CN106404756A - 一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，以CeO2/TiO2为电化学发光信号源，利用纳米多孔材料graphene/Fe3O4@Au优良的生物兼容性和大的比表面积增加抗体的固载量，根据电化学发光信号强度的不同，实现对肺癌标志物的检测。

Description

一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感 器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2电致化学发光传感器的制备方法及应用。具体涉及一种CeO2/TiO2作为发光材料，利用纳米多孔材料graphene/Fe3O4@Au优良的生物兼容性和大的比表面积作为基底材料增加抗体的固载量。以graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2作为基底材料，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
肺癌标志物在肺癌的临床诊断和早期治疗中的作用不容忽视。正常情况下，肺癌标志物在健康人的体液中浓度特别低，只有机体发生肿瘤时，肺癌标志物才会呈现出较高的浓度,这往往与肺癌、肝炎、以及膀胱癌等多种疾病相关。血清中肺癌标志物的浓度的快速、灵敏地检测对于癌症的早发现、早治疗有着重大意义。
目前检测肺癌标志物的分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒法，但是所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有的肺癌标志物检测方法存在的问题，提供一种快速可靠的基于graphene/Fe3O4@Au和CeO2/TiO2的电化学发光传感器的制备方法，实现对肺癌标志物的快速、灵敏、特异、高效检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴加6 μL、2 ~ 4 mg/mL的抗体Ab捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2/Ab溶液于电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2的电致化学发光传感器。
2. 抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液的制备
（1）将0.1 ~ 2 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到5 ~ 30 mL的超纯水中，随后向溶液中加入0.5 ~ 6.0 g三氯化铁固体和0.5 ~ 6.0 g氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴加入到100 ~ 500 mL、浓度为0.5 ~ 5.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在4000 ~8000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入200 ~ 600 mL、浓度为0.01 ~ 0.04 mol/L的盐酸溶液，在6000 ~ 9000 rpm的转速下离心分离5 ~ 15min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将1 ~ 5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到40 ~ 200 mL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.10 ~ 0.60 g亚硫酸氢钠固体，在80 ~ 160 °C下反应2~ 6 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将80 ~120 mL、质量分数为0.005 ~ 0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2 ~ 3 mL、质量分数为0.5 ~ 1.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10 ~ 20 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（4）将1 ~ 3 mL、浓度为 2 ~ 4 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与1 ~ 3 mL 金纳米粒子溶液混合，避光条件下振荡24 h，离心分离去除上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au溶液。
（5）将0.5 ~ 5.0 g的硝酸铈固体加入到20 ~ 100 mL超纯水中，随后加入0.1 ~ 5mL、质量分数为30%的过氧化氢溶液，用氨水溶液调节pH至9.0 ~ 11.0，在6000 ~ 8000 rpm的转速下离心分离，用超纯水进行洗涤三次，在60 ~ 140 °C下干燥，最后在450 °C下煅烧1~ 3 h得到CeO2，向2 ~ 10 mL钛酸正四丁酯和6 ~ 20 mL无水乙醇的混合溶液中加入1 ~ 5mL冰醋酸得到溶液A，将3 ~ 15 mL的无水乙醇与1 ~ 10 mL的超纯水混合得到溶液B，用硝酸溶液调节pH至2.3并加入0.17 ~ 2.0 g的CeO2固体，之后将溶液B缓慢地加入溶液A中，加入1 ~ 10 mL的聚乙二醇，经过陈化直至形成黄色凝胶，在450 °C下煅烧0.5 ~ 2 h，制得浅黄色的产物CeO2/TiO2；
（6）将1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au溶液与1 ~ 3 mL、浓度为2~ 4 mg/mL CeO2 /TiO2溶液混合，振荡24 ~ 36 h，离心分离弃去上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液；
（7）在1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液中，加入100~ 400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液，储存在4 °C下备用。
3. 根据制备方法制得的电致化学发光传感器用于待测样品的电化学检测：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.6 ~ 0 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.8 ~ 10.5的含浓度为35 ~ 65 mmol/L过硫酸钾的碳酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
4.待测物抗原选自下列肺癌标志物之一：鳞状细胞癌抗原SCCA、癌胚抗原CEA、糖链抗原CA15-3、神经元特异性烯醇化酶NSE。
本发明的有益成果
（1）本发明制备的电致化学发光传感器以CeO2/TiO2为发光材料，利用CeO2/TiO2良好的光学性质，构建的传感器具有更高的灵敏度。
（2）本发明制备的电致化学发光传感器以graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2作为基底材料，graphene/Fe3O4@Au生物兼容性好、比表面积大等优点有效地增加了抗体的固载量。
（3）本发明制备的电致化学发光传感器用于肺癌标志物的检测，操作简单，反应快速，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、灵敏、特异性检测。
实施例1 一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、2 mg/mL的抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液与电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化0.5 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2的电致化学发光传感器。
实施例2一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、3 mg/mL的抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液与电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化1 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2的电致化学发光传感器。
实施例3一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、4 mg/mL的抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液与电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化1.5 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2的电致化学发光传感器。
实施例4 抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液的制备
（1）将0.4 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到12.5 mL的超纯水中，随后向溶液中加入2.6 g三氯化铁固体和1.6 g氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到125mL、浓度为1.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，在4000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入250 mL、浓度为0.01 mol/L的盐酸溶液，在6000 rpm的转速下离心分离10 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将2.5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到50 mL、浓度为1.5 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.22 g亚硫酸氢钠固体，在95 °C下反应3 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将80 mL、质量分数为0.005%的氯金酸溶液煮沸，加入2 mL、质量分数为0.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（4）将1 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与1 mL 金纳米粒子溶液混合，避光条件下振荡24 h，离心分离去除上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au溶液；
（5）将0.9 g的硝酸铈固体加入到20 mL超纯水中，随后加入0.1 mL、质量分数为30%的过氧化氢溶液，用氨水溶液调节pH至9.0，在6000 rpm的转速下离心分离，用超纯水进行洗涤三次，在70 °C下干燥，最后在450 °C下煅烧1 h得到CeO2，向2 mL钛酸正四丁酯和6 mL无水乙醇的混合溶液中加入1 mL冰醋酸得到溶液A，将3 mL的无水乙醇与1 mL的超纯水混合得到溶液B，用硝酸溶液调节pH至2.3并加入0.17 g的CeO2固体，之后将溶液B缓慢地加入溶液A中，加入1 mL的聚乙二醇，经过陈化直至形成黄色凝胶，在450 °C下煅烧0.5 h，制得浅黄色的产物CeO2/TiO2；
（6）将1 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au溶液与1 mL、浓度为2 mg/mL CeO2/TiO2溶液混合，振荡24 h，离心分离弃去上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液；
（7）在1 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液中，加入100 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液，储存在4 °C下备用。
实施例5 抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液的制备
（1）将1.5 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到20 mL的超纯水中，随后向溶液中加入3.0 g三氯化铁固体和3.0 g氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到300mL、浓度为3.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在6000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入400 mL、浓度为0.03 mol/L的盐酸溶液，在7000 rpm的转速下离心分离10 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将3 mL Fe3O4纳米溶胶加入到120 mL、浓度为2.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.40 g亚硫酸氢钠固体，在120 °C下反应5 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将100 mL、质量分数为0.010%的氯金酸溶液煮沸，加入2.5 mL、质量分数为1.0%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流15 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（4）将2 mL、浓度为3 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与2 mL 金纳米粒子溶液混合，避光条件下振荡24 h，离心分离去除上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au溶液；
（5）将3.0 g的硝酸铈固体加入到60 mL超纯水中，随后加入3 mL、质量分数为30%的过氧化氢溶液，用氨水溶液调节pH至10.0，在7000 rpm的转速下离心分离，用超纯水进行洗涤三次，在120 °C下干燥，最后在450 °C下煅烧1.5 h得到CeO2，向6 mL钛酸正四丁酯和12 mL无水乙醇的混合溶液中加入3 mL冰醋酸得到溶液A，将9 mL的无水乙醇与6 mL的超纯水混合得到溶液B，用硝酸溶液调节pH至2.3并加入1.0 g的CeO2固体，之后将溶液B缓慢地加入溶液A中，加入6 mL的聚乙二醇，经过陈化直至形成黄色凝胶，在450 °C下煅烧1 h，制得浅黄色的产物CeO2/TiO2；
（6）将2 mL、浓度为3 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au溶液与2 mL、浓度为3 mg/mL CeO2/TiO2溶液混合，振荡28 h，离心分离弃去上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液；
（7）在2 mL、浓度为3 mg/mL graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液中，加入300 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液，储存在4 °C下备用。
实施例6 抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液的制备
（1）将2 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到30 mL的超纯水中，随后向溶液中加入6.0g三氯化铁固体和6.0 g氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到500 mL、浓度为5.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在8000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入600 mL、浓度为0.04 mol/L的盐酸溶液，在9000 rpm的转速下离心分离15 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到200 mL、浓度为3.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.60 g亚硫酸氢钠固体，在160 °C下反应6 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将120 mL、质量分数为0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入3 mL，质量分数为1.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流20 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（4）将3 mL、浓度为4 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与3 mL 金纳米粒子溶液混合，避光条件下振荡24 h，离心分离去除上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au溶液；
（5）将5.0 g的硝酸铈固体加入到100 mL超纯水中，随后加入5 mL、质量分数为30%的过氧化氢溶液，用氨水溶液调节pH至11.0，在8000 rpm的转速下离心分离，用超纯水进行洗涤三次，在140 °C下干燥，最后在450 °C下煅烧1 h得到CeO2，向10 mL钛酸正四丁酯和20 mL无水乙醇的混合溶液中加入5 mL冰醋酸得到溶液A，将15 mL的无水乙醇与10 mL的超纯水混合得到溶液B，用硝酸溶液调节pH至2.3并加入2.0 g的CeO2固体，之后将溶液B缓慢地加入溶液A中，加入10 mL的聚乙二醇，经过陈化直至形成黄色凝胶，在450 °C下煅烧0.5 h，制得浅黄色的产物CeO2/TiO2；
（6）将3 mL、浓度为4 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au溶液与3 mL、浓度为4 mg/mL CeO2/TiO2溶液混合，振荡36 h，离心分离弃去上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液；
（7）在3 mL、浓度为4 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液中，加入400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液，储存在4 °C下备用。
实施例7 鳞状细胞癌抗原SCCA的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.6 ~ 0 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.8 ~ 10.5的含浓度为35 ~ 65 mmol/L过硫酸钾的碳酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的鳞状细胞癌抗原SCCA产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.01 pg/mL ~ 10 ng/mL，检测限为3.28 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替鳞状细胞癌抗原SCCA进行检测。
实施例8癌胚抗原CEA的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.6 ~ 0 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.8 ~ 10.5的含浓度为35 ~ 65 mmol/L过硫酸钾的碳酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的癌胚抗原CEA产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.01 pg/mL ~ 10 ng/mL，检测限为3.28 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替癌胚抗原CEA进行检测。
实施例9糖链抗原CA15-3的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.6 ~ 0 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.8 ~ 10.5的含浓度为35 ~ 65 mmol/L过硫酸钾的碳酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的糖链抗原CA15-3产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.01 pg/mL ~ 10 ng/mL，检测限为3.28 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替糖链抗原CA15-3进行检测。

Claims (4)

1.一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴加6 μL、2 ~ 4 mg/mL的抗体Ab捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au /CeO2/TiO2/Ab溶液于电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3 %的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液制备步骤如下：
（1）将0.1 ~ 2 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到5 ~ 30 mL的超纯水中，随后向溶液中加入0.5 ~ 6.0 g三氯化铁固体和0.5 ~ 6.0 g氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到100 ~ 500 mL、浓度为0.5 ~ 5.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在4000 ~8000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入200 ~ 600 mL、浓度为0.01 ~ 0.04 mol/L的盐酸溶液，在6000 ~ 9000 rpm的转速下离心分离5 ~ 15 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将1 ~ 5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到40 ~ 200 mL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.10 ~ 0.60 g亚硫酸氢钠固体，在80 ~ 160 °C下反应2 ~6 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后可得到graphene/Fe3O4；
（3）将80 ~ 120 mL、质量分数为0.005 ~ 0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2 ~ 3 mL、质量分数为0.5 ~ 1.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10 ~ 20 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（4）将1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与1 ~ 3 mL金纳米粒子溶液混合，避光条件下振荡24 h，离心分离去除上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au溶液；
（5）将0.5 ~ 5.0 g的硝酸铈固体加入到20 ~ 100 mL超纯水中，随后加入0.1 ~ 5 mL、质量分数为30%的过氧化氢溶液，用氨水溶液调节pH至9.0 ~ 11.0，在6000 ~ 8000 rpm的转速下离心分离，用超纯水进行洗涤三次，在60 ~ 140 °C下干燥，最后在450 °C下煅烧1 ~3 h得到CeO2，向2 ~ 10 mL钛酸正四丁酯和6 ~ 20 mL无水乙醇的混合溶液中加入1 ~ 5mL冰醋酸得到溶液A，将3 ~ 15 mL的无水乙醇与1 ~ 10 mL的超纯水混合得到溶液B，用硝酸溶液调节pH至2.3并加入0.17 ~ 2.0 g的CeO2固体，之后将溶液B缓慢地加入溶液A中，加入1 ~ 10 mL的聚乙二醇，经过陈化直至形成黄色凝胶，在450 °C下煅烧0.5 ~ 2 h，制得浅黄色的产物CeO2/TiO2；
（6）将1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的graphene/Fe3O4@Au溶液与 1~ 3 mL、浓度为2 ~4 mg/mL CeO2/TiO2溶液混合，振荡24 ~ 36 h，离心分离弃去上清液，重新分散到1 mL超纯水中得到graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液；
（7）在1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2溶液中，加入100 ~400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab溶液，储存在4 °C下备用。
3.如权利要求1所述制备方法制得的基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2/Ab的电致化学发光传感器用于待测样品的检测，其特征在于，制备的电致化学发光传感器用于待测样品的检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.6 ~ 0 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 8.8 ~ 10.5的含浓度为35 ~ 65 mmol/L过硫酸钾的碳酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
4.如权利要求1所述的一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述待测物抗原选自下列肺癌标志物之一：鳞状细胞癌抗原SCCA、癌胚抗原CEA、糖链抗原CA15-3、神经元特异性烯醇化酶NSE。
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