CN111689585A - 一种采用白腐真菌共培养对罗丹明b降解脱色的方法 - Google Patents

一种采用白腐真菌共培养对罗丹明b降解脱色的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，包括以下步骤：步骤1，菌体培养；分别培养灵芝菌和金针菇菌体；步骤2，脱色培养基共培养；将培养后的灵芝菌和金针菇菌体按1：1比例搭配，转接入脱色培养基中，恒温震荡培养，然后直接用于罗丹明B脱色降解。本发明采用灵芝菌和金针菇共培养的方式，细胞分泌漆酶的化学催化脱色及菌体细胞物理吸附的双重脱色机制，能够对印刷废水特别是罗丹明B进行脱色，方法工艺简单，能够适应高浓度染料环境，耐受性好，脱色效率高，采用生物降解方式，绿色环保，处理效果好。

Description

一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法
技术领域
本发明涉及生物环保领域，尤其涉及一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法。
背景技术
全世界约有100,0000种人工合成染料正被广泛应用于纺织、印染、造纸、化工、皮革、医药及食品等行业，其中仅印染行业消耗的合成染料就达到全球染料的50％以上。虽然合成染料具有化学稳定、色度牢固、酸碱稳定性强等优越的商品特性，但限于整染工艺的低效利用率，每年约有超过10％的残留染料随工业废水排放，导致了严重的环境污染。其中工业应用量较大的偶氮类、蒽醌类、酞菁类、三苯甲烷类等染料不仅色泽鲜艳、结构复杂多样、难以降解，且具有致毒、致畸、致突变等生物危害已有多种化学氧化、物理吸附、光降解等技术相继应用于合成染料的脱色降解，但仍不同程度存在低效、耗时、高成本等不足。如何寻找有效的合成染料脱色、降解方法仍是环境和健康领域面临的重要挑战。
近年来，利用微生物尤其是白腐菌的生长和代谢对合成染料进行脱色、降解，已引起了极大的关注。白腐菌是一类丝状真菌，因附生在树木或木材上，引起木质白色腐烂而得名，能分泌漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等酶系，具有宽泛的底物特异性，可对三苯甲烷类，偶氮类，酞菁类等染料有不同程度的脱色降解。
罗丹明B(RhB)又称玫瑰红B，是一种具有鲜桃红色的人工合成三苯甲烷类染料，广泛应用于纺织印染和化妆品行业。RhB废水色度深、生物毒性大，还具有致癌作用。目前对RhB的处理方法主要有吸附、生物降解和高级氧化等方法。采用现有的单一白腐菌对典型三苯甲烷类染料罗丹明B进行脱色降解处理，发现漆酶活力低，脱色效果不理想。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，针对现有技术中的不足，采用灵芝菌和金针菇共培养，配合碳源、氮源和诱导物，解决了现有的单一白腐菌对典型三苯甲烷类染料罗丹明B进行脱色降解处理，存在漆酶活力低，脱色效果不理想的等问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，包括以下步骤：
步骤1，菌体培养；分别培养灵芝菌和金针菇菌体；
步骤2，脱色培养基共培养；将培养后的灵芝菌和金针菇菌体按1：1比例搭配，转接入脱色培养基中，在30℃、150r/min条件下恒温震荡培养，然后直接用于罗丹明B脱色降解。
通过上述灵芝菌和金针菇共培养方案，灵芝菌和金针菇共培养的漆酶活力显著高于单一白腐菌，且明显高于常规菌种的共培养组合，灵芝菌和金针菇共培养可提高培养基中营养物利用率，降低了产物的反馈抑制，促进漆酶的合成表达量。而共培养组合间的酶活差异源于不同属、种白腐菌间的生长、代谢之间存在协同差异性。通过共培养，可提升微生物的生长性能或代谢强度。
作为本发明的一种优选方案，所述脱色培养基包括碳源、氮源和诱导物。
作为本发明的一种优选方案，所述碳源为果糖；所述氮源为豆饼粉；所述诱导物为ABTS。由于灵芝菌和金针菇共培养过程中对高浓度的染料耐受性仍待强化，因此，采用上述方案对脱色培养基进行改进，以提高脱色效果。
作为本发明的一种优选方案，所述脱色培养基还包括KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和水。
作为本发明的一种优选方案，步骤1，将灵芝菌和金针菇分别切成黄豆粒大小菌块，转移至PDA平板，通过液体PDA培养基，在30℃的环境下，培养5-6天至菌丝基本长满PDA平板。
作为本发明的一种优选方案，所述液体PDA培养基包括200g/L的马铃薯、20g/L的蔗糖、15g/L的琼脂和水。
作为本发明的一种优选方案，所述脱色培养基中，所述果糖为19.89g/L，所述豆饼粉为3.308g/L，所述ABTS为1.566mmol/L。
作为本发明的一种优选方案，所述脱色培养基中，KH2PO4为0.01-0.10g/L,MgSO4·7H2O为0.2-0.8g/L，CaCl2为0.005-0.015g/L，FeSO4·7H2O为0.005-0.015g/L，MnSO4·4H2O为0.005-0.015g/L，ZnSO4·7H2O为0.0005-0.0015g/L，CuSO4·5H2O为0.001-0.003g/L。
通过上述技术方案，本发明技术方案的有益效果是：本发明采用灵芝菌和金针菇共培养的方式，细胞分泌漆酶的化学催化脱色及菌体细胞物理吸附的双重脱色机制，能够对印刷废水特别是罗丹明B进行脱色，方法工艺简单，能够适应高浓度染料环境，耐受性好，脱色效率高，采用生物降解方式，绿色环保，处理效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中各组分的漆酶分泌能力的图表。
图2为实施例2中灵芝菌与金针菇共培养对不同染料的脱色效果图表(第0d加入低浓度染料)。
图3为实施例2中灵芝菌与金针菇共培养对不同染料的脱色效果图表(第5d加入高浓度染料)。
图4为实施例3中不同碳源对共培养体系漆酶活力RhB脱色率的影响的图表。
图5为实施例3中果糖浓度对RhB脱色率及漆酶活力的影响的图表。
图6为实施例3中不同氮源对共培养体系漆酶活力RhB脱色率的影响的图表。
图7为实施例3中豆饼粉浓度对RhB脱色率及漆酶活力的影响的图表。
图8为实施例3中不同诱导物对RhB脱色率及漆酶活力的影响的图表。
图9为实施例3中ABTS对RhB脱色进程的影响的图表。
图10为实施例4中果糖与豆饼粉对RhB脱色率的交互影响图。
图11为实施例4中ABTS与果糖对RhB脱色率的交互影响图。
图12为实施例4中ABTS与豆饼粉对RhB脱色率的交互影响图。
图13为实施例5的吸收光谱分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将保存在4℃斜面的茶树菇、云芝、灵芝、香菇、金针菇分别挑取黄豆粒大小菌块，转接至PDA平板，30℃培养5-6天至菌丝基本长满平板。
随后用打孔器各取一块直径0.5cm的菌块，将茶树菇、云芝、灵芝、香菇、金针菇菌块各自放入PDA液体培养基，以及按1：1比例随机搭配组合，各自转接至PDA液体培养基，150r/min、30℃恒温震荡培养7d后，测定发酵液漆酶活力。
液体PDA培养基(g/L)：马铃薯200，蔗糖20，琼脂15，水1000mL，pH自然。
漆酶活力测定：取适当稀释的漆酶液0.6mL，加入2.4mL愈创木酚缓冲液，30℃水浴30min，在465nm处测定其吸光度变化。漆酶活力定义为每分钟氧化一微摩尔愈创木酚所需的酶量。每个实验设置3次重复，结果取平均值，数据分析与图表处理采用origin 201864bit软件。
结合图1，经单独培养以及组合搭配后，共培养体系中的漆酶活力显著高于单一白腐菌，均有不同程度的提高，且各组合菌株的漆酶分泌能力存在显著差异，而灵芝菌与金针菇共培养所产漆酶活力又明显高于其他共培养体系，达到42.5U/L。
实施例2
采用实施例1的方法，用基本脱色培养基代替PDA液体培养基，分别在第0d及第5d加入终浓度5mg/L-800mg/L的孔雀石绿、罗丹明B、甲苯胺蓝、酸性橙ΙΙ、酸性大红、直接耐晒蓝GL，培养8d后，取培养液，测定各染料的脱色率，比较灵芝菌和金针菇共培养对不同染料及其加入时机的脱色效果影响。
脱色率测定：
Figure BDA0002453284240000051
其中A0为染料原始吸光值，A1为脱色液吸光值。
基本脱色培养基(BM)(g/L):葡萄糖20，酵母浸粉3.0，KH2PO40.05,MgSO4·7H2O0.5，CaCl20.01，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.001，CuSO4·5H2O 0.002，水1000mL。
为考察共培养体系中合成染料加入时机及染料浓度对脱色效果的影响，分别采取在第0d及第5d将各类型染料接入灵芝菌与金针菇共培养体系，继续培养后，取样测定各染料的脱色率，结果如图2、图3所示。图2表明，染料与组合菌株同时加入培养基中时，在5mg/L的低浓度下，灵芝菌和金针菇共培养能有效脱色降解偶氮类染料(DB86、AO、ARGR)、三苯甲烷类染料(RhB、MG)和酞菁类染料(TB)，脱色率均在70％以上。染料浓度提升10倍后，培养物中未见菌丝球增殖，脱色率不足5％，这是因为合成染料本身对微生物的生长有毒性，培养之初即加入高浓度的染料，严重抑制了白腐菌的生长，基本无法脱色染料。图3结果表明，先对灵芝菌和金针菇组合菌进行适应性培养后第5d再加入合成染料，在50mg/L-800mg/L浓度范围内，各类型染料均被良好脱色，脱色率均接近90％以上。对于RhB而言，400mg/L浓度以下同样有良好的脱色效果，继续提高其添加浓度后，脱色效果急剧下降，浓度800mg/L时，脱色率不足30％。以上结果表明，灵芝菌和金针菇共培养时，采用RhB延迟加入方式，有利于其脱色降解，但组合菌对高浓度的染料耐受性仍待强化。
从实施例2中可以看出，为得到更好的脱色效果以及对高浓度的染料的耐受性，需要对基本脱色培养基进行优化。
实施例3
采用实施例2的方式，将基本脱色培养基中的葡萄糖、酵母浸粉分别用相同质量浓度的碳源(蔗糖、果糖、可溶性淀粉、半乳糖、麦芽糖、右旋糖40)、氮源(硫酸铵、豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵、尿素)进行替换，并分别加入1mM的诱导物(ABTS、阿魏酸、丁香醛、邻苯二酚、愈创木酚、Cu2+)，其他条件不变。按1：1比例转接入灵芝菌与金针菇菌体，30℃恒温震荡培养5d后，加入800mg/L的RhB，继续培养3天后，收集培养液，8000r/min离心5min后，测定上清液脱色率，考察不同碳源、氮源、诱导物及其添加量对RhB脱色的影响，确定各自较优的浓度水平。
不同碳源对RhB脱色效果的影响见图4。由图4可知：灵芝菌与金针菇共培养体系中施以不同类型碳源时，所产的漆酶活力及RhB脱色率均存在显著差异。漆酶活力的差异性可能源于微生物对不同结构糖类的利用效率不同，从而导致其代谢分泌漆酶活力的差异，继而呈现出不同的RhB脱色效果。其中以果糖的产漆酶活力及脱色效果最佳，分别达到114.45U/L及48％。
结合图5，在10-30g/L范围内改变果糖添加量，共培养体系的漆酶生产能力及RhB脱色性能呈现出显著的果糖浓度依赖性。随着果糖浓度的增加，漆酶活力及RhB脱色率同步升高，浓度为20g/L时，分别达到最高值108.43U/L及44％，继续提升果糖添加量，漆酶活力呈现显著下降趋势，RhB脱色率也同步降低。这种低浓度促进，高浓度抑制的现象，源于微生物代谢中的碳阻遏效应抑制了相关RhB脱色酶系的分泌量，继而导致脱色性能的下降。
不同氮源对共培养体系漆酶活力及RhB脱色性能的影响见图6。由图6可知：添加蛋白胨，豆饼粉及酵母浸粉时，所产漆酶活力及RhB脱色率均显著高于硝酸铵、硫酸铵等无机氮源的添加效果，其中以豆饼粉的效果最优，漆酶产量及脱色率分别达到142.79U/L、36％。豆饼粉等有机氮源除提供营养物供给微生物生长外，复杂的内含成分会不同程度诱导促进漆酶的合成，相应提升了漆酶催化脱色RhB的性能。实验中同时发现，大分子有机氮源的溶解性相对低于硫酸铵等化学合成氮源，其培养的菌丝球着色度较高，表明豆饼粉等对RhB也存在一定的物理吸附作用。
结合图7，整体上漆酶活力的变化趋势与RhB脱色率的变化趋势呈现一致性，二者均随豆饼粉的浓度增加而升高，2.5g/L浓度下分别达到最高值157.79U/L、42％，继续提高豆饼粉浓度，漆酶活力及脱色率均呈现下降趋势。以上表明：RhB的脱色主要是由共培养体系所分泌的漆酶催化引起的，因此二者的变化呈现一致性；而过高浓度的豆饼粉则可能因为氮阻遏效应抑制了漆酶的分泌，降低了脱色率。
不同诱导物对RhB脱色率及漆酶活力的影响见图8。当添加1mM浓度的小分子诱导物时，会显著影响共培养体系的漆酶活力及脱色率，其中以ABTS的漆酶诱导活力最强，脱色效果也最高，分别达到497.73U/L及87％左右。有研究表明，Cu2+会促进漆酶活力的提升，且阿魏酸、丁香醛等也是漆酶的小分子诱导物，均有利于漆酶的合成。本实验结果则显示，除ABTS外，其他诱导物对漆酶活力均无提升效果，甚至出现抑制现象。其原因在于化学合成的小分子介体物质多对微生物有剂量性细胞毒性，尤其是在高浓度添加时，会对细胞的生长产生明显抑制，造成产酶能力下降。
为比较ABTS添加对共培养体系RhB脱色的影响，分别测定了共培养体系中有无ABTS添加情况下RhB脱色率的时间进程曲线，结果见图9。图9表明，ABTS介入共培养体系可显著提升RhB的脱色效率，12h脱色率即达到44％，32h后脱色率即可超过90％，而无ABTS培养体系的脱色率全程低于30％。ABTS在RhB脱色进程中充当了介体物质，通过降低漆酶与RhB间的氧化还原电位差，降低高浓度底物对漆酶的抑制作用，提高了脱色反应速率，使脱色率大幅提升。
实施例4
在实施例3的基础上，进一步进行多因素优化实验。根据单因素实验所确定的因素种类及其各自较优水平，以碳源浓度(X1)、氮源浓度(X2)和漆酶诱导物浓度(X3)为自变量，以RhB脱色率(Y)为因变量，设计三因素三水平响应面实验，进行培养基优化。因素水平设计见表1。
表1为响应面因素水平表
Figure BDA0002453284240000071
选取果糖、豆饼粉和ABTS，设计三因素三水平Box-Behnken实验，进行多因素实验优化。实验结果如表2所示，得到变量X1、X2和X3与Y脱色关系的数学回归模型：
Y(脱色率％)＝94.38+1.35X1+2.11X2+7.14X3-3.13X1X2-0.68X1X3+0.2X2X3-3.79X1 2-3.47X2 2-6.36X3 2
表2为响应面实验设计及结果
Figure BDA0002453284240000081
结合表3，进行回归模型的方差分析，该模型P＜0.0001，极显著，失拟项不显著，相关系数R2＝0.9918，表明相关性良好；校正系数R2adj＝0.9812，说明模型的拟合程度良好。三因素中对RhB脱色率影响效果为ABTS>果糖>豆饼粉，均达到极显著水平，其中二次项果糖与豆饼粉对脱色率的影响存在明显交互作用。
对回归模型求解得X1＝-0.0055，X2＝0.3233，X3＝0.566，对应的营养培养条件为：果糖为19.89g/L，豆饼粉为3.308g/L，ABTS为1.566mmol/L，在此条件下，灵芝菌与金针菇共培养体系对RhB的理论脱色率为96.73％。三次重复验证实验RhB的平均脱色率达到93.42％，与理论值相对误差约为3.31％，表明该模型可以较好实际指导共培养体系进行RhB脱色降解。
表3响应面ANOVA分析
Figure BDA0002453284240000091
注：P值<0.05，*表示显著；P值＜0.01，**表示极显著。
响应面分析
所选浓度范围内，碳源、氮源、诱导物对共培养体系处理RhB脱色效果的交互影响，见图11、图12、图13。
由图10可知，随着果糖和豆饼粉浓度不断增大，RhB脱色率先增加后降低，二者存在最佳浓度水平值。低浓度果糖、豆饼粉导致营养供给不足，抑制了白腐菌的生长及漆酶分泌，进而会对RhB的脱色性能产生影响。因此维持合适的碳氮比对于白腐菌共培养体系是至关重要的。等高线变化疏密显示出果糖浓度的变化对RhB脱色率的影响大于豆饼粉，二者交互作用明显。
由图11可知，在所选浓度范围内，ABTS和果糖对RhB的脱色率影响存在极大值，且曲面陡峭程度表明ABTS对脱色率的影响程度要高于果糖。ABTS作为一种小分子介体物质加入培养体系中，通过降低漆酶催化反应的氧化还原电位而加速催化脱色反应，过高的浓度则可能会对微生物细胞产生生理毒性，会显著影响RhB的脱色效果。
由图12可知，RhB脱色率随豆饼粉浓度的升高而缓慢增加，过高的豆饼粉可能产生了氮阻遏效应，抑制了白腐菌的代谢，造成RhB脱色率也随之下降。ABTS对RhB脱色率的影响呈现低浓度促进，高浓度抑制效应，且其影响程度也远高于豆饼粉，与方差分析结果一致。
实施例5
分别设置单纯RhB染料对照组(A：RhB)、灵芝菌和金针菇共培养脱色RhB组(B：U281:I16+RhB)、ABTS介导的灵芝菌和金针菇共培养脱色RhB组(C：U281:I16+RhB+ABTS)、漆酶脱色RhB组(D：Lac+RhB)、ABTS介导的漆酶脱色RhB组(E：Lac+RhB+ABTS)，进行吸收光谱分析。
结合图13，RhB(A)染料在可见光区519nm处存在1个特征吸收峰，在354nm附件也有特征吸收峰呈现。其中，519nm处吸收峰主要源于其共轭结构中C＝N和C＝O结构，紫外光区的吸收主要来自RhB的苯环结构。RhB经灵芝菌和金针菇共培养处理后(B、C)，519nm及354nm处的吸收峰均下降，尤其以ABTS介导的灵芝菌和金针菇共培养体系中(C)，可见光区519nm处吸收峰显著降低，溶液颜色也从红色趋于无色，表明RhB中的发色基团被逐渐破坏，同时354nm处吸收峰基本消失，说明RhB的苯环结构同时受到了破坏。这种ABTS介导的RhB吸收峰的显著下降在漆酶体外脱色体系中同时存在(D、E)，表明无论是白腐菌活细胞脱色还是游离漆酶体外脱色，ABTS均起到了关键介体作用。对比灵芝菌和金针菇共培养脱色体系(C)与漆酶脱色体系(E)，可见C组的脱色效果显著高于E组，其原因在于灵芝菌和金针菇共培养体系中除了白腐菌分泌的漆酶可催化降解部分RhB外，菌体细胞的物理吸附也对RhB的脱色起到积极作用。因此，白腐菌共培养处理RhB过程中，包含了细胞分泌漆酶的化学催化脱色及菌体细胞物理吸附的双重脱色机制。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，菌体培养；分别培养灵芝菌和金针菇菌体；
步骤2，脱色培养基共培养；将培养后的灵芝菌和金针菇菌体按1：1比例搭配，转接入脱色培养基中，在30℃、150r/min条件下恒温震荡培养，然后直接用于罗丹明B脱色降解。
2.根据权利要求1所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述脱色培养基包括碳源、氮源和诱导物。
3.根据权利要求2所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述碳源为果糖；所述氮源为豆饼粉；所述诱导物为ABTS。
4.根据权利要求3所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述脱色培养基还包括KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和水。
5.根据权利要求4所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，步骤1，将灵芝菌和金针菇分别切成黄豆粒大小菌块，转移至PDA平板，通过液体PDA培养基，在30℃的环境下，培养5-6天至菌丝基本长满PDA平板。
6.根据权利要求5所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述液体PDA培养基包括200g/L的马铃薯、20g/L的蔗糖、15g/L的琼脂和水。
7.根据权利要求5所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述脱色培养基中，所述果糖为19.89g/L，所述豆饼粉为3.308g/L，所述ABTS为1.566mmol/L。
8.根据权利要求5所述的采用白腐真菌共培养对罗丹明B降解脱色的方法，其特征在于，所述脱色培养基中，KH2PO4为0.01-0.10g/L,MgSO4·7H2O为0.2-0.8g/L，CaCl2为0.005-0.015g/L，FeSO4·7H2O为0.005-0.015g/L，MnSO4·4H2O为0.005-0.015g/L，ZnSO4·7H2O为0.0005-0.0015g/L，CuSO4·5H2O为0.001-0.003g/L。
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