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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Tumortherapie zur Hemmung des Wachstums
durch immunologische Neutralisierung, der das Wachstum stimulierenden
Hormone in Verbindung mit einer Chemotherapie, bei welcher ein 5-Fluorouacilderivat
und Leucovorin genutzt wird.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Gastrin
ist ein Peptidhormon, welches in 2 vollentwickelten Formen vorliegt,
Tetratriacontagastrin (G34) und Heptadecagastrin (G17) und wird
durch spezialisierte Zellen, die G-Zellen, synthetisiert und sekretiert,
welche sich im Magenantrum befinden. Bei Gastrin produzierenden
Zellen werden diese Gastrinhormone posttranslational aus einem gemeinsamen
Vorläufermolekül hergestellt,
welches "Preprogastrin" genannt wird und
ein Signalpeptid enthält.
Das Signalpeptid "Pre" wird im endoplasmatischen
Retikulum der Zellen entfernt, was zu einem "Progastrin" Peptid führt, welches danach weiter
in der Zelle prozessiert wird, um die fertigen Gastrine G34 und
G17 zu bilden, vor der Sekretion in den Blutstrom (Dickinson 1991).
(Die vollständigen
Zitate für
die hier zitierten Referenzen werden im Referenzteil angegeben der
den Ansprüchen
vorausgeht). Beide vollentwickelten Formen von G34 und G17 werden
an ihrem Carboxy-terminalem Ende (-NH2)
amidiert. Beim Menschen wurden aufgrund von differentiellem Prozessieren
des Vorläufermoleküls mehrere
Formen von G17 gefunden, von denen jede verschiedene biologische
Aktivitäten
haben kann (Dickinson 1995 und Ciccotosto et al. 1995). Beim posttranslationalen
Prozessieren von Gastrin ist es die "vollentwickelte" Carboxy-amidierte Form, welche an einen
spezifischen Zellrezeptor, den sogenannten CCK-B/Gastrin Rezeptor,
via des Carboxyterminus des Peptids bindet. (Kopin et al. 1992).
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Die
Gastrinhormone werden in das zirkulierende Blut sekretiert und binden
an bestimmte Zellen im Magen, und zwar Enterochromaffin-artige (ECL)
Zellen und parietale Zellen, die indirekt oder direkt den Ausstoß an Magensäure beeinflussen.
Historisch gesehen wurden beide Gastrinhormone mit der Stimulation
der Sekretion der Magensäure
in Verbindung gebracht (Edkins, J.S. 1905). In den letzten Jahren
sammelten sich Beweise, die zeigten, daß Gastrin auch als trophischer
Faktor im Gastrointestinaltrakt wirkt (Johnson, L. 1992) und daß es das
Wachstum von gastrointestinalem Krebs (Watson et al. 1989, Dickinson,
C.J. 1995), so wie von nicht-gastrointestinalem Krebs, einschließlich kleinen
Karzinomen der Lunge, (Rehfeld et al. 1989) fördert.
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Verschiedene
Arten von Tumoren, einschließlich
kolorektalen, Magen-, pankreatischen und heptazellulären Adenocarcinoma,
besitzen CCK-B/Gastrin Rezeptoren in ihren Plasmamembran und die
Tumorzellen reagieren auf Gastrin mit starker zellulärer Proliferation
(Rehfeld, J.F., 1972, Upp et al. 1989 und Watson et al. 1993) Ansteigende
Plasmawerte der Gesamtmenge von Gastrin finden bei Patienten mit
kolorektalem Krebs statt und insbesondere erhöhte Werte des Hormonvorläufers Progastrin
wurden, durch die Benutzung von Gastrin-Antisera, bei vielen kolorektalen
Tumoren entdeckt (Ciccotosto et al. 1995). Vor kurzem wurde entdeckt,
daß viele
dieser Krebszellen auch Gastrin sekretieren und so einen autonomen
Signalweg zur Proliferation in Gamg setzen. (Van-Solinge et al.
1993, Nemeth et al. 1993 und Seva et al. 1994). Die Peptidhormone G17
und G34 binden an die CCK-B/Gastrin Rezeptoren an den Zellmembranen
normaler Zellen. Jedoch wurde entdeckt, daß G17, aber nicht G34, das
Wachstum von Gastrin-abhängigen
Krebszellen stimuliert. Insbesondere Serum-assoziertes G17 hat das
Potential, das Wachstum von kolorektalen Tumoren in Endocrin-abhängiger Art
und Weise zu stimulieren, abhängig
von den CCK-B/Gastrin
Rezeptoren von Tumorzellen (Watson et al. 1993). G17 ist besonders
darin verwickelt, das Wachstum von kolorektalen Adenocarcinomas
zu stimulieren, aufgrund einer möglichen
Steigerung der Affinität
der CCK-B/Gastrin Rezeptoren zu den Tumorzellen, verglichen mit
den anderen Gastinhormonarten (Rehfeld 1972 und Van Solinge et al.
1993). Es wurde entdeckt, daß die
CCK-B/Gastrin Rezeptoren in einer hoch affinen Form bei 56,7 % der
primären,
humanen, koloraktalen Tumore exprimiert waren (Upp et al. 1989).
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Zahlreiche
Studien haben gezeigt, daß,
zusätzlich
zur Fähigkeit
auf exogenenes, endokrines Gastrin zu reagieren, humane gastrische
und kolorektale Tumore Gastrin und seine Vorläufer produzieren (Ciccotosto et
al. 1995; Finley et al. 1993; Kochmann et al. 1992; Nemeth et al.
1993; Van Solinge et al. 1993), um so einen autokrinen Wachstumsstimulationsignalweg
in Gang zu setzen. Die Gastrinproduktion von Tumorzellen unterscheidet
sich von der in endokrinen G Zellen. Insbesondere enthalten diese
Tumorzellen eine hohe Konzentration des Vorläufers Progastrin, zusammen
mit einer niedrigeren Konzentration von vollentwickelten Peptiden. Es
wird postuliert, daß dieses
abnormale Verhältnis
aufgrund der konstitutiv unregulierten Abgabe von Gastrin, zusammen
mit einer limitierten Aktivität
der Peptidylglycin-α-amidierenden
Monooxygenase zustande kommt (Ciccotosto et al. 1995; Kelly 1998)
Deshalb führt
die unregulierte Abgabe von Gastrin zu einer abnormalen Produktion
und Sekretion von verschiedenen molekularen Formen des Hormons.
Insbesondere Koloncarcinomazellen prozessieren Progastrin nicht
effizient, was zu weniger Umwandlung des Vorläufergastrins zu vollentwickelten
Peptiden führt
und sie produzieren so unfertige oder anormale Gastrine (Dickinson
1995 und Rehfeld et al. 1993). Zusätzlich wird der erhöhte Gastrinlevel
bei kolorektalen Tumoren, zumindest teilweise, einer aberranten
Expression des Gastringens in kolorektalen Tumorzellen zugeschrieben
(Hoosein et al. 1990; Baldwin et al. 1992 und Finley et al. 1993).
Gastrin-ähnliche
Peptide wurden in solchen Zellen identifiziert (Hoosein et al. 1988;
Watson et al. 1991 und Finley et al. 1993) und wurden als Vorläufer Gastrinformen
bestätigt
(Van Solinge et al. 1993 und Nemeth et al. 1993).
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Die
Anwesenheit von amidiertem G17 (G17-NH2)
in einigen kolorektalen Krebsformen (Ciccotosto et al. 1995; Van
Solinge et al. 1993) zeigt, daß einige
Tumore einen inktakten Prozessierungssignalweg beibehalten, da eine
Amidierung von Gastrin nur in den sekretorischen Körnchen stattfindet
(Varro et al. 1994). Endogen produziertes Gastrin wirkt auch als
autokriner Wachstumsfaktor, da gezeigt wurde, daß das basale Wachstum einer
kolorektalen Zelllinie durch einen Anti-Gastrin Anitkörper gehemmt
wurde (Hoosein et al. 1988). Dies wurde in einer zweiten Studie
bestätigt,
bei welcher eine Northern Blot Analyse Gastrin mRNA in der gleichen
Zelllinie zeigte und durch ein Radioimmunoassay Gastrinähnliche
Immunoreaktivität
im Überstand
der Zellkultur nachgewiesen wurde (Hoosein et al. 1990). Gastrinpeptide
besitzen auch parakrine Funktionen (Watson et al. 1991 b) was in
Experimenten bestätigt
wurde (Finley et al. 1993), die zeigten, daß die Immunoreaktivität von Gastrin
in Subpopulationen maligner, kolorektaler Mucosalzellen vorherrschender
war.
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Wenn
G17 an seinen Rezeptor bindet wird ein G17/Rezeptorkomplex gebildet,
welcher das Zellwachstum, durch sekundäre Botenstoffe zur Regulierung
der Zellfunktion, stimuliert (Yamada et al. 1993). Die Bindung von
G17 an den CCK-B/Gastrinrezeptor führt zu einer Aktivierung des
Phosphatidylinositolabbaus, der Proteinkinase C Aktivierung mit
einem daraus folgenden Anstieg der intrazellulären Kalziumionenkonzentration
und der Induktion von c-fos und c-jun Protooncogenen via der, durch
Mitogen aktivierten, Proteinkinase, die mit Regulation der Zellproliferation
in Verbindung gebracht wurde (Todisco et al. 1993). Zusätzlich wurde
die Bindung von Gastrin an den CCK-B/Gastrin Rezeptor mit dem nachfolgenden
Anstieg der Phosphorilierung durch eine Tyrosinkinase in Verbindung
gebracht, der pp125FADK (focal adhesion kinase), die auch eine Rolle bei
der Übertragung
von mitogenen Signalen spielen könnte
(Taniguchi et al. 1994).
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Kolorektaler
Krebs bleibt eine schwer zu behandelnde Krankheit, da in den letzten
Jahren nur geringe Fortschritte im Hinblick auf die Überlebenschance
erreicht wurden. Eine Operation ist eine wirksame Behandlung der
primären
Erkrankung aber unwirksam gegenüber
verbleibenden okkulten Erkrankungen, die häufig auftreten. Eine nach der
Operation durchgeführte
Strahlungstherapie wird für
Patienten mit rektalem Krebs üblicherweise
empfohlen, um die Risiken eines erneuten Auftretens der Krankheit
zu reduzieren. Chemotherapie mit 5-Fluorouracil (5-FU) war die üblicherweise
effektivste Therapie nach der Operation bei Patienten mit weiter
fortgeschrittenem kolorektalem Krebs. Jedoch wurde gezeigt, daß die 5-FU
Therapie nur einen geringen Nutzen für den Patienten aufweist, da
5-FU hoch toxisch
ist und die Therapie ist kostspielig und scheint, weder alleine,
noch in Kombination mit anderen zytotoxischen Medikamenten, das Überleben
signifikant zu verlängern.
In den meisten Fällen
regieren okkulte oder inoperable kolorektale Tumore nicht gut auf
Chemotherapie oder Bestrahlung und es werden neue Behandlungen benötigt, um
die vorhandenen Verfahren zu ergänzen.
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Kürzlich haben
einige Studien gezeigt, daß eine
adjuvante Kombinationschemotherapie mit 5-FU und Leucovorin die
Wirksamkeit von 5-FU bei Patienten mit weiter fortgeschrittenem
kolorektalem Krebs erhöht. Leucovorin
ist ein Derivat der Folsäure,
auch bekannt als folinische Säure,
Citrovorumfaktor oder 5-Formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure. Die Studien zeigen, daß bei Patienten
der Duke Stufe C eine 5-FU/Leucovorin Kombinationstherapie
die Mortalität
um 10 bis 15 % senken kann (Moertel 1994). Bei der gleichen Patientengruppe
führte
eine kombinierte intravenöse
und intraperitonale Therapie mit 5-FU/Leucovorin zu einem nicht signifikanten
Trend hin zu krankheitsfreiem Überleben
und einem allgemeinen Überlebensvorteil
(Scheithauer et al. 1995). Bei fortgeschrittener Krankheit kann
die gleiche Kombination der Medikamente einen Überlebensvorteil zur Folge
haben (Taylor 1993) wo gezeigt wurde, daß es einen Mittelwert von 13,5
Monaten Überleben in
der Kombinationsgruppe gab, verglichen mit 7,5 Monaten bei mit 5-FU
behandelten Patienten (Petrioli et al. 1995). Jedoch ist diese Kombinationstherapie
nicht ohne eine signifikante Morbidität und führt zu schädlichen Nebenwirkungen einschließlich Stomatitis,
Diarrhö und
Myelosuppression (Mahood et al. 1991; Erlichman et al. 1988, Pietnelli
et al. 1989), was die Lebensqualität zu einem Thema macht, insbesondere
bei Patienten mit fortgeschrittener Krankheit.
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Eine
Anzahl von CCK-B/Gastrin Rezeptorantagonisten mit hoher Affinität wurde
therapeutisch sowohl in vitro als auch in vivo bei einer Anzahl
experimenteller gastrointestinaler Krebsformen bewertet. Zum Beispiel wurde
bei Proglumid, einem Glutaminsäurederivat
(Seva et al. 1990, Harrison et al. 1990 und Watson et al. 1991 a),
Benzotript, einem N-Acylderivat von Tryptophan, L-365.260, einem
Derivat von Aspercillin (Bock et al. 1989) und CI-988, einem Molekül, welches
die C-terminale Pentapeptidsequenz von CCK nachahmt (Hughes et al.
1990) gezeigt, daß sie
die Effekte von exogenem Gastrin auf das Wachstum gastrointestinaler Tumore
sowohl in vitro als auch in vivo effektiv neutralisieren (Watson
et al. 1991b und Romani et al. 1994). Jedoch haben diese Antagonisten
schwerwiegende toxische Nebenwirkungen und es fehlt ihnen an Spezifität, da sie
die Wirkung aller potentiellen Liganden des Rezeptors wie G34 und
CCK bei normalen Zellen blockieren. Jüngst wurden auch hoch wirksame
und selektive CCK-B/Gastrin Rezeptorantagonisten wie YM022 (Yuki et
al. 1997) und YF476 (Takinami et al. 1997) beschrieben.
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Proglumid
und Benzotript wurden umfangreich in vorklinischen Studien bewertet.
Das Hauptproblem mit diesen Verbindungen besteht in ihrer mangelhaften
Wirksamkeit, wobei relativ hohe Konzentrationen benötigt werden
um G17 zu ersetzen (Watson et al. 1992a; Watson et al. 1992b). Davon
unabhängig
hemmten Proglumid und Benzotript das basale und die durch Gastrin
stimulierte Prolifration in einer Anzahl von Zelllinien (Seva et
al. 1990; Watson et al. 1991 a). Zusätzlich steigerte Proglumid
das Überleben
von xenograften Mäusen,
die den Gastrin-empfindlichen Mauskolontumor MC26 tragen auf 39
Tage bei behandelten Tieren, von 25 Tagen bei den Kontrolltieren.
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Aufgrund
der niedrigen Spezifität
dieser Klasse von Gastrin entgegen wirkenden Mitteln für den Gastrin/CCK-B
Rezeptor wird auch vermutet, daß die
Hemmung des Wachstums auch durch eine vom Gastrin-Rezeptor unabhängige Funktion
induziert wird. Weiterhin binden die zellulären Rezeptoren, die das Gastrin
erkennen und binden, nicht an alle getesteten Inhibitoren (Seva
et al. 1994). Deshalb kann es, wenn eine vollständige Hemmung der Gastrinbindung
am Rezeptor nicht in der autokrinen Wachstumskaskade stattfindet, sein,
daß der
Gastrinantagonist nicht dazu in der Lage ist, diesen Mechanismus
der Förderung
des Tumorwachstums zu blockieren.
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Deshalb
werden neuartige therapeutische Ansätze benötigt sowohl als eigenständige Modalitäten und in
Kombinationsstrategien mit Chemotherapie. Kombinierte Behandlungen
erlauben die Möglichkeiten,
den therapeutischen Index zu erhöhen
und/oder die Dosen der benötigten
Chemotherapie zu senken, und somit die schädlichen Nebenwirkungen zu begrenzen.
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Ein
therapeutisches Verfahren um selektiv immunologisch die biologische
Aktivität
des Gastrinhormons zu neutralisieren würde eine effektive Möglichkeit
zur Verfügung
stellen, die pathologischen Veränderungen
die aus einer exzessiven Produktion von Gastrinhormon resultieren,
was mit kolorektalem Krebs in Verbindung gebracht wird, zu kontrollieren
oder zu verhindern.
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Die
gleichzeitig verleihenen U.S. Patente Nr. 5,023,077; 5,468,494;
5,607,676; 5,609,870 und 5,622,702 offenbaren immunogene Stoffe
und immunogene Zusammensetzungen, die für Kontrolle der G17 und G34
Level bei einem Patienten nützlich sind,
indem sie Anti-Gastrin Antikörper
erzeugen und sie offenbaren weiterhin die Anwendung solcher Zusammensetzungen
bei der Behandlung von gastrischen und duodenalen Geschwüren und
bei durch Gastrin induziertem Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft
die Anwendung der anti-G17 immunogenen Stoffe und immunogenen Zusammensetzungen
die in den Patenten Nr. 5,023,077; 5,468,494; 5,607,676; 5,609,870
und 5,622,702 offenbart werden in der Anwendung für eine Kombinationstherapie
mit chemotherapeutischen Mitteln, zur Behandlung eines von Gastrin
abhängigen
kolorektalen Krebs.
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Das
Verfahren zur Krebstherapie das hier beschrieben wird, hat einige
Vorteile gegenüber
den bisherigen Behandlungsmethoden für Krebs. Die Immunisierung
mit Anti-G17, in
Kombination mit chemotherapeutischen Mitteln wie 5-FU und Leucovorin
steigert den therapeutischen Effekt bei der Kontrolle und der Hemmung
des Wachstums des kolorektalen Tumors gegenüber der Chemotherapie alleine.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Kombinationstherapie zur Behandlung
von Tumoren bereit, die das immunologische Neutralisieren von Peptidhormonen
sowie von Faktoren, die die Teilung von Tumorzellen fördern, umfasst,
in Kombination mit einer Chemotherapie. Insbesondere liefert die
vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung Gastrin-abhängiger Krebsformen,
wie kolorektaler Adenokarzinome. Das Verfahren umfasst eine Kombinationstherapie,
die die Immunisierung des Patienten, der die Therapie benötigt, mit
Anti-G17 umfasst, in Verknüpfung
mit der Gabe von einem oder mehrerer chemotherapeutischer Mittel.
Die Anti-G17 Immunisierung zur Behandlung Gastrinabhängiger Tumore
ist erstaunlich wirksam bei der Bildung von Anti-G17 Antikörpern, unabhängig von
den bekannten myelo-suppresiven Effekten der verwendeten chemotherapeutischen
Mittel.
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Die
Anti-G17 Immunisierung umfasst die aktive oder passive Immunisierung
eines Patienten mit einem Anti-G17 Immunogen, gegen das Hormon G17
um die G17 Level des Patienten zu kontrollieren. Als Ergebnis der
Induktion der von Anti-G17 Antikörper
im Patienten ist das G17 Hormon in vivo neutralisiert und seine
physiologischen Effekte werden inhibiert, um so das G17-abhängige Tumorzellwachstum
zu hemmen.
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Weiterhin
steigert die Benutzung der Anti-G17 Immunisierung in Kombination
mit herkömmlicher
Chemotherapie die Wirksamkeit der Behandlung für kolorektalen Krebs, da in
der Kombination geringere Mengen der chemotherapeutischen Mittel
notwendig sein können, um
den Patienten zu behandeln, so wird ihr toxischer Effekt auf normales
Gewebe vermindert. Zusätzlich
kann die Lebensqualität
des Patienten verbessert werden und seine Überlebenszeit verlängert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren die aktive Immunisierung eines Säugers, der
einen Gastrin-abhängigen
Tumor aufweist, mit einem Anti-G17
Immunogen, in Kombination mit der Verabreichung einer oder mehrer
chemotherapeutischer Substanzen, wie 5-Fluorouacil, Leucovorin,
Levamisol, Cisplatin, Tumor-Nekrosis-Faktor und Proglumid. Das Anti-G17
Immunogen kann einem Patienten zu Beginn der Therapie und zu darauf
folgenden Intervallen verabreicht werden, so wie vom Patienten benötigt. Die Anti-G17
Antikörper,
die der Patient nach der Immunisierung bildet, binden und neutralisieren
G17 in seiner vollentwickelten, amidierten G17-Form, genauso wie
in seinen Vorläuferformen,
z.B. G17-Gly, in vivo und verhindern die Bindung von G17 an seine
Rezeptoren und verhindern so das Wachstum von Gastrin-abhängigen Tumorzellen.
Die Titer der Anti-G17 Antikörper
die ein immunisierter Patient bildet, können in vorbestimmten Intervallen
mit herkömmlichen
Techniken überprüft werden.
Zusätzlich
können
chemotherapeutische Mittel, wie von herkömmlichen Zeitplänen bestimmt,
oder niedrigen Dosen, wie vom Patienten benötigt, verabreicht werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines Gastrin-abhängigen Tumors
bereit, welches die passive Immunisierung eines Patienten, der einen
Gastrin-abhängigen
Tumor hat, mit Anti-G17 Antikörpern,
in Kombination mit der Verabreichung einer oder mehrer chemotherapeutischer
Substanzen, wie 5-Fluorouacil, Leucovorin, Levamisol, Cisplatin,
Tumor-Nekrosis-Faktor und Proglumid, umfasst. In einer bevorzugten
Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung können
die Antikörper
chimär,
humanisiert oder humane monoklonale Antikörper sein, die nach Verfahren
die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, hergestellt wurden. Die
Antikörper
können
zusammen mit den chemotherapeutischen Mitteln zu Beginn der Therapie
und zu darauf folgenden Intervallen verabreicht werden, so wie vom
Patienten benötigt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
einen Graphen, der die Zeitskala der Serumantikörpertiter nach der Immunisierung
von Ratten zeigt, die mit 500 μg/ml
Ratten Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen immunisiert wurden.
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2 zeigt
einen Graphen, der die Wirkung einer 30 mg/kg Dosis 5-FU/Leucovorin-Behandlung auf die
Anti-G17 (1-9) Antikörpertiter
von Ratten zeigt, die mit dem Immunogen der Erfindung immunisiert
wurden.
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3 zeigt
einen Scatchard Plot, der die Wirkung der Behandlungszyklen mit
30 mg/kg 5-FU/Leucovorin auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen
zeigt, die bei BDIX Ratten gezählt
wurden
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4 zeigt
eine Balkengraphik, die das durchschnittliche Gewicht eines Tumors
bei unbehandelten, mit Anti-G17 (1-9)-DT behandelten und mit DT
behandelten Ratten zeigt.
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5 zeigt
eine Balkengraphik, die das durchschnittliche Gewicht eines Tumors
bei mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin; 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT
Immunogen; 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT; 25 mg/kg
5-FU/Leucovorin und DT Immunogen; 25 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17
(1-9)-DT; 20 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen; 20 mg/kg 5-FU/Leucovorin
und Anti-G17 (1-9)-DT; 12,5 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen und mit
12,5 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT behandelten Ratten zeigt.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren
bereit, insbesondere jenen, die mit Gastrin-abhängigem kolorektalem Krebs in
Verbindung gebracht werden, wobei der Patient im Rahmen einer Kombinationstherapie
behandelt wird, die die Immunisierung des Patienten mit einem Anti-G17 Immunogen
und der Behandlung des Patienten mit chemotherapeutischen Mitteln,
wie 5-FU und Leucovorin, umfasst. Die Kombinationstherapie aus Anti-G17
Immunisierung und 5-FU/Leucovorin war überraschenderweise wirksamer
als frühere
Behandlungsmethoden für
kolorektalen Krebs. Die chemotherapeutischen Mittel, die im Rahmen
der Kombinationstherapie geeignet sind, hemmen die Produktion der
G17 Antikörper
bei einem immunisierten Patienten nicht maßgeblich und es ist möglich geringere
Dosen eines chemotherapeutischen Mittels zur Behandlung des Tumorwachstums
zu nutzen. Zusätzlich
sind die Anti-G17 Antikörpertiter,
die durch die Immunisierung produziert werden, geeignet alle Formen
des G-17 Hormons zu neutralisieren. Eine Anti-G17 Immunisierung
kann auch vor einer operativen Behandlung eines Tumors an einem
Patienten durchgeführt
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren die aktive Immunisierung eines Patienten,
der an Gastrin-abhängigem
kolorektalem Krebs leidet, indem eine Anti-G17 Immunogenzusammensetzung
in Verbindung der Anwendung chemotherapeutischer Mittel verabreicht
wird. Nachfolgende Anti-G17 Immunisierungen zur Auffrischung können, wie
vom Patienten benötigt
verabreicht werden, was durch eine Analyse des Anti-G17 Antikörpertiters
im Serum, nach der Immunisierung durch Standardverfahren und herkömmliche
radiologische Beurteilung der Tumore bestimmt wird.
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Die
Anti-G17 Immunogene umfassen natürliche
oder synthetische Peptidfragmente von N-Terminalen Aminosäuren von
G-17 als immunomimischen Teil des Immunogens. Dieser Peptidteil
wird an einen immunogenischen Träger,
wie das Diphtherietoxoid (DT) konjugiert. In einer bevorzugten Ausprägungsform
dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Anti-G17 Immunogen die
aminoterminalen Aminosäuren
von G-17 der Positionen 1 bis 9, an das Diphtherietoxin konjugiert,
welche die Aminosäuresequenz
pyroGlu – Gly – Pro – Trp – Leu – Glu – Glu – Glu – Glu haben.
Andere geeignete immunogene Proteincarrier schließen Rinderserumalbumin,
Keylimpet Hämocyanin,
Hämocyanin
und Tetanus-Toxoid mit ein.
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Die
Immunogene dieser Erfindung können
auch eine Verlängerung
oder eine Spacerpeptidsequenz umfassen, welche geeignet ist das
immunomimische Peptid vom Proteincarrier auf Abstand zu halten und
seine Fähigkeit
zu erhöhen,
an die Lymphocytrezeptoren zu binden. Eine geeignete Spacerpeptidsequenz
ist die Aminosäuresequenz
SSPPPPC (SEQ ID NR.: 2 in der Auflistung der Sequenzen). Jedoch
gibt es auch andere geeignete Spacerpeptide. In einer bevorzugten
Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung wird die bevorzugte Spacersequenz an
das Carboxy-terminale Ende des immunomimischen Peptids gehängt. Die
Immunogene der Erfindung werden mit herkömmlichen Techniken hergestellt
und werden in den US Pat. Nr. 5,023,077; 5,468,494; 5,607,676; 5,609,870,
5,688,506 und 5,622,702 offenbart. Nach der Immunisierung bilden
die Immunogene der Erfindung neutralisierende Antikörper mit
hoher Affinität,
um die Wirkung von G-17, in seiner vollentwickelten und Vorläuferform,
auf das Tumorwachstum bei immunisierten Tieren, zu hemmen. Die produzierten
Anti-G17 Antikörper
binden und neutralisieren vollentwickeltes und Vorläufer-G-17
und verhindern so die Bindung von G-17 an die Rezeptoren der Tumorzellen
und hemmen letztendlich das Zellwachstum. Die Immunogene erzeugen
Antikörper
die sowohl das Carboxy-amitierte und das Glycinerweiterte G17 neutralisieren
und sie erzeugen keine Kreuzreaktivität mit G34 oder CCK.
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Die
Zusammensetzungen, bei denen die Immunogene für die aktive Immunisierung
zur Behandlung von Gastrin-abhängigen
Tumoren an Patienten verabreicht werden, können in einer Vielzahl von
Formen vorliegen. Diese schließen
z.B. feste, halbfeste und flüssige
Dosierungsformen mit ein, wie Pulver, flüssige Lösungen, Suspensionen, Zäpfchen,
injizierbare und für
Infusionen geeignete Lösungen.
Die bevorzugte Form hängt
von der gewünschten
Form der Verabreichung und der therapeutischen Anwendungen ab. Die Zusammensetzungen
umfassen die vorliegenden Immunogene und geeignete pharmazeutisch
akzeptable Bestandteile und können
andere medizinische Mittel, Träger,
Hilfsstoffe, Arzneistoffträger
usw. mit einschließen,
die mit herkömmlichen
Verfahren gemischt werden können.
Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten.
Die Menge an aktiver Verbindung, die zur Immunisierung oder als
Medikament an einem Zeitpunkt oder über einen Zeitraum verabreicht
werden hängt
von dem zu behandelnden Subjekt, der An und Weise und der Form der
Verabreichung, sowie dem Urteil des behandelnden Arztes, ab.
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Eine
effektive Dosierung, die von 0,001 bis 2 mg der immunogenischen
Zusammensetzung reicht, wird dem Patienten zur Behandlung des gastrointestinalen
Krebs verabreicht. Die wirksame Dosierung der immunogenischen Zusammensetzung
ist dazu in der Lage, beim Patienten eine Immunantwort hervorzurufen,
die ausreichend ist, für
1 bis 3 Monate wirksame Mengen an Antikörpern zu bilden, die vollentwickeltes
oder Vorläufer-G-17 binden und neutralisieren.
Nach der Immunisierung und der Behandlung eines Patienten mit kolorektalem
Krebs mit dem chemotherapeutischen Mittel, z.B. mit 5-FU/Leucovorin,
wird die Wirksamkeit der Therapie auf das Wachstum des Tumors mit
herkömmlichen
klinischen Verfahren wie Ultraschall und Kernspintomographie (MRI) überwacht,
um die Anwesenheit und, falls vorhanden, die Größe von Tumoren zu bestimmen. Der
Titer der Anti-G17
Antikörper
kann auch mit einer Blutprobe des Patienten bestimmt werden.
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Auffrischungsimmunisierungen
sollten nach Bedarf verabreicht werden um einen wirksamen Antikörpertiter
aufrecht zu erhalten. Eine wirksame Behandlung des Gastrinabhängigen kolorektalen
Adenokarzinoms und andere Gastrin-abhängiger Krebsformen wie Magen-,
Leber-, Pankreas- und kleinzelliges Lungenkarzinom sollte, gemäß diesem
Verfahren, in einer Hemmung des Tumorwachstums und einer Verringerung der
Größe des Tumors
resultieren.
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Zur
passiven Immunisierung werden die Anti-G17 Antikörper intravenös, mit Hilfe
eines pharmakologisch verträglichen
Trägerstoffes,
wie einer Salzlösung,
zum Beispiel eine phosphat-gepufferte Salzlösung, an den Patienten verabreicht.
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Die
chemotherapeutischen Mittel werden in einer Dosierung gegeben, wie
durch herkömmliche
Zeitpläne
empfohlen, und können
zur Beginn der Therapie, gleichzeitig mit dem Anti-G17 Immunogen,
vor der Immunisierung oder nach der Immunisierung, verabreicht werden.
In einigen Fällen
kann es von Vorteil sein, die chemotherapeutischen Mittel sowohl
vor als auch nach der Immunisierung zu verabreichen. Es können auch nachträgliche chemotherapeutische
Behandlungen verabreicht werden, wie vom Patienten, nach der Auswertung
der Kernspintomographie und des Ultraschalls, benötigt.
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Die
folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit der
vorliegenden Kombinationstherapie auf kolorektale Formen von Krebs
zu zeigen.
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BEISPIEL 1
-
Die
folgenden Experimente wurden durchgeführt, um den potentiellen klinischen
Nutzen zu bestimmen, der von Anti-G17 (1-9)-DT ausgeht. Die Ziele
dieser Studie waren wir folgt:
- (a) Bestimmung
des Langzeiteffekts der spezifischen Ratte Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung
auf das histologische Erscheinungsbild des GI Trakts der Ratte
- (b) Beurteilung der Wirkung der 5-FU/Leucovorin Kombinationen
auf die Antikörpertiter,
die durch die Anti-G17 (1-9)-DT erhöht wurden, und
- (c) Bestimmung der therapeutischen Wirkung von Anti-G17 (1-9)-DT
und 5-FU/Leucovorin
Kombinationen auf ein Rattenkolonmodel.
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Zelllinie
-
DHDK12
ist eine Rattencolon-Epitheltumorzelllinie (Martin, 1983). Die Zelllinie
wurde in RPMI 1640 Wachstumsmedium (Gibco, Paisley, Schottland),
welches 10% fötales
Kälberserum
(FCS, Sigma, Poole, UK) unter befeuchteten Bedingungen bei 37 °C und 5%
CO2.
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Immunogen
-
Das
Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen besteht aus den Aminosäureresten
1-9 von G17, die über
den Carboxyterminus an den Peptidspacer SSPPPPC (SEQ ID NO.: 1 in
der Auflistung der Sequenzen), was wiederum an DT konjugiert ist.
Das Immunogen das bei diesen Studien verwendet wurde, wurde spezifisch
für Ratten G17
erzeugt, indem das humane G17 Epitop durch die aminoterminalen 9
Aminosäuren
von Ratten G17 ausgetauscht wurde, welches durch einen Peptidspacer
mit Diphtherietoxin (DT) verbunden ist. Antiserum welches durch
Ratte Anti-G17 (1-9)-DT erzeugt wurde, wurde als Anti-Ratte G17
(1-9):DT bezeichnet.
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Versuchstiere
-
Männliche
und weibliche BDIX Ratten wurden von der Cancer Studies Unit, University
of Nottingham, UK bereitgestellt, sie waren 6-10 Wochen alt und
wogen 340 – 420
g. Die Ratten wurden paarweise und mit einem Zeitplan von 12 Stunden
Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei 25 °C und 50 % Luftfeuchtigkeit
gehalten. Vor jedem Experiment wurden die Tiere gruppiert um die
Gewichtsverteilung auszugleichen. Die Größe der Gruppen reichte von
6 – 13
Tiere. Die Richtlinien des UK Coordinating Committee for Cancer
Research (UKCCCR) wurden während
allen Tierversuchen befolgt.
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Immunisierungsverfahren
-
Ratte
Anti-G17 (1-9)-DT wurde in einer sterilen Salzlösung (0,9 %), pH 7,3 auf 1
mg/ml gelöst.
Der Hilfsstoff Nor-Muramyldipeptid (Peninsula Labs., Belmont, CA,
USA) wurde zur Lösung
des Konjugats zugegeben um eine endgültige Konjugatkonzentation
zwischen 200 und 500 μg/ml
zu erreichen. Die wässrige
Lösung
wurde mit einem öligen
Träger
(Montanid ISA 703; AMS Seppic Inc., Paris, Frankreich) in einem
Verhältnis
von 1:2 (v/v) durch Emulgierung vermengt. Nachdem sie in eine Glasspritze
gegeben wurde, die durch einen Dreiweg-Sperrhahn mit einer zweiten
Spritze verbunden ist, wurde die Mischung 40 Mal durch die Spritzen hin
und her bewegt, um eine Emulsion zu erzeugen. Eine Emulsion, die
DT Peptid und Muramyldipetid enthält wurde auf gleiche An und
Weise für
Kontrollratten erzeugt. 200 μl
der Emulsion (50 μg/Ratte)
wurden subkutan injiziert (rechte Flanke der Versuchstiere). Die
Tiere wurden entweder mit einer einzelnen Injektion immunisiert oder
immer wieder in Intervalen von 21 Tagen, wie unten beschrieben.
-
Zytotoxischer Behandlungszeitplan
-
Die
Ratten erhielten 12,5 und 25 mg/kg 5-Fluorouacil (5-FU, David Bull
Labs., Warwick, UK) und 12,5 – 25
mg/kg Leucovorin (Lederle Labs., Gosport, Hants, UK) welches intravenös (iv) an
den Tagen 1, 3 und 5 verabreicht wird, wobei der Zyklus für die Dauer
der Studie alle 4 Wochen wiederholt wird (Asao, 1992). Die zytotoxische
Kombination wurde den Ratten entweder vor oder nach der Anti-G17
(1-9)-DT Immunisierung (200 μg/ml)
verabreicht.
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Initiierung des Tumorwachstums
-
DHDK12
Zellen wurden in steriler phosphatgepufferter Saline (PBS, Oxoid,
Hants., UK) mit einer Zellkonzentration von 2,5 × 107/ml
suspendiert. Die Ratten wurden mit einer 1 ml intraperitonalen Injektion
von Hypnorm (0,315 ng/ml Fenatanylcitrat und 10 mg/ml Fluanison;
Jannsen, Berrse, Belgien), Hypnovel (Sng/ml Midazolam; Roche, Basel,
Schweiz) und sterilem destilliertem Wasser in einem Verhältnis von
1:1:5 anästhesiert.
Nach einem subkutanen (s.k) Schnitt an der rechten Flanke wurde
ein Volumen von 200 μl
Zellsuspension in die Muskelschicht der Bauchdecke injiziert und
der chirurgische Schnitt wurde mit Wundklammern verschlossen. Jede
Gruppe des Experiments bestand aus 6 bis 13 Tieren.
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Bestimmung der spezifischen
Antiköpermengen
der mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten
-
Um
die Blutproben für
die Analyse zu erhalten wurde von Ratten während des Experiments zu verschiedenen
Zeitpunkten Schwanzblut entnommen und bei der Beendigung des Experiments
durch eine Herzpunktur unter terminaler Betäubung. Die Serumantikörperlevel
von Anti-Ratte G17 wurden mit einem "Enzyme-linked immmunosorbent assay" (ELISA) bestimmt.
Ein Konjugat aus Ratte G17 und Rinderserumalbumin (BSA) wurde auf
2 μg/ml
in 0,1 M Glycinpuffer (pH 9,5) gelöst und es wurden 25 μl pro Loch
in Immunulon U 96-Lochplatten (Dynatech Labs., Sussex, UK) gegeben.
Die Platten wurden über
Nacht bei 4 °C
inkubiert wonach nicht adsorbiertes Konjugat entfernt wurde und
die Platten wurden mit Puffer gewaschen (0,9 % Salzlösung, 0,5
% Tween-20 [Sigma], 0,02 % NaN3 [Sigma],
pH 7,3). Dieser Puffer wurde für
alle Waschschritte und Reagenzverdünnungen genutzt. Sera wurden
mit 10-fachen Verdünnungen
behandelt, beginnend bei einer Verdünnung von 1:100. Die Positivkontrolle
war Ratte Anti-Ratte
G17 (1-9)-DT Antiserum von vorher immunisierten Tieren und die Negativkontrolle
war normales Rattenserum und Serum von Ratten die nur mit DT immunisiert
wurden. Alle Kontrollseren wurden in den gleichen Verdünnungen
genutzt wie die Testseren. Die verdünnten Seren wurden in 25 μl Aliquots
in die Löcher
gegeben, entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 25 μl/Loch Ratten
G17-BSA bei 100 μg/ml
(als löslicher
Inhibitor). Die Grundkontrolllöcher
erhielten nur 25 μl.
Die Platten wurden für
60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert bevor sie mit dem Untersuchungspuffer gewaschen
wurden. Ziege Anti Ratte Immunoglobulin (H+L) (Zymed, San Francisco,
CA, USA) wurde in einer 1:500 Verdünnung zu den Platten gegeben,
50 μl/Loch,
und für
60 Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen
wurde Avidin-Alkalinphosphatase (Zymed) in einer 1:100 Verdünnung zugegeben
(50μl/Loch)
und die Platten wurden für
60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiterem Waschen wurde
p-Nitrophenylphosphatsubstrat (pNPP) (Sigma) zu den Platten gegeben
mit 50 μl/Loch
und nach einer 5-minütigen
Entwicklungszeit wurde die Absorption bei 405 nm gemessen. Der Unterschied
in der Absorption zwischen unbehandeltem Serum und Serum das mit
Ratten G17-BSA koninkubiert wurde, wurde als die spezifische Absorption
berechnet.
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Bestimmung der Anzahl
der weißen
Blutkörperchen
-
Heparinisiertes
Blut wurde während
des Experiments aus Schwanzblut und am Ende des Experiments durch
Punktur des Herzens gewonnen. Die Anzahl an weißen Blutkörperchen wurde von der Abteilung
für Hämatologie
des Universitätskrankenhauses
von Nottingham unter Benutzung eines FACScan analysiert.
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Histologie
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Nach
dem Töten
der Langzeit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten wurden repräsentative
Flächen des
Magens, des Darms und des Rektums der immunisierten Ratten und der
im Alter angeglichenen Kontrollen seziert und mit Formalin fixiert.
Die Stücke
wurden in Paraffin eingebettet und mit Hilfe eines Microtoms wurden Stücke von
4 μm geschnitten.
Diese wurden mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt
und durch einen Histopathologen bewertet, der kein Wissen über die
Behandlungsgruppen hatte.
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Vermehrung der Kryptazellen
-
Eine
Stunde vor dem Tod des Tieres wurde Vincristin (2mg/kg, Sigma) intraperitonal
injiziert, um einen Arrest in der Metaphase des Darmepitheliums
vor der Bestimmung der Vermehrung der Kryptazellen im Darm zu induzieren
(CCPR). Die Anzahl der Zellen in der Metaphase pro Krypte wurden
gezählt.
Der Darm und das Rektum wurden aus jeder Ratte entfernt, der Länge nach
geöffnet
und es wurde jeweils Schleimhaut in Carnoy Lösung fixiert. Die Krypten wurden
sanft, der Länge
nach unter einem Seziermikroskop zerdrückt und die Anzahl der Zellen
in der Metaphase wurde bestimmt (Vergrößerung × 25).
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Statistische Analyse
-
In vivo Ergebnisse wurden
durch einen Mann Whitney nicht-parametrischen Test unter Benutzung
des SPSS Statistik Pakets für
IBM PC analysiert.
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Langezeitstudien mit Anti-G17
(1-9)-DT
-
Es
wurden, wie oben beschrieben, fünf
männliche
Ratten mit Ratte Anti-G17 (1-9)-DT
immunisiert und es wurden über
einen Zeitraum von 34 Wochen, folgend auf eine einzelne Immunisierung,
ihre Antikörpertiter gemessen.
Zu diesem Zeitpunkt wurden die Ratten mit einer zweiten Injektion
von Ratten Anti-G17 (1-9)-DT aufgefrischt. Die Ergebnisse werden
in 1 gezeigt. 1 zeigt
den Zeitrahmen der Antikörpertiter
für bis zu
40 Wochen nach der Immunisierung von Ratten, die mit 500 μg/ml Ratten
Anti-G17 (1-9)-DT immunisiert wurden. Jeder Punkt zeigt ein einzelnes
Tier. Die Titer der Antikörper
wurden, wie oben beschrieben, mit einem Elisa Assay gemessen, indem
eine 1:100 Verdünnung
der Sera genutzt wurde. Immunisierungen werden durch den Pfeil angezeigt.
Nach der ersten Immunisierung reagierten vier der fünf Ratten
auf das Ratten Anti-G17
(1-9)-DT Immunogen. Antikörper
wurden, nach dieser einzelnen Injektion, in Woche 7 bei drei von
fünf Ratten
und bei 4 von fünf
Ratten in Woche 9 festgestellt. Auf diesen anfänglichen Anstieg der Antikörper folgte ein
zweiter Anstieg nach 15-20 Wochen, wonach der Antikörpertiter
stetig abnahm und in Woche 34 nahe Null war. Zu diesem Zeitpunkt
zeigt 1 auch, daß nach
einer zweiten Immunisierung mit Ratten Anti-G17 (1-9)-DT alle Ratten
messbare Anti-Ratten G17 Antikörpertiter
innerhalb von 1-2 Wochen nach der Immunisierung hatten.
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BEISPIEL 2
-
Histologische Langzeitanalyse
der mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten
-
Stücke des
Magens, des Darms und des Rektums wurden histologisch bestimmt,
nachdem sie, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt
wurden. Diese wurden mit Stücken
von in Alter und Geschlecht angeglichenen Kontrollratten verglichen.
Alle Teile des GI Trakts, die überprüft wurden,
waren bei den mit Anti-G17 (1-9)-DT
behandelten und den im Alter angeglichenen Kontrollen gleich, in
Hinblick auf die Länge
der Villae/Krypten/Schleimhaut-Höhe.
Im Magen waren die Anzahl und das Aussehen der Enterochromaffin-artigen
(ECL) Zellen in den beiden Tiergruppen gleich. Es gab jedoch einige
Hinweise auf Granulierung der G-Zellen in der Magenschleimhaut der
mit Anti-G17 (1-9)-DT behandelten Ratten.
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BEISPIEL 3
-
Rate der Vermehrung der
Kryptazellen (CCPR) des Darmepithels der mit Anti-G17 (1-9)-DT Langzeit-immunisierten
Ratten
-
Der
CCPR der Darmepithelzellen und die Antikörpertiter von Anti-Ratten G
17 wurden, wie oben beschrieben, analysiert. Tabelle 1 zeigt die
Ergebnisse, die von 4 von 5 Ratten erhalten wurden, indem CCPR mit
dem Anti-Ratten G17 Antikörpertiter
verglichen wird. Der durchschnittliche CCPR der Kontrollratten war 18,93
(Standardabweichung 3,2) und bei den mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten
Ratten 23,7 (Standardabweichung 7,9). Es gab keinen statistischen
Unterschied zwischen den mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten und
den im Alter angeglichenen Kontrollratten. Diese Ergebnisse zeigen,
daß die
Rate der Teilung der Kryptazellen im Darmepithel bei den Kontrollratten
und den mit Anti-G17 (1-9)-DT
immunisierten Ratten gleich ist.
-
Tabelle
1 Ein Vergleich der Antikörpertiter
von Anti-Ratten G17:DT mit der Vermehrung der Kryptazellen des Darms
-
-
BEISPIEL 4
-
Wirkung von Vor- und Nachzytotoxischer
Behandlung auf Antikörperwerte,
die von Ratte Anti-G17 (1-9)-DT erzeugt werden
-
Den
Ratten wurden 5-FU/Leucovorin mit 30 mg/kg im Verhältnis 1:1
intravenös,
wie in Beispiel 1 beschrieben, injiziert, entweder vor oder nach
der Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT. Jede Gruppe bestand aus 6 männliche
und 6 weiblichen Ratten pro Gruppe und die durchschnittlichen Antikörpertiter
wurden mit einer ELISA Technik gemessen, unter Verwendung einer
1:100 Verdünnung
von Serum. Die Antikörperlevel
jeder Ratte wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus Blutproben
bestimmt.
-
2 zeigt
die Wirkung von Prä-
und Postzytotoxischer Behandlung mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin Zyklen
auf die Antikörpertiter,
die durch die Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT (500 μg/ml) erzeugt
werden. In der Abbildung werden die Daten wie folgt repräsentiert:
-⎕- keine zytotoxischen Stoffe, 7 Immunisierungen; -
-
2 Immunisierungen vor 4 zytotoxischen Behandlungen; -O- 1 Immunisierung
vor 4 zytotoxischen Behandlungen, -Δ- 1 zytotoxische Behandlung
vor 4 Immunisierungen (2 zytoxische Behandlungen während der
Immunisierung); -⊠-
2 zytotoxische Behandlungen vor 4 Immunisierungen; -*- 3 zytotoxische
Behandlungen vor 3 Immunisierungen; und -
-
4 zytotoxische Behandlungen vor 2 Immunisierungen.
2 zeigt
den Durchschnitt von 6 weiblichen und 6 männlichen Ratten pro Gruppe.
Die Standardabweichung lag bei ungefähr 10 % des Durchschnitts.
Es gab durch die Vorbehandlung mit der zytotoxischen 5-FU/Leucovorin
Kombination keinen signifikanten Einfluß auf die Antikörpertiter
sowohl auf die erreichten Antikörperlevel
oder die Zeit die benötigt
wurde, um diese Level zu erreichen, verglichen mit unbehandelten,
mit Anti-G17 (1-9) DT immunisierten Ratten. Die maximale Anzahl
der Behandlungsszyklen die ausgewertet wurden lag bei 4 zytoxischen
Behandlungszyklen, gefolgt von 2 Immunisierungen.
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3 zeigt
den Effekt der Behandlung auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC)
bei BDIX Ratten.
-
Die
Wirkung der zytotoxischen Behandlung mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin
bei BDIX Ratten, die 4 zytotoxische Behandlungen vor 2 Immunisierungen
erhielten, auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen
(WBC) wird in 3 gezeigt. Wie in der Abbildung
gezeigt gab es eine signifikante Abnahme der WBC Menge bei den ausgewerteten,
repräsentativen
Ratten nach der zytotoxischen Behandlung (p < 0,005, Student T Test). Die Anzahl
wurde durch die Anzahl der zytotoxischen Behandlungen reduziert,
was auf Myelosuppression schließen
läßt. Es gab
jedoch keine Wirkung auf die Antikörperantwort der Ratten gegenüber dem
Anti-G17 (1-9)-DT, wie in 2 gezeigt
wird.
-
BEISPIEL 5
-
Effekt der Kombinationstherapie
von 5-FU, Leucocvorin und Anti-G17 (1-9)-DT auf das in vivo Wachstum
von DHDDK12 Tumoren
-
Die
Wirkung der kombinierten Therapien mit 5-FU/Leucovorin (12,5-30
mg/kg) und Ratten Anti-G17 (1-9)-DT (200 μg/ml) auf das Wachstum der Rattendarmkrebszellinie
DHDK12 in der Muskelschicht der Bauchdecke von BDIX Ratten wurde
durch den Vergleich mit Tumoren in Kontrolltieren getestet, wie
in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Am Ende der Therapie
wurden die Ratten getötet,
ihre Tumore entfernt und mit herkömmlichen Verfahren gewogen.
Jede Gruppe bestand aus 10-12 Ratten/Gruppe von gemischtem Geschlecht.
Die durchschnittlichen Gewichte der Tumore werden mit den interquartilen
Bereichen über
den Spalten gezeigt. Eine statistische Bestimmung wurde mittels
einem Mann Whitley U nicht-parametrischem Test, wie in Beispiel
1 beschreiben, durchgeführt.
-
Die 4 und 5 zeigen
die Wirkung der Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung auf die durchschnittlichen,
endgültigen
Gewichte der Tumore von BDIX Ratten, denen DHDK12 Tumorzellen in
die Muskelschicht der Bauchdecke eingepflanzt wurden. Dieser Weg
der Implantation führt
zu einem gut vaskulierten Tumor, der empfänglich gegenüber Therapien
ist, die in den Kreislauf eingebracht werden (Watson, 1996). Es
wurde früher
schon gezeigt, daß Ratten
Anti-G17 (1-9)-DT das endgültige
Gewicht eines DHDK12 Tumors um 56,6 % senkt, wenn es in einer Dosis
von 500 μg/ml
verabreicht wird (Watson, 1996). In den vorliegenden Versuchen wurde,
um alle Vorteile der Kombinationstherapie mit 5-FU/Leucovorin zu entdecken, die Anti-G17
(1-9)-DT Dosis auf 200 μg/ml
gesenkt, was zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums um
25,7 % führte, wie
in 4 gezeigt. 4 zeigt
Daten von Tumoren die aus unbehandelten Kontrollratten entfernt
wurden, von mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten und mit DT
immunisierten Ratten.
-
Nach
einem Zeitraum von 50 Tagen hatten die unbehandelten Ratten ein
durchschnittliches Tumorgewicht von 4,43 g. Eine Immunisierung mit
DT führte
zu einem Tumorgewicht von 4,7 g, was sich nicht signifikant vom
Tumorgewicht der unbehandelten Ratten unterschied, aber welches
signifikant größer war
als das durchschnittliche Tumorgewicht der mit Anti-G17 (1-9)-DT
immunisierten Ratten (3,49 g, p=0,034, Mann Whitney).
-
5 zeigt,
daß 5-FU/Leucovorin
allein, wenn es mit 30 mg/kg verabreicht wurde, das Tumorgewicht signifikant
auf einen Durchschnitt von 1,01 g senkt (p=0,0106 verglichen mit
unbehandelten Kontrollratten). Wenn die Ratten mit der selben zytotoxischen
Dosis 5-FU/Leucovorin zusammen mit einer Immunisierung mit DT behandelt
wurde, war das durchschnittliche Tumorgewicht nicht signifikant
verschieden (0,945 g).
-
Eine
Kombination von 5-FU/Leucovorin bei 30 mg/kg und einer Immunisierung
mit Ratten Anti-G17 (1-9)-DT ergab ein durchschnittliches Tumorgewicht
von 0,68 g, was sich nicht signifikant von der mit 5-FU/Leucovorin/DT
behandelten Gruppe unterschied (p=0,27). Die Kombination von 25
mg/kg 5-FU/Leucovorin und einer Immunisierung mit DT ergab ein durchschnittliches
Tumorgewicht von 0,96 g, was verglichen mit einem durchschnittlichen
Tumorgewicht von 0,68 g der Kombinationstherapiegruppe die mit Anti-G17 (1-9)-DT
Immunisierung in Verbindung mit 5-FU/Leucovorin behandelt wurde,
nicht signifikant war (p=0,409). Wenn die Dosis von 5-FU/Leucovorin
auf 20 mg/kg reduziert wurde, ergab die Kombination von 5-FU/Leucovorin/DT
Immunogen ein durchschnittliches Tumorgewicht von 1,23 g. Das durchschnittliche
Tumorgewicht wurde signifikant auf 0,71 g gesenkt wenn 20 mg/kg
5-FU/Leucovorin mit einer Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung kombiniert
wurde (p=0,027, Mann Whitney).
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Letztendlich
zeigt 5 auch, daß eine
Dosis von 5-FU/Leucovorin von 12,5 mg/kg kombiniert mit einer Anti-G17
(1-9)-DT Immunisierung (p=0,015, Mann Whitney) das durchschnittliche
Tumorgewicht von 1,34 g auf 0,41 g reduziert. Es wurden 5-FU/Leucovorin/Anti-G17
(1-9)-DT Kombinationen verglichen und es gab keinen statistisch
signifikanten Unterschied zwischen Anti-G17 (1-9)-DT das in Kombination
mit entweder 12,5, 20 oder 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin verabreicht
wurde. Aufgrund des begrenzten Nutzen der für die Kombinationschemotherapie
mit 5-FU/Leucovorin sowohl bei fortgeschrittenem Krebsstadium und
insbesondere in Szenarien mit einer Hilfsstoffstherapiebehandlung
(Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993; Petrioli, 1995)
kann es sein, daß neue
therapeutische Modalitäten
angewendet werden müssen,
entweder in Verbindung mit 5-FU/Leucovorin um den therapeutischen
Index zu erhöhen
(und möglicherweise
die chemotherapeutische Dosis zu senken um die Toxizität zu begrenzen)
oder als zweiter Behandlungsweg falls die Chemotherapie nicht wirksam
ist. Deshalb müssen neue
Behandlungen für
eine solche Anwendung erweitert werden. Immunotherapeutische Ansätze in Verbindung
mit Chemotherapie wurden bisher als problematisch angesehen, aufgrund
der mit chemotherapeutischen Mitteln in Verbindung gebrachten Myelosuppression,
wie z.B jene die bei 5-FU/Leucovorin beobachtet wird (Mahood, 1991).
In der vorliegenden Studie jedoch beeinflußt die Myelosuppresion der
Ratten, die durch 5-FU/Leucovorin Kombinationen von 30 mg/kg, verabreicht
gemäß Asao et
al. mit der maximal tolerierten Dosis, induziert wurde, die Menge
und die Zeit, die benötigt
wurde um Anti-Ratten G17:DT Antikörpertiter nach der Immunisierung
mit dem Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen zu erreichen, nicht.
-
Bei
Therapiestudien, bei denen 5-FU/Leucovorin in Kombination mit Anti-G17
(1-9)-DT benutzt
wurde, wurde eine Verstärkung
der 20 mg/kg und 12,5 mg/kg Dosierungen erreicht. Die 20 mg/kg war
so effektiv wie die maximal tolerierte Dosis, wenn sie mit Anti-G17 (1-9)-DT kombiniert
wurde und die 12,5 mg/kg Dosis zeigt einen Trend zu einem besseren
therapeutischen Effekt. Der Grund für letzteren Trend ist nicht
bekannt, es kann aber sein, daß die
zytotoxische Dosis das Immunsystem weniger beeinflußt als höhere Dosen,
was bei der allgemeinen Entzündungsantwort
gegen den Tumor helfen kann. 5-FU/Leucovorin, das in kontinuierlichen Abständen verabreicht
wird scheint einen "Alles
oder Nichts" Effekt
auf das Wachstum des Tumors zu haben, da ein Absenken der Dosis
auf 1 mg/kg keine Hemmung auf das Wachstum des Tumors zur Folge
hatte. Der therapeutische Effekt kann dann genauer eingestellt,
indem die Anzahl an toxischen Zyklen reduziert wird (Watson, persönliches
Gespräch).
Deswegen können
in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung niedrigere Dosen
als üblich
von 5-FU/Leucovorin verabreicht werden, um so die Nebenwirkungen
der Medikamente zu reduzieren, während
gleichzeitig eine wirksame Abtötung
der Tumorzellen durch Benutzung der vorliegenden Kombination erreicht
werden kann, da das Immunsystem nur minimal beeinflußt wird.
Deshalb wird der das Wachstum hemmende Effekt der Anti-G17 (1-9)-DT
Immunisierung verstärkt.
Diese Charakteristika der Kombinationstherapie sind unerwartet und überraschend,
im Hinblick auf die myelosuppressiven Effekte der chemotherapeutischen
Mittel selbst.
-
Weiterhin
ist die Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung aufgrund des Fehlens negativer
Effekte auf den Patienten wahrscheinlich eine Langzeitbehandlung,
wie durch die Länge
der Zeit gezeigt wird, nach der meßbare Antikörperlevel in Ratten waren die
eine einzelne Immunisierung erhielten. Die erste Immunisierung war
zu 80 % effektiv, im Hinblick auf die Anti-Gastrin Antikörperinduktion
und nach einer zweiten Immunisierung zu 100 % effektiv, gemeinsam
mit einem sofortigen Anstieg der Antikörperlevel. Obwohl eine Verstärkung der
Chemotherapie durch eine einzelne Anti-G17 (1-9)-DT Injektion ereicht
werden kann, zeigen die Abwesenheit von Nebenwirkungen bei den meisten
Patienten, die Charakteristik einer Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung
und die Antwortrate der Patienten nach Auffrischungen, daß eine mehrfache
Injektionskur wünschenswert
sein kann. Trotz der Länge
der Zeit in der die Anti-Ratten G17 Antikörper im Kreislauf blieben scheinen
keine negativen Langzeitwirkungen auf den GI Trakt aufzutreten,
wie durch eine einfache histologische Überprüfung bestimmt werden konnte.
Zusätzlich
zeigte der Index des Kryptazellenwachstums der Schleimhautzellen
des Darms keine signifikanten Einfluss auf ihr Wachstum.
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BEISPIEL 6
-
Behandlung von menschlichen
Patienten mit Darmkrebs mit einer Kombinationstherapie von 5-FU/Leucovorin und
Anti-G17 (1-9)-DT
-
Es
wurde bereits früher
gezeigt, daß eine
Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT eine wertvolle und sichere therapeutische
Alternative bei der Behandlung Gastrin-abhängiger Tumore ist. Die vorliegenden
Kombinationen von Anti-G17 Immunogenen mit 5-FU/Leucovorin verstärken die Wirksamkeit der Krebsbehandlung, insbesondere
der Behandlung von Darmkrebs und die mögliche Verringerung bei der
Dosierung der chemotherapeutischen Mittel, welche aufgrund der Kombination
nötig ist,
sollte die schädlichen
zytotoxischen Nebenwirkungen jedes momentan verwendeten chemotherapeutischen
Mittels reduzieren. Die vorliegenden Kombinationen eines Immunogens
mit chemotherapeutischen Mitteln kann auch als zweite Therapie bei
Patienten eingesetzt werden, die nicht auf die Chemotherapie alleine
reagieren.
-
Menschliche
Patienten mit kolorektalen Tumoren oder Darmkrebs werden mit einer
Kombination aus Chemotherapie und Immunotherapie behandelt.
-
Insbesondere
können
Patienten mit auf Gastrin reagierenden kolorektalen Tumoren oder
Darmkrebs mit der gleichzeitigen Gabe von 5-FU/Leucovorin und einer
Anti-G17 Immunogenzusammensetzung oder Anti-G17 Antikörpern behandelt
werden.
-
Genauer
gesagt stellt die bevorzugte Immunotherapie eine immunogene Zusammensetzung
bereit, die ein aminoterminales G17 (1-9) Peptid: DT Konjugat in
einem pharmazeutisch akzeptablem Trägerstoff umfaßt, welcher
einen Hilfsstoff enthalten kann, der die Immunantwort weiter anregt.
-
Der
bevorzugte immunotherapeutische Zeitplan kann vor, während oder
nach der Chemotherapie beginnen, abhängig von klinischen Aspekten.
So kann es zum Beispiel bei einem Patienten mit einer großen Tumorbelastung
vorteilhaft sein, mit einigen Chemotherapiezyklen zu beginnen, um
die Tumormenge zu reduzieren und dann mit der Immunotherapie zu
beginnen.
-
Andererseits
kann die Immunotherapie bei einem Patienten mit geringer Tumorbelastung
oder nach heilender Chirurgie vor oder während der Chemotherapie begonnen
werden.
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Die
aktive Immunisierungsdosis kann zwischen 300 μg bis zu 1200 μg des Anti-G17
Immunogens liegen, abhängig
vom Immunstatus des Patienten (oder der Kapazität der Immunantwort). Die Injektionsintervalle können an
den Tagen 1, 7 und 14 oder an den Tagen 1, 14 und 21 oder an den
Tagen 1, 14, dann 28 und 56 liegen. Alle Zeitplane können die
gleichen Antikörpertiter
zur Folge haben. Die beschleunigten Zeitpläne für die Immunisierung liefern
die Möglichkeit
für das
frühre
Auftreten der Immunantwort.
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Das
bevorzugte Verfahren für
die Anti-Gastrin Therapie setzt voraus, daß alle 6 Monate nach der anfänglichen
Immunisierungsperiode eine Auffrischung verabreicht wird, unabhängig davon
welches Protokoll verwendet wird.
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Ein
weiteres bevorzugtes Verfahren für
die effektive Neutralisierung von G17, Gly-G17 und G17NH2 stellt
eine passive Immunisierung mit Anti-G17 Antikörpern bereit, vorzugsweise
in gereinigter Form. Genauer wird eine Impfung von 10-1000 μg Anti-G17
(1-9) Antikörpern vor,
während
oder nach den Chemotherapiezyklen verabreicht, um die Gastrinaktivitäten zu kontrollieren.
Die passive Immunisierung kann täglich,
wöchentlich
oder alle zwei Wochen verabreicht werden. Andere Protokolle können befolgt
werden, abhängig
von der Wirksamkeit der Behandlung.
-
Eine
weitere Kombination der Behandlungen liefert eine anfängliche
passive Immunisierung vor und/oder während des ersten Zyklus der
Chemotherapie, gefolgt von einer aktiven Immunisierung wie oben beschrieben.
-
Es
gibt viele verwendete Chemotherapiekuren. Diese auf diesem Gebiet
anerkannte Kuren werden, obwohl sie hier nicht beschrieben werden,
nicht von der Kombinationsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung
ausgeschlossen. Eine bevorzugte Chemotherapiekur liefert 425 mg/m2 5-FU i.v. Bolus mit einer i.v. Infusion
von Leucovorin (Folsäure,
FA, 20 mg/m2) für 1-5 Tage für einen
Zeitraum von bis zu 4 Wochen.
-
Ein
weitere bevorzugte Kur liefert 200 mg/m2 FA über einen
Zeitraum von 2 Studenen, gefolgt von 5-FU i.v. Bolus von 400 mg/m2 + 5-FU von 600 mg/m2 über 22 Stunden
1 oder 2 Tage in einem Zeitraum von 2 Wochen.
-
Noch
eine weitere bevorzugte Kur liefert eine kontinuierliche Infusion
von 5-FU von 250-300 mg/m2 pro Tag kontinuierlich
i.v. für
4-6 Wochen gefolgt von 2 Wochen Pause.
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