甚至更优选约0.5mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约5mg纤维素酶的量与该培养材料进行混合。
[7].如段落4所述的方法，其中该半纤维素酶是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
[9].如段落4-8中任一项所述的方法，其中该半纤维素酶以每g培养材料约0.001mg至约50mg、优选约0.005mg至约40mg、更优选约0.01mg至约25mg、更优选约0.05mg至约20mg、更优选约0.05mg至约15mg、甚至更优选约0.075mg至约10mg、并且最优选约0.1mg至约5mg半纤维素酶的量与该培养材料进行混合。
[10].如段落1-9中任一项所述的方法，其中该培养材料包括选自下组的纤维素材料，该组由以下各项组成：农业残余物、草本材料、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、糠和木材；优选地，芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、橙皮、稻秸、柳枝稷、小麦秸秆、桉树、冷杉、松树、杨树、云杉、柳树、藻类纤维素、细菌纤维素、废棉、棉短绒、滤纸、锯末、谷物的籽粒以及棉花种子的外壳。
[11].如段落10所述的方法，其中该培养材料进一步包括粪肥、淀粉、石膏、糖、尿素、过磷酸钙、碳酸钙和/或石灰。
[12].如段落1-11中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与包含纤维素酶和半纤维素酶的酶组合物进行混合。
[13].如段落1-11中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
[14].如段落12或13所述的方法，其中半纤维素酶和纤维素酶的量为每g纤维素酶约0.005g至约1.0g、优选约0.005g至约0.75g、更优选约0.01g至约0.75g、更优选约0.05g至约0.5g、更优选约0.075g至约0.5g、甚至更优选约0.1g至约0.5g、并且最优选约0.1g至约0.45g半纤维素酶。
[15].如段落1-14中任一项所述的方法，该方法进一步包括
对该混合的培养材料进行堆肥；
任选地，进一步包括对该堆肥的培养材料进行第二次堆肥。
[16].如段落1-15中任一项所述的方法，该方法进一步包括
用蘑菇菌丝体接种该培养材料并且允许该蘑菇菌丝体发育成为蘑菇；并且任选地再生该蘑菇。
[17].如段落1-16中任一项所述的方法，其中该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、茶树菇、黑木耳、毛木耳(Auricularia polytricha)、平菇、灵芝、金针菇、猴头菇、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇(Pleurotusnebrodensis)、滑菇(Pholiota nameko)、银耳、以及鸡腿菇。
[18].一种用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的方法，该方法包括：
(a)提供一种培养材料，以及
(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶，优选地，与具有纤维素分解活性和/或半纤维素分解活性的酶进行混合。
[19].如段落18所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和任选地一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[20].如段落19所述的方法，其中该酶以每g的该培养材料约0.005mg至约100mg、优选约0.01mg至约50mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.1mg至约15mg、甚至更优选约0.1mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约10mg酶的量与该培养材料进行混合。
[21].如段落18-20中任一项所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和半纤维素酶，优选内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。
[22].如段落21所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
[23].如段落21或22所述的方法，其中该纤维素酶以每g的该培养材料约0.005mg至约50mg、优选约0.01mg至约40mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.25mg至约15mg、甚至更优选约0.5mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约5mg纤维素酶的量与该培养材料进行混合。
[24].如段落21所述的方法，其中该半纤维素酶是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
[25].如段落21-24中任一项所述的方法，其中该半纤维素酶以每g的该培养材料约0.001mg至约50mg、优选约0.005mg至约40mg、更优选约0.01mg至约25mg、更优选约0.05mg至约20mg、更优选约0.05mg至约15mg、甚至更优选约0.075mg至约10mg、并且最优选约0.1mg至约5mg半纤维素酶的量与该培养材料进行混合。
[27].如段落17-26中任一项所述的方法，其中该培养材料包括选自下组的纤维素材料，该组由以下各项组成：农业残余物、草本材料、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、糠和木材；优选地，芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、橙皮、稻秸、柳枝稷、小麦秸秆、桉树、冷杉、松树、杨树、云杉、柳树、藻类纤维素、细菌纤维素、废棉、棉短绒、滤纸、锯末、谷物的籽粒、以及棉花种子的外壳。
[28].如段落27所述的方法，其中该培养材料进一步包括粪肥、淀粉、石膏、糖、尿素、过磷酸钙、碳酸钙和/或石灰。
[29].如段落18-28中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与包含纤维素酶和半纤维素酶的酶组合物进行混合。
[30].如段落18-28中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
[31].如段落29或30所述的方法，其中半纤维素酶和纤维素酶的量为每g纤维素酶约0.005g至约1.0g、优选约0.005g至约0.75g、更优选约0.01g至约0.75g、更优选约0.05g至约0.5g、更优选约0.075g至约0.5g、甚至更优选约0.1g至约0.5g、并且最优选约0.1g至约0.45g半纤维素酶。
[31].如段落18-31中任一项所述的方法，该方法进一步包括
对该混合的培养材料进行堆肥；
任选地，进一步包括对该堆肥的培养材料进行第二次堆肥。
[32].如段落18-31中任一项所述的方法，该方法进一步包括
用蘑菇菌丝体接种该培养材料并且允许该蘑菇菌丝体发育成为蘑菇；并且任选地再生该蘑菇。
[33].如段落18-32中任一项所述的方法，其中该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、茶树菇、黑木耳、毛木耳(Auricularia polytricha)、平菇、灵芝、金针菇、猴头菇、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇(Pleurotusnebrodensis)、滑菇(Pholiota nameko)、银耳、以及鸡腿菇。
[34].一种用于蘑菇栽培的酶组合物，该酶组合物包括用于降解或转化纤维素材料的酶；优选地包括一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[35].如段落34所述的酶组合物，其中该酶组合物包括纤维素酶和半纤维素酶，优选内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。
[36].如段落34或35所述的酶组合物，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
[37].如段落34-36中任一项所述的酶组合物，其中该半纤维素酶是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
[38].如段落34-37中任一项所述的酶组合物，其中该半纤维素酶对该纤维素酶的量为每g纤维素酶约0.005g至约1.0g、优选约0.005g至约0.75g、更优选约0.01g至约0.75g、更优选约0.05g至约0.5g、更优选约0.075g至约0.5g、甚至更优选约0.1g至约0.5g、并且最优选约0.1g至约0.45g半纤维素酶。
[39].如段落34-38中任一项所述的酶组合物，其中该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、茶树菇、黑木耳、毛木耳(Auricularia polytricha)、平菇、灵芝、金针菇、猴头菇、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇(Pleurotusnebrodensis)、滑菇(Pholiota nameko)、银耳、以及鸡腿菇。
[40].如段落34-39中任一项所述的酶组合物用于蘑菇栽培的用途。
[41].如段落34-39中任一项所述的酶组合物用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的用途。
[42].纤维素酶和半纤维素酶用于蘑菇栽培的用途。
[43].纤维素酶和半纤维素用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的用途。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
酶
Ctec2，从诺维信公司商购地纤维素酶产品；
Classic 700T，从诺维信公司商购地纤维素酶产品；
Htec2，从诺维信公司商购地半纤维素酶产品。
实例1通过向底物中添加酶来提高草菇蘑菇的产量
方法和步骤
1.原料的干燥
将废棉(可从纺织厂获得)暴露于阳光下3-4天以防止细菌或真菌污染。
2.混合
将92％按重量计的废棉和8％按重量计的石灰混合(碳:氮为约23:1)并向其中加入水，得到具有含水量为约75％和pH为约8-8.5的培养材料。
3.第一次堆肥
制备七堆混合培养材料，每堆50kg干重，编号为1-7。根据表1将相关酶加入组“2-4”中并且然后充分混合，用石灰将pH调节至8。将这些堆进行堆肥一天，将温度保持在55℃-60℃，将pH调节至8。然后翻转这些堆并且根据表1将相关酶加入组“5-7”中，将pH调节至8并将温度保持在50℃-60℃。将组“1”作为对照。将这些堆的含水量保持在65％-75％。
表1蘑菇栽培期间的酶组合物
4.培养材料的喂养和喷雾
将培养材料喷雾到培养床上，厚度为8-10cm。每组/处理占用了一个包括3张床的床架。1×1.5m2用作具有约16.67kg干重的培养材料的一个床。
5.第二次堆肥
将该培养底物用燃烧的煤经受65℃-70℃持续1天。
6.冷却
将培养材料温度降至36℃-38℃。所得的pH为约pH 7.5-7.8并且含水量为约68％。
7.接种
用繁殖的草菇种子接种堆肥的培养材料(或培养底物)。接种量为培养材料的干重的约1.5％，该接种量为约0.13kg/m2。
8.菌丝体生长
将室温保持在28℃-32℃，并且将底物温度保持在33℃-36℃，培养底物的含水量在约70％，空气湿度在80％，pH 7.8-8.0。菌丝体生长到培养底物的底层需要约4天。然后将培养室通风以干燥底物的表面。之后，将水喷洒到底物上直到水滴从底层渗出，并且然后再次将培养室通风。在喷水后5-6小时内将温度保持在28℃，并将底物水含量控制回约70％。
9.蘑菇生长
将底物温度保持在28℃-33℃并将含水量保持在70％-75％，空气湿度在90％，pH7.0-8.0。将该材料的表面温度保持在30℃-32℃。这段时间内需要500-1000lx光。
结论
该培养过程的流程图示于图1中。生产产量示于表2中。从表2可以看出，酶的添加提高了蘑菇的生产产量。还可以看出，酶的添加提高了生物效率。
表2伴随酶添加的蘑菇的生产产量
*生物效率＝新鲜蘑菇的产量(kg)/培养材料的干重(kg)×100％。
实例2：通过在灭菌之前向培养底物中添加酶来提高金针菇的产量
方法和步骤
1.制备培养底物
将包含40％棉籽壳、15％锯屑、20％玉米芯、20％糠、3％玉米粉、1％石膏粉和1％石灰粉的材料混合。然后向这些材料中添加水，并且使水分含量为60％-65％。充分混合后，将该培养底物分散进入几个袋中，每个袋175g干物质。
2.酶处理和灭菌
对于灭菌前用酶处理的试验，根据表3将相应的酶与水加入组“2”中并充分混合，然后将这些材料在50℃、pH 5.0下孵育3天，每12小时搅拌。处理后用石灰将pH调节至8，并将水分含量保持为60％-65％。然后将酶处理的底物通过高压灭菌器进行灭菌。将“1”组作为对照，不进行酶处理。
表3.用于金针菇栽培的酶的组成。
3.接种
将15g-20g固体金针菇(Flammulina velutipes)种子接种到每袋培养底物中。
4.菌丝体生长
在20℃-22℃的温度、60％-65％的空气湿度、4000mL/m3的CO2浓度的条件下，黑金针菇的菌丝体在黑暗中生长。菌丝体生长到培养底物的底层需要约20天。然后将培养室通风以干燥底物的表面。一旦菌丝体充满袋子，就将真菌从表层上刮下。
5.子实体生长
针对子实体生长，在12℃-15℃的温度、90％-95％的空气湿度和600-800LX的日照下，将金针菇培养8至10天。对于随后的7至8天，温度逐渐降低至3℃-5℃，空气湿度和CO2浓度分别保持在80％-90％和2000mL/m3-2500mL/m3。子实体出来后，条件控制在8℃-10℃的温度、90％-95％的空气湿度和5000mL/m3-6000mL/m3的CO2浓度。
结论
金针菇栽培的过程流程图示于图2中。有/无酶处理的产量性能示于表4中。可以看出，在培养基灭菌前具有酶的添加的组“2”提高了金针菇的生产产量和蘑菇栽培的生物效率。
表4.具有酶添加的金针菇的生产产量。
*生物效率＝新鲜蘑菇的产量(g)/培养材料的干重(g)×100％。
实例3：通过在灭菌之后向培养底物中添加酶来提高金针菇的产量
方法和步骤
1.制备培养底物
将包含40％棉籽壳、15％锯屑、20％玉米芯、20％糠、3％玉米粉、1％石膏粉和1％石灰粉的材料混合。然后向这些材料中添加水，并且使水分含量为60％-65％。充分混合后，将该培养底物分散进几个瓶中，每个瓶175g干物质。
2.酶处理和灭菌
对于在灭菌后根据表5进行的酶处理的组“2”，首先将底物的水分含量保持在高压灭菌处理的45％，并且然后在高压灭菌处理后将相关酶与无菌水添加至底物中以使最终水分含量至60％-65％。将“1”组作为对照，不进行酶处理。
表5.用于金针菇栽培的酶的组成。
3.接种
将15g-20g固体金针菇(Flammulina velutipes)种子接种到每瓶培养底物中。
4.菌丝体生长
在20℃-22℃的温度、60％-65％的空气湿度、4000mL/m3的CO2浓度的条件下，黑金针菇的菌丝体在黑暗中生长。菌丝体生长到培养底物的底层需要约20天。然后将培养室通风以干燥底物的表面。一旦菌丝体充满袋子，就将真菌从表层上刮下。
5.子实体生长
针对子实体生长，在12℃-15℃的温度、90％-95％的空气湿度和600-800LX的日照下，将金针菇培养8至10天。对于随后的7至8天，温度逐渐降低至3℃-5℃，空气湿度和CO2浓度分别保持在80％-90％和2000mL/m3-2500mL/m3。子实体出来后，条件控制在8℃-10℃的温度、90％-95％的空气湿度和5000mL/m3-6000mL/m3的CO2浓度。
结论
金针菇栽培的过程流程图示于图2中。有/无酶处理的产量性能示于表6中。可以看出，在培养基灭菌后具有酶的添加的组“2”提高了金针菇的生产产量和蘑菇栽培的生物效率。
表6.具有酶添加的金针菇的生产产量。
*生物效率＝新鲜蘑菇的产量(g)/培养材料的干重(g)×100％。
实例4通过向底物中添加酶来提高双孢菇蘑菇的产量
方法和步骤
1.原料制备
水稻原种和牛粪分别预湿3-4天和6-8天。然后将具有54％按重量计的大米原种、36％按重量计的牛粪，3.5％按重量计的尿素，3.5％按重量计的过磷酸钙，1.5％按重量计的石膏和1.5％按重量计的石灰的组分的材料进行混合并调节至65％含水量。
2.第一次堆肥
制备四堆混合培养材料，每堆50kg干重，编号为1-4。将每堆隐藏起来并调节至pH7，在第6天、第11天和第16天分别为65％含水量。在第18天，翻转这些堆并且根据表7将相关酶加入组“2-4”中，将pH调节至7并将含水量保持在65％。将组“1”作为对照。
表7.蘑菇栽培期间的酶组合物
| 组号 | 纤维素酶 | 半纤维素酶 | 添加时间 |
| No.1(对照) | - | - | - |
| No.2 | 0.36mg/g材料 | 0.14mg/g材料 | 第一次堆肥结束时 |
| No.3 | 1.45mg/g材料 | 0.58mg/g材料 | 第一次堆肥结束时 |
| No.4 | 2.90mg/g材料 | 1.15mg/g材料 | 第一次堆肥结束时 |
3.培养材料的喂养和喷雾
将培养材料喷雾到培养床上。每组/处理占用了一个包括3张床的床架。1×0.5m2被用作一张床。
4.第二次堆肥
将培养底物经受60℃-65℃持续1天。然后将温度降至48℃-52℃并保持5-7天。
5.冷却
将培养材料温度降至30℃。
6.接种
用繁殖的双孢菇种子接种堆肥的培养材料(或培养底物)。接种量为培养材料的干重的约1.5％，该接种量为约0.13kg/m2。
7.菌丝体生长
将室温保持在25℃，培养底物的水含量在约70％-75％，持续约21天。然后用土壤覆盖这些床约3cm厚度。然后添加水以调节该覆盖土壤至18％-10％水含量并保持3-4天。
8.蘑菇生长
将底物温度保持在15℃-16℃，空气湿度保持在90％。从当菌丝体生长到距离该覆盖土壤的表面1cm距离的高度时的点开始将水倒入这些床中。6天内，总共要倒入3-4kg/cm2水。然后，从当蘑菇芽生长到大豆尺寸时的时间点开始将优质水倒入这些床中。再一个6天内，总共要倒入2.5-3kg/cm2水。
9.第二潮蘑菇生长
在又一个11天内，收集第二潮蘑菇。
10.第三潮蘑菇生长
在又一个16天内，收集第三潮蘑菇。
结论
该培养过程的流程图示于图3中。生产产量示于表8中。从表8可以看出，酶的添加提高了蘑菇的生产产量。还可以看出，酶的添加提高了生物效率。
表8.具有酶添加的蘑菇的生产产量
*生物效率＝新鲜蘑菇的产量(kg)/培养材料的干重(kg)×100％。
实例5：通过向底物中添加酶来提高杏鲍菇蘑菇的产量
方法和步骤
1.制备培养底物
将包含35％按重量计的锯末、35％按重量计的玉米芯、20％按重量计的糠、5％按重量计的玉米粉、4％按重量计的大豆粉和1％按重量计的石灰粉的材料进行混合。然后向这些材料中添加水，并且使水分含量为66％-68％，pH保持为6.5。充分混合后，将该培养底物分散进入几个袋中，每个袋550g干物质。
2.酶处理和灭菌
对于灭菌前用酶处理的这些试验组，根据表9将相应的酶与水加入组“2-4”中并充分混合，然后将这些材料在40℃下孵育24小时。然后将全部底物通过高压灭菌器进行灭菌。将组“1”作为对照，不进行酶处理。
表9.用于杏鲍菇蘑菇栽培的酶的组成。
| 组号 | 纤维素酶 | 半纤维素酶 | 投加点 |
| 1 | - | - | - |
| 2 | 0.55mg/g材料 | 0.14mg/g材料 | 灭菌之前 |
| 3 | 2.20mg/g材料 | 0.58mg/g材料 | 灭菌之前 |
| 4 | 8.80mg/g材料 | 2.30mg/g材料 | 灭菌之前 |
3.接种
将10g固体杏鲍菇种子接种到每袋培养底物中。
4.菌丝体生长
在温度为25℃、空气湿度为60％-65％、10m3/h-16m3/h通风的条件下，杏鲍菇蘑菇的菌丝体在黑暗中生长。菌丝体生长到培养底物的底层需要约60天。将这些袋再保持12天用于后熟。
5.子实体生长
为了子实体生长，在温度为13℃、空气湿度为93％、适度通气以保持CO2浓度低于0.1％和500-800LX的光照下培养杏鲍菇15天。子实体出来后，额外的芽被拾取并且每个袋子仅保留1-2个杏鲍菇芽。然后将条件控制为温度为15℃-17℃、空气湿度为开始时的90％-95％和生长晚期的85％-90％、以及500-1000LX的光照。
结论
杏鲍菇栽培的过程流程图示于图4中。有/无酶处理的产量性能示于表10中。可以看出，具有酶的添加的组“2”和组“3”显著提高了杏鲍菇的生产产量。
表10.具有酶添加的杏鲍菇的生产产量。
*生物效率＝新鲜蘑菇的产量(g)/培养材料的干重(g)×100％。
在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
Claims (15)
1.一种用于栽培蘑菇的方法，该方法包括：
(a)提供一种培养材料，以及
(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
2.如权利要求1所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和任选地一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该酶以每g培养材料约0.005mg至约100mg、优选约0.01mg至约50mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.1mg至约15mg、甚至更优选约0.1mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约10mg酶的量与该培养材料进行混合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该培养材料包括选自下组的纤维素材料，该组由以下各项组成：农业残余物、草本材料、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、糠和木材；优选地，芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、橙皮、稻秸、柳枝稷、小麦秸秆、桉树、冷杉、松树、杨树、云杉、柳树、藻类纤维素、细菌纤维素、废棉、棉短绒、滤纸、锯末、谷物的籽粒以及棉花种子的外壳；更优选地，该培养材料进一步包括粪肥、淀粉、石膏、糖、尿素、过磷酸钙、碳酸钙和/或石灰。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该蘑菇选自下组，该组由以下各项组成：香菇、茶树菇、黑木耳、毛木耳(Auricularia polytricha)、平菇、灵芝、金针菇、猴头菇、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、双孢菇、杏鲍菇、草菇、白灵菇(Pleurotus nebrodensis)、滑菇(Pholiota nameko)、银耳、以及鸡腿菇。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
7.一种用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的方法，该方法包括：
(a)提供一种培养材料，以及
(b)将该培养材料与用于降解或转化纤维素材料的酶进行混合。
8.如权利要求7所述的方法，其中该酶包括纤维素酶和任选地一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中酶以每g的该培养材料约0.005mg至约100mg、优选约0.01mg至约50mg、更优选约0.05mg至约25mg、更优选约0.1mg至约20mg、更优选约0.1mg至约15mg、甚至更优选约0.1mg至约10mg、并且最优选约0.5mg至约10mg酶的量与该培养材料进行混合。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，该方法包括
(a)提供一种培养材料，
(b)将该培养材料与纤维素酶进行混合，
(c)将该培养材料与半纤维素酶进行混合，
其中步骤(b)和步骤(c)同时进行或顺序进行。
11.一种用于蘑菇栽培的酶组合物，该酶组合物包括用于降解或转化纤维素材料的酶；优选地包括纤维素酶和任选地一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、半纤维素酶、淀粉酶、酯酶、棒曲霉素、过氧化氢酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
12.如权利要求11或12所述的酶组合物，其中该酶组合物包括纤维素酶和半纤维素酶；优选地以每g纤维素酶约0.005g至约1.0g、优选约0.01g至约1.0g、更优选约0.15g至约0.75g、更优选约0.15g至约0.5g、更优选约0.1g至约0.5g、甚至更优选约0.1g至约0.5g、并且最优选约0.05g至约0.2g半纤维素酶的量。
13.如权利要求11或12所述的酶组合物用于蘑菇栽培的用途。
14.如权利要求11或12所述的酶组合物用于提高蘑菇产量和/或蘑菇栽培的生物效率的用途。
15.纤维素酶和半纤维素酶用于蘑菇栽培的用途。
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