CN106163527A - 用于治疗和预防骨质疏松症的胃泌素拮抗剂 - Google Patents

Abstract

在一些方面，提供的实施例基于本发明对胃泌素在调节老化的肠‑卵巢轴和逆转胃泌素介导的骨质流失的靶向胃泌素活性影响方面的作用的证明。提供的为方法、组合物和药剂(包括胃泌素拮抗剂)来治疗、改善和预防骨疾病和病情。用于治疗有需要的主体中与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情的方法可包括向主体施用至少一剂治疗上有效量的胃泌素受体靶向药剂，从而治疗与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情。

Description

用于治疗和预防骨质疏松症的胃泌素拮抗剂

相关申请

该申请要求了2013年11月22日提交的美国临时申请号61/907,980的权益和优先权，其内容通过引用全部并入到本申请中。

技术领域

在某些方面，提供的实施例基于在此证明的胃泌素在老化肠道-卵巢轴调节中的作用和在逆转胃泌素介导的骨质流失中针对胃泌素活性的影响。本发明提供了用于治疗、稳定、改善和预防骨疾病和病情的方法、组合物和制剂，包括胃泌素拮抗剂。

背景技术

特征为骨质流失和高风险骨折的骨质疏松症是最普通的疾病之一，特别是在老年当中，估计在全球范围内其影响着约1亿的人口。当老年人骨折的发生率逐渐增加时，治疗方法的选择会受到限制。目前，抗骨质再吸收剂(例如二膦酸盐、迪诺塞麦和激素治疗)最常用来治疗骨质疏松症。设计这些制剂来减慢骨重建以及增加骨密度。然而，它们与显著的副作用相关，包括颌骨坏死、非典型性骨折、心房颤动和增加中风或癌症的风险。同化剂可被用来在患有骨质疏松症的患者中产生新骨。然而，找到增加骨量以及调节成骨细胞介导的骨形成和骨髓肥胖之间平衡的合成代谢因子是个挑战。此外，市场上可获得的唯一同化剂(特立帕肽)不仅非常昂贵以及难以给药，而且与包括降低血压、恶心、疼痛、虚弱以及萎靡不振的副作用相关。而且，已经发现在大鼠中使用特立帕肽会引起恶性肿瘤的生长(成骨细胞癌)。总之，骨质疏松症的治疗选择是有限的，刺激骨形成的新的治疗方法的发展是优先考虑的。

虽然卵巢衰竭和骨脱矿质作为骨质疏松症的关键因素是公认的，但是准确的病原尚未完全解决。更好地了解骨质疏松症和相关骨疾病或病情的病因可产生用于治疗骨质疏松症和其他骨疾病和病情的新的替代方法和组合物。

需要用于治疗骨质疏松症和其他骨疾病和病情的方法和组合物。本申请克服了上述要注意的问题，并提供了一种用于通过调节胃泌素的影响来治疗、稳定和/或预防骨疾病或病情进展的新方法。

发明内容

本申请提供了用于通过向有需要的主体施用药剂来治疗，例如稳定和/或预防，例如预防骨疾病或失调进展的方法、用途、化合物和组合物。在一些实施例中，骨疾病或失调的特征为骨质疏松症。在其他实施例中，向有需要的主体施用的药剂靶向(例如抑制或拮抗)胃泌素和/或胃泌素受体，例如胃泌素或胃泌素受体拮抗剂。根据一个实施例，施用的药剂靶向CCK2受体。

在某些方面，本发明提供的实施例涉及激素胃泌素直接或间接地调节骨形成，因此提高了随之而来的与骨质疏松性改变一致的骨病理生理学的骨质流失的证明(见图57)。在某些方面，在本发明中提供的实施例涉及阻断该胃泌素的作用(例如，使用靶向CCK2受体的胃泌素拮抗剂)在骨质疏松症的动物模型中具有有益的效果，因此在骨质疏松症和其他骨疾病和病情的治疗、预防和改善中有用的证明。

因此，在一些实施例中提供的为在骨疾病和病情(例如临床、病理或影像上的特征为骨质疏松症)中的胃泌素拮抗剂的方法、化合物和用途，例如拮抗胃泌素活性的药剂。在某些方面，方法和用途涉及包括疾病和病情的疾病和病情的治疗、改善和/或预防。在某些方面，提供的为用于使用靶向胃泌素和/或胃泌素受体的药剂(例如胃泌素拮抗剂)治疗、改善骨(例如特征为骨质疏松症的那些)疾病/病情的方法和组合物，例如，在i)老年人(男性或女性)；ii)患有卵巢功能下降或卵巢功能衰竭的女性；iii)患有高胃泌素血症的个体，包括患有天生高胃泌素血症(例如，肿瘤高胃泌素血症与胃粘膜萎缩相关的高胃泌素血症)和/或发生抑酸药物的使用后果的高胃泌素血症(例如，药剂的分类，包括全质子泵抑制剂或所有短期或长期起作用的组胺两种受体拮抗剂的分类)和/或iv)胃切除手术的个体。在一些实施例中，使用胃泌素靶向药剂(例如胃泌素拮抗剂，如胃泌素靶向或胃泌素受体靶向药剂；例如胃泌素或胃泌素受体拮抗剂，如靶向CCK2受体的药剂)进行治疗、改善和/或预防。

在一些实施例中，提供的为用于通过向主体施用胃泌素或胃泌素受体靶向药剂治疗或预防主体中骨疾病或病情的方法、用途和药剂，因此治疗或预防疾病或病情或其进展。在一些实施例中，胃泌素或胃泌素受体靶向药剂为胃泌素拮抗剂或胃泌素受体拮抗剂，例如选择性胃泌素受体拮抗剂，例如选择性的CCK2受体拮抗剂，如不能拮抗其他受体或其他胃泌素受体的一种。选择性的CCK2受体拮抗剂的示例为YF476。

在一些实施例中，骨疾病或病情是特征为骨质疏松症的疾病或病情，例如，已经在临床上、病理上或放射学上被定性为骨质疏松症的一种。在一些实施例中，主体为患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性。在其他方面，主体：(a)为患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性，(b)患有高胃泌素血症。在一些方面，主体：(a)为患有有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性，(b)患有高胃泌素血症，(c)已经经历了胃切除。在一些方面，主体患有天然的高胃泌素血症，该高胃泌素血症为肿瘤高胃泌素血症或与抑酸药物相关的高胃泌素血症，例如用质子泵抑制剂或组胺2受体给药。在一些方面，所述方法进一步包括与胃泌素或胃泌素靶向药剂一起同时或以任何顺序地向主体施用质子泵抑制剂或组胺2受体拮抗剂。在一些方面，所述方法进一步包括同时或以任何顺序施用药剂治疗另一种骨质疏松症。

在一些实施例中，用于治疗有需要的主体中的与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情的方法包括向主体施用至少一剂治疗上有效量的胃泌素受体靶向药剂，从而治疗与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情。

在一些实施例中，所述方法进一步包括静脉注射施用多剂胃泌素受体靶向药剂。

在另一些实施例中，所述方法进一步包括口服施用多剂胃泌素受体靶向药剂。

在一些实施例中，所述方法进一步包括特征为骨质疏松症的疾病或病情。

在其他实施例中，所述方法进一步包括施用选择性CCK2受体拮抗剂。

在另一些实施例中，所述方法进一步包括施用选择性CCK2受体拮抗剂YF476。

在一些实施例中，所述方法进一步包括患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性的主体。在其他实施例中，所述方法进一步包括：(a)患有卵巢功能下降或卵巢衰竭女性以及(b)患有高胃泌素血症的主体。在一些实施例中，所述方法进一步包括(a)患有卵巢功能下降或卵巢衰竭女性；(b)患有高胃泌素血症；(c)已经经历了胃切除。

而在另一些实施例中，高胃泌素血症为肿瘤高胃泌素血症或与抑酸药物相关的高胃泌素血症。

在其他实施例中，所述方法进一步包括与治疗上有效量的质子泵抑制剂(PPI)或组胺2受体(H₂R)拮抗剂同时或以任何顺序一起施用选择性胃泌素受体靶向药剂。

而在另一实施例中，所述方法进一步包括，其中PPI为奥美拉唑，H₂R拮抗剂为拉伏替丁(loxtidine)。

在其他实施例中，所述方法进一步包括以0.2-14μg/kg的主体体重施用治疗上有效量的胃泌素受体靶向药剂。

在另外的实施例中，胃泌素受体靶向药剂的治疗上有效量为10-25纳摩尔。

在一些实施例中，通过皮下注射向主体施用胃泌素受体靶向药剂。

在另一些实施例中，通过静脉注射向主体施用胃泌素受体靶向药剂。

在一些实施例中，以每日片剂20-100mg的剂量向主体口服施用胃泌素受体靶向药剂。

本发明还提供了药剂和组合物，例如在提供的方法中使用的制药组合物和试剂盒，例如包括胃泌素和胃泌素受体靶向药剂的药剂和组合物，例如拮抗剂和含有所述拮抗剂的试剂盒，所述拮抗剂和试剂盒带有向这些主体施用拮抗剂的说明书。

附图说明

图1是显示骨重塑的调节子的图。卵巢功能(和雌性激素分泌)与骨维护成正相关。维生素D被认为是对其的补充，然而，低的维生素D与骨质疏松症有关，这可能是维生素D受体突变没有与增加的骨折风险有关的附带现象。甲状旁腺产生的PTH负面地调节骨生理，通过低水平的循环钙放大的效果。雌性激素拮抗PTH的负影响。虽然胃激素的作用还不清楚，但是已知胃切除会增加骨质流失。这被认为是反映了酸的损失，以及由此引发的钙摄入的降低。

图2显示了骨生理和结构以及强度测量。微计算机断层扫描技术(MicroCT)和骨弯曲以及锇摄入和PCR被用来评价不同动物模型中的骨动力学和骨质疏松性特征。MicroCT评估了骨小梁和皮层骨的密度和体积。可以进行皮层骨的半径和周长的测定。可以进行骨的连接密度、结构模型指数(SMI)以及刚度(所有结构的测定)的计算。极惯性矩(pMOI)以及骨折和工作负荷确定潜在的骨强度。锇摄入能够确定成脂表型的改变，而PCR能评价骨活性中涉及的转录本活性。

图3为证实G细胞作为钙传感器的系列图(3A-3D)。CaC1₂(4mM)刺激钙内流(FITC位移：>5倍向右–用流式细胞仪测量)，其在缺乏CaC1₂的情况下，没有观察到(3A)。剂量依赖性的CaC1₂刺激了胃泌素的释放(EC₅₀＝4.1mM，8倍)并通过采用钙通道拮抗剂硝苯吡啶(lμm)的预培养被抑制(10分钟)(3B)。该钙介导的胃泌素分泌物与cAMP产物不相关(3C)，并且不能被PKA抑制剂H-89或MAPK抑制剂PD98059(0.1μM)抑制，这两者都与cAMP/MAPK介导的胃泌素分泌物有关(3D)。相比之下，PI3K信号通路抑制剂渥曼青霉素(lnM)显著地抑制了CaC1₂介导的胃泌素释放。这些结果证明胃泌素分泌物与通过PI₃K信号转换的被钙通道调节的钙传感机制耦合。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未受刺激的细胞相比，*p<0.05，WORT：渥曼青霉素。

图4为显示PTH刺激的G细胞功能的系列图(4A-4D)。PTH刺激的胃泌素释放了估计的EC₅₀＝60nM的～8倍(4A)，通过用PKA抑制剂H-89(10μM)预培养10分钟能够抑制的效果(4B)。同样剂量依赖性的PTH刺激了cAMP产生(E₅₀＝4nM，250％)(4C)，通过H-89逆转的应答(预培养：10分钟-10μM)(4D)。这些结果证实胃泌素分泌与PTH受体介导的PKA活性和cAMP信号耦合。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未受刺激的细胞或单独的PTH相比，*p<0.05。

图5为证实钙抑制G细胞功能的两个图(5A-5B)。降钙素抑制了估计值为IC₅₀＝l.9nM的胃泌素的释放(～20％，5A)，通过采用PKA抑制剂H-89(10μM)的预培养逆转的效果。剂量依赖性的降钙素抑制了cAMP产生(I₅₀＝3.8nM，20％)(5B)。这些结果证实胃泌素分泌与降钙素受体介导的PKA抑制cAMP信号耦合。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未受刺激的相比，*p<0.05；与降钙素介导的抑制相比，#p<0.05。

图6为证实雌激素抑制G细胞功能的系列图(6A-6C)。G细胞表达ESRα转录本(6A)，17β-雌二醇抑制cAMP的合成(IC₅₀＝1.1x10^-12M，-15％)和胃泌素的释放(IC₅₀＝4.6x10^-12M，～20％)(6B)。此外，采用该ESRα拮抗剂的预培养抑制了MAPK的磷酸化(75％，6C)。这些结果确认胃泌素分泌通过雌激素受体α介导的PKA/cAMP产生和MAPK信号发出而被抑制。平均值±SEM(n＝4次实验)。与单独的17β-雌二醇(1nM)相比，*p<0.05。

图7为G细胞调节的模型。含有直接或非直接的膳食钙的鲁米诺药剂通过腺苷酸环化酶的活化(AC)(通过与导致胃泌素分泌的Gas耦合)诱导ERK磷酸化。PTH通过耦合PTH1受体的G蛋白也通过这种途径刺激胃泌素的释放。ERK磷酸化可正影响Ca2+的流入，其通过饮食直接被增加。L型钙通道同样地通过激活PKC调节分泌。胃泌素分泌的抑制剂包括降钙素(通过cAMP的抑制)以及激活ERα来抑制cAMP和MAPK通路的雌性激素。AC：腺苷酸环化酶；GAS：胃泌素；PDK：磷酸肌醇依赖性蛋白激酶；PKA：蛋白激酶A；虚线反映的是抑制，实线反映的是刺激。

图8是显示人类PTH分泌的胃泌素刺激的两个图(8A-8B)。胃泌素(CCK2)和组胺(H1)的受体在从临床手术切除中分离的PTH主细胞中被表达(8A)。这些细胞表达高水平(3倍)的PTH(5A)。胃泌素刺激了PTH的合成(EC₅₀＝10^-9M，40％)和释放(EC₅₀＝4.2x10^-10M，50％)(8B)。这些结果证明PTH的合成和分泌与胃泌素受体(CCK2)介导的活性耦合。平均值±SEM(n＝4次实验)。

图9为显示胃泌素刺激甲状腺C细胞(MTC-SK)功能的系列图(9A-9D)。胃泌素刺激的cAMP产生(EC₅₀＝6.7x10^-13M，～5倍)通过选择性CCK₂受体拮抗剂YF476逆转(9A)。YF476单独没有显著的效果。胃泌素对cAMP的刺激效应可通过采用PKA抑制剂H-89(l0μM)的预培养被抑制(9B)。降钙素分泌物被胃泌素剂量依赖性地影响，由YF476逆转的效果(9C)。胃泌素(0.1nM)刺激(～3倍)降钙素基因的转录，由采用H-89(10μM)的预培养的逆转效果(9D)。CCK2受体的表达没有被H-89抑制(9D)。这些结果确定了降钙素的合成和释放由胃泌素受体(CCK2)介导的PKA活性和cAMP信号调节。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未受刺激的相比，#p<0.05；与单独的胃泌素(0.1nM)相比，*p<0.05。

图10是显示胃泌素对PTH以及MTC-SK的合成和分泌的影响–共培养模型系统的图示(10A)、显微照片(10B)和系列图(10C-10F)。从手术样品中分离的人类PTH细胞与MTC-SK细胞系共培养。在图10A中包括清晰说明细胞定位和靶标位点的图，而显微照片展示了这些细胞类型中的每一种的生长(10B)。将胃泌素添加到共培养系统中显著地刺激了PTH的转录(～75％，10C)和分泌(～60％，10D)。这些效果可被采用选择性CCK₂受体拮抗剂YF476(l0nM)的预培养(10分钟)逆转。相比之下，胃泌素抑制了降钙素的转录(基底的–10E)和释放(～70％-10F)。这些结果确定了胃泌素在模型系统中的基本影响是刺激PTH以及抑制降钙素。相比之下，后一种影响与在单培养(单独的MTC-SK细胞)实验中的胃泌素的刺激效应形成对照。CON＝对照，GAS＝胃泌素(10^-10M)，G+INH＝胃泌素+YF476(10^-11M)。PET＝聚酯膜(0.4mm)。平均值±SEM，n＝3。与对照相比，*p<0.05(未受刺激的)；与胃泌素(10^-10M)相比，**p<0.05。

图11为显示CCK2受体在分离的骨源细胞和骨中的表达的图(11A)和一系列的显微照片(11B-11H)。CCK2受体的转录本水平在颅骨的成骨细胞、hFOB细胞系(hFOB)中以及人骨髓间充质干细胞(BMMSC)中被确定(11A)。使用免疫组织化学法，在骨骺板(EP)中以及在骨髓细胞(箭头)中确定(11B，11C–100x放大)特异免疫染色。参与软骨内骨化的细胞表达受体(11D、E、F)，成骨细胞也如此(11F)。有CCK2R阳性的成骨细胞沿骨内膜排列成行(11G)以及在愈合骨骼中(11H)的证据。我们解释这些结果以表明CCK2R在软骨细胞、成骨细胞和骨髓间充质骨髓细胞中表达，并且CCK2R参与调节骨化和骨骼愈合。靶向受体可能调节这些现象。CCK2R免疫染色＝棕色细胞(DAB)，复染色＝苏木精。11D-H：放大率＝400x。

图12是显示在人骨骨髓样品中胃泌素/CCK2表达的照片(12A)、序列分析(12B)、以及照片(12C)。标准PCR鉴定出源于动脉粥样硬化诱导的肢体缺血(没有骨髓炎的证据)的切除中分离的皮层骨骨髓样品中的～320个碱基对(箭头)(12A)。序列分析(BioEdit)鉴定出与典型的CCK2基因具有92％同源性(12B)。蛋白质印迹法证实了在研究的10个样品中表达CCK2(箭头–50kD)(12C)。

图13为展示胃泌素和靶向CCK2在骨源细胞增殖上的影响的一组图(13A和13B)。在所有的细胞类型中，胃泌素以EC₅₀＝1-2x10^-11M剂量依赖性地刺激BrdU摄入(13A)。这不会被选择性的CCK2受体拮抗剂YF476逆转，这确实看似增加了增殖，特别是在BMMSC中(13B)。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未受刺激的相比，*p<0.05；与胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。

图14为展示胃泌素和靶向CCK2在骨源细胞矿化上的影响的一组图(14A和14B)。在所有的细胞类型中，胃泌素以IC₅₀＝3.2x10^-11–1.3x10^-10M剂量依赖性地抑制骨矿化(用Ostemalge测定)(14A)。这没有被选择性CCK2受体拮抗剂YF476逆转，这增加了增殖，特别是在颅骨的成骨细胞中(14B)。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未被受刺激的相比，*p<0.05；与胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。

图15为展示胃泌素和靶向CCK2在骨源细胞基因表达上的影响的一组图。在所有的细胞类型中，胃泌素(1nM)抑制了成骨细胞分化基因、碱性磷酸酶(ALKP)的表达(顶行)。这被选择性CCK2受体拮抗剂YF476(1nM)逆转。在成骨细胞中，胃泌素还抑制了M-CSH和RANKL，其被YF476正常化了(底行)。平均值±SEM(n＝4次实验)。与未被受刺激的相比，*p<0.05，与胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。

图16展示了在乳鼠属(Mastomys)模型中，短期和慢性高胃泌素血症对循环激素水平的影响。在处理的第8周(～2倍)和第16周(～3.5倍)显著升高了胃泌素水平。在短和长期高胃泌素的动物中，雌性激素(雌二醇)均下降了(～50％)。PTH在第8周显著地升高了(～75％)，但是在第16周显著地减少了(～3倍)。这些结果证明在活体内模型中短期的高胃泌素血症抑制了雌性激素的释放和PTH分泌物的相互活化。长期高胃泌素血症还与雌二醇的降低有关，但这并不导致PTH升高。后者的机理还不清楚，但可能显示了暴露于长期胃泌素刺激的甲状旁腺中CCK2受体或其信号应答的下调。平均值±SEM，与对照动物相比，*p<0.05。与8周处理的动物相比，#p<0.05。CON＝对照动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图17是显示钙轴相关受体PTH1R、ERα和CaSR在乳鼠属模型的胃中的表达的一对图(17A和17B)和照片(17C)。来自正常(n＝4)的胃粘膜的PCR和蛋白印迹法的结果分别与用拉伏替丁处理8周(n＝4)和16周(n＝5)的动物相比。在底部，短期(8周)和长期(16周)高胃泌素血症均显著增加了HDC，但分别降低了PTH1R和Erα表达(17A)。在窦部，高胃泌素血症与胃泌素转录的显著增加以及PTH1R、ERα和CaSR表达的提高有关(17B)。这些影响在长期高胃泌素血症中更为明显。在蛋白水平上总结了RNA的影响(蛋白质印迹法–17C)。特别是，PTH1R表达在底部降低了(F)但在窦部增加了(A)–顶部板。窦的ERα表达在16周被提高了(中部板)CaSR也提高了(底部板)。这些结果证明底部和窦部应答与钙骨轴相关的受体的差异合成和表达的短期和长期的高胃泌素血症。特别是，功能受体在胃的组胺合成部分(底部)下调，但是这些在胃泌素分泌(窦部)的胃部是增加的。在一些方面，这反映了窦部以及钙敏G细胞的致敏性。平均值±SEM，与对照(未受处理的)动物相比，*p<0.05。CON＝对照动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图18展示了在甲状旁腺和甲状腺中CCK2受体的表达。CCK2受体的免疫染色确定了甲状旁腺内的甲状旁腺细胞大部分为CCK阳性(不同的染色反映了膜结合的表达[箭头]和细胞核]18A)。在甲状腺内，单个C细胞可通过CCK2抗体染色来确定(染色反映了膜结合的表达[箭头]-18B、18C(下方的两个箭头))。相比之下，乳鼠属甲状腺内的渗透免疫细胞为CCK2阴性(上面的三个箭头，蓝色的仅为核)(18C)。这些结果展示了在PTH和甲状腺细胞中CCK2受体的膜表达。这与显示胃泌素对从这些结构中分离的细胞的影响的活体外结果一致。核染色＝DAPI，其他染色＝FITC标记的CCK2。购自Abeam的抗体(ab14439，兔多克隆，1:100稀释)。

图19显示了用微计算机断层扫描技术(microCT)测定的在短期和长期高胃泌素性动物模型中的骨小梁变化。骨体积(19A)以及骨体积与骨小梁体积的比例(19B)在短期和长期的高胃泌素性动物中降低了，但是在短期处理的动物中这一点更明显(50％比30％)。两种密度表观密度(19C)和组织密度(19D)的测量在两个胃泌素群组中显著地降低了(～100％)。连接密度(每单位体积骨小梁的数量的测定)在长期高胃泌素群组中显著地降低了(～60％)(19E)。短期胃泌素与从更像板状的结构(SMI接近0)到更像杆状的结构(SMI增加>1)的骨的转换相关(19F)。这在长期高胃泌素性动物中没有那么明显。这些结果证明胃泌素显著地改变了乳鼠属模型的骨表型。这些改变与“骨质疏松”表型一致。BV＝骨体积，TV＝骨小梁体积，ConnDens＝连接密度，SMI＝结构模型指数(杆状：板状几何比的测定)。平均值±SEM，与对照动物相比，*p<0.05。CON＝对照动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图20为显示基于锇染色的骨脂肪组织活化的一系列照片。脂肪细胞摄取锇并在骨中易于识别。对照动物(右股骨，n＝5，上部板)主要显示出在胫骨骨骺中的锇摄取。短期高胃泌素性动物也显示出在骨骺中的锇摄取，但在干骺端中显著的摄取也被注意到(n＝5，底板)。这些结果与脂肪组织的胃泌素活化以及“老化”表型一致。

图21为显示来自对照、8周和16周拉伏替丁处理的乳鼠属的甲苯胺蓝、TRAP染色的股骨的一系列的显微照片，证明骨矿化和吸收腔的模式。一方面，拉伏替丁处理后的动物中的改变反映了骨矿化的流失和增加的吸收——与骨质疏松症的表型一致的特征。BM＝骨矿化，RC＝吸收腔。

图22是显示乳鼠属模型中的microCT和碎骨比较的系列图(22A-22C)。用伺服液压测试机器(Instron model 8874)载荷至失效(四点弯曲)。注意到在骨的刚度和骨折载荷之间存在显著相关性(R²＝0.86，p<0.01)(22A)，表明增加骨的刚度将需要更大的骨折载荷。我们评价了骨屈伸和骨小梁和皮质密度的microCT测定之间的关系。这些确定了骨小梁密度与使骨断裂所需的力呈负相关(R²＝-0.54)(22B)，而增加皮质密度与较高的骨折载荷相关(R²＝0,71，22C)。这些结果证明在该模型中，使骨头骨折需要的机械力与骨结构和密度相关，并且这两种方法的结合提供了生理上相关的信息。N＝7只动物，uCT＝microCT。

图23为总结在乳鼠属模型中胃泌素介导的变化的图表。与对照(未受处理、正常饮食的动物)相比，短期的拉伏替丁处理提高了循环的胃泌素和PTH，但减少了雌二醇。这与降低的骨密度和骨质疏松性表型有关。在胃中，PTH1R的表达被上调，而ERα降低。在钙敏受体(CaSR)中没有检测到变化。与对照相比，长期的拉伏替丁处理提高了循环的胃泌素，但减少了PTH以及雌二醇。这与降低的骨密度和骨质疏松症性表型有关。在胃中，PTH1R、ERα和CaSR的表达被上调，与钙代谢表型的活化一致。8周＝8周的拉伏替丁处理，16周＝16周的拉伏替丁处理，骨d＝骨密度测定，Osteo＝骨质疏松性表型。

图24为显示在乳鼠属模型中胃泌素介导的骨表型改变的总结图。与对照(未受处理，正常饮食的动物)相比，短期处理的动物显示出提高的循环胃泌素和PTH，但是降低的雌二醇。这与降低的骨密度和骨质疏松性表型(包括具有低扭转强度的弱骨(weak bone))有关。在长期处理的动物中，注意到提高的循环胃泌素，但是PTH和雌二醇都降低了。这与降低的骨密度以及以弱但硬的骨骼为特征的骨质疏松性表型有关。pMOI＝极惯性矩(ploarmoment of inertia)，PTH＝甲状旁腺激素。

图25是显示在乳鼠属模型中卵巢切除术对短期和长期高胃泌素血症介导的循环PTH水平的影响的图。卵巢切除术增加了PTH水平～100％。短期高胃泌素血症同样地提高了PTH水平。这在OVX/8周处理的动物中增加了(高出对照300％)。长期胃泌素处理显著地降低了～60％的水平。卵巢切除术逆转了这种情况，使PTH水平正常化。这些结果证实了卵巢切除术介导的PTH释放的活化(与雌激素损失一致)并且在活体内模型中这通过短期高胃泌素血症被放大。长期高胃泌素血症出现减少了PTH释放，在切除卵巢的动物中也看到了这种效果。机制可反映在暴露于长期胃泌素刺激的PTH腺中的CCK2受体或其信号应答的下调。这种效果抵消了雌激素的损失，表明胃泌素在PTH腺功能中可能起到作用。平均值±SEM，与对照动物相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，#p<0.05。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图26是显示正常的和高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型的胃中神经内分泌相关的转录的表达的一系列的图(26A-26D)。比较来自正常(n＝11)、切除卵巢(OVX，n＝8)的乳鼠属(顶部)以及OVX和短期(n＝4)和长期(n＝4)高胃泌素性动物(底部)胃粘膜的PCR结果。卵巢切除术显著地增加了胃粘膜CgA(4倍)和HDC(～6倍)的表达(26A)。短期和长期高胃泌素血症对OVX介导的CgA合成都没有额外的影响(2.8-4.2倍相比于4.3倍)(26B)。短期高胃泌素血症提高了胃泌素的表达(～40倍–26C)和HDC(～40倍-26D)。长期高胃泌素血症提高了胃泌素和HDC，但对于ECL细胞源的HDC表达的效果最明显(～45倍-26D)。这些结果证实了雌性激素调节HDC的ECL细胞转录(从而组胺合成)，并且胃泌素的合成被雌性激素相似的调节。循环的胃泌素进一步上调表达。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。与OVX相比，#p<0.05。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图27是显示在正常饮食的乳鼠属卵巢切除术模型的胃中钙轴相关受体PTH1R、ERα和CaSR的表达的图。比较来自正常的和切除卵巢的(OVX)乳鼠属的胃粘膜的PCR结果。卵巢切除术增加了雄性激素受体(～6-倍)以及两种雌性激素受体(ESR1和ESR2，都是～4倍)的胃粘膜表达。CaSR和PTH1R也通过雌性激素的损失增加了(分别为5和4倍)。这些结果证实了雌性激素的损失与钙敏和甲状旁腺：卵巢轴相关的转录上调相关。循环胃泌素进一步上调表达。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。CON＝假手术对照动物(n＝11)，OVX＝卵巢切除术(n＝8)。AR＝雄性激素受体，ESR＝雌激素受体，CaSR＝钙敏受体，PTH1R＝甲状旁腺1型受体。

图28是显示在高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型的胃中的钙轴相关受体PTH1R、AR、ERα和CaSR的表达的系列图(28A-E)。来自OVX和短期(n＝4)以及长期(n＝4)高胃泌素性OVX动物的胃粘膜的PCR结果。在雄性激素受体中卵巢切除术诱导的升高在短期和长期高胃泌素性动物中被正常化，在短期动物中效果更明显(28A)。对两种雌性激素受体注意到相似的结果(28B，C)。CaSR(28D)和PTH1R(28E)被高胃泌素血症显著的降低了。这些结果确定钙：骨轴相关受体的表达被短期和长期高胃泌素血症正常化，所述表达通过卵巢切除术在胃粘膜中上调。这反映了在高胃泌素环境中调节或重新调整钙敏的生理学尝试的。平均值±SEM，与切除卵巢的动物相比，*p<0.05；与短期高胃泌素性动物相比，#p<0.05。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。AR＝雄性激素受体，ESR＝雌激素受体，CaSR＝钙敏受体，PTH1R＝甲状旁腺1型受体。

图29是显示骨小梁和皮层骨的微计算机断层扫描技术(microCT)的一系列的截图(29A-H)。与对照骨相比(29A)，切除卵巢的动物的骨小梁骨显示出显著的损失。短期(29C)和长期(29D)高胃泌素血症都在这方面降低了，在长期高胃泌素性动物中该效果更明显。在皮层骨中，卵巢切除术分别与来自正常的、切除卵巢的(OVX)和用拉伏替丁处理8周和16周的OVX动物的骨小梁和皮层骨的图像相关。骨质流失，特别是在股骨的骨小梁区域随着OVX被注意到。在一些方面，这可被胃泌素升高来增加。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图30是显示在正常和高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型中骨小梁和皮层骨的MicroCT测量的一系列的图表(30A-D)。与正常的动物相比，骨小梁密度被卵巢切除术显著的降低了(～50％)(30A)。这被长期高胃泌素血症放大了(85％)。骨小梁体积也被卵巢切除术显著地降低了(～50％)(30B)。这被长期高胃泌素血症放大了(～70％)。皮层骨密度没有被卵巢切除术降低，但在长期高胃泌素性动物中明显地降低了(～5％，30C)。皮层体积被卵巢切除术显著地降低了(～30％)(30D)。这被短期高胃泌素血症放大了(～30％)。这些结果证明在卵巢切除术模型中胃泌素放大了骨质流失，并导致与骨质疏松性表型一致的microCT特征。长期高胃泌素血症的影响主要反映在骨小梁改变中。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图31是显示正常和高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型中皮层骨的骨内和骨膜尺寸的MicroCT测量的一系列的图表(31A-D)。相比于正常动物，卵巢切除术显著降低了骨内半径(～20％)(31A)。这被短期高胃泌素血症显著地放大了(30％)。骨内周长被卵巢切除术显著地降低了(～18％)(31B)。这被短期高胃泌素血症显著地放大了(～27％)。同样地，在切除卵巢的动物中骨膜半径减小了(～20％，31C)，效果被短期高胃泌素血症显著地放大了(～30％)。骨膜周长也被卵巢切除术降低了(～20％)，效果被短期高胃泌素血症放大了(～30％)(31D)。这些结果证明胃泌素放大了皮层骨的尺寸，效果主要被短期高胃泌素血症突出了。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图32是显示来自切除卵巢的乳鼠属中的甲苯胺蓝、TRAP染色股骨的一对显微照片，确定骨矿化和再吸收腔模式以及破骨细胞的数量和位置。红色细胞表示TRAP染色，破骨细胞为红色染色的多核细胞(黄色箭头)。左板(100x放大)，右板(400x放大)。RC＝吸收腔。

图33是显示来自正常和高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型的股骨的Instron 4点弯曲结果的一系列的图表(33A-D)。刚度被卵巢切除术增加了(～15％)，效果被长期高胃泌素血症显著地放大了(33A)。短期高胃泌素血症与到正常水平的刚度的降低有关。使骨折断的最大载荷在切除卵巢的动物中显著地降低了(～20％～33B)。高胃泌素血症没有改变这一点，但与短期动物相比，长期高胃泌素性动物需要更高的载荷来使骨折断。相似地，骨折载荷在切除卵巢的动物中被降低了(～25％)，并且没有被胃泌素改变(33C)。然而，长期高胃泌素性动物需要比短期高胃泌素性动物更高的载荷来使骨折。使骨折断需要的总功在切除卵巢的动物被增加了(～20％)(33D)。而长期高胃泌素血症没有改变功，短期高胃泌素性动物的骨需要少-50％的功来骨折。这些结果证明卵巢切除术之后的骨的强度被短期胃泌素(导致弱骨)和长期胃泌素(硬骨)差异地影响了。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图34是显示正常和高胃泌素性乳鼠属卵巢切除术模型中骨的总强度的一系列的图表(34A-E)。极惯性矩(pMOI)在切除卵巢的动物中被显著地降低了(25％，34A)。扭转载荷失效(failure)的这一测定被短期高胃泌素血症特别地扩大了(～50％)。pMOI与刚度(R²＝0.23–34B)、最大载荷(R²＝0.33–34C)和骨折载荷(R2＝0.3–34D)显著相关。总功与pMOI不相关(34E)。这些结果证实了卵巢切除术之后骨的扭转强度降低了，并且短期胃泌素特别地放大了这一参数。刚度和最大/骨折载荷的总相关性是乳鼠属卵巢切除术效果的反映。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。

图35是显示源于正常饮食乳鼠属卵巢切除术模型中的皮层源骨骨髓的骨重建相关的转录本表达的一系列的图(35A-I)。比较来自正常的与切除卵巢的(OVX)乳鼠属模型的骨髓细胞的PCR结果。卵巢切除术显著地降低了ALOX5(35A-炎症：～20％)和RUNX2(29B-成骨细胞的分化：～100％-35B)的表达，但没有降低TCF4(35C–参与TGFβ介导的骨形成)、IGF-1(35D–骨形成)、PTGS2(35E–炎症)或RANKL(35F–骨质流失)的表达。在CXCL12(35G-成骨细胞活化：～20％)、PPARg(35H-脂肪细胞分化：～60％)和HIF-1a(35I-组织缺氧介导的骨损害：～250％)中注意到增加。这些结果证实了雌性激素的损失与骨髓源转录本的上调有关，所述转录本涉及重建和骨质流失。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。CON＝假手术对照动物(n＝11)，OVX＝卵巢切除术(n＝8)。

图36是显示在切除卵巢的乳鼠属模型中胃泌素介导的骨表型改变的图表。与单独的卵巢切除术(正常饮食的动物，降低的雌性激素，升高的PTH和骨质疏松症特征例如硬、弱骨)相比，短期高胃泌素性动物显示出与低扭转强度的较弱的骨头有关的降低的皮质层特征。该表型比在单独的卵巢切除术中更明显。在长期高胃泌素性动物(显示出正常的PTH)中，注意到导致显著的硬骨的骨小梁损伤。该表型比在单独的卵巢切除术中更明显。pMOI＝极惯性矩，PTH＝甲状旁腺激素。

图37是显示在切除卵巢的小鼠模型中的循环激素水平上胃泌素敲除(knockout)、组氨酸脱羧酶敲除(knockout)或双敲除(double knockout)的效果的一系列图。雌性激素水平在所有的动物中被卵巢切除术显著地降低了～50％。胃泌素水平没有被卵巢切除术影响，但与胃泌素KO或双KO的动物相比，HDCKO的动物表达升高了～3倍。PTH在胃泌素KO的动物中被显著地降低了(～80％)。相比之下，卵巢切除术之后，在HDC和双KO的动物中水平被显著地增加了(～100％)。这些结果证明雌性激素损失没有活化胃泌素KO的动物中的PTH释放。这表明胃泌素改变了甲状旁腺中的雌性激素的功能。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。G＝胃泌素KO，GH＝胃泌素/HDC双KO，H＝HDC KO，KO＝敲除，N＝没有卵巢切除术，O＝卵巢切除术。

图38是显示在切除卵巢的小鼠敲除模型的胃中的神经内分泌和钙敏受体的表达的一系列的图。在底部，胃泌素KO和卵巢切除术的组合显著地增加了CCK2(ECL细胞的胃泌素响应性：～3倍)和HDC(ECL组胺合成：～20倍)。相比之下，在切除卵巢的HDCKO的小鼠的底部没有看到变化。在窦部，CaSR在切除卵巢的胃泌素KO小鼠中被显著地降低了(～60％)，而CaSR(～60％)以及胃泌素自身的表达(～70％)在切除卵巢的HDC KO的小鼠中都降低了。一方面，这反映了在胃泌素敲除的动物中卵巢切除术和雌性激素的损失显著地活化了ECL细胞以及降低了G细胞的钙敏应答。在HDC KO的动物中，卵巢切除术对窦部的影响是有限的。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。G＝胃泌素KO，H＝HDC KO，KO＝敲除，N＝没有卵巢切除术，O＝卵巢切除术。

图39是显示在切除卵巢的小鼠模型中的皮层和骨小梁测量的MicroCT测量的一系列图(39A-F)。在胃泌素KO的动物中，骨内半径(39A)和周长(39B)在卵巢切除术后被显著地增加了(～30％)。这反映了雌性激素损失和胃泌素缺乏的组合增加了皮层骨的厚度。在这些环境中，胃泌素的损失没有负面影响骨头。在HDC KO的动物中，卵巢切除术显著地降低了皮层骨的体积(～25％-39C)，但导致了具有较高扭转强度的骨骼(39D)。这确定了组胺的损失加重了雌性激素对骨骼的影响。双KO也与骨小梁(～50％-39E)和皮层骨体积(～15％-39F)的减小有关，但这没有转变为显著的骨弱。这确定了虽然在骨表型中有一些变化，但是胃泌素和组胺的损失的结合没有显著地改变骨的生物学。G＝胃泌素敲除，GH＝胃泌素/HDC双敲除，H＝HDC敲除，N＝没有卵巢切除术，O＝卵巢切除术。

图40是显示在敲除小鼠卵巢切除术的模型中的皮层源骨髓中的骨重建相关的转录本的表达的一系列图表(40A-D)。比较来自非切除卵巢的与切除卵巢的小鼠的骨髓细胞的PCR结果。仅在胃泌素KO的动物中，卵巢切除术显著地增加了ALOX5(40A-炎症：～100％)、CXCL12(40B-成骨细胞活化：～70％)、HIF-1a(40C-组织缺氧介导的骨损害：～5倍)和IGF-1(40D–骨形成：～100％)的表达。这些结果表明雌性激素和胃泌素的损失的结合与涉及重建的骨髓源的转录本的上调有关。对没有切除卵巢的动物的值进行了标准化。平均值±SEM，与没有切除卵巢的动物相比，*p<0.05。G＝胃泌素敲除，GH＝胃泌素/HDC双敲除，H＝HDC敲除，N＝没有卵巢切除术，O＝卵巢切除术。

图41是显示在切除卵巢的小鼠敲除模型中骨表型改变的概述图表。尽管“前骨质减少的”激素环境(雌性激素的损失，升高的PTH)，卵巢切除术之后的胃泌素敲除的动物显示出了骨内特征和相对正常的骨表型的增加。HDC KO的小鼠，显示出皮层体积减小，但骨头变强了。双KO在骨小梁和皮层特征中也显示出一些变化——这些没有导致改变骨的强度。尽管失去了卵巢功能以及PTH升高了，组合的损失(胃泌素和组胺二者)没有导致骨表型异常。胃泌素降低似乎是对骨表型的保护。GAS＝胃泌素，pMOI＝极惯性矩，PTH＝甲状旁腺激素。

图42是显示在对照、切除卵巢和用胃泌素拮抗剂处理的卵巢切除术CD-1的小鼠中骨小梁的MicroCT测量的一系列图。BV/TV比例、连接密度(Conn-Dens)、骨小梁的数量(TB.N)、骨表面和密度，都被卵巢切除术显著地降低了。结构模型指数(SMI)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间距(Tb.Sp)也都增加了。胃泌素拮抗剂处理逆转了除骨小梁的厚度和间距之外的大部分的这些效果。这些结果证明选择性抑制胃泌素受体减轻了卵巢切除术模型中的骨质流失，并导致与正常表型一致的microCT特征。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图43是显示在对照、切除卵巢和用胃泌素拮抗剂处理的卵巢切除术CD-1的小鼠中皮层骨的MicroCT测定的一系列的图。皮层密度和骨表面(BS)都被卵巢切除术显著地降低了。皮层厚度(Ct.TH)被增加了。胃泌素拮抗剂处理逆转了对密度的影响，但没有改变厚度。这些结果证明选择性抑制胃泌素受体逆转了卵巢切除术模型中的皮层密度。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图44是显示在对照、未受处理的和胃泌素拮抗剂处理的小鼠中的骨的综合强度的一系列的图。卵巢切除术显著地降低了骨强度(包括刚度、屈服刚度、最大(max)载荷和折断的骨折载荷)，以及增加了需要折断骨头的总功。采用胃泌素拮抗剂的处理逆转了这些影响，除了载荷。这些结果确定了卵巢切除术之后，骨的强度被降低了，靶向胃泌素受体减轻了雌性激素损失介导的影响。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图45是显示来自对照和用胃泌素拮抗剂(OVX+GA)或载体(OVX)处理的切除卵巢的CD-1小鼠的甲苯胺蓝和TRAP染色的股骨的一系列的显微照片。骨矿化(BM：降低)、再吸收腔(RC：增加)和破骨细胞(染色的多核细胞(两个箭头)：增加)的模式被OVX影响了。这些效果被药物处理逆转了。一方面，这意味着靶向CCK2受体使骨形态正常化了，与低的雌性激素水平无关。

图46是显示胃泌素拮抗剂处理对切除卵巢小鼠的模型中的循环激素水平的影响的一系列的图。雌性激素被卵巢切除术显著地降低了，而PTH和胃泌素都被卵巢切除术升高了。胃泌素拮抗剂处理对PTH没有影响，但使胃泌素水平正常化了。卵巢切除术增加了所有的三种骨标记，PINP、CTX1和骨钙素。胃泌素拮抗剂抑制了这些影响中的每一个。我们解释这些结果以表明被卵巢切除术引起的骨活性标记被靶向胃泌素受体正常化了。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图47是显示对照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗剂处理的卵巢切除术CD的大鼠的骨小梁中的MicroCT测量的一系列的图。BV/TV比、骨小梁数量(TB.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨表面和密度都被卵巢切除术显著地降低了。结构模型指数(SMI)和骨小梁间距(Tb.Sp)都增加了。胃泌素拮抗剂处理逆转了大多数的这些影响，除了SMI以外。这些结果证明选择性的抑制胃泌素受体改善了卵巢切除术模型中的骨质流失，并在CD大鼠中导致了与正常表型一致的microCT特征。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。与CON相比，平均值±SEM.*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图48是显示在对照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗剂处理卵巢切除术CD的大鼠中皮层骨的MicroCT测量的一系列的图。皮层密度和骨表面(BS)以及极惯性矩(pMOI)都被卵巢切除术显著地降低了。胃泌素拮抗剂处理逆转了对密度的影响，并与BV/TV比的增加以及皮层厚(Ct.TH)度都有关。这些结果证明了选择性地抑制胃泌素受体逆转了卵巢切除术模型中的皮层密度损失。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图49是显示对照、未受处理的以及胃泌素拮抗剂处理的大鼠中的骨的总强度的一系列图。卵巢切除术显著地降低了包括刚度、屈服刚度以及折断骨折载荷的骨强度。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些影响。这些结果证实了随着卵巢切除术，骨强度降低了，并且靶向胃泌素受体改善了这些雌性激素介导的效果。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8周＝短期高胃泌素血症，16周＝长期高胃泌素血症。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图50是显示来自对照和用胃泌素拮抗剂(OVX+GA)或载体(OVX)处理的切除卵巢CD的大鼠的甲苯胺蓝和TRAP染色的股骨的一系列的图。骨矿化(不同程度地降低)、吸收腔(RC)(增加了)以及破骨细胞(染色的多核细胞(两个箭头)：增加了)的模式被OVX影响了。这些影响被药物处理逆转了。一方面，这反映了靶向CCK2受体使与低的雌性激素水平无关的骨形态正常化了。

图51是显示胃泌素拮抗剂处理对切除卵巢的大鼠模型中的循环激素水平的影响的一系列的显微照片。雌性激素被卵巢切除术显著地降低了，而胃泌素被卵巢切除术升高了。胃泌素拮抗剂处理没有显著的影响。卵巢切除术增加了PINP和骨钙素。胃泌素拮抗剂抑制了这些影响。一方面，这些结果证明了由卵巢切除术引起的骨活性标记被靶向胃泌素受体正常化了。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图52是显示在对照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗剂处理的卵巢切除术的乳鼠属中的MicroCT测量的一系列的图表。BV/TV比、骨小梁数量(TB.N)、密度和骨表面都被卵巢切除术显著地降低了，而结构模型指数(SMI)和骨小梁间距(Tb.Sp)增加了。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些影响，并与骨小梁厚度的增加有关(Tb.Th)。这些结果证明了在乳鼠属中，选择性地抑制胃泌素受体改善了卵巢切除术模型中的骨质流失，并导致与正常的表型一致的microCT特征。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图53是显示对照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗剂处理的卵巢切除术乳鼠属中的皮层骨的MicroCT测量的一系列的图表。测定的类型没有一个被卵巢切除术显著地影响或者被胃泌素拮抗剂处理改变。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。

图54是显示对照、未受处理的和胃泌素拮抗剂处理的乳鼠属中的骨的总强度的一系列的图。卵巢切除术显著地降低了包括刚度、屈服刚度以及折断的最大和骨折载荷的骨强度。并且使总功增加了。用胃泌素拮抗剂的处理逆转了这些影响。这些结果证实了骨强度随着卵巢切除术降低了，并且靶向胃泌素受体改善了这些雌性激素介导的影响。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，8wk＝短期高胃泌素血症，16wk＝长期高胃泌素血症。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图55是显示来自对照和用胃泌素拮抗剂(OVX+GA)或载体(OVX)处理的切除卵巢的乳鼠属的甲苯胺蓝和TRAP染色的股骨的一系列的显微照片。骨矿化(BM：降低了)、吸收腔(RC：增加了)和破骨细胞(染色的多核细胞(两个箭头)：增加了)的模式被OVX影响了。这些影响被药物处理逆转了。我们对其进行解释以表明靶向CCK2受体使与低的雌性激素水平和组成性胃泌素受体活化无关的骨形态正常化了。

图56是显示胃泌素拮抗剂处理对切除卵巢的乳鼠属模型中的循环激素的影响的一系列的图。雌性激素被卵巢切除术显著地降低了，而PTH和胃泌素被卵巢切除术升高了。胃泌素拮抗剂处理逆转了对PTH和胃泌素的影响。卵巢切除术显著地增加了PINP、CTX-1和骨钙素。胃泌素拮抗剂抑制了这些影响。我们解释这些结果以表明被卵巢切除术引起的骨活性标记被胃泌素受体正常化了。CON＝对照动物，OVX＝切除卵巢的动物，OVX+GA＝胃泌素拮抗剂处理的切除卵巢的动物。平均值±SEM。与CON相比，*p<0.05；与单独的OVX相比，**p<0.05。

图57显示了一个基于本发明证明结果的调节骨重建的综合模型。本发明显示了卵巢功能(和雌性激素分泌)以及甲状旁腺PTH分泌物的影响被窦胃泌素分泌G细胞调整。由于胃中的主要钙敏细胞以及PTH和雌性激素信号在胃内的联系，通过其对骨重建(破骨细胞活化)的负影响，胃泌素是骨表型的主要的调节子。这些作用可被降钙素和甲状腺改变，并被来自ECL细胞的组胺的释放放大。较深的灰色线＝刺激，较浅的灰色线＝抑制作用。

图58是显示胃泌素/CCK2受体靶标在人体内分配的图。所述受体在甲状腺(包括甲状旁腺)中、胃内以及在骨中被表达。在甲状腺中，CCK2在甲状旁腺中的降钙素分泌C细胞以及PTH分泌细胞上被表达。在肠中，CCK2在组胺分泌的ECL细胞中被表达，而在骨中，受体表达可存在于包括成骨细胞和骨原细胞的多种细胞中。用特异拮抗剂靶向胃泌素/CCK2受体将直接地(骨)或间接地通过胃和状腺/甲状旁腺轴抑制骨疾病，例如骨质疏松症。PTH＝甲状旁腺。

具体实施方式

根据一个实施例，本申请提供了一种用于治疗、稳定和/或预防骨疾病或病情发展的新方法。这种新方法得到了以下发现的支持：激素胃泌素直接或间接地调节骨形成，因此促进了骨质流失，同时伴随着与骨质疏松性改变一致的随之而来的骨病理生理(见图57)。

根据本申请的一个方面，已经发现用靶向CCK2S受体的胃泌素拮抗剂阻止这些胃泌素的影响在显示出特征为骨质疏松症的骨疾病或病情的动物模型中具有有益的效果。

因此，本申请涉及胃泌素靶向药剂(例如胃泌素拮抗剂，或拮抗胃泌素活性的药剂)治疗骨疾病或病情的用途(见图58)。

A.定义

如在本发明中使用的术语“病情”一般是指健康状况中的疾病、事件或变化。

如在本发明中使用的术语“骨疾病或病情”是指与骨异常有关的疾病或病情，所述骨异常可通过增加骨量和/或骨生长来治疗。例如，骨疾病或病情可包括：原发性骨质疏松，继发性骨质疏松症，成骨不全，骨营养不良，骨质减少，佩吉特氏病(Paget's disease)，由于骨转移、放射疗法或化学疗法产生的溶骨性病变(osteolytic lesions)，牙周疾病，牙槽骨质流失，由于不能移动或性激素的缺乏引起的骨质流失，由于转移性癌症引起的骨质流失，由炎性疾病引起的骨和软骨的骨质流失，骨关节炎，截骨术骨质流失，儿童特发性骨质流失，脊柱弯曲以及骨折。骨疾病或病情可以为与高胃泌素血症相关的骨疾病或病情。骨疾病或病情还可在如下段描述的特定环境下的主体中被显示出。

如在本发明中使用的术语“主体”是指哺乳动物，优选人类。例如，这些主体可以包括以下主体：i)老年人(男性或女性)；ii)患有卵巢功能降低或失去卵巢功能的女性；iii)患有天生(肿瘤的或与胃粘膜萎缩有关的)高胃泌素血症的个体，或iv)作为抑酸药物(药剂类型包括所有的质子泵抑制剂或所有短期或长期作用组胺的两种受体拮抗剂)使用结果的高胃泌素血症个体，或v)胃切除手术的个体。在所有的这些情况下，这些主体中的骨疾病或病情可通过使用一类胃泌素靶向药剂被改善。例如，这类胃泌素靶向药剂为靶向CCK2受体的胃泌素拮抗剂。

如在本发明中使用的术语“胃泌素靶向药剂”的意思是胃泌素拮抗剂，例如胃泌素靶向或胃泌素受体靶向药剂，以及胃泌素或胃泌素受体拮抗剂，例如靶向CCK2受体的药剂。

如在本发明中使用的术语“治疗上有效量”的意思是将获得骨疾病或病情的治疗目的、改善效果或预防，或将改善疾病或病情严重度和发病率的如在本申请中描述的胃泌素靶向药剂的量。骨疾病或病情严重程度中的改善包括疾病或病情的逆转，以及缓解疾病或病情的进展。

如在本发明中使用的术语动词形式的“治疗”或名词形式的“治疗”的意思是减轻，包括停滞，或推迟或减弱疾病或病情，或与本发明中描述的疾病或病情相关的一种或多种症状的进展、发展、启动或严重程度，或改善出现的不可控制的或不需要的症状，预防额外的症状，或改善或预防潜在的症状代谢原因。因此，所述术语表示对具有疾病或症状，或具有潜在发展为这种疾病或症状的主体赋予了有益的结果。当主体经历了疾病、病情或患病的部分或全面的缓解，或其一种或多种迹象或症状的减轻，即获得了应答，例如但不限于骨质流失的逆转或预防，骨量丢失的逆转或预防，骨折或其风险的逆转或预防，骨密度的增加或预防，骨重建的增加，骨吸收和/或骨增生的降低。

在本发明中使用与列举的数值有关的术语“约”将被理解为包括列举的数值和加或减所述列举值的百分之十之内的数值。

在本发明中使用术语“在......之间”将被理解为当提及一个数值范围时，包括范围的每一个端点的数值。例如在长度为10个碱基对和20个碱基对之间的核酸序列包括长度为10个碱基对的核酸序列和长度为20个碱基对的核酸序列。

B.G细胞和胃泌素在钙敏和骨疾病中的作用

特征为骨质流失和高的骨折风险的骨质疏松症为最常见的疾病之一，特别是在老年人当中，据估计其影响了全世界大约1亿人。虽然卵巢衰竭和骨脱矿质在这种疾病中是被公认的关键要素，但是确切的病因仍然没有完全解决。关于图1，显示了已知的骨重建的激素和矿物质调节子。

在正常的情况下，作为生理或机械应答，发生了骨重建，以维持强度和矿物的动态平衡(特别是钙)。这些涉及由成骨细胞和破骨细胞活性影响的形成和吸收的内部相关的现象。通常，这涉及包括破骨细胞前体活化、活化吸收、吸收的逆转以及新骨的形成四个步骤。前两步需要花费2-4周，最后一步需要花费4-6月来完成。

在围绝经期和绝经早期的女性中骨重建增加，然后随着变老减缓，但比绝经前的女性以更快的速率持续。骨重建还被认为在老年男性中被增加了。

关于图2，皮层骨是致密的和坚实的，并且环绕着骨髓空间。其具有外部的骨膜表面和内部的骨内膜表面。其通常比骨小梁具有更少的代谢活性。骨膜表面活性对外加生长和骨折修复是重要的。骨内膜表面具有比骨膜表面更高的重建活性，可能是更大的生物力学应变或更大的暴露于来自相邻的骨髓室的信号的结果。

增加的皮层重建引起皮层多孔性(cortical porosity)增加和皮层骨量降低。骨吸收通常在骨内膜表面上超过骨形成，而骨形成通常在骨膜表面上超过骨吸收。

骨小梁由散布在骨髓室中的骨小梁板和杆的蜂窝状网络组成。其比皮层骨的代谢更活跃。这种骨类型的逆转似乎对矿物质代谢和维持机械强度最重要。

骨重建的生物学是复杂的，并涉及一系列的激活因子，例如PTH、雌激素、生长因子和炎性细胞因子以及饮食摄入量，例如钙和维生素D。这导致现在可供管理之用的广谱治疗的发展。这些包括对他汀类药物、成纤维细胞生长因子-1、或甲状旁腺激素(PTH)自身使用的激素替代治疗。

PTH被认为是骨代谢的关键调节子，因为其通过吸收过程增强了Ca²⁺从骨储存中的释放。然而，PTH的效果是间接的，因为破骨细胞没有PTH受体。PTH反而结合成骨细胞，并导致RANKL的表达。RANKL通过受体RANK激活破骨细胞前体细胞来融合，形成负责骨吸收的新的破骨细胞。

支持骨质疏松症中的PTH的作用的证据来自报道了PTH值在上了年纪的人中比在年轻的成人中高的多项研究。提出了有助于较高的PTH值的若干因素，包括降低的肾脏功能、或许是由于吃的动机减少造成的钙(Ca²⁺)的有效肠道吸收的减少、PTH的抗血钙作用、维生素D不足的更高的患病率以及，更特别地是，在老年人中增加的胃pH值中。

后者反映了壁细胞的量(黏膜萎缩)伴随着胃pH的升高以及窦部神经内分泌G细胞的胃泌素分泌物的增加而损失。

在胃粘膜的完整性和功能中，年龄相关的变化被认为是上了年纪的人的肠胃病中的主要问题，并被认为是造成药物敏感性增加、出血以及未能充分吸收钙和铁的原因。

Ca²⁺/PTH/维生素D轴被认为是通过使甲状旁腺、肾、骨和胃肠道的功能协调以增加血清中的Ca²⁺而没有伴随着血清磷水平的增加来维持系统的Ca²⁺体内平衡。这个轴主要是旨在通过使Ca²⁺从骨骼流通、由肾储存Ca²⁺以及增加胃肠道的Ca²⁺吸收来防止低血钙症。

在对血清Ca²⁺浓度降低应答时，甲状腺中的钙敏受体(CaSR)增加PTH分泌，而肾中的CasR降低肾脏的Ca²⁺排泄。然而，钙敏并不受限于甲状旁腺，CaSR存在于多种其他细胞类型中，包括窦部产生胃泌素的G细胞。该神经内分泌细胞，假定其胃的位置被唯一地定位以感受和应答饮食中的Ca²⁺摄入。

CaSR检测细胞外的Ca²⁺浓度的变化，并启动适应性激素和离子转运应答来维持合成的钙的动态平衡。甲状旁腺、甲状腺C细胞和肾目前被认为是代表CaSR表达的生理相关的位点。总之，低的(<1mM)循环细胞外的Ca²⁺是甲状旁腺细胞中的PTH分泌的主要刺激物。在较高的浓度下，Ca²⁺通过CaSR磷酸化和后续的失活抑制PTH的合成和分泌。

在绵羊的滤泡旁细胞中以及在甲状腺髓样癌(MTC)细胞系TT中也鉴定出了CaSR。后者以降钙素分泌应答Ca²⁺。

虽然CaSR已经在成骨细胞和破骨细胞中被鉴定出，但Ca²⁺敏感性的生理作用是不清楚的，因为其在这些细胞中以非常低的水平被表达。与骨细胞相比，在胃中鉴定出了生理相关的CaSR。最近，已经克隆并测序了来自人窦部G细胞的CaSR，其以>2mM的Ca²⁺浓度行使功能。

下面的小节(1-8)提供了在实施例中证明本发明研究的简单概述和讨论。提供这些小节是为了进一步说明实施例，但并不旨在限制包含其中的结果和结论。

1.分离G细胞的研究

在此证明的是G细胞作为Ca²⁺传感器的生理作用(见实施例1，图3)。总之，在用餐期间摄取的钙(1-10mM)刺激胃泌素，释放。机械地，细胞外的Ca²⁺被胃的CaSR接受，其通过钙诱导的通路激活胃泌素释放。本发明证明的结果进一步确定G细胞在肠/甲状旁腺的钙动态平衡中作为关键的神经内分泌细胞。

进行研究以确认G细胞上的PTH受体的存在以及随着cAMP的活化，PTH介导的胃泌素释放(见图4)。这些研究得到了其他研究的支持。例如在麻醉的猪中，PTH的注入(40单位/20min)增加了窦部和混合静脉血中的胃泌素水平，而没有诱导系统性的高钙血症。而且，在年幼的麻醉的猪中，天然的牛PTH和合成的人1-34PTH(0.02-4U/min)快速(在10-30分钟内)并且明显地(大约10倍)增加了胃泌素的释放。

在分离的胃泌素细胞中也进行了研究，显示17β-雌二醇(ESRα拮抗剂)抑制胃泌素的释放(见图6)。雌性激素的非基因组靶向效果在其他细胞类型(例如乳腺组织)中已经被很好地定义了。这些效果(ERα介导的MAPK信号发出)在G细胞中也是可证明的，其中雌性激素是胃泌素分泌的有效抑制剂。

该信息表明改变与更年期状态一致的雌性激素环境将极大地改变/刺激G细胞的功能(发信号和分泌)。这与之前的在老年大鼠中存在包括增加的G细胞功能和高的PTH的环境的的报道一致。该组合被公认为与骨质疏松症的发展有关。

额外的体外研究已经确定胃泌素分泌可通过肠产生的组胺和血清素来调节。提出的组胺在骨骼系统的调节中的作用与模棱两可的信息有关。在肥大细胞增生症和过敏疾病中，过量的组胺释放可导致骨质疏松症的发展。相比之下，在成骨细胞中，组胺可直接通过破骨细胞前体和破骨细胞以及间接通过增加RANKL(破骨细胞激活受体)的表达增加骨吸收。此外，在体内研究中，H1和H2受体拮抗剂可对骨组织发挥保护效果，虽然这不能一贯地在所有的实验模型中重复出来。然而，组胺在离体以及体外中都能调节胃泌素的释放。

血清素在骨代谢中的作用还不完全清楚。注射血清素通过血清素介导的成骨细胞增殖(这些细胞表达5-HT₂受体)增加大鼠中的骨矿密度。在动物模型中，血清素似乎以Lrp5依赖的方式限制了骨的形成。Lrp5通过抑制限速血清素合成酶(Tph1)限制了血清素的产生。然而，在临床研究中，LRP5突变与循环血清素中没有变化有关，并且患者显示出高骨量。血清素再摄取抑制剂(SSRI)与成骨细胞增殖有关，但在中年女性中，SSRI的使用与骨质流失率的增加无关。此外，类癌综合征中的高循环血清素与临床上显著降低的骨密度、骨结构变差，或降低的骨形成标记无关。血清素的任何影响可选择性地通过G细胞，胃泌素释放由5-HT₃受体刺激。因此，胺可通过G细胞上的活性调节骨形成。

当共同评估后，本发明提出的数据和观察结果(例如鲁米诺钙敏受体的存在、甲状旁腺和甲状腺功能调节的以及维生素D的受体的选择性表达、以及胺类受体表达(被组胺和血清素正调节))，确定了G细胞在肠/甲状旁腺钙动态平衡轴中作为关键神经内分泌细胞。

2.胃泌素靶向研究(在体外)

本发明证实的研究探索了哪种细胞可能是潜在的胃泌素受体。此外，这些研究检验了胃泌素细胞是否能通过胃泌素的释放调节钙动态平衡轴(见实施例2)。

在PTH主细胞中是否存在CCK₂受体还不清楚，但已经在大量的生理研究中被揭示了。在分离的牛甲状旁腺细胞中，高浓度的胃泌素(>1μM)增加了cAMP的积累(在～50％的实验中为40-60％)，PTH释放的先决条件。

鸟类模型也支持了该观察结果。在鸡中高胃泌素血症(使用质子泵抑制剂(PPI)，奥美拉唑(400μM/kg/天)五周)的诱发导致PTH腺的尺寸以及PTH转录的增加。这些影响通过胃泌素的注射(连续的，5nmol/kg/小时，3周)来概括。

在此描述的研究证明了胃泌素/CCK₂受体在分离的人PTH主细胞(来自人的外科手术样本)上的表达，以及胃泌素对人PTH的合成和释放具有刺激效应(见图8)。因此，本发明证明了甲状旁腺细胞为胃泌素的靶标。因为PTH刺激胃泌素释放(见图4)，因此激活甲状旁腺(PTH)分泌表明了前馈刺激环(G细胞到PTH)。在本发明的研究中，在这些细胞中也鉴定出了刺激组胺H₁受体的表达。

在G细胞上也鉴定出了刺激组胺H₁受体的表达。组胺是一种在正常的增生性PTH腺中的cAMP产生和PTH分泌的已知激活剂。C细胞和C细胞源肿瘤(骨髓甲状腺癌)表达胃泌素/CCK₂受体。此外，在人甲状腺薄片(human thyroid slice)中，胃泌素诱导cAMP产生以及降钙素释放。

3.骨中功能胃泌素靶标的鉴定

为了评价胃泌素对骨自身的直接影响，评价了骨细胞上的胃泌素受体的存在以及胃泌素释放对骨源细胞是否具有影响(见实施例3)。

在三种不同的模型中检验了胃泌素的影响，1)小鼠的颅骨成骨细胞，2)人胎成骨细胞系，hFOB 1.19，3)人骨髓间充质干细胞(BMMSC)。颅骨成骨细胞是已知的研究成骨细胞功能的模型，包括增殖、矿化和细胞信号发放。hFOB为转染SV40大T抗原人细胞系，其被用作研究正常人的成骨细胞差异、成骨细胞生理机能，以及激素、生长因子，和其他细胞因子对成骨细胞功能和差异的影响的模型。BMMSC为可分化为组织再生所需要的各种细胞类型(包括成骨细胞和软骨细胞)的多潜能骨髓基质细胞，并在年龄相关的骨关节炎中发挥着病理作用。

本发明证明的结果显示骨内的多种细胞类型可被胃泌素激活/调节。由于含有胃泌素的循环血液通过骨髓渗透，因此循环胃泌素水平上的改变与表达CCK2受体的任何骨源细胞都是生物学相关的。

由于胃泌素是已知的增殖性调节子，所以还研究了在三种不同的细胞模型中胃泌素对增殖(BrdU摄入)的影响。其中证明的结果显示，除了其他的以外，胃泌素刺激成骨细胞和BMMSC的增殖，所述增殖不能被选择性胃泌素拮抗剂(GA)逆转。这些结果进一步表明胃泌素引起伴随着矿化损失的成骨细胞的去分化。GA拮抗剂没有减少增殖，但是维持了骨表型。通过本发明证明的结果显示胃泌素在两个水平上直接影响骨细胞的功能：成骨细胞和骨髓干细胞，并可能通过软骨细胞行为的调节在生长板处具有影响。

4.胃泌素研究：质子泵抑制剂对G细胞功能的影响

胃泌素分泌是由与骨质疏松症有关的老化的两个方面(老化和胃粘膜萎缩膜，与由于泌酸壁细胞的丧失而延长的高胃pH有关)调节的动力学生理应答。胃pH的持续升高导致循环胃泌素水平的升高，其还与长期的PPI或H2受体拮抗剂的使用有关。这些药剂常用来治疗消化不良的胃症状或胃食管反流，两者都与老年女性群体特别相关。

酸性的胃环境(低的胃pH)对促进被GI肠道最佳吸收的离子钙的产生也是很重要的。

在人类中，胃切除术(缺乏酸)和恶性贫血(丧失在低酸状态下循环的壁细胞)都很好地记录为与骨质减少和骨折的风险增加有关。胃切除术通常涉及显著减少胃酸的泌酸细胞的切除术，恶性贫血与壁细胞(产酸)的损失、升高的胃的pH(>4)有关，但在胃的底部(ECL细胞)和窦部(胃泌素细胞)仍然具有功能性的神经内分泌细胞。

升高的胃的pH和升高的胃泌素水平液还在老化的胃中以及长期使用PPI中发生。PPI已经暗示增加了骨吸收和骨折的风险。对G细胞功能和胃泌素分泌的酸抑制作用(升高的胃pH)被证明于此(见实施例4)。结果显示，除了其他迹象以外，增加胃的pH显著地影响了G细胞的功能。特别是，影响了G细胞Ca²⁺敏感活性和对生理调节的应答。

5.酸封堵对骨动力学的影响：乳鼠属高胃泌素性模型

强效抑酸药物的问世(例如PPI)已彻底改革了酸相关疾病的管理。在连续或长期的基础上，上百万的个体都在使用这些药物。

众所周知，明显的胃酸过少(高的胃的pH)，特别是在PPI清除降低并具有较高的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染的患病率的上了年纪的群体中，导致钙吸收不良。这得到了大量的研究的支持，所述研究已经显示PPI治疗降低了不可溶钙的吸收和骨密度。因此，髋骨骨折风险的显著增加与长期的PPI治疗有关，特别是在高剂量的PPI长期使用者中。

考虑到上述使用PPI的问题，本发明证明的结果调查了在乳鼠属模型中，抑酸对胃、循环激素、甲状旁腺以及骨生理学的影响(见实施例5)。结果证实，除其他迹象之外，由抑酸药物引起的高胃泌素血症与骨变化有关，所述骨变化与被认为与骨质疏松症等同的外观形态相似。

6.在切除卵巢的乳鼠属中酸封堵对骨动力学的影响

在乳鼠属模型上进行卵巢切除术以产生用于骨研究的“绝经后”表型。由于在本发明中已经显示雌性激素损失调节G细胞，因此，评价了雌性激素损失对骨表型的特异性作用(见实施例6)。结果支持，除了其他迹象以外，循环胃泌素水平放大了雌性激素损失介导的骨变化。

7.对胃神经内分泌功能和骨动力学的影响：基因敲除小鼠模型(有或没有卵巢切除术)

在大鼠中，胃切除术(除去包括窦部的G细胞和底部分泌组胺的ECL细胞的整胃)或PPI(例如奥美拉唑)的使用，导致磷酸钙的吸收障碍，以及骨矿密度受损和骨质减少。进一步的观察是在小鼠中注入胃泌素-17引起低血钙症。

在实验动物中，部分的以及全部的胃切除术和胃迷走神经切断术(躯干的/选择性的等等)(其改变神经内分泌细胞分泌)，影响了细胞外的矿物动态平衡并导致作为晚期后遗症的骨质减少。

迷走神经切断术后和胃切除术后的骨质减少的潜在机制还不清楚。推测是，它们反映了胃泌素对PTH/Ca²⁺轴或对骨功能的直接影响，或通过例如组胺的间接影响。值得注意的是观察到身体的同侧的迷走神经切断术对与肺癌有关的肥大性肺性骨关节病(HPOA)的医治有效。相似地，由侵袭性尖部肿瘤性肺病变(潘科斯特综合征，Pancoast syndrome)引起的迷走神经切断术与手臂中的身体同侧的骨变化有关。

组胺是由胃底部的类肠嗜铬细胞细胞(ECL)分泌的，并且是酸分泌的主要调节子，因为其分泌主要被循环胃泌素驱动。泌酸(胃的底部)粘膜的ECL细胞为一种“关闭的”局部化分泌细胞，即其没有达到胃腔，并因此不能对膳食钙直接应答。

ECL细胞的分泌产物包括组胺、嗜铬粒蛋白A和胰抑制素(pancreastatin)以及结合钙的蛋白质，钙结合蛋白。ECL细胞表达胃泌素和组胺受体，并且主要对转换胃泌素信号(通过组胺分泌)起作用来调节壁细胞介导的酸(HCL)分泌。

组胺本身已经被证明显示出对骨细胞功能的独立的影响。然而，关于组胺是否是保护的或骨质减少的研究是模棱两可的。已经注意到在肥大细胞增生症和过敏疾病中过量的组胺释放与骨质疏松症的发展有关。这表明组胺在骨重建中起着负面作用。通过含有ECL细胞的胃产酸部分的外科切除术(泌酸的/底部黏膜)减少了大鼠中骨含量的研究提供了这一意见的进一步地支持。这些观察通过体外研究进一步得到了支持。因此，在表达组胺H_1-3受体的成骨细胞的MC3T3-El(El)细胞中，组胺增加了RANKL转录本的表达和蛋白产物。这些效果被H₁受体拮抗剂抑制。在共培养中，组胺与骨髓细胞(来源于小鼠颅骨的MC3T3-El(El)细胞)一起在维生素D₃的存在下刺激破骨细胞形成。这一效果被采用抗ODF/RANKL的中和抗体的预培养阻断。使用基因芯片的方法探测骨髓造血前体细胞的分化成骨再吸收的破骨细胞，值得注意的是RANKL刺激了包括H₁受体的70种靶标基因。在切除卵巢的大鼠中，用受体拮抗剂法莫替丁的研究证明通过降低破骨细胞的活性抑制了脊椎骨量的损失。这些效果是短期的并且经过6个月损失。这些数据的总和表明组胺在调节骨吸收中具有活性作用。这一观察得到了来源于一个大的寄存器为基础的情况下的数据的支持：对照研究显示长期使用组胺H1受体拮抗剂降低了骨折的风险。

在ECL细胞中，负责调节组胺分泌的关键酶为组氨酸脱羧酶(HDC)。HDC为零的小鼠的特征为完全缺乏组胺合成，并且基础胃酸分泌以及胃泌素抗性降低。这些动物显示出显著地增加的股骨厚度以及与骨矿物质含量升高和骨吸收降低有关的胸椎的厚度。破骨细胞在数量和活性方面都降低了。当HDC为零的小鼠被切除卵巢的皮层以及骨小梁骨质流失减少50％时表明组胺缺乏使骨骼免患雌性激素驱动的骨质疏松症。因此，推断组胺对雌性激素介导的骨重建起到了增强作用。

虽然认为ECL细胞产生替代的促骨胺或多肽貌似合理，但没有鉴定出这样的激素。因此，组胺的作用作为胃泌素、ECL细胞和骨病理生理机制之间的联动因素是可能的，因为这种胺的合成和分泌与胃泌素联系特别紧密。

本发明的研究用胃泌素和组胺的敲除模型证明了骨代谢调解(整合性)中的组胺和胃泌素之间的关系(见实施例7)。

已经在疾病(包括胰腺癌、胃神经内分泌肿瘤和胃溃疡)的药理水平上研究了靶向胃泌素/CCK2受体。后者的发生涉及通过组胺的合成和释放ECL细胞的酸刺激的功能以及由胃泌素受体阻断的组胺分泌的抑制将降低酸分泌的观点。一种这样的拮抗剂为YF476，1,4-苯二氮杂-2-酮基的胃泌素/CCK2受体拮抗剂，涉及原型类似物L365,260。已经在体外和体内证明了YF476对ECL细胞组胺的合成和释放的有效性。由于组胺分泌被胃泌素介导的CCK2受体的刺激激活，酸分泌效应中独立的生理事件将涉及CCK2受体拮抗剂阻断对骨的与组胺释放相关的影响和胃泌素对骨自身的任何直接影响的能力。

8.原理证明研究：胃泌素拮抗剂对三种啮齿动物模型中的卵巢切除术介导的骨表型的影响

本发明描述的研究评价了胃泌素拮抗剂YF476对三种啮齿动物模型中的OVX介导的骨密度损失/骨变化的影响，并集中到骨强度的研究、形态学和循环生物标志物(见实施例8)。

C.使用胃泌素靶向药剂治疗骨疾病或病情

本发明研究证明了，除其他迹象之外，CCK2受体在骨中的存在和胃泌素靶向药剂在治疗骨疾病中的功效。提供的是使用这种胃泌素靶向药剂治疗和预防骨疾病或病情的方法和组合物，所述骨疾病或病情包括特征为骨质疏松症的那些。

在一些实施例中，合适的胃泌素靶向药剂包括，但不限于，胃泌素调节子，所述胃泌素调节子包括胃泌素释放肽(GRP)(蛙皮素)，生长抑素和包括奥曲肽(OCTR)和RC-160的生长抑素类似物。在其他实施例中，合适的胃泌素靶向药剂包括CCK2受体拮抗剂(包括netazepide(YF476)和其他的1,4-苯二氮平-2-酮基胃泌素/CCK受体促效药)。在一些实施例中，胃泌素靶向药剂选自CCK2受体拮抗剂：Z-360、L-740093、YM022、RP73870、JB93182、AG041R、丙谷胺(及类似物)、JNJ-2607109(及衍生物)、CI-988、PD-135158、L-365260、LY-288513、L-364718、GW-5823、氯戊米特、CR 2194(螺谷胺)、PD-149164、PD-135666、CI-1015、RP-69758、TP-680、PD-140548和伊曲谷胺(及衍生物)。

胃泌素靶向药剂可通过皮下给药的方式向主体给药。在一些实施例中，胃泌素靶向药剂通过浅层肌肉注射进行给药。在其他实施例中，胃泌素靶向药剂静脉注射或口服给药。

实施例

为了更好的说明要保护的发明，提供了下面的实施例，并且下面的实施例不能被解释为是对本发明范围的限制。在特定材料被提及的程度上，其仅是说明的目的，而不是旨在限制本发明。在没有行使创造性的能力以及没有脱离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可发展等同的方式或反应物。

实施例1：分离G细胞的研究

关于图3，开展了证明G细胞作为Ca²⁺-传感器生理作用的研究。通过涉及PKC通路和通过二氢吡啶敏感的钙通道的Ca²⁺流入的机理，增加外部Ca²⁺的浓度刺激了胃泌素从分离的G细胞中释放。EC₅₀为4.1mM，这主要是通过PKC调节的通路发生。这些结果与作为饮食(鲁米诺)钙传感器的G细胞一致。

而且，在G细胞上鉴定出了PTH受体的存在。关于图4，PTH介导的胃泌素释放随着cAMP活化被证明了。PTH通过PKA活化和细胞内的cAMP产物显著地刺激了胃泌素的释放(EC₅₀＝60nM)，证明G细胞上的PTH受体是有作用的，并且由该鲁米诺钙敏窦细胞产生的胃泌素的分泌可由PTH调节。

在G细胞中还鉴定出了降钙素受体。关于图5，显示了与PTH相比，通过cAMP产物的抑制，降钙素(甲状腺C细胞)抑制了胃泌素的释放。

这证明了G细胞，如其他的PTH/降钙素靶标(例如成骨细胞)一样，可被不存在于胃中的神经内分泌细胞系统刺激(PTH)或抑制(降钙素)。

这些观察提供了已知的钙动态平衡调节子(通过敏感血浆Ca²⁺水平–PTH/甲状腺细胞)可直接影响胃部的鲁米诺钙敏细胞–产生胃泌素的G细胞–并改变其分泌型。

评价了卵巢激素(雌激素)对G细胞功能的影响。关于图6，使用实时荧光定量PCR(实时PCR)鉴定了胃泌素细胞上存在雌性激素受体(ESRα)转录本。进一步证明了在分离的胃泌素细胞中17–雌二醇(ESRa拮抗剂)抑制胃泌素的释放(IC₅₀＝4.6x10^-12M)、cAMP产生(IC₅₀＝1.1x10^-12M)和MAPK活性(图6)。

该信息表明使雌激素环境改变为与更年期状态一致将明显地改变/刺激G细胞的功能(信号发出和分泌)。这与之前的老年大鼠生存环境中的报道一致，包括提高的G细胞的功能和高的PTH。这个组合被公认为与骨质疏松症的发展有关。

关于表1，神经内分泌EC和ECL细胞分离制备的转录本的比较证明了G细胞是能感受鲁米诺钙的唯一细胞，因为仅神经内分泌细胞表达CaSR而不表达钙结合蛋白。关于图7，这表明G细胞胃泌素分泌可被由甲状旁腺主细胞分泌的PTH、来自甲状腺C细胞的降钙素和来自卵巢细胞的雌性激素直接调节。

表1.通过转录组(U133A微阵列)分析测定，比较钙代谢相关的转录本和神经内分泌受体在G细胞、EC细胞和ECL细胞中的存在

CaSR：钙敏受体；ESRα＝雌性激素α；H3＝组胺亚型3，5-HT3：血清素亚型3；PTH：甲状旁腺

结果确定了G细胞为肠/甲状旁腺钙动态平衡轴中关键的神经内分泌细胞。

实施例2：胃泌素靶向研究(体外)

评价了作为潜在胃泌素靶标的细胞类型：评价了钙动态平衡轴的胃泌素细胞通过胃泌素释放的调节。

已经证明了在分离的人PTH主细胞上胃泌素/CCK₂受体的表达。关于图8，进一步证明了胃泌素对人PTH的合成和释放具有刺激效应。这些结果表明甲状旁腺细胞为胃泌素的靶标。由于PTH刺激胃泌素释放(见图4)，因此激活甲状旁腺(PTH)分泌显示前馈刺激回路(G细胞到PTH)。刺激性组胺H₁受体在这些细胞上的表达也得到了鉴定。

关于图9，在分化良好的人MTC细胞系MTC-SK中，胃泌素刺激了cAMP和降钙素的释放，由选择性的CCK₂拮抗剂(YF476)逆转的效果(IC₅₀＝8.6x10^-13M)。这些结果表明甲状腺C细胞表现为胃泌素的靶标。由于降钙素抑制了胃泌素的释放(见图5)，C细胞活化将提供反馈抑制回路。

为了评价甲状腺/甲状旁腺系统对胃泌素的整体响应性(刺激或抑制)，评价了胃泌素对甲状旁腺/MTC-SK共培养系统的影响。评价了胃泌素是否为骨吸收的刺激物(通过增加PTH的合成和释放)或通过降钙素的释放为这一过程的抑制物。

关于图10，CCK₂受体的刺激(在甲状旁腺和甲状腺C细胞中都表达)导致在PTH转录和从培养的PTH细胞中的分泌方面显著的升高。相比之下，胃泌素导致降钙素的合成和释放的显著抑制。这些效果被含有选择性的CCK₂拮抗剂(YF476)的预培养逆转了。

这些结果表明甲状腺C细胞的胃泌素刺激被甲状旁腺细胞中释放的PTH逆转了。这是在该模式共培养系统内，胃泌素的影响主要是PTH介导的影响的证据。在健康的志愿者中，胃泌素注入的影响是增加了PTH的分泌，而不是降钙素(显著降低释放)。这表明胃泌素对甲状腺的任何体内的效果主要与甲状旁腺和PTH释放有关。

这些结果支持了由鲁米诺敏感细胞(G细胞)释放的肠道(胃的)激素直接调节甲状旁腺，以及非直接调节甲状腺C细胞降钙素分泌物。

实施例3：在骨中鉴定功能性胃泌素靶标

为了评价胃泌素对骨自身的直接影响，评价了骨细胞上的胃泌素受体的存在和胃泌素是否具有对骨源细胞的影响。QPCR、蛋白质印迹和免疫组织化学技术被用来鉴定受体在骨中的表达。此后，检测了胃泌素在三种不同模型中的影响，1)小鼠颅骨成骨细胞；2)人胎成骨细胞细胞系，hFOB 1.19；3)人骨髓间充质干细胞(BMMSC)。

CCK2受体：使用qRT-PCR，在颅骨成骨细胞、hFOB细胞系和人BMMSC中鉴定CCK2受体的表达(图11A)。用范围在31.2-34的CQ值，在所有的模型中进行了表达鉴定。免疫组织化学(IHC)鉴定了小鼠骨中的胃泌素受体–特异免疫染色在生长板中的软骨细胞中被进行了鉴定。一些表达在成骨细胞和衬于骨内膜上的细胞中进行了鉴定(图11B-C)。也在源于10种骨髓的人皮层骨髓样品(收集于下面的包括肢体缺血的动脉粥样硬化的截肢(没有骨髓炎的证据))中进行了标准PCR和蛋白质印迹。PCR鉴定出了与CCK2受体相关大小的条带(图12A)。其被测序(Sanger)并被鉴定显示出与CCK2R有92％的同源性(图12B)。蛋白质印迹证实了在所有的人类样品中都能表达CCK2受体蛋白(图12C)。

总结：胃泌素靶标在小鼠的颅骨成骨细胞、在hFOB和BMMSC细胞系以及在包括生长板的骨(软骨细胞)和在人骨髓(收集于骨内膜)中可被鉴定出，表明骨内的多种细胞类型都可被胃泌素激活/调节。由于含有胃泌素的循环血液通过骨髓渗透，因此循环胃泌素水平的改变与表达CCK2受体的任何骨源细胞都有生物学上的相关性。

在体外胃泌素的影响：胃泌素是一种已知的增殖性调节子，所以胃泌素对增殖的影响(BrdU摄入)最初在三种细胞模型中进行了研究。胃泌素在所有的三种细胞类型中都刺激了增殖，EC₅₀为1-2x10^-11M(图13A)以及最大的效果为～50％(1nM)。这些对增殖的刺激性影响没有被含有选择性的胃泌素拮抗剂(YF476)的预培养抑制(图13B)。这种化合物似乎增强了BMMSC细胞中的增殖。为了评价成骨细胞和BMMSC的胃泌素活化的生物学意义，进行了评价胃泌素介导的影响是否会导致骨矿化的研究。测定了荧光Osteomalge结合到矿化结节的羟基磷灰石部分。在所有的三种细胞类型中，胃泌素抑制了骨的矿化，IC₅₀为3.2x10^-11–1.3x10^-10M(图14A)，最大的抑制剂效果为～30-50％(1nM)。这些对矿化的抑制效果被含有选择性胃泌素拮抗剂(YF476)的预培养抑制了(图14B)。该化合物似乎特异性地增强了小鼠成骨细胞的颅骨细胞的矿化。

概括：胃泌素刺激了成骨细胞和BMMSC的增殖，所述增殖被胃泌素拮抗剂逆转。胃泌素介导的增殖与矿化的丢失损失有关，表明成骨细胞的表型是能够逆转的。GA逆转了该胃泌素的抑制效果。这些结果表明胃泌素引起成骨细胞的去分化，伴随着矿化损失。所述拮抗剂没有降低增殖，但保持了骨骼的表型。这种效果在颅骨的成骨细胞中最明显。

为了进一步评价胃泌素活化的生物学意义，进行了评价这些胃泌素介导的效果是否增加骨形态生成蛋白2(BMP2–参与成骨细胞分化)、RANKL(在成骨细胞上表达的破骨细胞激活受体)以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF–参与骨髓祖细胞和破骨细胞活性激活物的调节)表达的研究。

在小鼠的颅骨培养中，胃泌素(1nM)完全抑制了MSCF-1基因的表达，也抑制了RANKL的转录(0.8倍)以及ALKP(图15)。在hFOB中，胃泌素还抑制了这些转录本。含有YF476的预培养逆转并使这些效果正常化。这些基因中的任何一个都没有在BMMSC中被鉴定出，但对ALKP，胃泌素的影响是值得注意的，而BMP2没有在任何细胞类型中被鉴定出来。这确定了胃泌素的影响是异化的，用YF476抑制它们导致成骨细功能的正常化以及产生合成代谢表型。

这些数据表明胃泌素不但调节增殖和分化，而且还参与调节祖细胞。此外，胃泌素影响BMMSC的增殖。YF化合物逆转了表型效应，而没有抑制增殖。因此，胃泌素在两个水平上直接影响骨细胞的功能：成骨细胞和骨髓干细胞，可能通过调节软骨细胞的行为在生长板处有效果。

实施例4：胃泌素研究：质子泵抑制剂对G细胞功能的影响

由于PPI与骨吸收和骨折风险的增加有关，因此评价了酸抑制(升高的胃pH)对G细胞功能和胃泌素分泌的作用。G细胞分离于小鼠(乳鼠属—多乳属)窦部黏膜，已对所述小鼠进行了不可逆的H2受体拮抗剂(洛克替丁1mg/L，在饮用水中)的处理，来产生持久的高胃泌素血症。该动物已经作为与胃酸分泌长期的药物抑制(低酸状态病理学)有关的胃酸病理生理学模型进行了广泛的研究。

用不可逆胃酸抑制剂处理30天的乳鼠属(6-9个月)显示出升高的血浆胃泌素水平(104±23pg/ml，对未处理的动物中的28±13pg/ml，p<0.05)。这反映了低pH抑制胃泌素释放的损失(结果是升高了胃的pH水平)。因此，该处理导致胃酸缺乏和高胃泌素性的动物。

与从未处理的动物分离的G细胞相比，从胃酸缺乏(高pH的胃—低酸暴露G细胞)的动物中分离的G细胞中的胃泌素含量、胃泌素转录本水平以及基底胃泌素释放都显著地(p<0.05)升高了(表2)。

表2.在分离的啮齿动物的G细胞中，正常的胃pH和升高的胃pH(低酸)的差异总结

*p<0.05对正常的G细胞。^#对β肌动蛋白、GAPDH和HPRT归一化。

GRP＝胃泌素释放肽，OCTR＝奥曲肽

关于表2，升高的胃pH(低酸状态)刺激了G细胞的胃泌素含量(>2倍)、转录(>4倍)和分泌(>8倍)。这些细胞刺激腺的生理应答(例如GRP和钙)降低了-EC₅₀增加了。相似地，这些细胞对抑制剂(例如奥曲肽，OCTR)更不敏感，IC₅₀增加了～5倍。

胃泌素释放的调节子GRP(蛙皮素)和生长抑素(OCTR)分别显示出增加(GRP:EC₅₀分别为1.1pM对1nM)和降低的功效(生长抑素类似物，奥曲肽:28pM至140pM)(表2)。此外，在检测钙时，“高胃泌素性”G细胞为～100％不敏感(在正常饮食细胞中EC₅₀＝10mM对4mM)。

这些数据证明增加体内的胃(pH)环境显著地影响了G细胞的功能。增加胃pH(例如，将存在于老年个体或使用PPI的患者)特异地改变了G细胞的Ca²敏感性和对生理调节的应答。这证明了长期抑制壁细胞的功能以及降低酸分泌基本上改变了窦部G细胞对鲁米诺环境的应答。

这一观察是具有临床意义的，因为在高鲁米诺pH环境下，产生了更多的胃泌素。高胃泌素血症是重要的，因为胃泌素既刺激了PTH的释放也对骨细胞具有直接的影响(见图8、10、11)。

实施例5：酸阻断对骨动力学的影响：乳鼠属高胃泌素性模型

在乳鼠属模型中检验了抑酸对胃、循环激素、甲状旁腺以及对骨生理的效果。

对于这些动物中的骨生物学知道的非常少。一项研究确定了大多数(～80％)动物的椎间盘退化>9个月，以及在动关节(肘、膝)的严重骨关节炎。

在实验室的啮齿动物中，乳鼠属，除了单一近交系的小鼠(STR/lN)外，似乎是对骨关节炎最敏感的。

4-6个月大的动物(雌性)用洛克替丁处理60或120天。年龄和性别匹配的未经处理的动物提供对照组。

循环激素：激素分析(ELISA)证实胃泌素/PTH和雌二醇改变作为H₂受体阻断的功能。特别是，胃泌素分泌的短期升高(洛克替丁处理8周)与升高的PTH分泌和雌二醇/雌激素抑制有关(图16)。长期(16周)、慢性高胃泌素血症与PTH和雌二醇的抑制有关。

胃：证明了在高胃泌素血症(图17B)期间，ECL组胺(组氨酸脱羧酶-HDC)(图17A)和G细胞胃泌素(在mRNA水平上)的活化。这与短期高胃泌素血症期间的PTH1R的活化(在mRNA和蛋白水平上)，和胃的ERα选择性降低(在mRNA和蛋白水平上)有关；然后，这在16周增加了，并且与高胃泌素血症期间CaSR(在mRNA和蛋白水平上)的活化有关(图17A-C)。

甲状旁腺：使用免疫组织化学，证明了在乳鼠属的甲状旁腺中的CCK2受体的表达和甲状腺(图18)。这些结果确定了甲状旁腺和甲状腺C细胞都表达胃泌素受体。甲状旁腺中的CCK2受体提供了G细胞的基础：PTH轴凭借甲状旁腺分泌(例如，PTH中)可由胃泌素调节。

骨形态学和动力学：使用Micro CT评价来开展高胃泌素性动物中啮齿动物股骨的骨形态学分析(图19)。这些证明了较低的骨体积和降低的密度以及抗拉强度。这些数据证明了升高的胃泌素水平刺激了骨吸收。

结构模型指数(SMI)确定了板状/杆状比例的位移，其证明了股骨几何学的改变。因此，胃泌素增加了SMI，表明通过重建，骨表型向更像杆状的形态改变。后者与较弱的和较硬的骨以及在骨质疏松症的女性中注意的骨脆性有关。

与正常的乳鼠属相比，慢性高胃泌素性动物显示出具有下面特征的骨关节炎表型：骨骺板增厚、骨脆性(由于增加的脂肪细胞形成导致骨重建异常)和异常的免疫原性特征识别。

骨髓从股骨中被分离出并被用于评价破骨细胞形成。与从切除卵巢的小鼠中分离的细胞相比，破骨细胞和成骨细胞可在异常早期时间被培养。这是高胃泌素性模型中的这两个种群的细胞活化的证据。这与引起事件的CCK2受体的活化一致。

与切除卵巢的小鼠相比，高胃泌素性乳鼠属显示出夸张的形态骨重建。在高胃泌素性动物中，异常骨髓表型的存在进一步通过基于qPCR的通路激活鉴定得到了确认。这包括ALOX5和PTGS2(炎症)的下调、PPARy(脂肪细胞的活化)的下调以及TNFSR11(RANKL)(骨细胞活性)的上调。PCR结果特别是骨活性的激活与观察到的宏观骨髓改变(骨骺生长、骨脆性)一致。

为了进一步评价骨髓表型以及评价骨脂肪组织是否被激活(骨代谢和完整性的测定)，在年龄性别匹配的对照和短期高胃泌素动物中使用了基于锇染色的程序。值得注意的是在处理的动物中摄入量显著地增加了(图20)。这与“老年的”骨/骨质疏松症的表型一致。

这些结果证实了短期高胃泌素血症与骨改变有关，所述骨改变与等同于骨质疏松症的形态学外观相似。

此后，用骨组织形态测定术进行了检测。这些研究确定了在处理8周和16周的乳鼠属中，随着吸收腔的增加以及显著增加(p<0.05)的TRAP阳性破骨细胞的数量，降低了骨矿化(15±6p<0.05和16±4.5p<0.05，与对照9±3相比)。还注意到了骨样缝和骨软化的证据(图21)。

最后，在乳鼠属中用Instron装置检测了骨强度。股骨以四点弯曲载荷损坏。用伺服液压测试机以0.05mm/sec的偏转率进行测试(Instron model 8874；Instron公司，Norwood，MA，美国)。

最后，在乳鼠属中用Instron装置检测了骨强度。股骨以四点弯曲载荷损坏。用伺服液压测试机以0.05mm/sec的偏转率进行测试(Instron model 8874；Instron公司，Norwood，MA，美国)。

硬度在158-173N/mm的范围。使骨头骨折所需要的最大载荷范围在32.8-45.7N/mm。这些值彼此强烈的相关(图17A，R²＝0.86，p<0.003，线性回归分析)。

骨密度(micro CT)和骨折力的比较确定了骨小梁(R²＝0.54，22B)和皮层(R²＝0.71，22C)骨的相关性。

因此，使用Instron装置测定骨强度提供了与高胃泌素血症期间异常和脆性的骨表型发展一致的额外信息。这些医学数据支持了高胃泌素模型中胃泌素驱动的“骨质疏松性”表型生物学基础的证据。

总结(图23和24)：短期高胃泌素血症(8周)引起股骨中明显和可测定的骨质疏松性改变。在胃的窦部，短期高胃泌素血症与活跃的G细胞(转录本)、增加PTH1R以及降低的雌性激素响应性(ERα/β和AR)有关，但没有改变CaSR的表达。骨分析观察结果与出于更年期后状况的人中的那些类似。

延长到16周的高胃泌素血症(慢性模型)导致股骨中可测定的骨质疏松性改变，并与窦的CaSR和ERα以及PTH1R表达的增加有关(图17)。

G细胞上的升高的循环胃泌素和增加的PTH1R表达的组合为与骨质疏松症表型相关的一致性特征。

这些结果表明高胃泌素乳鼠属为评价胃泌素对骨病理生理学影响的合适的模型，并证明了高胃泌素血症对骨的显著前骨质疏松性影响。

实施例6：在切除卵巢的乳鼠属中酸阻断对骨动力学的影响

对于骨研究，卵巢切除术是产生“更年期后”表型的标准程序。由于雌性激素显示出G细胞调节效应(见图6)，因此接下来评价了在未处理的动物中、在切除卵巢的动物中，以及在具有短期(8周)和长期(16周)高胃泌素血症的切除卵巢的动物中，雌性激素损失对骨表型的特殊的作用。在乳鼠属中，用后路手术进行了双侧卵巢切除术(OVX)以及输卵管结扎。8周后，对动物进行了研究。

循环激素：8周后，由于卵巢切除术，雌性激素减少。然而，血清PTH增加了～2倍(图25)。

胃：卵巢切除术与嗜铬粒蛋白A(CgA)和HDC转录的显著增加有关，但胃泌素的表达没有被改变(图26)。这证明雌性激素在胃中的一个影响是下调ECL细胞组胺合成。

卵巢切除术增加了雄性激素(6倍)和雌性激素受体(ESRα/β都为：4-7倍)以及CaSR(5倍)和PTH1R(4倍)的胃粘膜转录(图27)。因此，雌性激素的除去导致参与传感和响应膳食钙的胃部细胞受体(即CaSR和甲状旁腺轴(PTH1R))可检测的变化。

短期高胃泌素血症/OVX模型：卵巢切除术模型中的短期高胃泌素血症增加了循环PTH(图25)。在胃中，胃泌素和HDC转录本都被抑酸(8周洛克替丁)和OVX的组合升高了(图26B-D)。随着OVX发生的受体(即AR/ESRα/β、CaSR和PTH1R)的增加的表达(即图27)在高胃泌素性动物中没有被鉴定出。水平被降低并且不再与对照不同(图28)。这表明酸分泌的药理抑制(伴随着胃pH和胃泌素的升高)使参与钙传感的受体的胃表达正常化了，即使当雌性激素被除去时。

长期高胃泌素血症/OVX模型：16周高胃泌素血症与血浆PTH水平的正常化有关(图30)。在胃中，HDC被升高了(图26)。在16周处理的动物中，AR/ESRα/、CaSR和PTH1R的水平与对照没有差异(图28)。在长期模型中，胃的受体表达涉及钙敏，因为在短期模型中，在雌性激素去除期间，其是正常的。

在OVX和高胃泌素性OVX模型中的骨形态学和动力学：

Micro CT分析：骨小梁形貌显示于图29。骨测量确定了密度和体积随着卵巢切除术降低了～50％。这与啮齿动物卵巢切除术的之前的报道一致(图30A，C)。胃泌素介导的降低在长期高胃泌素性动物(降低了80-85％)中最显著(p<0.005)。后面的动物也显示出了皮层密度的降低(～5％，p<0.05)(图30B)。皮层骨体积在所有的OVX动物中降低了(～15％)，但在短期高胃泌素性动物中最显著(p<0.005，～30％)(图30D)。

皮层骨的进一步测量确定了在骨内膜和骨膜中的显著降低。OVX降低了半径(20％)和周长(18％)(图31A-D)。在短期高胃泌素性动物中确定了更为显著的降低(半径：25-30％；周长：27％)。，这些都小于在单独的OVX期间测定的降低(p<0.02)。长期高胃泌素性动物中的测量与单独的OVX不同。

这些结果确定了升高的循环胃泌素水平放大了雌性激素丢失介导的骨变化。短期高胃泌素血症最显著的效果是在皮层骨和骨内膜/骨膜的水平上，而长期高胃泌素血症的效果在骨小梁中是占优势的，这确定了后者在骨代谢和强度的调节中还具有作用。为了评价后者，进行了强度测试研究。

骨组织形态测定术：随着吸收腔的增加以及TRAP阳性破骨细胞(26.8±11与对照9±3相比，p<0.05)的数量显著增加(p<0.05)，卵巢切除术与骨矿化的降低有关(图32)。

骨机械强度试验：股骨的四点弯曲分析确定了OVX动物中刚度的增加(图33A)。OVX也降低了最大载荷和骨折载荷(图33B，C)。这表明雌性激素损失本身降低了骨的强度(皮层效应)，同时增加了其刚度(杆状/板状的改变有关的骨小梁效应)。短期高胃泌素血症降低了使骨头骨折所需的功的量(图33D)。这些参数表示与弱的、受损的皮层骨一致的影响(图30-31)。OVX产生的骨的刚度被短期高胃泌素血症逆转了，表明这些胃泌素的影响仅限于骨重建的活化和吸收阶段。长期高胃泌素血症逆转了使骨头骨折所需的载荷和功。然而，骨的刚度在与骨小梁改变一致的这些动物中增加了(图30)。这与包括骨形成的逆转和形成阶段的骨重建表型一致，但在骨是硬的因而是脆的中是异常的。

机械强度评价：pMOI(极惯性矩)为骨总强度(和刚度)的度量，并与及载荷损坏成比例(扭转)。其在畸形愈合中增加了。评价了该参数以提供额外的骨强度测定，因为其特别表示了骨弱(bone weakness)的测定。OVX降低了pMOI，其被短期高胃泌素血症进一步显著地减少了(图34A)。这确认了卵巢切除术削弱了骨头，并证明胃泌素的增加恶化了骨头的弱点。长期高胃泌素血症与pMOI(与对照相比)降低有关，但与单独的OVX没有差异。在短期(异常的活化和重建)和长期(异常的逆转和骨形成)的暴露期间，这与四点弯曲的数据一致(见上面)并突出了胃泌素的效果。

骨髓的实时PCR分析：与骨重建有关的五个基因被OVX显著地改变了(两个降低以及三个升高)。特别是，皮层骨髓源ALOX5(炎症)和RUNX2(成骨细胞分化)显著地降低了(图35)。CXCL12、PPARγ和HIF-1α的表达增加了。CXCL12与PTH介导的成骨细胞活化、脂肪细胞分化的PPARγ(骨保护机制)和组织缺氧介导骨损伤的HIF-1α(负调节RUNX2的表达，与骨膜的成骨祖细胞活化有关)有关。这与成骨细胞分化和破骨细胞活化的抑制一致。

短期(8周)和长期(16周)高胃泌素血症都没有显著地改变(放大或抑制)骨重建中OVX介导的基因表达的改变。然而，PTGS2(或可诱导的COX2)被胃泌素显著地降低了。这是一种骨损伤的应答，并与与保护有关的生物学应答一致。

总结(图36)：乳鼠属模型中卵巢切除术有关的骨(骨小梁和皮层)异常与骨生理学(成骨细胞功能的抑制)和源于皮层的骨骨髓细胞水平的基因表达的改变有关。这与胃黏膜神经内分泌标记的增加有关，所述标记包括HDC和钙敏/PTH1R应答。

卵巢切除术后的短期高胃泌素血症进一步以与单独卵巢切除术的骨表型(降低的骨小梁以及皮层密度和体积)和骨髓基因表达谱(例如HIF-1α的活化)相似的变化削弱了骨头。增加胃泌素的转录是胃中最显著的改变，并使CaSR/PTH1R表达正常化。

长期高胃泌素血症导致弱的和非常硬的骨头。在表型(骨小梁以及皮层密度和体积的降低)和在骨髓基因的表达(HIF-1α的活化)方面看到与单独卵巢切除术相似的改变。最显著的胃的改变是伴随着CaSR/PTH1R表达正常化的HDC的活化。

总之，骨质流失/异常与细胞的骨髓活化的变化以及胃黏膜神经内分泌细胞转录的改变有关。

实施例7：对胃神经内分泌功能和骨动力学的影响：基因敲除小鼠模型-有或没有 卵巢切除术

使用胃泌素和组胺的敲除模型的研究证明了组胺和胃泌素在骨代谢调节(整合性)中的关系，并提高了胃泌素和组胺在不同物种模型到乳鼠属中的作用。这些研究评价了胃泌素介导的组胺分泌对骨生物学的影响(以及我们观察到的G细胞被雌性激素调节)。使用了三种敲除的组合：HDC敲除小鼠以及胃泌素敲除和两者结合(HDC/GAS)敲除的动物。

循环激素：a)随着卵巢切除术，在所有的三种敲除模型中，雌性二醇被降低(80-90％)到了相似的水平(～2pg/ml)(图37)。b)在胃泌素和双敲除的小鼠中胃泌素是低的(10-20pg/ml)；在HDC敲除的动物中，胃泌素水平比GAS或GAS/HDC敲除的动物高出5x。这些水平没有被卵巢切除术影响，并与正常饮食的乳鼠属相似。

PTH水平在所有的三种敲除的模型中相似(图37)，但是是正常饮食的乳鼠属的-50％。卵巢切除术在HDC和HDC/GAS敲除的动物中增加了PTH水平，与雌性激素对甲状旁腺分泌物的抑制影响的丢失一致。这表明缺乏组胺对甲状旁腺没有影响。相比之下，PTH在GAS敲除的动物中随着卵巢切除术降低了。在乳鼠属中，8周的高胃泌素血症增加了PTH的释放，并且在体外实验中，确认了胃泌素介导PTH释放。这表明生理上的PTH释放需要胃泌素。雌性激素和胃泌素丢失的组合导致“低的”PTH分泌甲状旁腺。由于PTH通过RANK成骨细胞(骨吸收)¹⁰²与破骨细胞的活化有关，因此在这种环境中，胃泌素的缺乏能够被解释为“保护性的”。

胃：在胃泌素KO的动物中，OVX显著地上调了底部中的CCK2受体(3倍)(图38)并增加了HDC 10倍，表明雌性激素发挥着对ECL细胞的抑制影响。在窦部G细胞中，OVX下调了CaSR 60％，表明G细胞的钙敏感性被雌性激素调节。与对照(没有卵巢切除术)相比，在HDCKO的动物中，OVX下调了包括CaSR、PTH1R和CCK2大部分的靶标基因。胃泌素也被显著的下调了。在双KO的动物中，CCK2被卵巢切除术上调了。这些数据表明雌性激素调节了涉及钙敏以及因此钙代谢的转录本的表达，。特别是，胃的ECL和G细胞是雌性激素应答性的，特别是在钙生理学方面。

骨形态学和动力学：

骨micro CT：在胃泌素KO的小鼠中，卵巢切除术对股骨的密度和体积没有显著的影响，但增加了骨内膜和骨膜的厚度(图39A)。这直接与在短期和长期高胃泌素血症中注意到的效果相反(降低了骨小梁以及皮层骨密度和体积，以及骨内膜和骨膜的测定–见图24)。这导致与没有切除卵巢的骨头相比，不硬以及削弱的骨头。这证明胃泌素的缺乏(在低的雌性激素环境中)具有保护性，并可反映这些动物中的低的循环PTH水平。

HDCKO小鼠：在HDC KO的小鼠中，卵巢切除术对股骨密度和体积，或对骨内膜/骨膜的厚度没有显著的影响。然而，所述骨头与没有切除卵巢的骨头相比是硬的，需要较高的载荷来骨折，并显示出了增加的pMOI(p<0.03)(图39B)。因此，我们的调查确认了早期的研究⁹⁹，所述早期的研究为雌性激素和组胺丢失的结合增加了骨强度。

Gas/HDCKO小鼠：在胃泌素/HDC双KO的小鼠中，卵巢切除术对股骨密度没有显著的影响，但骨小梁和皮层体积降低了(p<0.03)(图39C)。没有看到骨内膜/骨膜厚度的改变。这导致与没有切除卵巢的骨头相比没有被削弱的骨头。

骨髓qPCR：在胃泌素KO的动物中，卵巢切除术与两个基因(ALOX5和CXCL12)的上调有关。(图40A-B)。这些通过PTH分别参与白细胞三烯的合成和炎症以及成骨细胞的活化。在乳鼠属模型中，卵巢切除术下调了ALOX5，但上调了CXCL12，影响没有被高胃泌素血症显著改变。在HDC和HDC/GASKO的动物中，卵巢切除术没有显著的影响，表明组胺在这两个基因的调节中没有起到作用。

骨髓PCR也确认了在胃泌素KO动物中，卵巢切除术与HIF-lα和IGFl的上调有关(图40C-D)。如在前面指出的，这些分别参与了骨祖细胞的调节和骨量的维持。

总结(图41)：在小鼠模型中，胃泌素丢失(在低的雌性激素环境中)改变了骨的生理学。卵巢切除术与短期或长期的高胃泌素血症的比较(在乳鼠属模型中)，导致显著更软的骨头。因此，胃泌素似乎对骨髓具有不利的以及“抗保护的”影响。单独的HDCKO(在低的雌性激素环境下)与显著较强(更硬)的骨头有关，表明组胺，如胃泌素，在骨生理学上起着调节的作用。组胺的去除(通过HDC KO)逆转了这一效果，并且因此与胃泌素和组胺协力是骨生理学中的关节调节子的结论一致。

在低的雌性激素环境中，胃泌素和HDC丢失(例如，组胺的丢失)的结合与显著较弱的骨头没有关系，并且骨动力学与正常的没有不同。这表明组胺(如胃泌素)可激活“骨质疏松”样的骨表型。因此，组胺的降低(去除)(通过HDC KO)逆转了由于雌性激素减少引起的前骨质疏松症的影响。

实施例8：原理证明的研究：在三种啮齿动物模型中，胃泌素拮抗剂对卵巢切除术 介导的骨表型的影响

在三种啮齿动物模型中评价了胃泌素拮抗剂(YF476)对OVX介导的骨密度丢失/骨变化的影响，集中于骨强度的研究、形态学和循环生物标记。检测了两种“正常的”OVX模型：a)小鼠(株系：CD-1[瑞士株系]–Charles River)和b)大鼠(株系：CD IGS[Sprague Dawley株系]–Charles River)，以及乳鼠属(内源性被激活的胃泌素/CCK2受体信号)模型。

让在两个月大时进行了手术(OVX)的动物恢复，然后被暴露于口服的抑酸剂以及胃泌素拮抗剂(GA)，YF476(单独注射)。小鼠和大鼠都被暴露于PPI奥美拉唑下，而乳鼠属被暴露于H₂受体拮抗剂洛克替丁(loxitidine)下。GA给药是以抑酸开始的单一皮下注射。药代动力学上，其剂量范围为15-20nmol经过8周的时间。关于剂量的描述包括在表3中。

表3：剂量的理论验证研究

物种	酸抑制剂	GA
			小鼠–CD-1	2ml/10g体重，21μg/mg/天)	15ug/动物
大鼠–CD	0.8ml/10g体重，8.5μg/mg/天	50ug/动物
			乳鼠属	0.85ml/10g体重，82.7-91.2μg/mg/天	10ug/动物

每种动物模型都包括三组：a)A组＝安慰剂盐溶液处理(没有OVX/对照)，b)B组＝OVX+抑酸治疗(OVX)，以及c)组＝GA处理切除卵巢的动物(OVX+GA)。在研究结束时(2个月)，我们评价了GA是否逆转OVX介导的骨参数的改变(microCT，骨强度和形态计量学以及循环标记)。

模型1：小鼠OVX：在GA处理开始时，动物为89天(3.0个月)大，在研究结束时，它们为146天(4.8个月)大。检测的骨小梁骨的数据确定了卵巢切除术显著降低了BV/TV(0.05±0.02对0.18±0.04，p<0.05)以及密度(37±5对173±18，p<0.05)，并增加了SMI(1.8±1.2对1.1±0.4，p<0.05)和骨小梁间距(0.6±0.18对0.28±0.05，p<0.05)(表4，图42)。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些卵巢切除术介导的骨变化，除了骨小梁的厚度和间距，所述骨小梁的厚度和间距保持了增加。这与骨小梁的骨密度的显著增加有关(70.7±19，p<0.05与OVX相比)。

表4.模型1中的骨小梁结果

^&表观密度(骨小梁)；^*p<0.05与对照相相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

皮层骨参数分析确定了卵巢切除术显著地降低了骨表面积(11.6±0.9对13.4±1.4，p<0.05)，增加了皮层厚度(0.2±0.01对0.15±0.01，p<0.05)，并与降低的皮层密度989±26对1153±39，p<0.05有关(表5，图43)。胃泌素-拮抗剂处理逆转了OVX介导的在密度方面的降低(1025±37，p<0.05相比于OVX)。

表5.模型1中的皮层骨数据

^&表观密度(皮层)；^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

使用Instron设备骨强度的测量确定了胃泌素拮抗剂在逆转OVX介导的骨表型中的功效。卵巢切除术显著地降低了(p<0.05)骨强度(刚度[246±29对294±34]，屈服刚度[221±28对271±33]，骨折载荷的断裂量[37±6对56±7])和需要破坏骨头增加的总功[28.3±9.7对20.4±2.3，p<0.05]。胃泌素拮抗剂处理使这些卵巢切除术介导的骨变化正常化，除了骨折载荷[43±6]之外，所述骨折载荷虽然增加了，但还是保持低于对照(表6，图44)。

表6.骨强度数据

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未受处理的)

形态计量学确定了在OVX小鼠中，随着吸收腔的增加以及TRAP阳性破骨细胞的数量(29±5对16±3，p<0.05)的增加(p<0.05)降低的骨矿化。胃泌素-拮抗剂处理逆转了这些现象(图45)。

卵巢切除术显著地(p<0.05)降低了循环雌性激素(1.9±0.9pg/ml对5.1±1.9)，并与PTH(123±74pg/ml对51±32)和胃泌素(3200±263pg/ml对2437±787)的增加有关。用拮抗剂处理逆转了卵巢切除术介导的在胃泌素方面的增加，但没有逆转PTH(表7，图46)。循环骨生物标记还被OVX改变了。特别是，PINP增加了(0.19±0.01ng/ml对0.1y±0.006，p<0.05)，CTx-1也是如此(0.60±0.14ng/ml对0.29±0.13，p<0.05)，骨钙素升高了(6.7±2.3ng/ml对4.1±1.2，p<0.05)。拮抗剂处理减弱了这三种中的每一种的卵巢切除术介导的改变。

表7.三组中的循环血液水平

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

总结(模型1)：在小鼠模型中，单一注射胃泌素拮抗剂与卵巢切除术介导的骨改变(在第8周检测)的逆转有关。尽管循环雌性激素低以及PTH水平高，这些效果发生了，并且被形态计量学参数(矿化、破骨细胞的数量)以及与合成代谢作用一致的循环骨生物标记表达的正常化证明了。

模型2：大鼠OV模型：在GA处理开始时，动物为98天(3.2个月)大，在研究结束时，它们为163天(5.4个月)大。检测骨小梁的数据确定了卵巢切除术显著地降低了BV/TV(0.15±0.03相对于0.27±0.07，p<0.05)和密度(159±26相对于287±71，p<0.05)。骨小梁间距(0.58±0.1相对于0.44±0.19，p<0.05)以及SMI(1.5±0.2相对于0.6±0.4，p<0.05)增加了(表8，图47)。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些卵巢切除术介导的骨变化，除了保持增加的SMI(1.3±0.17)之外。这与骨小梁的密度的增加(204±27，p<0.05相比于OVX)有关。

表8.来自模型2的骨小梁数据结果

^&表观密度(骨小梁)；^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

皮层骨参数分析确定了卵巢切除术显著降低了骨表面(42.7±2.5相比于49.9±3，p<0.05)，增加皮层厚度(0.66±0.03相比于0.61±0.07，p<0.05)，并与皮层密度的降低(1067±22相比于1144±17，p<0.05)有关(表9，图48)。胃泌素-拮抗剂处理逆转了OVX介导的在密度方面的降低(1098±24，p<0.05相比于OVX)。

表9.来自模型2的皮层骨数据结果

^&表观密度(皮层)；^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未受处理的)

使用Instron设备测定骨强度确定了胃泌素拮抗剂在逆转OVX介导的骨表型中的功效。卵巢切除术显著地降低了(p<0.05)骨强度(刚度[495±43相比于578±48]，屈服刚度[445±39相比于526±66]，骨折载荷的断裂量[265±29相比于300±17])。胃泌素拮抗剂处理使这些卵巢切除术介导的骨变化正常化(表10，图49)。

表10.骨强度数据

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未受处理的)

形态计量学确定了在OVX大鼠中，随着吸收腔的增加以及TRAP阳性破骨细胞的数量(11±3相对于2±2，p<0.05)的增加(p<0.05)改变了骨的矿化。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些现象(图50)。

卵巢切除术显著地(p<0.05)降低了循环雌性激素(2.1±0.3pg/ml相比于5.3±2.5)，并与在胃泌素(3200±789pg/ml相比于954±406)方面的增加有关。用拮抗剂处理对雌性激素或胃泌素没有显著的影响(表11，图51)。循环骨生物标记还被OVX改变了。具体来说，PINP(0.57±0.18ng/ml相比于0.35±0.06，p<0.05)和骨钙素(1.35±0.9ng/ml相比于0.43±0.07，p<0.05)都被升高了。用拮抗剂处理减弱了这些卵巢切除术介导的变化中的每一种。

表11.在三组中的循环血液标记水平

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

总结(模型2)：在大鼠模型中，单一注射胃泌素拮抗剂与卵巢切除术介导的骨改变的逆转有关(在第8周检测)。尽管循环雌性激素低以及PTH水平高，但是这些效果发生了，并且被形态计量学参数(矿化、破骨细胞的数量)以及与合成代谢作用一致的循环骨生物标记表达的正常化证明了。

模型3：乳鼠属OVX模型：在GA处理开始时，动物为121天(4.0个月)大，在研究结束时，180天(6.0个月)大。卵巢切除术显著地降低了BV/TV比(0.06±0.03相比于0.14±0.05，p<0.05)，骨小梁的数量(1.4±0.3相比于2.0±0.6，p<0.05)和骨表面(8.5±3.7相比于18.5±2.3，p<0.05)，并增加了SMI(1.1±0.3相比于0.74±0.21，p<0.05)，以及骨小梁间距(0.82±0.15相比于0.57±0.17，p<0.05)(表12，图52)。这与在骨小梁密度(60.6±37相比于157±51，p<0.05)方面的显著降低有关。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些卵巢切除术介导的骨改变，使骨小梁骨密度(187±66)正常化。药物还与骨小梁的数量(2.4±0.6，p<0.05，相比于对照)和厚度(0.08±0.01，p<0.05，相比于对照)的增加有关。

表12.来自模型3的骨小梁的数据结果

^&表观密度(骨小梁)；^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

皮层骨参数的评价确定了卵巢切除术没有显著地改变任何皮层骨参数(表13，图53)。胃泌素拮抗剂处理在切除卵巢的动物中没有影响。

表13.来自模型3的皮层骨数据结果

^&表观密度(皮层)；^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

使用Instron设备的骨强度的测定确定了胃泌素拮抗剂在逆转OVX介导的骨表型中的功效。卵巢切除术显著地降低了(p<0.05)骨强度(刚度[138±7相比于332±65]，屈服刚度[125±6相比于299±59]，断裂的骨折载荷[8±4相比于56±13])并提高了破坏骨头需要的总功[51±7.7相比于34±11.6，p<0.05]。胃泌素拮抗剂处理使这些卵巢切除术介导的骨变化正常化(表14，图54)。

表14.骨强度数据

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)

形态计量学确定了在OVX乳鼠属中，随着吸收腔的增加以及TRAP阳性破骨细胞的数量(27±11相比于9±3，p<0.05)的增加(p<0.05)降低了骨矿化。胃泌素拮抗剂处理逆转了这些现象(图55)。

卵巢切除术显著地(p<0.05)降低了循环雌性激素(1.9±0.6pg/ml相对于8.9±2.1)，并与PTH(523±308pg/ml相对于290±71)和胃泌素(7265±3198pg/ml相对于3705±2015)方面的增加有关。用拮抗剂处理逆转了卵巢切除术介导的胃泌素(2704±430)和PTH(150±37)的增加(表15，图56)。循环骨生物标记还被OVX改变了。具体来说，PINP增加了(0.16±0.03ng/ml相对于0.13±0.01，p<0.05)，CTx-1同样如此(0.24±0.17ng/ml相对于0.03±0.03，p<0.05)，而骨钙素升高了(1.6±1.1ng/ml相对于0.4±0.16，p<0.05)。用拮抗剂处理减弱了这三种卵巢切除术介导的变化中的每一种。

表15.在三组中的循环血液标记水平

^*p<0.05与对照相比；^**p<0.05与单独的OVX相比(未处理的)；^#p＝0.07与对照相比

总结(模型3)：在乳鼠属模型中，单一注射胃泌素拮抗剂与卵巢切除术介导的骨改变的逆转有关(在第8周检测)。尽管循环雌性激素低，但是这些效果还是发生了，并且被形态计量学参数(矿化、破骨细胞的数量)以及与合成代谢作用一致的循环骨生物标记表达的正常化证明了。

总结(模型1、2和3)：在三种模型中，单一注射胃泌素拮抗剂(10-20μMg体重)逆转了卵巢切除术介导的骨质流失和强度，恢复正常或趋向于正常化。尽管低的循环雌性激素以及高的PTH水平，这还是发生了，并与前骨(pro-bone)量信号的变型有关。

在整个申请中，参考了各种网站数据内容、出版物、专利申请和专利。(网站是由他们的统一资源定位器，或URL引用，网址在万维网上)每一个这些参考的公开通过引用于此其全部内容并入到本发明中。

本发明公开的实施例不能限制本发明的范围，其旨在本对本发明的单个方面的一对一的说明，任何功能等同的那些都包括在本发明的范围内。除了本发明中描述的那些，根据前面的描述和教导，本领域的技术人员对本发明的模型和方法的各种改变是显而易见的，并且相似的确定为落在本发明的范围内。这种改变或其他的实施方式可在没有脱离本发明精神真正的范围内被实践。

Claims (16)

1.一种用于治疗有需要的主体中的与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情的方法，包括向主体施用至少一剂治疗上有效量的胃泌素受体靶向药剂，从而治疗与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在治疗时间内施用所述胃泌素受体靶向药剂来消退与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在高胃泌素血症期间，向主体施用至少一剂胃泌素受体靶向药剂，不考虑高胃泌素血症的原因。

4.根据权利要求1所述的方法，其中与高胃泌素血症有关的骨疾病或病情是特征为骨质疏松症的疾病或病情。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃泌素受体靶向药剂为选择性的CCK2受体拮抗剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述选择性的CCK2受体拮抗剂为YF476。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述主体为卵巢功能降低或卵巢衰竭的女性。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述主体：(a)为卵巢功能降低或卵巢衰竭的女性，以及(b)具有高胃泌素血症。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括与治疗上有效量的质子泵抑制剂(PPI)或组胺2受体(H₂R)拮抗剂一起同时或以任意顺序施用所述胃泌素受体靶向药剂。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述胃泌素受体靶向药剂的治疗上有效量为10-25纳摩尔。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述高胃泌素血症为肿瘤高胃泌素血症或与抑酸药物有关的高胃泌素血症。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述胃泌素受体靶向药剂的治疗上有效量在0.2-14μg/kg的主体体重之间。

13.根据权利要求1所述的方法，其中将所述胃泌素受体靶向药剂通过皮下注射以单剂向主体给药。

14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述胃泌素受体靶向药剂通过静脉注射向所述主体给药。

15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述胃泌素受体靶向药剂以范围为20-100mg的剂量口服向主体给药。

16.根据权利要求9所述的方法，其中将所述PPI或H₂R拮抗剂向主体口服给药。