DE69924483T2

DE69924483T2 - Kombinationstherapie zur behandlung von tumoren

Info

Publication number: DE69924483T2
Application number: DE69924483T
Authority: DE
Inventors: C. Philip GEVAS; Stephen Grimes; L. Stephen KARR; A. Susan WATSON; Dov Michaeli
Original assignee: Aphton Corp
Current assignee: Receptor Biologix Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2019-05-15
Also published as: PT1076561E; HUP0101947A3; PL344414A1; HK1032360A1; DK1076561T3; WO1999059628A3; CN1303288A; HUP0101947A2; CN1216605C; KR100699574B1; AU3904599A; JP2002515457A; CA2327439A1; PL193109B1; EP1076561A2; WO1999059628A2; DE69924483D1; KR20010052355A; ES2237103T3; EP1076561B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf eine Tumortherapie zur Hemmung des Wachstums durch immunologische Neutralisierung, der das Wachstum stimulierenden Hormone in Verbindung mit einer Chemotherapie, bei welcher ein 5-Fluorouacilderivat und Leucovorin genutzt wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gastrin ist ein Peptidhormon, welches in 2 vollentwickelten Formen vorliegt, Tetratriacontagastrin (G34) und Heptadecagastrin (G17) und wird durch spezialisierte Zellen, die G-Zellen, synthetisiert und sekretiert, welche sich im Magenantrum befinden. Bei Gastrin produzierenden Zellen werden diese Gastrinhormone posttranslational aus einem gemeinsamen Vorläufermolekül hergestellt, welches "Preprogastrin" genannt wird und ein Signalpeptid enthält. Das Signalpeptid "Pre" wird im endoplasmatischen Retikulum der Zellen entfernt, was zu einem "Progastrin" Peptid führt, welches danach weiter in der Zelle prozessiert wird, um die fertigen Gastrine G34 und G17 zu bilden, vor der Sekretion in den Blutstrom (Dickinson 1991). (Die vollständigen Zitate für die hier zitierten Referenzen werden im Referenzteil angegeben der den Ansprüchen vorausgeht). Beide vollentwickelten Formen von G34 und G17 werden an ihrem Carboxy-terminalem Ende (-NH₂) amidiert. Beim Menschen wurden aufgrund von differentiellem Prozessieren des Vorläufermoleküls mehrere Formen von G17 gefunden, von denen jede verschiedene biologische Aktivitäten haben kann (Dickinson 1995 und Ciccotosto et al. 1995). Beim posttranslationalen Prozessieren von Gastrin ist es die "vollentwickelte" Carboxy-amidierte Form, welche an einen spezifischen Zellrezeptor, den sogenannten CCK-B/Gastrin Rezeptor, via des Carboxyterminus des Peptids bindet. (Kopin et al. 1992).
Die Gastrinhormone werden in das zirkulierende Blut sekretiert und binden an bestimmte Zellen im Magen, und zwar Enterochromaffin-artige (ECL) Zellen und parietale Zellen, die indirekt oder direkt den Ausstoß an Magensäure beeinflussen. Historisch gesehen wurden beide Gastrinhormone mit der Stimulation der Sekretion der Magensäure in Verbindung gebracht (Edkins, J.S. 1905). In den letzten Jahren sammelten sich Beweise, die zeigten, daß Gastrin auch als trophischer Faktor im Gastrointestinaltrakt wirkt (Johnson, L. 1992) und daß es das Wachstum von gastrointestinalem Krebs (Watson et al. 1989, Dickinson, C.J. 1995), so wie von nicht-gastrointestinalem Krebs, einschließlich kleinen Karzinomen der Lunge, (Rehfeld et al. 1989) fördert.
Verschiedene Arten von Tumoren, einschließlich kolorektalen, Magen-, pankreatischen und heptazellulären Adenocarcinoma, besitzen CCK-B/Gastrin Rezeptoren in ihren Plasmamembran und die Tumorzellen reagieren auf Gastrin mit starker zellulärer Proliferation (Rehfeld, J.F., 1972, Upp et al. 1989 und Watson et al. 1993) Ansteigende Plasmawerte der Gesamtmenge von Gastrin finden bei Patienten mit kolorektalem Krebs statt und insbesondere erhöhte Werte des Hormonvorläufers Progastrin wurden, durch die Benutzung von Gastrin-Antisera, bei vielen kolorektalen Tumoren entdeckt (Ciccotosto et al. 1995). Vor kurzem wurde entdeckt, daß viele dieser Krebszellen auch Gastrin sekretieren und so einen autonomen Signalweg zur Proliferation in Gamg setzen. (Van-Solinge et al. 1993, Nemeth et al. 1993 und Seva et al. 1994). Die Peptidhormone G17 und G34 binden an die CCK-B/Gastrin Rezeptoren an den Zellmembranen normaler Zellen. Jedoch wurde entdeckt, daß G17, aber nicht G34, das Wachstum von Gastrin-abhängigen Krebszellen stimuliert. Insbesondere Serum-assoziertes G17 hat das Potential, das Wachstum von kolorektalen Tumoren in Endocrin-abhängiger Art und Weise zu stimulieren, abhängig von den CCK-B/Gastrin Rezeptoren von Tumorzellen (Watson et al. 1993). G17 ist besonders darin verwickelt, das Wachstum von kolorektalen Adenocarcinomas zu stimulieren, aufgrund einer möglichen Steigerung der Affinität der CCK-B/Gastrin Rezeptoren zu den Tumorzellen, verglichen mit den anderen Gastinhormonarten (Rehfeld 1972 und Van Solinge et al. 1993). Es wurde entdeckt, daß die CCK-B/Gastrin Rezeptoren in einer hoch affinen Form bei 56,7 % der primären, humanen, koloraktalen Tumore exprimiert waren (Upp et al. 1989).
Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß, zusätzlich zur Fähigkeit auf exogenenes, endokrines Gastrin zu reagieren, humane gastrische und kolorektale Tumore Gastrin und seine Vorläufer produzieren (Ciccotosto et al. 1995; Finley et al. 1993; Kochmann et al. 1992; Nemeth et al. 1993; Van Solinge et al. 1993), um so einen autokrinen Wachstumsstimulationsignalweg in Gang zu setzen. Die Gastrinproduktion von Tumorzellen unterscheidet sich von der in endokrinen G Zellen. Insbesondere enthalten diese Tumorzellen eine hohe Konzentration des Vorläufers Progastrin, zusammen mit einer niedrigeren Konzentration von vollentwickelten Peptiden. Es wird postuliert, daß dieses abnormale Verhältnis aufgrund der konstitutiv unregulierten Abgabe von Gastrin, zusammen mit einer limitierten Aktivität der Peptidylglycin-α-amidierenden Monooxygenase zustande kommt (Ciccotosto et al. 1995; Kelly 1998) Deshalb führt die unregulierte Abgabe von Gastrin zu einer abnormalen Produktion und Sekretion von verschiedenen molekularen Formen des Hormons. Insbesondere Koloncarcinomazellen prozessieren Progastrin nicht effizient, was zu weniger Umwandlung des Vorläufergastrins zu vollentwickelten Peptiden führt und sie produzieren so unfertige oder anormale Gastrine (Dickinson 1995 und Rehfeld et al. 1993). Zusätzlich wird der erhöhte Gastrinlevel bei kolorektalen Tumoren, zumindest teilweise, einer aberranten Expression des Gastringens in kolorektalen Tumorzellen zugeschrieben (Hoosein et al. 1990; Baldwin et al. 1992 und Finley et al. 1993). Gastrin-ähnliche Peptide wurden in solchen Zellen identifiziert (Hoosein et al. 1988; Watson et al. 1991 und Finley et al. 1993) und wurden als Vorläufer Gastrinformen bestätigt (Van Solinge et al. 1993 und Nemeth et al. 1993).
Die Anwesenheit von amidiertem G17 (G17-NH₂) in einigen kolorektalen Krebsformen (Ciccotosto et al. 1995; Van Solinge et al. 1993) zeigt, daß einige Tumore einen inktakten Prozessierungssignalweg beibehalten, da eine Amidierung von Gastrin nur in den sekretorischen Körnchen stattfindet (Varro et al. 1994). Endogen produziertes Gastrin wirkt auch als autokriner Wachstumsfaktor, da gezeigt wurde, daß das basale Wachstum einer kolorektalen Zelllinie durch einen Anti-Gastrin Anitkörper gehemmt wurde (Hoosein et al. 1988). Dies wurde in einer zweiten Studie bestätigt, bei welcher eine Northern Blot Analyse Gastrin mRNA in der gleichen Zelllinie zeigte und durch ein Radioimmunoassay Gastrinähnliche Immunoreaktivität im Überstand der Zellkultur nachgewiesen wurde (Hoosein et al. 1990). Gastrinpeptide besitzen auch parakrine Funktionen (Watson et al. 1991 b) was in Experimenten bestätigt wurde (Finley et al. 1993), die zeigten, daß die Immunoreaktivität von Gastrin in Subpopulationen maligner, kolorektaler Mucosalzellen vorherrschender war.
Wenn G17 an seinen Rezeptor bindet wird ein G17/Rezeptorkomplex gebildet, welcher das Zellwachstum, durch sekundäre Botenstoffe zur Regulierung der Zellfunktion, stimuliert (Yamada et al. 1993). Die Bindung von G17 an den CCK-B/Gastrinrezeptor führt zu einer Aktivierung des Phosphatidylinositolabbaus, der Proteinkinase C Aktivierung mit einem daraus folgenden Anstieg der intrazellulären Kalziumionenkonzentration und der Induktion von c-fos und c-jun Protooncogenen via der, durch Mitogen aktivierten, Proteinkinase, die mit Regulation der Zellproliferation in Verbindung gebracht wurde (Todisco et al. 1993). Zusätzlich wurde die Bindung von Gastrin an den CCK-B/Gastrin Rezeptor mit dem nachfolgenden Anstieg der Phosphorilierung durch eine Tyrosinkinase in Verbindung gebracht, der pp125FADK (focal adhesion kinase), die auch eine Rolle bei der Übertragung von mitogenen Signalen spielen könnte (Taniguchi et al. 1994).
Kolorektaler Krebs bleibt eine schwer zu behandelnde Krankheit, da in den letzten Jahren nur geringe Fortschritte im Hinblick auf die Überlebenschance erreicht wurden. Eine Operation ist eine wirksame Behandlung der primären Erkrankung aber unwirksam gegenüber verbleibenden okkulten Erkrankungen, die häufig auftreten. Eine nach der Operation durchgeführte Strahlungstherapie wird für Patienten mit rektalem Krebs üblicherweise empfohlen, um die Risiken eines erneuten Auftretens der Krankheit zu reduzieren. Chemotherapie mit 5-Fluorouracil (5-FU) war die üblicherweise effektivste Therapie nach der Operation bei Patienten mit weiter fortgeschrittenem kolorektalem Krebs. Jedoch wurde gezeigt, daß die 5-FU Therapie nur einen geringen Nutzen für den Patienten aufweist, da 5-FU hoch toxisch ist und die Therapie ist kostspielig und scheint, weder alleine, noch in Kombination mit anderen zytotoxischen Medikamenten, das Überleben signifikant zu verlängern. In den meisten Fällen regieren okkulte oder inoperable kolorektale Tumore nicht gut auf Chemotherapie oder Bestrahlung und es werden neue Behandlungen benötigt, um die vorhandenen Verfahren zu ergänzen.
Kürzlich haben einige Studien gezeigt, daß eine adjuvante Kombinationschemotherapie mit 5-FU und Leucovorin die Wirksamkeit von 5-FU bei Patienten mit weiter fortgeschrittenem kolorektalem Krebs erhöht. Leucovorin ist ein Derivat der Folsäure, auch bekannt als folinische Säure, Citrovorumfaktor oder 5-Formyl-5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure. Die Studien zeigen, daß bei Patienten der Duke Stufe C eine 5-FU/Leucovorin Kombinationstherapie die Mortalität um 10 bis 15 % senken kann (Moertel 1994). Bei der gleichen Patientengruppe führte eine kombinierte intravenöse und intraperitonale Therapie mit 5-FU/Leucovorin zu einem nicht signifikanten Trend hin zu krankheitsfreiem Überleben und einem allgemeinen Überlebensvorteil (Scheithauer et al. 1995). Bei fortgeschrittener Krankheit kann die gleiche Kombination der Medikamente einen Überlebensvorteil zur Folge haben (Taylor 1993) wo gezeigt wurde, daß es einen Mittelwert von 13,5 Monaten Überleben in der Kombinationsgruppe gab, verglichen mit 7,5 Monaten bei mit 5-FU behandelten Patienten (Petrioli et al. 1995). Jedoch ist diese Kombinationstherapie nicht ohne eine signifikante Morbidität und führt zu schädlichen Nebenwirkungen einschließlich Stomatitis, Diarrhö und Myelosuppression (Mahood et al. 1991; Erlichman et al. 1988, Pietnelli et al. 1989), was die Lebensqualität zu einem Thema macht, insbesondere bei Patienten mit fortgeschrittener Krankheit.
Eine Anzahl von CCK-B/Gastrin Rezeptorantagonisten mit hoher Affinität wurde therapeutisch sowohl in vitro als auch in vivo bei einer Anzahl experimenteller gastrointestinaler Krebsformen bewertet. Zum Beispiel wurde bei Proglumid, einem Glutaminsäurederivat (Seva et al. 1990, Harrison et al. 1990 und Watson et al. 1991 a), Benzotript, einem N-Acylderivat von Tryptophan, L-365.260, einem Derivat von Aspercillin (Bock et al. 1989) und CI-988, einem Molekül, welches die C-terminale Pentapeptidsequenz von CCK nachahmt (Hughes et al. 1990) gezeigt, daß sie die Effekte von exogenem Gastrin auf das Wachstum gastrointestinaler Tumore sowohl in vitro als auch in vivo effektiv neutralisieren (Watson et al. 1991b und Romani et al. 1994). Jedoch haben diese Antagonisten schwerwiegende toxische Nebenwirkungen und es fehlt ihnen an Spezifität, da sie die Wirkung aller potentiellen Liganden des Rezeptors wie G34 und CCK bei normalen Zellen blockieren. Jüngst wurden auch hoch wirksame und selektive CCK-B/Gastrin Rezeptorantagonisten wie YM022 (Yuki et al. 1997) und YF476 (Takinami et al. 1997) beschrieben.
Proglumid und Benzotript wurden umfangreich in vorklinischen Studien bewertet. Das Hauptproblem mit diesen Verbindungen besteht in ihrer mangelhaften Wirksamkeit, wobei relativ hohe Konzentrationen benötigt werden um G17 zu ersetzen (Watson et al. 1992a; Watson et al. 1992b). Davon unabhängig hemmten Proglumid und Benzotript das basale und die durch Gastrin stimulierte Prolifration in einer Anzahl von Zelllinien (Seva et al. 1990; Watson et al. 1991 a). Zusätzlich steigerte Proglumid das Überleben von xenograften Mäusen, die den Gastrin-empfindlichen Mauskolontumor MC26 tragen auf 39 Tage bei behandelten Tieren, von 25 Tagen bei den Kontrolltieren.
Aufgrund der niedrigen Spezifität dieser Klasse von Gastrin entgegen wirkenden Mitteln für den Gastrin/CCK-B Rezeptor wird auch vermutet, daß die Hemmung des Wachstums auch durch eine vom Gastrin-Rezeptor unabhängige Funktion induziert wird. Weiterhin binden die zellulären Rezeptoren, die das Gastrin erkennen und binden, nicht an alle getesteten Inhibitoren (Seva et al. 1994). Deshalb kann es, wenn eine vollständige Hemmung der Gastrinbindung am Rezeptor nicht in der autokrinen Wachstumskaskade stattfindet, sein, daß der Gastrinantagonist nicht dazu in der Lage ist, diesen Mechanismus der Förderung des Tumorwachstums zu blockieren.
Deshalb werden neuartige therapeutische Ansätze benötigt sowohl als eigenständige Modalitäten und in Kombinationsstrategien mit Chemotherapie. Kombinierte Behandlungen erlauben die Möglichkeiten, den therapeutischen Index zu erhöhen und/oder die Dosen der benötigten Chemotherapie zu senken, und somit die schädlichen Nebenwirkungen zu begrenzen.
Ein therapeutisches Verfahren um selektiv immunologisch die biologische Aktivität des Gastrinhormons zu neutralisieren würde eine effektive Möglichkeit zur Verfügung stellen, die pathologischen Veränderungen die aus einer exzessiven Produktion von Gastrinhormon resultieren, was mit kolorektalem Krebs in Verbindung gebracht wird, zu kontrollieren oder zu verhindern.
Die gleichzeitig verleihenen U.S. Patente Nr. 5,023,077; 5,468,494; 5,607,676; 5,609,870 und 5,622,702 offenbaren immunogene Stoffe und immunogene Zusammensetzungen, die für Kontrolle der G17 und G34 Level bei einem Patienten nützlich sind, indem sie Anti-Gastrin Antikörper erzeugen und sie offenbaren weiterhin die Anwendung solcher Zusammensetzungen bei der Behandlung von gastrischen und duodenalen Geschwüren und bei durch Gastrin induziertem Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der anti-G17 immunogenen Stoffe und immunogenen Zusammensetzungen die in den Patenten Nr. 5,023,077; 5,468,494; 5,607,676; 5,609,870 und 5,622,702 offenbart werden in der Anwendung für eine Kombinationstherapie mit chemotherapeutischen Mitteln, zur Behandlung eines von Gastrin abhängigen kolorektalen Krebs.
Das Verfahren zur Krebstherapie das hier beschrieben wird, hat einige Vorteile gegenüber den bisherigen Behandlungsmethoden für Krebs. Die Immunisierung mit Anti-G17, in Kombination mit chemotherapeutischen Mitteln wie 5-FU und Leucovorin steigert den therapeutischen Effekt bei der Kontrolle und der Hemmung des Wachstums des kolorektalen Tumors gegenüber der Chemotherapie alleine.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Kombinationstherapie zur Behandlung von Tumoren bereit, die das immunologische Neutralisieren von Peptidhormonen sowie von Faktoren, die die Teilung von Tumorzellen fördern, umfasst, in Kombination mit einer Chemotherapie. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung Gastrin-abhängiger Krebsformen, wie kolorektaler Adenokarzinome. Das Verfahren umfasst eine Kombinationstherapie, die die Immunisierung des Patienten, der die Therapie benötigt, mit Anti-G17 umfasst, in Verknüpfung mit der Gabe von einem oder mehrerer chemotherapeutischer Mittel. Die Anti-G17 Immunisierung zur Behandlung Gastrinabhängiger Tumore ist erstaunlich wirksam bei der Bildung von Anti-G17 Antikörpern, unabhängig von den bekannten myelo-suppresiven Effekten der verwendeten chemotherapeutischen Mittel.
Die Anti-G17 Immunisierung umfasst die aktive oder passive Immunisierung eines Patienten mit einem Anti-G17 Immunogen, gegen das Hormon G17 um die G17 Level des Patienten zu kontrollieren. Als Ergebnis der Induktion der von Anti-G17 Antikörper im Patienten ist das G17 Hormon in vivo neutralisiert und seine physiologischen Effekte werden inhibiert, um so das G17-abhängige Tumorzellwachstum zu hemmen.
Weiterhin steigert die Benutzung der Anti-G17 Immunisierung in Kombination mit herkömmlicher Chemotherapie die Wirksamkeit der Behandlung für kolorektalen Krebs, da in der Kombination geringere Mengen der chemotherapeutischen Mittel notwendig sein können, um den Patienten zu behandeln, so wird ihr toxischer Effekt auf normales Gewebe vermindert. Zusätzlich kann die Lebensqualität des Patienten verbessert werden und seine Überlebenszeit verlängert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die aktive Immunisierung eines Säugers, der einen Gastrin-abhängigen Tumor aufweist, mit einem Anti-G17 Immunogen, in Kombination mit der Verabreichung einer oder mehrer chemotherapeutischer Substanzen, wie 5-Fluorouacil, Leucovorin, Levamisol, Cisplatin, Tumor-Nekrosis-Faktor und Proglumid. Das Anti-G17 Immunogen kann einem Patienten zu Beginn der Therapie und zu darauf folgenden Intervallen verabreicht werden, so wie vom Patienten benötigt. Die Anti-G17 Antikörper, die der Patient nach der Immunisierung bildet, binden und neutralisieren G17 in seiner vollentwickelten, amidierten G17-Form, genauso wie in seinen Vorläuferformen, z.B. G17-Gly, in vivo und verhindern die Bindung von G17 an seine Rezeptoren und verhindern so das Wachstum von Gastrin-abhängigen Tumorzellen. Die Titer der Anti-G17 Antikörper die ein immunisierter Patient bildet, können in vorbestimmten Intervallen mit herkömmlichen Techniken überprüft werden. Zusätzlich können chemotherapeutische Mittel, wie von herkömmlichen Zeitplänen bestimmt, oder niedrigen Dosen, wie vom Patienten benötigt, verabreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines Gastrin-abhängigen Tumors bereit, welches die passive Immunisierung eines Patienten, der einen Gastrin-abhängigen Tumor hat, mit Anti-G17 Antikörpern, in Kombination mit der Verabreichung einer oder mehrer chemotherapeutischer Substanzen, wie 5-Fluorouacil, Leucovorin, Levamisol, Cisplatin, Tumor-Nekrosis-Faktor und Proglumid, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung können die Antikörper chimär, humanisiert oder humane monoklonale Antikörper sein, die nach Verfahren die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, hergestellt wurden. Die Antikörper können zusammen mit den chemotherapeutischen Mitteln zu Beginn der Therapie und zu darauf folgenden Intervallen verabreicht werden, so wie vom Patienten benötigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Graphen, der die Zeitskala der Serumantikörpertiter nach der Immunisierung von Ratten zeigt, die mit 500 μg/ml Ratten Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen immunisiert wurden.
2 zeigt einen Graphen, der die Wirkung einer 30 mg/kg Dosis 5-FU/Leucovorin-Behandlung auf die Anti-G17 (1-9) Antikörpertiter von Ratten zeigt, die mit dem Immunogen der Erfindung immunisiert wurden.
3 zeigt einen Scatchard Plot, der die Wirkung der Behandlungszyklen mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen zeigt, die bei BDIX Ratten gezählt wurden
4 zeigt eine Balkengraphik, die das durchschnittliche Gewicht eines Tumors bei unbehandelten, mit Anti-G17 (1-9)-DT behandelten und mit DT behandelten Ratten zeigt.
5 zeigt eine Balkengraphik, die das durchschnittliche Gewicht eines Tumors bei mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin; 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen; 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT; 25 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen; 25 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT; 20 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen; 20 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT; 12,5 mg/kg 5-FU/Leucovorin und DT Immunogen und mit 12,5 mg/kg 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT behandelten Ratten zeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren bereit, insbesondere jenen, die mit Gastrin-abhängigem kolorektalem Krebs in Verbindung gebracht werden, wobei der Patient im Rahmen einer Kombinationstherapie behandelt wird, die die Immunisierung des Patienten mit einem Anti-G17 Immunogen und der Behandlung des Patienten mit chemotherapeutischen Mitteln, wie 5-FU und Leucovorin, umfasst. Die Kombinationstherapie aus Anti-G17 Immunisierung und 5-FU/Leucovorin war überraschenderweise wirksamer als frühere Behandlungsmethoden für kolorektalen Krebs. Die chemotherapeutischen Mittel, die im Rahmen der Kombinationstherapie geeignet sind, hemmen die Produktion der G17 Antikörper bei einem immunisierten Patienten nicht maßgeblich und es ist möglich geringere Dosen eines chemotherapeutischen Mittels zur Behandlung des Tumorwachstums zu nutzen. Zusätzlich sind die Anti-G17 Antikörpertiter, die durch die Immunisierung produziert werden, geeignet alle Formen des G-17 Hormons zu neutralisieren. Eine Anti-G17 Immunisierung kann auch vor einer operativen Behandlung eines Tumors an einem Patienten durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die aktive Immunisierung eines Patienten, der an Gastrin-abhängigem kolorektalem Krebs leidet, indem eine Anti-G17 Immunogenzusammensetzung in Verbindung der Anwendung chemotherapeutischer Mittel verabreicht wird. Nachfolgende Anti-G17 Immunisierungen zur Auffrischung können, wie vom Patienten benötigt verabreicht werden, was durch eine Analyse des Anti-G17 Antikörpertiters im Serum, nach der Immunisierung durch Standardverfahren und herkömmliche radiologische Beurteilung der Tumore bestimmt wird.
Die Anti-G17 Immunogene umfassen natürliche oder synthetische Peptidfragmente von N-Terminalen Aminosäuren von G-17 als immunomimischen Teil des Immunogens. Dieser Peptidteil wird an einen immunogenischen Träger, wie das Diphtherietoxoid (DT) konjugiert. In einer bevorzugten Ausprägungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Anti-G17 Immunogen die aminoterminalen Aminosäuren von G-17 der Positionen 1 bis 9, an das Diphtherietoxin konjugiert, welche die Aminosäuresequenz pyroGlu – Gly – Pro – Trp – Leu – Glu – Glu – Glu – Glu haben. Andere geeignete immunogene Proteincarrier schließen Rinderserumalbumin, Keylimpet Hämocyanin, Hämocyanin und Tetanus-Toxoid mit ein.
Die Immunogene dieser Erfindung können auch eine Verlängerung oder eine Spacerpeptidsequenz umfassen, welche geeignet ist das immunomimische Peptid vom Proteincarrier auf Abstand zu halten und seine Fähigkeit zu erhöhen, an die Lymphocytrezeptoren zu binden. Eine geeignete Spacerpeptidsequenz ist die Aminosäuresequenz SSPPPPC (SEQ ID NR.: 2 in der Auflistung der Sequenzen). Jedoch gibt es auch andere geeignete Spacerpeptide. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird die bevorzugte Spacersequenz an das Carboxy-terminale Ende des immunomimischen Peptids gehängt. Die Immunogene der Erfindung werden mit herkömmlichen Techniken hergestellt und werden in den US Pat. Nr. 5,023,077; 5,468,494; 5,607,676; 5,609,870, 5,688,506 und 5,622,702 offenbart. Nach der Immunisierung bilden die Immunogene der Erfindung neutralisierende Antikörper mit hoher Affinität, um die Wirkung von G-17, in seiner vollentwickelten und Vorläuferform, auf das Tumorwachstum bei immunisierten Tieren, zu hemmen. Die produzierten Anti-G17 Antikörper binden und neutralisieren vollentwickeltes und Vorläufer-G-17 und verhindern so die Bindung von G-17 an die Rezeptoren der Tumorzellen und hemmen letztendlich das Zellwachstum. Die Immunogene erzeugen Antikörper die sowohl das Carboxy-amitierte und das Glycinerweiterte G17 neutralisieren und sie erzeugen keine Kreuzreaktivität mit G34 oder CCK.
Die Zusammensetzungen, bei denen die Immunogene für die aktive Immunisierung zur Behandlung von Gastrin-abhängigen Tumoren an Patienten verabreicht werden, können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Diese schließen z.B. feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen mit ein, wie Pulver, flüssige Lösungen, Suspensionen, Zäpfchen, injizierbare und für Infusionen geeignete Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der gewünschten Form der Verabreichung und der therapeutischen Anwendungen ab. Die Zusammensetzungen umfassen die vorliegenden Immunogene und geeignete pharmazeutisch akzeptable Bestandteile und können andere medizinische Mittel, Träger, Hilfsstoffe, Arzneistoffträger usw. mit einschließen, die mit herkömmlichen Verfahren gemischt werden können. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten. Die Menge an aktiver Verbindung, die zur Immunisierung oder als Medikament an einem Zeitpunkt oder über einen Zeitraum verabreicht werden hängt von dem zu behandelnden Subjekt, der An und Weise und der Form der Verabreichung, sowie dem Urteil des behandelnden Arztes, ab.
Eine effektive Dosierung, die von 0,001 bis 2 mg der immunogenischen Zusammensetzung reicht, wird dem Patienten zur Behandlung des gastrointestinalen Krebs verabreicht. Die wirksame Dosierung der immunogenischen Zusammensetzung ist dazu in der Lage, beim Patienten eine Immunantwort hervorzurufen, die ausreichend ist, für 1 bis 3 Monate wirksame Mengen an Antikörpern zu bilden, die vollentwickeltes oder Vorläufer-G-17 binden und neutralisieren. Nach der Immunisierung und der Behandlung eines Patienten mit kolorektalem Krebs mit dem chemotherapeutischen Mittel, z.B. mit 5-FU/Leucovorin, wird die Wirksamkeit der Therapie auf das Wachstum des Tumors mit herkömmlichen klinischen Verfahren wie Ultraschall und Kernspintomographie (MRI) überwacht, um die Anwesenheit und, falls vorhanden, die Größe von Tumoren zu bestimmen. Der Titer der Anti-G17 Antikörper kann auch mit einer Blutprobe des Patienten bestimmt werden.
Auffrischungsimmunisierungen sollten nach Bedarf verabreicht werden um einen wirksamen Antikörpertiter aufrecht zu erhalten. Eine wirksame Behandlung des Gastrinabhängigen kolorektalen Adenokarzinoms und andere Gastrin-abhängiger Krebsformen wie Magen-, Leber-, Pankreas- und kleinzelliges Lungenkarzinom sollte, gemäß diesem Verfahren, in einer Hemmung des Tumorwachstums und einer Verringerung der Größe des Tumors resultieren.
Zur passiven Immunisierung werden die Anti-G17 Antikörper intravenös, mit Hilfe eines pharmakologisch verträglichen Trägerstoffes, wie einer Salzlösung, zum Beispiel eine phosphat-gepufferte Salzlösung, an den Patienten verabreicht.
Die chemotherapeutischen Mittel werden in einer Dosierung gegeben, wie durch herkömmliche Zeitpläne empfohlen, und können zur Beginn der Therapie, gleichzeitig mit dem Anti-G17 Immunogen, vor der Immunisierung oder nach der Immunisierung, verabreicht werden. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, die chemotherapeutischen Mittel sowohl vor als auch nach der Immunisierung zu verabreichen. Es können auch nachträgliche chemotherapeutische Behandlungen verabreicht werden, wie vom Patienten, nach der Auswertung der Kernspintomographie und des Ultraschalls, benötigt.
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit der vorliegenden Kombinationstherapie auf kolorektale Formen von Krebs zu zeigen.
BEISPIEL 1
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um den potentiellen klinischen Nutzen zu bestimmen, der von Anti-G17 (1-9)-DT ausgeht. Die Ziele dieser Studie waren wir folgt:

(a) Bestimmung des Langzeiteffekts der spezifischen Ratte Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung auf das histologische Erscheinungsbild des GI Trakts der Ratte
(b) Beurteilung der Wirkung der 5-FU/Leucovorin Kombinationen auf die Antikörpertiter, die durch die Anti-G17 (1-9)-DT erhöht wurden, und
(c) Bestimmung der therapeutischen Wirkung von Anti-G17 (1-9)-DT und 5-FU/Leucovorin Kombinationen auf ein Rattenkolonmodel.

Zelllinie
DHDK12 ist eine Rattencolon-Epitheltumorzelllinie (Martin, 1983). Die Zelllinie wurde in RPMI 1640 Wachstumsmedium (Gibco, Paisley, Schottland), welches 10% fötales Kälberserum (FCS, Sigma, Poole, UK) unter befeuchteten Bedingungen bei 37 °C und 5% CO₂.
Immunogen
Das Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen besteht aus den Aminosäureresten 1-9 von G17, die über den Carboxyterminus an den Peptidspacer SSPPPPC (SEQ ID NO.: 1 in der Auflistung der Sequenzen), was wiederum an DT konjugiert ist. Das Immunogen das bei diesen Studien verwendet wurde, wurde spezifisch für Ratten G17 erzeugt, indem das humane G17 Epitop durch die aminoterminalen 9 Aminosäuren von Ratten G17 ausgetauscht wurde, welches durch einen Peptidspacer mit Diphtherietoxin (DT) verbunden ist. Antiserum welches durch Ratte Anti-G17 (1-9)-DT erzeugt wurde, wurde als Anti-Ratte G17 (1-9):DT bezeichnet.
Versuchstiere
Männliche und weibliche BDIX Ratten wurden von der Cancer Studies Unit, University of Nottingham, UK bereitgestellt, sie waren 6-10 Wochen alt und wogen 340 – 420 g. Die Ratten wurden paarweise und mit einem Zeitplan von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei 25 °C und 50 % Luftfeuchtigkeit gehalten. Vor jedem Experiment wurden die Tiere gruppiert um die Gewichtsverteilung auszugleichen. Die Größe der Gruppen reichte von 6 – 13 Tiere. Die Richtlinien des UK Coordinating Committee for Cancer Research (UKCCCR) wurden während allen Tierversuchen befolgt.
Immunisierungsverfahren
Ratte Anti-G17 (1-9)-DT wurde in einer sterilen Salzlösung (0,9 %), pH 7,3 auf 1 mg/ml gelöst. Der Hilfsstoff Nor-Muramyldipeptid (Peninsula Labs., Belmont, CA, USA) wurde zur Lösung des Konjugats zugegeben um eine endgültige Konjugatkonzentation zwischen 200 und 500 μg/ml zu erreichen. Die wässrige Lösung wurde mit einem öligen Träger (Montanid ISA 703; AMS Seppic Inc., Paris, Frankreich) in einem Verhältnis von 1:2 (v/v) durch Emulgierung vermengt. Nachdem sie in eine Glasspritze gegeben wurde, die durch einen Dreiweg-Sperrhahn mit einer zweiten Spritze verbunden ist, wurde die Mischung 40 Mal durch die Spritzen hin und her bewegt, um eine Emulsion zu erzeugen. Eine Emulsion, die DT Peptid und Muramyldipetid enthält wurde auf gleiche An und Weise für Kontrollratten erzeugt. 200 μl der Emulsion (50 μg/Ratte) wurden subkutan injiziert (rechte Flanke der Versuchstiere). Die Tiere wurden entweder mit einer einzelnen Injektion immunisiert oder immer wieder in Intervalen von 21 Tagen, wie unten beschrieben.
Zytotoxischer Behandlungszeitplan
Die Ratten erhielten 12,5 und 25 mg/kg 5-Fluorouacil (5-FU, David Bull Labs., Warwick, UK) und 12,5 – 25 mg/kg Leucovorin (Lederle Labs., Gosport, Hants, UK) welches intravenös (iv) an den Tagen 1, 3 und 5 verabreicht wird, wobei der Zyklus für die Dauer der Studie alle 4 Wochen wiederholt wird (Asao, 1992). Die zytotoxische Kombination wurde den Ratten entweder vor oder nach der Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung (200 μg/ml) verabreicht.
Initiierung des Tumorwachstums
DHDK12 Zellen wurden in steriler phosphatgepufferter Saline (PBS, Oxoid, Hants., UK) mit einer Zellkonzentration von 2,5 × 10⁷/ml suspendiert. Die Ratten wurden mit einer 1 ml intraperitonalen Injektion von Hypnorm (0,315 ng/ml Fenatanylcitrat und 10 mg/ml Fluanison; Jannsen, Berrse, Belgien), Hypnovel (Sng/ml Midazolam; Roche, Basel, Schweiz) und sterilem destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:1:5 anästhesiert. Nach einem subkutanen (s.k) Schnitt an der rechten Flanke wurde ein Volumen von 200 μl Zellsuspension in die Muskelschicht der Bauchdecke injiziert und der chirurgische Schnitt wurde mit Wundklammern verschlossen. Jede Gruppe des Experiments bestand aus 6 bis 13 Tieren.
Bestimmung der spezifischen Antiköpermengen der mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten
Um die Blutproben für die Analyse zu erhalten wurde von Ratten während des Experiments zu verschiedenen Zeitpunkten Schwanzblut entnommen und bei der Beendigung des Experiments durch eine Herzpunktur unter terminaler Betäubung. Die Serumantikörperlevel von Anti-Ratte G17 wurden mit einem "Enzyme-linked immmunosorbent assay" (ELISA) bestimmt. Ein Konjugat aus Ratte G17 und Rinderserumalbumin (BSA) wurde auf 2 μg/ml in 0,1 M Glycinpuffer (pH 9,5) gelöst und es wurden 25 μl pro Loch in Immunulon U 96-Lochplatten (Dynatech Labs., Sussex, UK) gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert wonach nicht adsorbiertes Konjugat entfernt wurde und die Platten wurden mit Puffer gewaschen (0,9 % Salzlösung, 0,5 % Tween-20 [Sigma], 0,02 % NaN₃ [Sigma], pH 7,3). Dieser Puffer wurde für alle Waschschritte und Reagenzverdünnungen genutzt. Sera wurden mit 10-fachen Verdünnungen behandelt, beginnend bei einer Verdünnung von 1:100. Die Positivkontrolle war Ratte Anti-Ratte G17 (1-9)-DT Antiserum von vorher immunisierten Tieren und die Negativkontrolle war normales Rattenserum und Serum von Ratten die nur mit DT immunisiert wurden. Alle Kontrollseren wurden in den gleichen Verdünnungen genutzt wie die Testseren. Die verdünnten Seren wurden in 25 μl Aliquots in die Löcher gegeben, entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 25 μl/Loch Ratten G17-BSA bei 100 μg/ml (als löslicher Inhibitor). Die Grundkontrolllöcher erhielten nur 25 μl. Die Platten wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert bevor sie mit dem Untersuchungspuffer gewaschen wurden. Ziege Anti Ratte Immunoglobulin (H+L) (Zymed, San Francisco, CA, USA) wurde in einer 1:500 Verdünnung zu den Platten gegeben, 50 μl/Loch, und für 60 Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde Avidin-Alkalinphosphatase (Zymed) in einer 1:100 Verdünnung zugegeben (50μl/Loch) und die Platten wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiterem Waschen wurde p-Nitrophenylphosphatsubstrat (pNPP) (Sigma) zu den Platten gegeben mit 50 μl/Loch und nach einer 5-minütigen Entwicklungszeit wurde die Absorption bei 405 nm gemessen. Der Unterschied in der Absorption zwischen unbehandeltem Serum und Serum das mit Ratten G17-BSA koninkubiert wurde, wurde als die spezifische Absorption berechnet.
Bestimmung der Anzahl der weißen Blutkörperchen
Heparinisiertes Blut wurde während des Experiments aus Schwanzblut und am Ende des Experiments durch Punktur des Herzens gewonnen. Die Anzahl an weißen Blutkörperchen wurde von der Abteilung für Hämatologie des Universitätskrankenhauses von Nottingham unter Benutzung eines FACScan analysiert.
Histologie
Nach dem Töten der Langzeit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten wurden repräsentative Flächen des Magens, des Darms und des Rektums der immunisierten Ratten und der im Alter angeglichenen Kontrollen seziert und mit Formalin fixiert. Die Stücke wurden in Paraffin eingebettet und mit Hilfe eines Microtoms wurden Stücke von 4 μm geschnitten. Diese wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und durch einen Histopathologen bewertet, der kein Wissen über die Behandlungsgruppen hatte.
Vermehrung der Kryptazellen
Eine Stunde vor dem Tod des Tieres wurde Vincristin (2mg/kg, Sigma) intraperitonal injiziert, um einen Arrest in der Metaphase des Darmepitheliums vor der Bestimmung der Vermehrung der Kryptazellen im Darm zu induzieren (CCPR). Die Anzahl der Zellen in der Metaphase pro Krypte wurden gezählt. Der Darm und das Rektum wurden aus jeder Ratte entfernt, der Länge nach geöffnet und es wurde jeweils Schleimhaut in Carnoy Lösung fixiert. Die Krypten wurden sanft, der Länge nach unter einem Seziermikroskop zerdrückt und die Anzahl der Zellen in der Metaphase wurde bestimmt (Vergrößerung × 25).
Statistische Analyse
In vivo Ergebnisse wurden durch einen Mann Whitney nicht-parametrischen Test unter Benutzung des SPSS Statistik Pakets für IBM PC analysiert.
Langezeitstudien mit Anti-G17 (1-9)-DT
Es wurden, wie oben beschrieben, fünf männliche Ratten mit Ratte Anti-G17 (1-9)-DT immunisiert und es wurden über einen Zeitraum von 34 Wochen, folgend auf eine einzelne Immunisierung, ihre Antikörpertiter gemessen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Ratten mit einer zweiten Injektion von Ratten Anti-G17 (1-9)-DT aufgefrischt. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. 1 zeigt den Zeitrahmen der Antikörpertiter für bis zu 40 Wochen nach der Immunisierung von Ratten, die mit 500 μg/ml Ratten Anti-G17 (1-9)-DT immunisiert wurden. Jeder Punkt zeigt ein einzelnes Tier. Die Titer der Antikörper wurden, wie oben beschrieben, mit einem Elisa Assay gemessen, indem eine 1:100 Verdünnung der Sera genutzt wurde. Immunisierungen werden durch den Pfeil angezeigt. Nach der ersten Immunisierung reagierten vier der fünf Ratten auf das Ratten Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen. Antikörper wurden, nach dieser einzelnen Injektion, in Woche 7 bei drei von fünf Ratten und bei 4 von fünf Ratten in Woche 9 festgestellt. Auf diesen anfänglichen Anstieg der Antikörper folgte ein zweiter Anstieg nach 15-20 Wochen, wonach der Antikörpertiter stetig abnahm und in Woche 34 nahe Null war. Zu diesem Zeitpunkt zeigt 1 auch, daß nach einer zweiten Immunisierung mit Ratten Anti-G17 (1-9)-DT alle Ratten messbare Anti-Ratten G17 Antikörpertiter innerhalb von 1-2 Wochen nach der Immunisierung hatten.
BEISPIEL 2
Histologische Langzeitanalyse der mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten
Stücke des Magens, des Darms und des Rektums wurden histologisch bestimmt, nachdem sie, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden. Diese wurden mit Stücken von in Alter und Geschlecht angeglichenen Kontrollratten verglichen. Alle Teile des GI Trakts, die überprüft wurden, waren bei den mit Anti-G17 (1-9)-DT behandelten und den im Alter angeglichenen Kontrollen gleich, in Hinblick auf die Länge der Villae/Krypten/Schleimhaut-Höhe. Im Magen waren die Anzahl und das Aussehen der Enterochromaffin-artigen (ECL) Zellen in den beiden Tiergruppen gleich. Es gab jedoch einige Hinweise auf Granulierung der G-Zellen in der Magenschleimhaut der mit Anti-G17 (1-9)-DT behandelten Ratten.
BEISPIEL 3
Rate der Vermehrung der Kryptazellen (CCPR) des Darmepithels der mit Anti-G17 (1-9)-DT Langzeit-immunisierten Ratten
Der CCPR der Darmepithelzellen und die Antikörpertiter von Anti-Ratten G 17 wurden, wie oben beschrieben, analysiert. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, die von 4 von 5 Ratten erhalten wurden, indem CCPR mit dem Anti-Ratten G17 Antikörpertiter verglichen wird. Der durchschnittliche CCPR der Kontrollratten war 18,93 (Standardabweichung 3,2) und bei den mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten 23,7 (Standardabweichung 7,9). Es gab keinen statistischen Unterschied zwischen den mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten und den im Alter angeglichenen Kontrollratten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Rate der Teilung der Kryptazellen im Darmepithel bei den Kontrollratten und den mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten gleich ist.
Tabelle 1 Ein Vergleich der Antikörpertiter von Anti-Ratten G17:DT mit der Vermehrung der Kryptazellen des Darms
BEISPIEL 4
Wirkung von Vor- und Nachzytotoxischer Behandlung auf Antikörperwerte, die von Ratte Anti-G17 (1-9)-DT erzeugt werden
Den Ratten wurden 5-FU/Leucovorin mit 30 mg/kg im Verhältnis 1:1 intravenös, wie in Beispiel 1 beschrieben, injiziert, entweder vor oder nach der Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT. Jede Gruppe bestand aus 6 männliche und 6 weiblichen Ratten pro Gruppe und die durchschnittlichen Antikörpertiter wurden mit einer ELISA Technik gemessen, unter Verwendung einer 1:100 Verdünnung von Serum. Die Antikörperlevel jeder Ratte wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus Blutproben bestimmt.
2 zeigt die Wirkung von Prä- und Postzytotoxischer Behandlung mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin Zyklen auf die Antikörpertiter, die durch die Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT (500 μg/ml) erzeugt werden. In der Abbildung werden die Daten wie folgt repräsentiert: -⎕- keine zytotoxischen Stoffe, 7 Immunisierungen; -
- 2 Immunisierungen vor 4 zytotoxischen Behandlungen; -O- 1 Immunisierung vor 4 zytotoxischen Behandlungen, -Δ- 1 zytotoxische Behandlung vor 4 Immunisierungen (2 zytoxische Behandlungen während der Immunisierung); -⊠- 2 zytotoxische Behandlungen vor 4 Immunisierungen; -*- 3 zytotoxische Behandlungen vor 3 Immunisierungen; und -
- 4 zytotoxische Behandlungen vor 2 Immunisierungen. 2 zeigt den Durchschnitt von 6 weiblichen und 6 männlichen Ratten pro Gruppe. Die Standardabweichung lag bei ungefähr 10 % des Durchschnitts. Es gab durch die Vorbehandlung mit der zytotoxischen 5-FU/Leucovorin Kombination keinen signifikanten Einfluß auf die Antikörpertiter sowohl auf die erreichten Antikörperlevel oder die Zeit die benötigt wurde, um diese Level zu erreichen, verglichen mit unbehandelten, mit Anti-G17 (1-9) DT immunisierten Ratten. Die maximale Anzahl der Behandlungsszyklen die ausgewertet wurden lag bei 4 zytoxischen Behandlungszyklen, gefolgt von 2 Immunisierungen.
3 zeigt den Effekt der Behandlung auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) bei BDIX Ratten.
Die Wirkung der zytotoxischen Behandlung mit 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin bei BDIX Ratten, die 4 zytotoxische Behandlungen vor 2 Immunisierungen erhielten, auf die durchschnittliche Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) wird in 3 gezeigt. Wie in der Abbildung gezeigt gab es eine signifikante Abnahme der WBC Menge bei den ausgewerteten, repräsentativen Ratten nach der zytotoxischen Behandlung (p < 0,005, Student T Test). Die Anzahl wurde durch die Anzahl der zytotoxischen Behandlungen reduziert, was auf Myelosuppression schließen läßt. Es gab jedoch keine Wirkung auf die Antikörperantwort der Ratten gegenüber dem Anti-G17 (1-9)-DT, wie in 2 gezeigt wird.
BEISPIEL 5
Effekt der Kombinationstherapie von 5-FU, Leucocvorin und Anti-G17 (1-9)-DT auf das in vivo Wachstum von DHDDK12 Tumoren
Die Wirkung der kombinierten Therapien mit 5-FU/Leucovorin (12,5-30 mg/kg) und Ratten Anti-G17 (1-9)-DT (200 μg/ml) auf das Wachstum der Rattendarmkrebszellinie DHDK12 in der Muskelschicht der Bauchdecke von BDIX Ratten wurde durch den Vergleich mit Tumoren in Kontrolltieren getestet, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Am Ende der Therapie wurden die Ratten getötet, ihre Tumore entfernt und mit herkömmlichen Verfahren gewogen. Jede Gruppe bestand aus 10-12 Ratten/Gruppe von gemischtem Geschlecht. Die durchschnittlichen Gewichte der Tumore werden mit den interquartilen Bereichen über den Spalten gezeigt. Eine statistische Bestimmung wurde mittels einem Mann Whitley U nicht-parametrischem Test, wie in Beispiel 1 beschreiben, durchgeführt.
Die 4 und 5 zeigen die Wirkung der Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung auf die durchschnittlichen, endgültigen Gewichte der Tumore von BDIX Ratten, denen DHDK12 Tumorzellen in die Muskelschicht der Bauchdecke eingepflanzt wurden. Dieser Weg der Implantation führt zu einem gut vaskulierten Tumor, der empfänglich gegenüber Therapien ist, die in den Kreislauf eingebracht werden (Watson, 1996). Es wurde früher schon gezeigt, daß Ratten Anti-G17 (1-9)-DT das endgültige Gewicht eines DHDK12 Tumors um 56,6 % senkt, wenn es in einer Dosis von 500 μg/ml verabreicht wird (Watson, 1996). In den vorliegenden Versuchen wurde, um alle Vorteile der Kombinationstherapie mit 5-FU/Leucovorin zu entdecken, die Anti-G17 (1-9)-DT Dosis auf 200 μg/ml gesenkt, was zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums um 25,7 % führte, wie in 4 gezeigt. 4 zeigt Daten von Tumoren die aus unbehandelten Kontrollratten entfernt wurden, von mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten und mit DT immunisierten Ratten.
Nach einem Zeitraum von 50 Tagen hatten die unbehandelten Ratten ein durchschnittliches Tumorgewicht von 4,43 g. Eine Immunisierung mit DT führte zu einem Tumorgewicht von 4,7 g, was sich nicht signifikant vom Tumorgewicht der unbehandelten Ratten unterschied, aber welches signifikant größer war als das durchschnittliche Tumorgewicht der mit Anti-G17 (1-9)-DT immunisierten Ratten (3,49 g, p=0,034, Mann Whitney).
5 zeigt, daß 5-FU/Leucovorin allein, wenn es mit 30 mg/kg verabreicht wurde, das Tumorgewicht signifikant auf einen Durchschnitt von 1,01 g senkt (p=0,0106 verglichen mit unbehandelten Kontrollratten). Wenn die Ratten mit der selben zytotoxischen Dosis 5-FU/Leucovorin zusammen mit einer Immunisierung mit DT behandelt wurde, war das durchschnittliche Tumorgewicht nicht signifikant verschieden (0,945 g).
Eine Kombination von 5-FU/Leucovorin bei 30 mg/kg und einer Immunisierung mit Ratten Anti-G17 (1-9)-DT ergab ein durchschnittliches Tumorgewicht von 0,68 g, was sich nicht signifikant von der mit 5-FU/Leucovorin/DT behandelten Gruppe unterschied (p=0,27). Die Kombination von 25 mg/kg 5-FU/Leucovorin und einer Immunisierung mit DT ergab ein durchschnittliches Tumorgewicht von 0,96 g, was verglichen mit einem durchschnittlichen Tumorgewicht von 0,68 g der Kombinationstherapiegruppe die mit Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung in Verbindung mit 5-FU/Leucovorin behandelt wurde, nicht signifikant war (p=0,409). Wenn die Dosis von 5-FU/Leucovorin auf 20 mg/kg reduziert wurde, ergab die Kombination von 5-FU/Leucovorin/DT Immunogen ein durchschnittliches Tumorgewicht von 1,23 g. Das durchschnittliche Tumorgewicht wurde signifikant auf 0,71 g gesenkt wenn 20 mg/kg 5-FU/Leucovorin mit einer Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung kombiniert wurde (p=0,027, Mann Whitney).
Letztendlich zeigt 5 auch, daß eine Dosis von 5-FU/Leucovorin von 12,5 mg/kg kombiniert mit einer Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung (p=0,015, Mann Whitney) das durchschnittliche Tumorgewicht von 1,34 g auf 0,41 g reduziert. Es wurden 5-FU/Leucovorin/Anti-G17 (1-9)-DT Kombinationen verglichen und es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Anti-G17 (1-9)-DT das in Kombination mit entweder 12,5, 20 oder 30 mg/kg 5-FU/Leucovorin verabreicht wurde. Aufgrund des begrenzten Nutzen der für die Kombinationschemotherapie mit 5-FU/Leucovorin sowohl bei fortgeschrittenem Krebsstadium und insbesondere in Szenarien mit einer Hilfsstoffstherapiebehandlung (Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993; Petrioli, 1995) kann es sein, daß neue therapeutische Modalitäten angewendet werden müssen, entweder in Verbindung mit 5-FU/Leucovorin um den therapeutischen Index zu erhöhen (und möglicherweise die chemotherapeutische Dosis zu senken um die Toxizität zu begrenzen) oder als zweiter Behandlungsweg falls die Chemotherapie nicht wirksam ist. Deshalb müssen neue Behandlungen für eine solche Anwendung erweitert werden. Immunotherapeutische Ansätze in Verbindung mit Chemotherapie wurden bisher als problematisch angesehen, aufgrund der mit chemotherapeutischen Mitteln in Verbindung gebrachten Myelosuppression, wie z.B jene die bei 5-FU/Leucovorin beobachtet wird (Mahood, 1991). In der vorliegenden Studie jedoch beeinflußt die Myelosuppresion der Ratten, die durch 5-FU/Leucovorin Kombinationen von 30 mg/kg, verabreicht gemäß Asao et al. mit der maximal tolerierten Dosis, induziert wurde, die Menge und die Zeit, die benötigt wurde um Anti-Ratten G17:DT Antikörpertiter nach der Immunisierung mit dem Anti-G17 (1-9)-DT Immunogen zu erreichen, nicht.
Bei Therapiestudien, bei denen 5-FU/Leucovorin in Kombination mit Anti-G17 (1-9)-DT benutzt wurde, wurde eine Verstärkung der 20 mg/kg und 12,5 mg/kg Dosierungen erreicht. Die 20 mg/kg war so effektiv wie die maximal tolerierte Dosis, wenn sie mit Anti-G17 (1-9)-DT kombiniert wurde und die 12,5 mg/kg Dosis zeigt einen Trend zu einem besseren therapeutischen Effekt. Der Grund für letzteren Trend ist nicht bekannt, es kann aber sein, daß die zytotoxische Dosis das Immunsystem weniger beeinflußt als höhere Dosen, was bei der allgemeinen Entzündungsantwort gegen den Tumor helfen kann. 5-FU/Leucovorin, das in kontinuierlichen Abständen verabreicht wird scheint einen "Alles oder Nichts" Effekt auf das Wachstum des Tumors zu haben, da ein Absenken der Dosis auf 1 mg/kg keine Hemmung auf das Wachstum des Tumors zur Folge hatte. Der therapeutische Effekt kann dann genauer eingestellt, indem die Anzahl an toxischen Zyklen reduziert wird (Watson, persönliches Gespräch). Deswegen können in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung niedrigere Dosen als üblich von 5-FU/Leucovorin verabreicht werden, um so die Nebenwirkungen der Medikamente zu reduzieren, während gleichzeitig eine wirksame Abtötung der Tumorzellen durch Benutzung der vorliegenden Kombination erreicht werden kann, da das Immunsystem nur minimal beeinflußt wird. Deshalb wird der das Wachstum hemmende Effekt der Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung verstärkt. Diese Charakteristika der Kombinationstherapie sind unerwartet und überraschend, im Hinblick auf die myelosuppressiven Effekte der chemotherapeutischen Mittel selbst.
Weiterhin ist die Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung aufgrund des Fehlens negativer Effekte auf den Patienten wahrscheinlich eine Langzeitbehandlung, wie durch die Länge der Zeit gezeigt wird, nach der meßbare Antikörperlevel in Ratten waren die eine einzelne Immunisierung erhielten. Die erste Immunisierung war zu 80 % effektiv, im Hinblick auf die Anti-Gastrin Antikörperinduktion und nach einer zweiten Immunisierung zu 100 % effektiv, gemeinsam mit einem sofortigen Anstieg der Antikörperlevel. Obwohl eine Verstärkung der Chemotherapie durch eine einzelne Anti-G17 (1-9)-DT Injektion ereicht werden kann, zeigen die Abwesenheit von Nebenwirkungen bei den meisten Patienten, die Charakteristik einer Anti-G17 (1-9)-DT Immunisierung und die Antwortrate der Patienten nach Auffrischungen, daß eine mehrfache Injektionskur wünschenswert sein kann. Trotz der Länge der Zeit in der die Anti-Ratten G17 Antikörper im Kreislauf blieben scheinen keine negativen Langzeitwirkungen auf den GI Trakt aufzutreten, wie durch eine einfache histologische Überprüfung bestimmt werden konnte. Zusätzlich zeigte der Index des Kryptazellenwachstums der Schleimhautzellen des Darms keine signifikanten Einfluss auf ihr Wachstum.
BEISPIEL 6
Behandlung von menschlichen Patienten mit Darmkrebs mit einer Kombinationstherapie von 5-FU/Leucovorin und Anti-G17 (1-9)-DT
Es wurde bereits früher gezeigt, daß eine Immunisierung mit Anti-G17 (1-9)-DT eine wertvolle und sichere therapeutische Alternative bei der Behandlung Gastrin-abhängiger Tumore ist. Die vorliegenden Kombinationen von Anti-G17 Immunogenen mit 5-FU/Leucovorin verstärken die Wirksamkeit der Krebsbehandlung, insbesondere der Behandlung von Darmkrebs und die mögliche Verringerung bei der Dosierung der chemotherapeutischen Mittel, welche aufgrund der Kombination nötig ist, sollte die schädlichen zytotoxischen Nebenwirkungen jedes momentan verwendeten chemotherapeutischen Mittels reduzieren. Die vorliegenden Kombinationen eines Immunogens mit chemotherapeutischen Mitteln kann auch als zweite Therapie bei Patienten eingesetzt werden, die nicht auf die Chemotherapie alleine reagieren.
Menschliche Patienten mit kolorektalen Tumoren oder Darmkrebs werden mit einer Kombination aus Chemotherapie und Immunotherapie behandelt.
Insbesondere können Patienten mit auf Gastrin reagierenden kolorektalen Tumoren oder Darmkrebs mit der gleichzeitigen Gabe von 5-FU/Leucovorin und einer Anti-G17 Immunogenzusammensetzung oder Anti-G17 Antikörpern behandelt werden.
Genauer gesagt stellt die bevorzugte Immunotherapie eine immunogene Zusammensetzung bereit, die ein aminoterminales G17 (1-9) Peptid: DT Konjugat in einem pharmazeutisch akzeptablem Trägerstoff umfaßt, welcher einen Hilfsstoff enthalten kann, der die Immunantwort weiter anregt.
Der bevorzugte immunotherapeutische Zeitplan kann vor, während oder nach der Chemotherapie beginnen, abhängig von klinischen Aspekten. So kann es zum Beispiel bei einem Patienten mit einer großen Tumorbelastung vorteilhaft sein, mit einigen Chemotherapiezyklen zu beginnen, um die Tumormenge zu reduzieren und dann mit der Immunotherapie zu beginnen.
Andererseits kann die Immunotherapie bei einem Patienten mit geringer Tumorbelastung oder nach heilender Chirurgie vor oder während der Chemotherapie begonnen werden.
Die aktive Immunisierungsdosis kann zwischen 300 μg bis zu 1200 μg des Anti-G17 Immunogens liegen, abhängig vom Immunstatus des Patienten (oder der Kapazität der Immunantwort). Die Injektionsintervalle können an den Tagen 1, 7 und 14 oder an den Tagen 1, 14 und 21 oder an den Tagen 1, 14, dann 28 und 56 liegen. Alle Zeitplane können die gleichen Antikörpertiter zur Folge haben. Die beschleunigten Zeitpläne für die Immunisierung liefern die Möglichkeit für das frühre Auftreten der Immunantwort.
Das bevorzugte Verfahren für die Anti-Gastrin Therapie setzt voraus, daß alle 6 Monate nach der anfänglichen Immunisierungsperiode eine Auffrischung verabreicht wird, unabhängig davon welches Protokoll verwendet wird.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren für die effektive Neutralisierung von G17, Gly-G17 und G17NH₂ stellt eine passive Immunisierung mit Anti-G17 Antikörpern bereit, vorzugsweise in gereinigter Form. Genauer wird eine Impfung von 10-1000 μg Anti-G17 (1-9) Antikörpern vor, während oder nach den Chemotherapiezyklen verabreicht, um die Gastrinaktivitäten zu kontrollieren. Die passive Immunisierung kann täglich, wöchentlich oder alle zwei Wochen verabreicht werden. Andere Protokolle können befolgt werden, abhängig von der Wirksamkeit der Behandlung.
Eine weitere Kombination der Behandlungen liefert eine anfängliche passive Immunisierung vor und/oder während des ersten Zyklus der Chemotherapie, gefolgt von einer aktiven Immunisierung wie oben beschrieben.
Es gibt viele verwendete Chemotherapiekuren. Diese auf diesem Gebiet anerkannte Kuren werden, obwohl sie hier nicht beschrieben werden, nicht von der Kombinationsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. Eine bevorzugte Chemotherapiekur liefert 425 mg/m² 5-FU i.v. Bolus mit einer i.v. Infusion von Leucovorin (Folsäure, FA, 20 mg/m²) für 1-5 Tage für einen Zeitraum von bis zu 4 Wochen.
Ein weitere bevorzugte Kur liefert 200 mg/m² FA über einen Zeitraum von 2 Studenen, gefolgt von 5-FU i.v. Bolus von 400 mg/m² + 5-FU von 600 mg/m² über 22 Stunden 1 oder 2 Tage in einem Zeitraum von 2 Wochen.
Noch eine weitere bevorzugte Kur liefert eine kontinuierliche Infusion von 5-FU von 250-300 mg/m² pro Tag kontinuierlich i.v. für 4-6 Wochen gefolgt von 2 Wochen Pause.
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SEQUENZ AUFLISTUNG

Claims

Eine Kombination, die für Benutzung bei der Behandlung eines Gastrinabhängigen Tumors geeignet ist, welche (i) ein Immmunogen, welches ein Gastrin G17-immunomimisches Peptid enthält, und (ii) ein oder mehrere chemotherapeutische Mittel, um den Tumor zu behandeln, umfast.
Eine Kombination, gemäß Anspruch 1, wobei das chemotherapeutische Mittel aus 5-Fluorouracil, Leucovorin, Levamisol, Cisplatin, Tumor-Necrosis Faktor 10 und Proglumid ausgewählt wird.
Eine Kombination, gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Gastrin G17-immunomimische Peptid an einen Diphtherie-Toxoid Carrier konjugiert wird.
Eine Kombination, gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Immmunogen, welches ein Gastrin G17-immunomimisches Peptid enthält, ein Gastrin G17-immunomimisches Peptid, einen Proteincarrier und ein Spacerpeptid, welches dazu geeignet ist, das Gastrin G17-immunomimische Peptid auf Abstand vom Proteincarrier zu halten und seine Fähigkeit an Lymphozytrezeptoren zu binden, verbessert, umfasst.
Eine Kombination, gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gastrin G17-immunomimische Peptid SEQ ID NO: 1 ist.
Eine Kombination, gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, welches weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Carrier enthält.
Eine Kombination, gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, um einen Gastrin-abhängigen Tumor bei einem Patienten zu behandeln.
Eine Kombination, gemäß Anspruch 1, welche als chemotherapeutische Mittel 5-Fluorouracil und Leucovorin enthält, um einen Gastrin-abhängigen kolorektalen Tumor bei einem Patienten zu behandeln.
Die Benutzung einer Kombination, gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 8, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Gastrinabhängigen Tumors