新颖类单醣的甘胺酸化糖醇组成物在设计与开发抗糖尿病药
物上的使用方法
发明人:
林希龙(亚凯迪亚,加州),林羿秀(亚凯迪亚,加州),林怡彣(尔湾,加州),以及张钦次(喜瑞都,加州)。
优先权:
本发明要求以2014年1月26日提交的申请号为61/931,650,标题为“用于体外及生物体内递送核酸系药物的糖醇系复合物的组成及配方”的美国临时申请案为其优先权。本发明还要求以2014年9月13日提交的申请号为62/050,107,标题为“用于糖尿病治疗的新颖类单醣的甘胺酸化糖醇组成物”的美国临时申请案为其优先权。本发明还要求以2014年8月12日提交的申请号为14/457,829,标题为“用于生物体内及体外递送核酸系药物的新颖糖醇系组成物”的美国申请案为其优先权。本发明还要求以2014年9月25日提交的申请号为62/054,981,标题为“用于糖尿病治疗的新颖类单醣的甘胺酸化糖醇组成物”的美国申请案为其优先权。
技术领域
本发明是关于一种新颖似糖的化学组成物以及其在糖尿病治疗上的使用方法。具体而言,本发明教示以类单醣的经修饰的糖醇组成物取代病患吸收的糖类的使用方法,并由以处理糖尿病。该些新颖糖醇组成物透过一称“甘胺酸化”的反应修饰为甘胺酸化糖醇以模拟单醣。因此,本发明提供以该些甘胺酸化糖醇降低人类肠内的糖摄取的新颖使用方法,并因此预防糖尿病患者于餐后发生的高血糖症状。此外,本发明首次教示似糖醇及糖的化学化合物可经甘胺酸化修饰,由以降低其在糖尿病患者体内的病理效应。因此,本发明不仅包含一新颖似糖的化学组成物及其在治疗糖尿病上的使用方法,并包含透过甘胺酸化生产此新颖组成物的最佳步骤与方法学。
背景技术
第一型糖尿病(Diabetes mellitus(DM)),又称diabetes,为一类代谢疾病,其在人类以及其他哺乳类例如小鼠身上发生长期高血糖症状。此高血糖症状包含高血糖水平(即>140mg/dL)、频尿、易口渴及饥饿,以及更严重者为酮酸中毒(diabeticketoacidosis)及高渗压昏迷(hyperosmolar coma)。长期高血糖症状常导致心脏疾病、中风、肾衰竭、四肢溃疡、眼损伤以及肥胖症。糖尿病有两种类型:第一型糖尿病(type-I DM)起因于胰腺不足量胰岛素的生产(或称胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)),以及第二型糖尿病(type-II DM)起因于身体无法对胰岛素产生反应(或称胰岛素阻抗;非胰岛素依赖性糖尿病;NIDDM)。在治疗上,第一型糖尿病(type-I DM)透过胰岛素注射来处理;第二型糖尿病(type-II DM)不一定透过胰岛素处理,而是再依据胰岛素阻抗的病理原因。
目前针对第二型糖尿病的药物治疗可分为五类:第一类药物可提增胰腺的胰岛素产生,例如磺酰尿素类(Sulfonylureas)、美格替耐(Meglitinides)以及Stitagliptin;第二类药物降低肝脏的糖生成,例如为Metformin;第三类药物增加经由尿液的糖分排泄,例如为Canagliflozin;第四类药物降低脂肪组织以及肌肉中的胰岛素阻抗,例如为噻唑烷二酮类(Thiazolidinediones);最后一类药物延迟及/或降低肠内的糖吸收,例如为α-葡萄糖苷酶抑制剂(alpha-glucosidase inhibitors)。然而,由于这些药物针对某些天然代谢路径的动力学性质,其常常呈现不同程度的副作用包含低血糖(磺酰尿素类、美格替耐、Stitagliptin以及α-葡萄糖苷酶抑制剂)、肾衰竭(Metformin以及Canagliflozin)、心脏衰竭(Metformin以及噻唑烷二酮类)、肠胃道问题(Metformin以及α-葡萄糖苷酶抑制剂)、以及水肿与贫血(噻唑烷二酮类)。在某些较为糟糕的情况下,甚至有死亡的报导出现。
处理第二型糖尿病并预防肾衰竭以及心脏衰竭等致命问题最好的方式为延迟及降低肠内糖的吸收;然而,在不失去能量提供的条件下。目前例如α-葡萄糖苷酶抑制剂此类的抗糖尿病药物,具有抑制肠内将碳水化合物转换为单醣的酵素的功能,并因此阻碍肠内的糖吸收。然而,未经消化的碳水化合物可能与结肠细菌反应,并引发肠胃道方面的问题如胀气以及腹泻。就好的一方面来说,此副作用有助于减少肥胖,然而,阻断糖的吸收也意谓身体失去能量的供应。因此,α-葡萄糖苷酶抑制剂过量可以导致糖尿病患者的急性低血糖。
近来,糖类及糖类代替物如人工甜味剂恶化糖尿病患者的糖不耐受性的情况已受到进一步注意(Suez et al.,(2014)Nature in press,doi:10.1038/nature13793)。
总而言之,目前在处理第二型糖尿病方面尚无安全的药剂/物或糖类代替物,其同时能维持正常的身体能量供应。因此,有需要发展一新颖抗糖尿病组成物,其不但能减低肠内糖的吸收,并提供身体另一能量来源。
发明内容
干细胞如同藏宝盒,含有各种有效成分可用于设计及开发美容、药学以及治疗性药物及/或应用。所述药物及/或应用包含但不限于引发及增进生物体细胞/组织/器官再生、修复/愈合受伤组织与器官、更生老化细胞/组织/器官、处理退化性疾病(即癌症、糖尿病、骨质疏松、帕金森氏症与阿兹海默症……等等),以及避免肿瘤/癌症发生、发展及/或转移。基于这些潜质,发明人于2008上半年开发一生产以微型核糖核酸诱发的多能性干细胞(iPSCs)的新颖技术(Lin等人,2008,2010及2011)且成功使用该iPSCs作为筛选、鉴定、分离以及生产潜在可用于临床测试及使用的药物原料(Chen与Lin,(2013)Recent Patents onRegenerative Medicine 3,5-16)。
糖醇(sugar alcohols)为一种衍生自糖的多元醇(polyol alcohols,polyhydricalcohol,polyalcohol,glycitol)的通类;糖醇在iPSCs的早期也发现有大量甘胺酸化的发生。依据化学上对于聚合物的定义,多元醇(polyol)为具有数个活性的可参与有机反应的氢氧基的化合物,其中聚合的多元醇(polymeric polyols)常具有聚醚或聚酯的态样。大部分的糖醇为白色、水溶性的自然发生的物质,且常用于美容、药学以及食品工业,作为保湿剂、增稠剂以及甜味剂。糖醇一般以化学式H(HCHO)n+1H表示,其化学式异于糖的H(HCHO)nHCO。再者,糖醇不像糖,后者倾向形成环状结构。然而,糖醇能够经脱水形成环状醚,例如山梨糖醇经脱水形成异山梨酯(isosorbide)。糖醇具有不同的链长且链的每一碳分子连接有一氢氧基(OH)。糖醇进一步因其氢氧基的相对方位(立体化学)而有分别;举例来说,甘露糖醇和山梨糖醇为异构物,享有相同的化学式C6H8(OH)6,但第二碳原子(C2)上的氢氧基的方位相异。属于常见类型的糖醇包含但不限于醛醣醇(alditol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、赤藻糖醇(丁四醇)(erythritol)、海藻糖醇(fucitol)、半乳糖醇(galactitol)、甘油(丙三醇)(glycerol,glycerin)、艾杜糖醇(iditol)、肌醇(inositol)、异麦芽酮糖醇(巴糖醇)(isomalt)、乳糖醇(lactitol)、麦芽糖醇(maltitol)、甘露糖醇(mannitol)、聚葡糖醇(氢化葡萄糖)(polyglycitol)、山梨糖醇(sorbitol)、苏糖醇(threitol)、庚七醇(volemitol),以及木糖醇(xylitol)。
糖醇可分为三类:单甘胺酰甘油(monoglycylated glycerol,MGG)、双甘胺酰甘油(diglycylated glycerin,DGG),以及三甘胺酰甘油酯(triglycylated glyceride,TGG)。使用高效能液相层析法,吾人可分离出并收集纯的MGG及部分混合的DGG与TGG(图1)。进一步的立体化学分析显示MGG的结构类似单醣类如葡萄糖、果糖,以及半乳糖;DGG与TGG的结构则与双醣类相似。由于结构上的相似,MGG或许可取代单醣而干扰以及减低糖尿病患者的糖吸收。
本发明最先识别及揭示此新颖的似糖(sugar-like)的甘胺酸化糖醇化合物可用于处理糖尿病。进一步而言,本发明的目的在于提供甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇组成物在治疗糖尿病的高血糖症状和肥胖症的问题上的使用方法;该方法包含投予一含有甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇的组成物,其中该甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇来自经甘胺酸化反应修饰的至少一糖醇或至少一糖;其中该至少一糖醇具有H(HCHO)n+1H的化学式,而该至少一糖具有H(HCHO)nHCO的化学式。
本发明提供一种组成物,用于开发糖尿病的高血糖症状和肥胖症的治疗。该组成物包含一甘胺酸化糖或一甘胺酸化糖醇,其中该甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇来自经甘胺酸化反应修饰的至少一糖醇或至少一糖;其中该糖醇具有H(HCHO)n+1H的化学式,而该糖具有H(HCHO)nHCO的化学式。
附图说明
图示及实施例的特别参照仅作为说明的用途但不为限制。
图1示意以高效能液相层析法分离DGG/TGG与MGG;
图2A示意中度脱水的甘胺酸化的化学反应及其所生成的单甘胺酸化糖醇(单甘胺酰糖醇)(monoglycylated sugar alcohols MGG),其中该单甘胺酸化糖醇包含1-单甘胺酰甘油、3-单甘胺酰甘油,以及2-单甘胺酰甘油。单甘胺酰甘油的化学式依pH状态为NH2CH2CO(HCHO)3H或NH3 +CH2CO(HCHO)3H。
图2B与2C示意高度脱水的甘胺酸化及所生成的双甘胺酸化糖醇(DGG)及三甘胺酸化糖醇(TGG)。以甘油(丙三醇)的甘胺酸化为例,会有两种高甘胺酸化产物:其一为双甘胺酰甘油(2B;DGG),另一为1,2,3-三甘胺酰甘油酯(2C;TGG)。
图3示意甘胺酸化糖醇如MGG在细胞内的代谢的概念图。举例来说,由于结构上的相似性,MGG透过GLUT2-介导的携带式输送或胞饮作用吸收。由细胞摄取后,MGG经由类似于糖解作用的机转处理为丙酮酸;丙酮酸在其他重要的生物代谢例如克式循环(Krebscycle)及糖质新生上有作用。
图4示意含有甘胺酸化糖醇的抗糖尿病药物在患糖尿病小鼠的高血糖症状上的生物体内治疗效果。(小鼠:雄性,8周大C57BL/6J,共6只)
图5示意甘胺酸化糖醇在具有饮食所致肥胖症的小鼠身上在体重变化上的效果。(小鼠:雄性,8周大C57BL/6J,共6只)
具体实施方式
图2A-2C所示为一新颖化学反应-糖醇的甘胺酸化;经由该化学反应生产MGG、DGG以及TGG的。先前仅观察到胺基酸间甘胺酸化的发生,然未曾于糖醇或糖当中发现此一反应。如此处所作的定义,甘胺酸化(甘胺酰化)为糖醇或糖的氢氧基(HO-)由甘胺酸的甘胺酰基(NH2CH2COO-或NH3 +CH2COO-)取代的一化学反应;此反应且在该糖/糖醇的氢氧基移掉的碳原子与该甘胺酰基(glycyl group)之间形成醚键(R-O-R)。此反应包含脱水发生的缩合反应。在以甘油(丙三醇)为糖醇的甘胺酸化当中,将有三种甘胺酸化产物:其一为1-、2-、或3-单甘胺酰甘油(MGG;图2A),另一为1,2-、或2,3-、或1,3,-双甘胺酰甘油(DGG;图2B),以及最后1,2,3-三甘胺酰甘油酯(TGG;图2C)。在此例中,甘胺酸化可为部分或完全反应;举例来说,MGG及DGG为部分甘胺酸化的产物,而TGG为完全甘胺酸化的产物。由于MGG、DGG以及TGG在酸性条件下如肠胃道系统(GI)内带负电,因此对于吸收糖进入细胞的葡萄糖转运子(GLTU)具有高亲和力。因此,MGG/DGG/TGG与GLUT的结合防止糖通过GLUT吸收进入体内,特别是GI系统内。同样的,相似于糖醇,单糖等包含葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖以及乳糖也得以经甘胺酸化修饰,而用于降低糖尿病患者的糖摄取。
如同天然的糖,该些甘胺酸化糖醇能经由葡萄糖转运子(GLUT)及/或GLUT调控的内吞作用吸收进入人类细胞。举例来说,图3表示在人类肝细胞HepG2中,大部分MGG经由GLUT2[又称溶质载体家族2(促葡萄糖转运子)成员2(SLC2A2)],透过蛋白质构形变化以及转运机制所吸收。然而,一些MGG以及大部分的DGG以及TGG与GLUT2因高亲和力结合,因此阻碍糖流入需要的构形变化。在其他途径中,细胞活化另一内吞机制,随着GLUT2与MGG/DGG/TGG的结合摄入GLUT2,导致细胞表面上GLUT2的减少以及降低肠胃道(GI)细胞的糖吸收。
细胞内甘胺酸化糖醇详细的代谢“甘胺酰甘油解(glycylglycerolysis)”表示于图3。在吸收进到细胞内后,甘胺酸化的糖醇例如MGG将首先经处理为二羟丙酮磷酸盐(dihydroxyacetone phosphate(DHAP)),接着变成其异构体D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate(GADP))。之后,甘油醛磷酸脱氢酶(GADPH)将GADP转变为D-1,3-双磷酸甘油酸(D-1,3-bisphosphoglycerade(1,3-BGP)),后者接着由磷酸甘油酸激酶(PGK)催化为3-磷酸甘油酸(3-PG),再经磷酸甘油酸变位酶(PGM)转变为2-磷酸甘油酸(2-PG),接着再由烯醇酶转变为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。最后,在PEP经由一激酶(PK)转换为丙酮酸后,终产物:丙酮酸最后能由细胞利用来产生能量(透过克氏循环或柠檬酸循环),生产糖(透过糖质新生),并且参与其他细胞代谢。因此,该些甘胺酸化糖醇不仅能降低糖尿病患者血中糖的水平,并可作为另一能量来源,由以预防常见于过量抗糖尿病药物如α-葡萄糖苷酶抑制剂的急性低血糖症。
由于甘胺酸化糖醇透过降低人类肠胃系统内的糖吸收来发挥功能,以口服方式投予为递送此类药物的最佳方法。此外,生产甘胺酸化糖醇的原料为糖醇及甘胺酸,一方面两者为膳食来源,且此类药物经过测试,显示在小鼠(四十分之一的身体重)体内剂量达1克时没有毒性或低血糖的征象。然而在高剂量(>0.65克/每只小鼠)组别,当中15%~20%的小鼠可在餐后观察到轻度至中度的腹泻。为进一步测试其在处理糖尿病及肥胖症上的药效,发明人在餐前喂食每只饮食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(n=3)1毫升的1毫克纯化的MGG;此外,另以1毫升双蒸水喂食控制组C57BL/6J小鼠(n=3)。在投予药物后,每只小鼠每餐喂食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠饲料的高碳水化合物餐食。接着,于餐后0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小时,以Bayer Contour Next USB系统测全血糖水平。在全长4小时的测量期间停止水的摄取。
图4示意血糖水平的变化结果。以MGG处理的小鼠,血中葡萄糖经测量在餐后0小时为85、91、77mg/dL(平均值84.3±7.0mg/dL);在餐后0.5小时为135、147、121mg/dL(平均值134.3±13.0mg/dL);在餐后1小时为157、151、147mg/dL(平均值151.7±5.5mg/dL);在餐后1.5小时为155、131、158mg/dL(平均值148±13.4mg/dL);在餐后2小时为129、137、133mg/dL(平均值133±4.0mg/dL);在餐后2.5小时为97、121、101mg/dL(平均值106.3±12.0mg/dL);在餐后3小时为91、89、88mg/dL(平均值89.3±1.5mg/dL);在餐后3.5小时为93、85、83mg/dL(平均值87±5.0mg/dL)以及餐后4小时的88、93、85mg/dL(平均值88.7±4.0mg/dL)。基于所测得的数据可相比于从常人身上测得的数据,发明人推论出以甘胺酸化糖醇如MGG处理,显然可以在患糖尿病的个体摄取高碳水化合物的餐食后,维持个体接近/似正常的血糖水平。另一方面,未处理的控制组小鼠,血中葡萄糖经测量在餐后0小时为73、79、88毫克/公合(平均值80±7.5毫克/公合);在餐后0.5小时为255、167、315毫克/公合(平均值245.7±74.0毫克/公合);在餐后1小时为375、267、415毫克/公合(平均值345.7±74.0毫克/公合);在餐后1.5小时为315、281、379毫克/公合(平均值325±49.0毫克/公合);在餐后2小时为295、285、311毫克/公合(平均值297±13.0毫克/公合);在餐后2.5小时为264、284、315毫克/公合(平均值287.7±25.5毫克/公合);在餐后3小时为171、222、299毫克/公合(平均值230.7±64.0毫克/公合);在餐后3.5小时为157、199、285毫克/公合(平均值213.7±64.0毫克/公合)以及餐后4小时的143、166、213毫克/公合(平均值173.7±35.0毫克/公合)。发明人进一步比较从经MGG处理的小鼠获得的数据与从未经处理小鼠身上获得的数据,发现以甘胺酸化糖醇处理得以显著降低葡萄糖吸收以及血糖值,因此成功地防止患糖尿病的动物身上的高血糖症状。
此外,在MGG处理的小鼠身上亦观察到体重损失;相较之下,控制组没有体重的损失。如图5所示,糖尿病C57BL/6J小鼠(n=3)在每餐(每日三次高碳水化合物餐食)前以1毫克MGG处理(溶于1毫升双蒸水)约一个月,之后,在小鼠身上观察到约16%~30%(平均值23%)体重的损失;相较之下,仅以1毫升双蒸水处理的控制组小鼠(n=3)获得平均超过49%的体重。此结果明显指出甘胺酸化糖醇对生物体另一潜在的在治疗肥胖症上的用途,特别是与糖尿病相关的肥胖症的用途。
基于上述实验结果,发明人证实本发明的新颖甘胺酸化糖醇组成物不仅能用于治疗糖尿病的高血糖症状以及肥胖症的问题,亦可预防常见于其他抗糖尿病药物的低血糖风险。因此,此透过与单醣类竞争而阻碍或减少肠胃道系统内糖摄取的新药可为糖尿病患者带来一更安全以及更有效的治疗。值得注意的是,由于所有用于制造甘胺酸化糖醇组成物的原料全然没有毒性且根据食品与药物管理局(FDA)的规定,是安全的,此新颖抗糖尿病药物亦能作为膳食补充品,用于糖尿病患者的每日照护。
A.定义
为增进对本发明的了解,将数个名词定义如下:
处理的细胞:单一或多个人类或动物细胞,选自由体细胞、组织细胞、干细胞、生殖腺细胞、肿瘤细胞、癌细胞及其组合组成的群。
甘胺酸化(甘胺酰化):一化学反应,其中糖醇或糖的氢氧基(-OH)由甘胺酸或甘胺酰胺基酸的甘胺酰基(NH2CH2COO-或NH3 +CH2COO-)取代,且在该糖醇/糖的移掉氢氧基的碳原子与该甘胺酸及/或甘胺酰胺基酸的甘胺酰基(glycyl group)之间形成醚键(R-O-R)。
药学及治疗上的应用:生物医学方面的使用,用于诊断的处理方法、装置及/或设备,干细胞产生,干细胞研究及/或治疗开发,组织/器官修复及/或再生,伤口愈合处理,肿瘤抑制,癌症治疗及/或预防,疾病处理,糖尿病与肥胖处理,药物生产,及以上的组合。
原核细胞:一单细胞生物,该单细胞生物缺乏明显膜包围(membrane-bound)的细胞核,且其遗传物质以DNA的连续链(continuous strand)的形式存在;该单细胞生物例如为细菌、古细菌。
真核生物或真核细胞:一单细胞或多细胞生物,该单细胞或多细胞生物的细胞含有有膜包围的细胞核及其他构造(胞器);该单细胞或多细胞生物例如为酵母菌、植物、动物。
B.组成物及应用
本发明揭露一新颖的甘胺酸化糖醇组成物及其在治疗糖尿病的高血糖症状和肥胖症的问题上的使用方法,其中该甘胺酸化糖醇组成物含有经甘胺酸化反应修饰的至少一糖醇或至少一糖。
此外,本发明亦教示一新颖甘胺酸化的方法及其在制造带正电糖醇与糖的化合物上的使用方法,其中该带正电糖醇与糖的化合物能透过静电亲合力(electrostaticaffinity)及/或结构相似性(structural similarity)干扰带负电的物质如细胞表面受器及穿膜转运子。
本发明所揭露的甘胺酸化糖醇/糖组成物、以及糖醇与糖的甘胺酸化反应首次于本申请案所主张美国优先权案(申请号14/457,829,申请日2014年8月12日,发明名称“用于生物体内及体外递送核酸系药物的新颖糖醇系组成物”)。进一步来说,此甘胺酸化糖醇及/或糖在治疗糖尿病以及肥胖症上的使用方法全然新颖且先前未曾报导过的。此外,于本发明中首次揭露的关于甘胺酸化糖醇的代谢,有助开发治疗相关代谢疾病例如糖尿病与肥胖症的医药及/或膳食补充品。
实施例
在以下的实验揭露中,所用的简称如下:M(莫耳,molar);mM(毫莫耳,millimolar);μm(微莫耳,micromolar);mol(摩耳,moles);pmol(微微摩耳,picomole);gm(公克,grams);mg(毫克,milligrams);μg(微克,micrograms);ng(毫微克,nanograms);L(公升,liters);ml(毫升,milliliters);μl(微升,microliters);℃(摄氏度,degreesCentigrade);RNA(核糖核酸,ribonucleic acid);DNA(去氧核糖核酸,deoxyribonucleicacid);dNTP(去氧核糖核苷三磷酸,deoxyribonucleotide triphosphate);PBS(磷酸盐缓冲液,phosphate buffered saline);NaCl(氯化钠,sodium chloride);HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸,N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid);HBS(HEPES缓冲液,HEPES buffered saline);SDS(十二烷基硫酸钠,sodiumdodecylsulfate);Tris-HCl(三羟甲基胺基甲烷-氯化氢,tris-hydroxymethylaminomethane-hydrochloride);ATCC(美国菌种保存中心,American TypeCulture Collection,Rockville,MD);hESC(人类胚胎干细胞,human embryonic stemcells);以及iPSC(诱发型多能性干细胞,induced pluripotent stem cells)。
1.甘胺酸化糖醇组成物的制造
虽然糖/糖醇的甘胺酸化的天然机制尚未清楚,但发明人已开发人工生成甘胺酸化糖醇及甘胺酸化糖的化学步骤与方法。首先,准备一含有1.0M浓度甘油或果糖,以及0.9%(w/v)氢氧化钠的双蒸水溶液。接着,将甘胺酸加入到该溶液中以及混合;甘胺酸并于该溶液达到0.05~0.3M(这部分并依据想达到的最终甘胺酸化糖醇/糖浓度调整)的最终浓度。经过在4℃、持续搅动下隔夜保存,将加入有甘胺酸的溶液加热至高于45℃,且较佳大于94℃,直到所含水分近完全蒸发。此干式脱水(dry-style dehydration)步骤通常产生约35%的MGG,以及约65%的DGG/TGG。在使用前,可透过加入预期体积的灭菌双蒸水,溶解该干反应的产物,以及调整该甘胺酸化糖醇的最终浓度。另一方面,为了提升MGG的生产率,发明人进一步设计一使用高压灭菌器的湿式脱水步骤;其中,与前述相异,在混合甘胺酸以及甘油与氢氧化钠溶液后,将此混合物放置于高压灭菌器,并以大约121℃以及100kPa进行一干式灭菌循环。在灭菌周期结束后,反应物将含有大约78%的MGG以及约22%的DGG/TGG。在使用前,可透过加入预期体积的灭菌双蒸水调整该甘胺酸化糖醇的最终浓度。MGG、DGG以及TGG的化学结构表示于图2A~2C。
2.人类细胞处理以及培养
来自ATCC的人类肝细胞株HepG2,依据厂商的建议,培养于37℃以及5%CO2的环境。
3.高效液相层析法(HPLC)分析
依据MGG与DGG及TGG之间电荷的不同,本发明采用逆向HPLC(reverse-phaseHPLC)法将MGG自DGG与TGG分离。其中使用Ultimate 3000高效液相层析(HPLC)仪(ThermoScientific)以及DNA Pac PA-100管柱(BioLC Semi-Prep 9x250mm),并以3.6毫升/分钟的流速进行。起始缓冲液(starting buffer)为50mM的Tris-HCl(pH 7.6),移动缓冲液(mobile buffer)为50mM的Tris-HCl(pH 7.6)以及500mM过氯酸钠。以UV侦测仪于260nm的波长量测带不同电荷的甘胺酸化糖醇的讯号。结果表示于图1。
4.以甘胺酸化糖醇处理的糖尿病小鼠的活体评估
为测试MGG在治疗糖尿病上的药效,发明人以1毫克纯化的MGG,1毫升,在餐前分别处理每只饮食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(雄性,8周大,n=3)。控制组C57BL/6J小鼠(雄性,8周大,n=3)喂食1毫升双蒸水。在投予药物后,每只小鼠每餐喂食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠饲料的高碳水化合物餐食。接着,于餐后0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小时,以Bayer Contour Next USB系统测全血糖水平。在处理前4小时以及餐后4小时期间停止提供水及食物。然而,在每餐之间,每只小鼠各再给予2毫升双蒸水。结果示于图4。
5.以甘胺酸化糖醇处理的肥胖症小鼠的活体评估
为测试MGG在治疗肥胖症上的药效,发明人以1毫克纯化的MGG,1毫升,分别在餐前处理每只饮食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(雄性,8周大,n=3)。控制组C57BL/6J小鼠(雄性,8周大,n=3)喂食1毫升双蒸水。在投予药物后,每只小鼠每餐喂食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠饲料的高碳水化合物餐食。在大约1个月的期间内,每只小鼠每日处理及喂食三次。双蒸水无限提供。结果示于图5。
6.统计分析
任何超过10%的讯号强度变化即被视为一阳性结果,该等结果被分析后以平均值±标准差(mean±SE)表示。资料的统计分析是以单因子变异数分析(one-way ANOVA)来计算。当主要效应显著时,使用杜纳的事后比较(Dunnett’s post-hoc test)来鉴别与控制组有显著差异的群。在两处理组之间进行配对比较时,使用双尾司徒顿t检验(two-tailedstudent t test)。对于包含超过两处理组的实验,则在ANOVA后进行一事后多变域测验(post-hoc multiple range test)。机率值p<0.05被认为是具有统计上的意义。所有p值由双尾检定来决定。
文献
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