CN106282087A - 一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基及培养方法。固体培养基的配方组合为面粉或玉米粉:麦麸:珍珠岩:营养液=1.5‑1.6:1.5‑1.6:1‑1.2:1.25，营养液配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，水1L。选用的珍珠岩质量轻，透气性好，可增加培养基的透气性，白僵菌可以自由生长至培养基的各个角落，另外加入的营养液可以被珍珠岩很好的吸附，供白僵菌生长用；培养方法为改良的固液双相发酵法：取一定量的白僵菌分生孢子配成悬浮液，加入营养液中，振荡培养24h后，得到种子液；将种子液取适量均匀接入上述固体培养基中，白僵菌长满培养基后即可。本发明所述的培养基原料价格低廉，省时省工，培养过程中不需要人工翻料，且大大提高了产孢量。
Description
技术领域
本发明属于微生物杀虫剂技术领域，涉及一种提高松毛虫（Dendrolimus punctantus）白僵菌（Beauveria bassiana）产孢量的固体培养基及其培养方法。
背景技术
白僵菌作为一种微生物杀虫剂具有不污染环境及持续控制害虫的作用特点，被广泛应用于农林害虫的防治，目前国内成功并大面积应用于松毛虫及玉米螟的防治。白僵菌的产孢量是影响白僵菌毒力的主要因素之一，据报道，营养及环境的温度湿度等条件均会影响白僵菌的产孢量。目前，生产上主要采用固液双向发酵法生产白僵菌。固相培养阶段，大米+稻壳+黄粉虫组合布氏白僵菌产孢量最高，前期黑暗培养，后期给予适当的光照，可以促进大量产孢，李茂业，生物技术通报，2009年增刊。增加培养料透气性也能显著提高产孢量，黄桂英，中国会议，1996年，《中国重生真菌研究与应用》第四卷，不同碳氮源对球孢白僵菌产孢也具有一定的影响，王爽，黑龙江农业科学，2013年第8期。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基；
本发明的另一个目的是提供一种提高松毛虫白僵菌产孢量的培养方法；
所述的马尾松毛虫白僵菌菌株S1-7是发明人从感染白僵菌的松毛虫幼虫上分离获得，于2015年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.11644。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，主要由以下重量组分制成，原料重量份数比例为：淀粉:麦麸:珍珠岩:水=1.5-1.6:1.5-1.6:1-1.2:1.25。
进一步地，以上所述的固体培养基，由以下重量原料组成：淀粉1.5份、麦麸1.5份、谷壳1.0份、营养液1.25份。
进一步地，以上所述的淀粉为面粉或玉米粉。
进一步地，以上所述的谷壳或用珍珠岩代替。
进一步地，以上所述的营养液含有：葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，其余为水。
进一步地，以上所述的固体培养基原料的配制：先称取麦麸加入直径:高=5.5:8.5带塑料透气孔的玻璃瓶中,再称取淀粉加入，最后加入珍珠岩或者谷壳，用玻璃棒稍微混匀后，加入水充分搅拌混匀，盖上塑料盖，放入高压灭菌锅121℃，灭菌40min,冷却后备用。
一种提高松毛虫白僵菌产孢量的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养阶段
用发明人分离得到松毛虫白僵菌种，用PDA培养基活化后在25℃条件下培养，取培养12-15天的分生孢子，加入含10%吐温-80的无菌水，将孢子悬浮液的浓度调整为6.4×108个/mL取5mL加入装有40mL培养液的三角瓶中，在150r/min、25℃、黑暗的条件下,震荡培养24h,获得种子液；
（2）固体培养阶段
用移液枪将上述种子液5mL均匀加入16g固体培养基上，种子液与固体培养基的加入配比为5︰16，置于恒温恒湿培养箱，在25℃、湿度75%的黑暗条件下培养，培养10天后获得粗产物；
（3）产品收集处理
将粗产物放入烘箱，在恒温30℃烘24h，获得产品。
（4）产孢量的测定方法
称取培养好的白僵菌固体培养物1g,放入100mL装有无菌水20mL的三角瓶中，加入一滴吐温-80，玻璃珠20-30粒，170r/min,震荡1h，得到孢子悬浮液，取孢子悬浮液1mL加入装有59mL无菌水的三角瓶中，充分混匀，血球计数板计数，并计算每1g固体培养物中孢子的含量。采用DPS软件Duncan′s新复极差法分析数据。
本发明的技术优点和积极效果：
1.本发明的固体培养基原料即面粉、麦麸、珍珠岩或谷壳等，都是价格低廉的材料，白僵菌固体培养成本较低。
2本发明因为加入了珍珠岩，具有质量轻，透气性好等特点，可以增加培养基的透气性，是白僵菌可以自由生长至培养基的各个角落，在整个培养过程中不需要人工翻料，省时省工。
3. 本发明由于在培养基中另外加入了营养液，营养液可以被珍珠岩很好的吸附，供白僵菌生长不间断均匀培养用，大大地提高了产孢量。
具体实施方式
实施例1
一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，由以下重量原料组成：面粉6g、麦麸6g、珍珠岩4 g、营养液1.25份。
以上所述的营养液含有：葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，其余为水。
以上所述的固体培养基的配制方法：先称取麦麸6g,加入直径5.5cm、高8.5cm带塑料透气孔的玻璃瓶中,再称取面粉或者玉米粉6g，最后加入珍珠岩4 g，用玻璃棒稍微混匀后，加入5mL水充分搅拌混匀，盖上塑料盖，放入高压灭菌锅121℃，灭菌40min,冷却后备用。
毛虫白僵菌产孢量的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养阶段
用发明人分离得到松毛虫白僵菌种，用PDA培养基活化后在25℃条件下培养，取培养2周的分生孢子，加入含10%吐温-80的无菌水，将孢子悬浮液的浓度调整为6.4×108个/mL取5mL加入装有40mL培养液的三角瓶中，在150r/min、25℃、黑暗的条件下,震荡培养24h,获得种子液；
（2）固体培养阶段
用移液枪将上述种子液5mL均匀加入16g固体培养基上，种子液与固体培养基的加入配比为5︰16，置于恒温恒湿培养箱，在25℃、湿度75%的黑暗条件下培养,当培养10天后获得粗产物；
（3）产品收集处理
将粗产物放入烘箱，在恒温30℃烘24h，获得产品。
实施例2
本实施例与实施例1不同的是以水代替营养液，面粉:麦麸:珍珠岩:水=1.6: 1.6:1.1:1.25，培养12天，其他工艺操作同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1不同的是原料以谷壳代替珍珠岩，培养11天，其他工艺操作同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1不同的是原料无珍珠岩，以玉米粉代替面粉，其他工艺操作同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例3不同的是原料以玉米粉代替面粉，玉米粉:麦麸:谷壳:营养液=1.6:1.5: 1.2:1.25，其他工艺操作同实施例3。
实施例6
本实施例与实施例4不同的是玉米粉:麦麸:营养液=1.5:1.6:1.25，其他工艺操作同实施例4。
对照例
本实施例与实施例3不同的是原料以以水代替营养液，其他工艺操作同实施例3。
对上述实施例和对照例的产孢量的测定：
称取培养好的白僵菌固体培养物1g,放入100mL装有无菌水20mL的三角瓶中，加入一滴吐温-80，玻璃珠20-30粒，170r/min,震荡1h，得到孢子悬浮液，取孢子悬浮液1mL加入装有59mL无菌水的三角瓶中，充分混匀，血球计数板计数，并计算每1g固体培养物中孢子的含量。采用DPS软件Duncan′s新复极差法分析数据。各实施例和对照例的产孢量的测定结果见表所示。
各实施例产孢量测定结果
从实施例的产孢量产孢量最高的培养基是实施例1即面粉：麦麸：珍珠岩：营养液组合，产孢量为（114.33±1.45aA）×108个/mL，产孢量是对照例面粉:麦麸:谷壳:水组合的近2倍，采用珍珠岩和营养液的培养基，均达到了极其显著的效果。
Claims (7)
1. 一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，其特征在于：主要由以下重量组分制成，原料重量份数比例为：淀粉:麦麸:珍珠岩: 营养液=1.5-1.6:1.5-1.6:1-1.2:1.25。
2.根据权利要求1所述的一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，其特征在于：由以下重量原料组成：淀粉1.5份、麦麸1.5份、谷壳1.0份、营养液1.25份。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，其特征在于：所述的淀粉为面粉或玉米粉。
4.根据权利要求1所述的一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，其特征在于：所述的谷壳或用珍珠岩代替。
5.根据权利要求1或2所述的一种提高松毛虫产孢量的固体培养基，其特征在于：所述的营养液含有：葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，其余为水。
6.根据权利要求1或2所述的一种提高松毛虫白僵菌产孢量的固体培养基，其特征在于：所述的固体培养基原料的配制：先称取麦麸加入直径:高=5.5: 8.5带塑料透气孔的玻璃瓶中,再称取淀粉加入，最后加入珍珠岩或者谷壳，用玻璃棒稍微混匀后，加入水，充分搅拌混匀，盖上塑料盖，放入高压灭菌锅121℃，灭菌40min,冷却后备用。
7.一种提高松毛虫白僵菌产孢量的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）液体培养阶段
用发明人分离得到松毛虫白僵菌种，用PDA培养基活化后在25℃条件下培养，取培养12-15天的分生孢子，加入含10%吐温-80的无菌水，将孢子悬浮液的浓度调整为6.4×108个/mL取5mL加入装有40mL培养液的三角瓶中，在150r/min、25℃、黑暗的条件下,震荡培养24h,获得种子液；
（2）固体培养阶段
用移液枪将上述种子液5mL均匀加入16g固体培养基上，种子液与固体培养基的加入配比为5︰16，置于恒温恒湿培养箱，在25℃、湿度75%的黑暗条件下培养，培养10天后获得粗产物；
（3）产品收集处理
将粗产物放入烘箱，在恒温30℃烘24h，获得产品；
（4）产孢量的测定方法
称取培养好的白僵菌固体培养物1g,放入100mL装有无菌水20mL的三角瓶中，加入一滴吐温-80，玻璃珠20-30粒，170r/min,震荡1h，得到孢子悬浮液，取孢子悬浮液1mL加入装有59mL无菌水的三角瓶中，充分混匀，血球计数板计数，并计算每1g固体培养物中孢子的含量；
采用DPS软件Duncan′s新复极差法分析数据。
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| 邹东霞: "桉蝙蛾高毒力白僵菌菌株筛选及鉴定", 《中国森林病虫》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108371147A (zh) * | 2018-02-28 | 2018-08-07 | 河南恩赛姆生物科技有限公司 | 黑水虻虫菌复合制剂及其生产方法 |
| CN108371147B (zh) * | 2018-02-28 | 2021-07-13 | 河南恩赛姆生物科技有限公司 | 黑水虻虫菌复合制剂及其生产方法 |
| CN112795490A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-05-14 | 赣州市林业科学研究所 | 一种球孢白僵菌固体培养基及其培养方法 |
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