CN106214774A - 一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法,该方法包括如下步骤:(1)卡西卡甫枣去核,干燥,粉碎,得到卡西卡甫枣粉末;(2)破壁处理:将卡西卡甫枣粉末在乙醇介质中,使用超声波细胞粉碎机进行破壁处理;(3)卡西卡甫枣粉末经破壁处理后,按料液比为1:10~30,用乙醇提取,提取液浓缩干燥得总黄酮。与传统提取方法相比,本发明方法能更有效地把药材有效成分总黄酮充分释放出来,提高卡西卡甫枣总黄酮的质量和资源利用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法。
背景技术
卡西卡甫枣又名酸枣、小红枣,为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge)Hu ex.H.F.Chow的干燥成熟果实。具有清血排毒,清热消炎,止咳化痰,补身安神,除疹止痒等功效。用于热性或血液质性或胆液质性各种病证,如血热腐败、浓液成块,发热发烧、肺炎、胸膜炎、乃孜来性感冒、咳嗽顽痰、体虚失眠、皮疹瘙痒等。
黄酮的功效是多方面的,它是一种很强的抗氧剂,可有效清除体内的氧自由基,如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出,这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上,这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老,也可阻止癌症的发生。药理研究表明,枣类黄酮具有明显的止咳、祛痰、行血、止血、通经活络之功效,同时具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖的作用,它能有效增强机体免疫力。枣肉黄酮能增强小鼠体液免疫和细胞免疫功能,并对放射性损伤有一定的保护作用,是免疫增强剂。研究证实,卡西卡甫枣的黄酮类成分具有抗癌的生理活性,其药用价值备受关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法,包括如下步骤:
(1)卡西卡甫枣去核,干燥,粉碎,得到卡西卡甫枣粉末;
(2)破壁处理:将卡西卡甫枣粉末在乙醇介质中,使用超声波细胞粉碎机进行破壁处理;
(3)卡西卡甫枣粉末经破壁处理后,按料液比为1:10~30,用乙醇提取,提取液浓缩干燥。
进一步,步骤(1)粉碎后,卡西卡甫枣粉末过100目筛。
进一步,步骤(2)破壁处理时,超声波频率为400Hz。
进一步,步骤(2)破壁处理的时间为30~90min。
更进一步,步骤(2)破壁处理的时间为60min。
进一步,步骤(3)提取时,温度为40~80℃,时间为0.5~2.5h。
更进一步,步骤(3)提取时,提取时间1.7h、提取温度74℃、液料比1:26。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是未破壁处理的卡西卡甫枣在100倍(左)和400倍(右)下的显微镜图片;
图2是破壁处理30min的卡西卡甫枣在100倍(左)和400倍(右)下的显微镜图片;
图3是破壁处理60min的卡西卡甫枣在100倍(左)和400倍(右)下的显微镜图片;
图4是破壁处理90min的卡西卡甫枣在100倍(左)和400倍(右)下的显微镜图片;
图5为提取时间对总黄酮含量的影响曲线;
图6为提取温度对总黄酮含量的影响曲线;
图7为料液比对总黄酮含量的影响曲线;
图8为提取时间、提取温度、液料比对总黄酮含量的响应面三维图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法,步骤如下:
步骤一:卡西卡甫枣预处理
对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干,将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的粉末,备用。
步骤二:卡西卡甫枣破壁
称取卡西卡甫枣粉末,加入无水乙醇适量在400Hz条件下使用超声波细胞粉碎机(设备型号:Scientz-11D型)进行破壁处理。
步骤三:卡西卡甫枣总黄酮的粗提
破壁处理后,按料液比为1:10~30(g/ml),向步骤二的混合液中补加无水乙醇,然后将混合液置于40~80℃恒温水浴锅中浸提0.5~2.5h,离心,取上清液,得到提取液;使用旋转蒸发仪将提取液浓缩,并使用真空干燥箱烘干,烘干时间为24h,得到干浸膏,提取液总黄酮含量的测定见2.1节。
一、破壁处理时间的影响
1.1细胞计数
分别取卡西卡甫枣粉末样1、样2,样3,样4,其中样2破壁处理,30min,样3破壁处理60min,样4破壁处理90min,分别置于25ml容量瓶中,加稀甘油适量,混匀,定容至刻度。取干净血球计数板(16×16),加盖玻片,用移液枪精密吸取药液30μl,滴于计数板狭缝中,在荧光倒置显微镜下观察,从图可以看出,卡西卡甫枣未破壁细胞有大量完整薄壁细胞(图1),破壁30min后完整薄壁细胞极少(图2),破壁60min后除草酸钙方晶,红棕色物等细胞后含物外,纤维、导管等细胞均已被截断,未见完整细胞(图3、4),故考察卡西卡甫枣的细胞破壁率宜选择薄壁细胞测定,因此,以卡西卡甫枣粉末中完整的薄壁细胞为显微特征计数物指标,显微观察示其为完整的不规则圆形,此特征具有代表性,故进行计数(以1个视野为1个计数单位)在荧光倒置显微镜下观察,计完整薄壁细胞数目,平行测三次取平均值。
1.2破壁率检测
分别取卡西卡甫枣未破壁、破壁30min、破壁60min、破壁90min混悬液,精密称取,按3.1项下制片,于显微镜下观察,根据三者完整薄壁细胞个数、混悬液体积、称样量,按下列公式计算卡西卡甫枣未破壁、破壁30min、破壁60min、破壁90min混悬液中显微特征的个数:
卡西卡甫枣粉末显微特征个数/mg=
公式中:X为计数板每16个格子下的特征数;V为药材混悬液总体积(ml);V'为盖玻片下混悬液体积(ml);W为药材称取量(mg)。
再根据卡西卡甫枣未破壁、破壁30min、破壁60min、破壁90min混悬液中的显微特征个数,按下列公式计算细胞破壁率:
Y=(A-B)/A×100%
Y:细胞破壁率;A:卡西卡甫枣未破壁时的显微特征个数;B:卡西卡甫枣破壁后的显微特征个数。
卡西卡甫枣粉末未破壁显微特征(薄壁细胞)个数计算的相关参数(n=16)如下表
根据文献可知,破壁率达到98%以上即算破壁完全,故从我们将卡西卡甫枣细胞破壁时间固定为60min。
二、提取条件的影响
单因素试验 破壁处理时间固定为60 min,依次改变提取时间、提取温度、液料比进行单因素实验。
2.1、检测方法
用紫外分光光度法测定总黄酮含量 对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干,将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的粉末。称取卡西卡甫枣粉末,按 1:10~30(g/ml)的料液比,加入无水乙醇,混匀后置于40~80℃恒温水浴锅中浸提0.5~2.5h,离心,取上清液,得到提取液;使用旋转蒸发仪将提取液浓缩,并定容到50ml容量瓶中,吸取提取液1ml,加适量蒸馏水,加入浓度为5%NaNO2 0.5mL,摇匀置6min;再加入浓度为10% A1(NO3)30.5mL,摇匀置6min;加入浓度为4% NaOH 4mL,用蒸馏水定容至10mL,摇匀15min后测定吸光度,以芦丁为标准品,根据吸光度(Y)和浓度(X)的回归方程:y=14.737x-0.0248,R=0.9994,计算浓度。总黄酮含量=总黄酮的质量/卡西卡甫枣粉末的质量。
2.2、提取时间对总黄酮含量的影响
以提取温度60℃,液料比1:25(g/ml),提取时间0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h进行回流提取,考察提取时间对总黄酮含量的影响,结果见图5。
从图5可以看出,在提取温度、料液比相同的条件下,随着提取时间的增加,提取所得卡西卡甫枣总黄酮含量先增加,之后开始逐渐减少至趋于平稳,这是因为提取时间可影响提取溶剂与细胞内的活性物质接触,提取时间越长,溶剂越能够充分渗透到细胞内与活性物质接触溶解,从而提高提取的黄酮含量;而提取时间过长时则会导致细胞内的温度过高,造成提取物的氧化,另外还有其他物质的更多溶出,从而降低总黄酮的量,故从黄酮含量的角度来看,提取时间选择1.5h为宜。
2.3提取温度对总黄酮含量的影响
以液料比1:25(g/ml),提取时间1.5h,提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行回流提取,考察提取温度对总黄酮含量的影响,结果见图6。
从图6可知,在提取时间、料液比相同的条件下,卡西卡甫枣总黄酮的含量随着温度的上升而增加,这可能是因为温度的升高会加快分子的运动,同时温度升高也能软化和破坏细胞壁组织从而有利于细胞内的黄酮类化合物的流出,而当温度超过70℃时,黄酮类化合物的含量下降,这可能是因为温度过高,造成提取物的氧化分解,另外还有其他物质的更多溶出,从而降低总黄酮的量,因此从黄酮含量的角度来说,考虑选择提取温度在70℃左右较好。
2.4液料比对总黄酮含量的影响
以提取时间1.5h,提取温度60℃,液料比1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)、1:30(g/ml)进行回流提取,考察提取时间对总黄酮含量的影响,结果见图7。
从图7可以看出,在提取时间、提取温度相同的条件下,当料液比为1:25 (g/mL)时,黄酮类化合物的含量最高,当料液比大于1:25(g/mL)时,总黄酮含量反而降低。这可能是因为溶剂量过多时,一些其他类物质也被提取出来,而有效成分的总量变化不大,相比较而言总黄酮含量呈下降趋势。就黄酮含量的角度而言,选择料液比为1:25 (g/mL)左右为宜。
三、响应面法优化提取条件
根据单因素试验结果,选择提取时间、提取温度、液料比三个因素,并在单因素实验结果确定的最优水平两侧对称选2个水平,具体因素水平设置见表1。
表1 因素水平设置表
利用Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计,以提取时间A、提取温度B、液料比C为自变量,以总黄酮含量为响应值Y,建立多元二次方程:
Y=1.4+0.074A+0.096B+0.033C+0.012AB-0.036AC-3.394E-003BC-0.11A2-0.13B2-0.047C2
通过单因素实验可以看出,提取温度、提取时间,液料比三个因素对卡西卡甫枣的总黄酮含量影响较显著,选取这三个因素进行响应面优化实验,实验方案设计与响应值结果见表2,回归方程方差分析见表3。
表2 响应曲面设计方案以及响应值
表3 总黄酮含量回归方程的方差分析
利用 Design-Expert 软件根据多元二次回归方程进行绘图分析,得到回归方程的响应面及其等高线图,见图8。
黄酮含量:由表3分析可知,(P=0.0002<P=0.05)二次回归方程模型显著,失拟项显著(P=0.1212>P=0.05)。表明该方程对实验拟合情况好,可以用该模型代替真实实验点对不同反应条件下卡西卡甫枣总黄酮含量的实验进行结果预测和分析。回归模型方程各项的方差分析结果还表明,方程一次项中A、B、C影响是极显著的,二次项的影响也都是显著的,方程的拟合是较充分的,但交互项AB、AC、BC的P值均>0.05,表明提取时间、提取温度、液料比这三个因素的两两交互作用不显著。通过该模型的方差分析可知:提取温度(B)对黄酮含量影响差异显著(P=0.0002),而提取时间(A)、液料比(C)两个因素对黄酮含量影响差异不显著。即:提取温度的改变将会显著影响黄酮含量。三因素对黄酮含量影响效应的大小依次提取温度(B)> 提取时间(A)>液料比(C)。
利用 Design-Expert 软件分析,并从响应面实验分析结果可以看出,回流提取的提取温度和提取时间是影响卡西卡甫枣总黄酮含量的主要因素,选取总黄酮含量为最大值时,由Design-Expert 软件直接分析得出卡西卡甫枣中总黄酮回流提取的最佳工艺条件为:提取时间1.66h,提取温度73.9℃,液料比1:26.05时,预测总黄酮含量最优值为1.4379mg/g。
实施例1
在上述优化条件下,考虑实际操作的局限性,将工艺参数修正为提取时间1.7h、提取温度74°C、液料比1:26。在此修正条件下进行了3次平行验证实验,卡西卡甫枣总黄酮含量的平均值为1.4352mg/g,相比误差0.18%,与理论预测值较接近,结果较理想。
对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干,将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的颗粒,称取卡西卡甫枣粉末9.9322g,加入无水乙醇适量在400Hz条件下使用超声波细胞粉碎机(设备型号:Scientz-11D型)进行破壁处理60min,然后按 1:26( g/mL)料液比补充无水乙醇,置于74℃恒温水浴锅中浸提1.7h,离心,取上清液,得到提取液;使用旋转蒸发仪将提取液浓缩,使用NaNO2-Al(NO3)3显色紫外分光光度法测得卡西卡甫枣总黄酮含量,在此条件下进行了3次平行验证实验,得到卡西卡甫枣总黄酮含量平均为1.4334mg/g,相比误差0.12%,与理论预测值较接近,结果较理想。
对比例1
对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干,将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的颗粒,称取卡西卡甫枣粉末10.8135g,按 1:26( g:mL)料液比加入无水乙醇,置于74℃恒温水浴锅中浸提1.7h,离心,取上清液,得到提取液;使用旋转蒸发仪将提取液浓缩,使用NaNO2-Al(NO3)3显色紫外分光光度法测得卡西卡甫枣总黄酮含量,在此条件下进行了3次平行验证实验,得到卡西卡甫枣总黄酮含量平均为1.3805mg/g,与最优工艺得到的卡西卡甫枣总黄酮含量相比降低了4%。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种卡西卡甫枣总黄酮的破壁提取方法,包括如下步骤:
(1)卡西卡甫枣去核,干燥,粉碎,得到卡西卡甫枣粉末;
(2)破壁处理:将卡西卡甫枣粉末在乙醇介质中,使用超声波细胞粉碎机进行破壁处理;
(3)卡西卡甫枣粉末经破壁处理后,按料液比为1:10~30,用乙醇提取,提取液浓缩干燥。
2.根据权利要求1所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(1)粉碎后,卡西卡甫枣粉末过100目筛。
3.根据权利要求1所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(2)破壁处理时,超声波频率为400Hz。
4.根据权利要求1所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(2)破壁处理的时间为30~90min。
5.根据权利要求1所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(2)破壁处理的时间为60min。
6.根据权利要求1所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(3)提取时,温度为40~80℃,时间为0.5~2.5h。
7.根据权利要求6所述的破壁提取方法,其特征在于,步骤(3)提取时,提取时间1.7h、提取温度74℃、液料比1:26。
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