ES2237103T3 - Terapia de combinacion para el tratamiento de tumores. - Google Patents

Abstract

Combinación adecuada para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina, que comprende: (i) un inmunógeno que contiene el péptido inmunoimitador de gastrina G17, y (ii) uno o más agentes quimioterápicos para tratar el tumor.

Description

Terapia de combinación para el tratamiento de tumores.

Campo de la invención

La invención se refiere a una terapia tumoral para inhibir el crecimiento neutralizando inmunológicamente las hormonas peptídicas estimuladoras del crecimiento, en combinación con quimioterapia aplicando un derivado de 5-fluorouracilo y leucovorina.

Antecedentes de la invención

La gastrina es una hormona peptídica que se produce en dos formas maduras, la tetratriacontagastrina (G34) y la heptadecagastrina (G17), y se sintetiza y se secreta por células especializadas, las células G, que se localizan en el antro pilórico. En las células que producen gastrina, estas hormonas gastrinas se procesan tras la traducción a partir de una molécula precursora común denominada "preprogastrina" que contiene un péptido señal. El péptido señal "pre" se elimina en el retículo endoplasmático de la célula, dando como resultado el péptido "progastrina", que a su vez se procesa adicionalmente en la célula para dar las gastrinas maduras G34 y G17, antes de su secreción en el torrente circulatorio (Dickinson, 1991). (Las menciones completas para las referencias citadas en el presente documento se proporcionan en la sección de bibliografía que precede a las reivindicaciones). Ambas formas maduras de G34 y G17 están amidadas en su extremo carboxilo terminal (-NH_{2}). En los seres humanos se han encontrado múltiples formas de G17, que resultan del procesamiento diferencial de la molécula precursora, cada una de las cuales puede tener actividades biológicas diferentes (Dickinson 1995 y Ciccotosto et al., 1995). En el procesamiento tras la traducción de la gastrina, es la forma "madura" amidada en el extremo carboxilo la que se une a un receptor celular específico, el denominado receptor CCK-B/gastrina, a través del extremo carboxilo terminal del péptido (Kopin et al.,
1992).

Las hormonas gastrinas se secretan a la sangre circulante y se unen a células específicas en el estómago, concretamente, a las células similares a enterocromafines (ECL) y a las células parietales, que afectan directa o indirectamente a la producción de ácido del estómago. Históricamente, ambas hormonas gastrinas se han asociado con la estimulación de la secreción de ácido gástrico (Edkins, J. S., 1905). En los últimos años, se han acumulado pruebas que demuestran que la gastrina también actúa como un factor trófico dentro del tracto gastrointestinal (Johnson, L. 1992) y que potencia el crecimiento de cánceres gastrointestinales (Watson et al. 1989, Dickinson, C. J., 1995), así como de cánceres no gastrointestinales, incluyendo el carcinoma de células pequeñas del pulmón (Rehfeld et al., 1989).

Varios tipos de tumores, incluyendo los adenocarcinomas colorrectales, estomacales, pancreáticos y hepatocelulares poseen receptores CCK-B/gastrina en sus membranas plasmáticas y las células tumorales responden a la gastrina con una fuerte proliferación celular (Rehfeld, J. F., 1972, Upp et al., 1989 y Watson et al. 1993). En los pacientes con cánceres colorrectales, se producen niveles plasmáticos elevados de gastrina total y, en particular, se ha detectado un aumento de la cantidad del precursor hormonal progastrina en muchos tumores colorrectales utilizando antisueros anti-gastrina (Ciccotosto et al. 1995). Más recientemente se ha descubierto que muchas de esas células cancerígenas también secretan gastrina y, por tanto, realizan una ruta proliferativa autónoma (Van-Solinge et al., 1993, Nemeth et al., 1993 y Seva et al., 1994).

Las hormonas peptídicas G17 y G34 se unen a los receptores CCK-B/gastrina sobre las membranas celulares de las células normales. Sin embargo, se ha encontrado que G17, pero no G34, estimula el crecimiento de las células cancerígenas dependientes de gastrina. La G17 asociada al suero, en particular, tiene la capacidad de estimular el crecimiento de tumores colorrectales de una manera endocrina, mediada por los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales (Watson et al., 1993). G17 está particularmente implicada en la potenciación del crecimiento de adenocarcinomas colorrectales debido a un posible aumento de la afinidad por los receptores CCK-B/gastrina en las células tumorales, en comparación con otros tipos de hormona gastrina (Rehfeld, 1972 y Van Solinge et al., 1993). Se encontró que los receptores CCK-B/gastrina se expresaban en una forma de alta afinidad en el 56,7% de los tumores colorrectales primarios humanos (Upp et al., 1989).

Numerosos estudios han demostrado que, además de poder responder a la gastrina endocrina exógena, los tumores colorrectales y gástricos humanos producen gastrina y sus precursores (Ciccotosto et al., 1995; Finley et al., 1993; Kochman et al., 1992; Nemeth et al., 1993; Van Solinge et al., 1993), realizando así una ruta autocrina estimuladora de crecimiento. La producción de gastrina en las células tumorales difiere de la de las células G endocrinas. Específicamente, estas células tumorales contienen una elevada proporción del precursor progastrina, junto con una concentración inferior de péptidos maduros. Se supone que esta razón anómala se debe a la liberación constitutiva no regulada de gastrina combinada con una actividad limitada de la actividad de la monooxigenasa \alpha-amidante de peptidilglicinas (Ciccotosto et al., 1995; Kelly, 1998). Por tanto, la liberación no regulada de gastrina conduce a la producción y la secreción anómalas de las diferentes formas moleculares de la hormona. Específicamente, las células de carcinoma de colon no procesan eficazmente la progastrina, dando como resultado una menor conversión del precursor gastrina en los péptidos maduros y, por tanto, producen gastrinas en su mayoría incompletas o aberrantes, (Dickinson, 1995 y Rehfeld et al., 1993). Además, el aumento del nivel de gastrina en los tumores colorrectales se atribuye, en parte, a la expresión aberrante del gen de la gastrina en las células de tumor colorrectal (Hoosein et al., 1990, Baldwin et al., 1992 y Finley et al., 1993). Los péptidos similares a gastrina se han identificado en tales células (Hoosein et al., 1988, Watson et al., 1991a y Finley et al., 1993), y se confirmó que eran clases precursoras de gastrina (Van-Solinge et al., 1993 y Nemeth et al. 1993).

La presencia de G17 amidada (G17-NH_{2}) en algunos cánceres colorrectales (Ciccotosto et al., 1995; Van Solinge et al., 1993) demuestra que algunos tumores conservan una ruta de procesamiento intacta, ya que la amidación de la gastrina sólo se produce en los gránulos secretores (Varro et al., 1994). La gastrina producida endógenamente también actúa como un factor de crecimiento autocrino, puesto que se demostró que el crecimiento basal de una línea celular colorrectal se inhibía por un anticuerpo anti-gastrina (Hoosein et al., 1988). Esto se confirmó en un segundo estudio en el que un análisis de Northern blot (inmunotransferencia) reveló ARNm de gastrina en las mismas líneas celulares y un radioimmunoensayo reveló inmunorreactividad similar a la gastrina en el sobrenadante del cultivo celular (Hoosein et al., 1990). Los péptidos de gastrina también desempeñan papeles paracrinos (Watson et al., 1991b) lo que se confirmó (Finley et al., 1993) en experimentos que mostraban la inmunorreactividad de la gastrina más predominante en subpoblaciones de células mucosas colorrectales malignas.

Cuando G17 se une a su receptor, se forma un complejo G17 / receptor que estimula el crecimiento celular por medio de mensajeros secundarios para regular la función celular (Yamada et al., 1993). La unión de G17 al receptor CCK-B/gastrina conduce a la activación de la rotura del fosfatidilinositol, a la activación de la proteína cinasa C con un aumento resultante en la concentración del ión calcio intracelular, y a la inducción de los protooncogenes c-fos y c-jun a través de la proteína cinasa activada por mitógeno, que está implicada en la regulación de la proliferación celular (Todisco et al., 1995). Además, la unión de la gastrina al receptor CCK-B/gastrina se ha asociado con el aumento posterior en la fosforilación por una tirosina cinasa, la ppl25FADK (cinasa de adhesión focal), que también puede desempeñar un papel en la transmisión de señales mitógenas (Taniguchi et al., 1994).

El cáncer colorrectal sigue siendo una temible enfermedad para tratar, ya que en los últimos años sólo se han obtenido mejoras de poca importancia en la supervivencia. La cirugía es un tratamiento eficaz de la enfermedad primaria, pero es inútil frente a la enfermedad oculta residual, que frecuentemente está presente. La terapia con radiación tras la cirugía se recomienda generalmente para los pacientes con cánceres rectales para reducir los riesgos de recaída de la enfermedad. La quimioterapia con 5-fluorouracilo (5-FU) ha sido el tratamiento tradicional más eficaz tras la cirugía en los pacientes con cánceres colorrectales más avanzados. Sin embargo, se ha demostrado que el tratamiento con 5-FU sólo tiene un beneficio mínimo para el paciente, puesto que el 5-FU es sumamente tóxico y el tratamiento es costoso y no parece prolongar significativamente la supervivencia, solo o en combinación con otros fármacos citotóxicos. En la mayoría de los casos, los tumores colorrectales ocultos o inoperables no responden bien a la quimioterapia o a la radiación, y son necesarios nuevos tratamientos para complementar los procedimientos actuales.

Recientemente, varios estudios han demostrado que la quimioterapia de combinación complementaria con 5-FU y leucovorina mejora la eficacia del 5-FU en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. La leucovorina es un derivado del ácido fólico, también conocido como ácido folínico, factor citrovórum o ácido 5-formil-5,6,7,8-tetrahidrofólico. Los estudios demuestran que en los pacientes en el estadio C de Dukes, la terapia de combinación con 5-FU/leucovorina puede reducir la mortalidad en del 10 al 15% (Moertel., 1994). En el mismo grupo de pacientes, la terapia combinada intravenosa e intraperitoneal con 5-FU/leucovorina dio como resultado una tendencia no significativa a la supervivencia libre de enfermedad y una ventaja global de supervivencia (Scheithauer et al., 1995). En la enfermedad avanzada, la misma combinación de fármacos puede dar lugar a una ventaja de supervivencia (Taylor, 1993), que se ha demostrado que es de 13,5 meses de supervivencia media en el grupo de combinación, en comparación con 7,5 meses en los pacientes tratados con 5-FU (Petrioli et al., 1995). Sin embargo, esta quimioterapia de combinación no carece de morbilidad significativa y produce efectos secundarios nocivos, incluyendo estomatitis, diarrea y mielosupresión (Mahood et al., 1991; Erlichman et al., 1988; Pietnelli et al., 1989), haciendo que la calidad de vida sea un problema, especialmente en los pacientes con enfermedad avanzada.

Se han evaluado terapéuticamente varios antagonistas del receptor CCK-B/gastrina de alta afinidad, tanto in vitro como in vivo, en varios cánceres gastrointestinales de experimentación. Por ejemplo, se ha demostrado que proglumida, un derivado del ácido glutámico (Seva et al., 1990; Harrison et al., 1990 y Watson et al., 1991a); benzotript, un derivado N-acílico del triptófano; L-365.260, un derivado de aspercilina (Bock et al., 1989); y CI-988, una molécula que imita la secuencia pentapeptídica del extremo C-terminal de CCK (colecistocinina) (Hughes et al., 1990) neutralizan eficazmente los efectos de la gastrina exógena sobre el crecimiento de tumores gastrointestinales, tanto in vitro como in vivo (Watson et al., 1991b y Romani et al., 1994). Sin embargo, estos antagonistas tienen graves efectos secundarios tóxicos y carecen de especificidad ya que bloquean la acción de todos los ligandos potenciales del receptor, tales como G34 y CCK en las células normales. Recientemente, también se han descrito antagonistas sumamente potentes y selectivos del receptor CCK-B/gastrina, tales como YM022 (Yuki et al., 1997) y YF476 (Takinami et al., 1997).

La proglumida y el benzotript se han evaluado ampliamente en estudios preclínicos. El principal problema con estos compuestos es su falta de potencia, requiriéndose concentraciones relativamente altas para desplazar a la G17. (Watson et al., 1992a; Watson et al., 1992b). Pese a esto, la proglumida y el benzotript inhibieron la proliferación basal y estimulada por gastrina de varias líneas celulares (Seva et al., 1990; Watson et al., 1991a). Además, la proglumida aumentó la supervivencia de ratones con xenoinjerto que llevaban el tumor de colon de ratón sensible a gastrina MC26 hasta 39 días en los animales tratados desde los 25 días en los animales control.

Debido a la baja especificidad de esta clase de agentes antagonistas de gastrina para el receptor CCK-B/gastrina, se cree que la inhibición del crecimiento está inducida por una acción independiente del receptor de gastrina. Además, los receptores celulares que reconocen y se unen a la gastrina no se unen a todos los inhibidores probados (Seva et al., 1994). Por tanto, si no se produce la inhibición completa de la unión de la gastrina al receptor en la cascada de crecimiento autocrina, los antagonistas de la gastrina pueden ser incapaces de bloquear este mecanismo de potenciación del crecimiento tumoral.

Por tanto, son necesarios enfoques terapéuticos novedosos, tanto como modalidades por derecho propio, como para estrategias de combinación con quimioterapia. Los tratamientos combinados ofrecen la posibilidad de mejorar el índice terapéutico y/o reducir la dosis de quimioterapia requerida, limitando así los efectos secundarios desventajosos.

Un método terapéutico para neutralizar de manera selectiva inmunológicamente la actividad biológica de la hormona gastrina proporcionaría un medio eficaz para controlar o prevenir los cambios patológicos que resultan de la producción excesiva de la hormona gastrina asociada con los cánceres colorrectales.

Las patentes de los EE.UU. cedidas conjuntamente números 5.023.077; 5.468.494; 5.607.676; 5.609.870 y 5.622.
702 describen inmunógenos y composiciones inmunogénicas útiles para controlar los niveles de G17 y G34 en un paciente, generando anticuerpos anti-gastrina, y también describen la utilización de tales composiciones para el tratamiento de las úlceras gástricas y duodenales y los cánceres inducidos por gastrina. La presente invención se refiere al uso de inmunógenos y composiciones inmunogénicas anti-G17 descritos en las patentes números 5.023.077; 5.468.494; 5.607.676; 5.609.870 y 5.662.702 en una terapia de combinación con agentes quimioterápicos para tratar los cánceres colorrectales dependientes de gastrina.

El método de tratamiento contra el cáncer descrito en el presente documento tiene varias ventajas con respecto a los métodos de tratamiento actuales contra el cáncer colorrectal. La inmunización con anti-G17, en combinación con agentes quimioterápicos tales como el 5-FU y la leucovorina, aumenta los efectos terapéuticos controlando o inhibiendo el crecimiento del tumor colorrectal con respecto a la quimioterapia sola.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una terapia de combinación para tratar tumores que comprende neutralizar inmunológicamente hormonas peptídicas y factores que potencian la división de las células tumorales, en combinación con quimioterapia. En particular, la presente invención proporciona un método para tratar cánceres dependientes de gastrina, tales como los adenocarcinomas colorrectales. El método comprende una terapia de combinación que comprende la inmunización con anti-G17 del paciente que necesita el tratamiento, junto con la administración de uno o más agentes quimioterápicos. La inmunización con anti-G17 para tratar los tumores dependientes de gastrina es sorprendentemente eficaz en la generación de anticuerpos anti-G17, pese a los conocidos efectos mielosupresores de los agentes quimioterápicos utilizados.

La inmunización con anti-G17 comprende la inmunización activa o pasiva de un paciente con un inmunógeno anti-G17 contra la hormona G17, con el fin de controlar los niveles de G17 del paciente. Como resultado de la inducción de los anticuerpos anti-G17 en un paciente, la hormona G17 se neutraliza in vivo y sus efectos fisiológicos se inhiben, por lo que inhiben el crecimiento de las células tumorales dependientes de G17.

Además, el uso de inmunización con anti-G17 en combinación con la quimioterapia habitual aumenta la eficacia del tratamiento contra el cáncer colorrectal puesto que en combinación, pueden requerirse cantidades inferiores de los agentes quimioterápicos para tratar a un paciente, disminuyendo así sus efectos tóxicos sobre los tejidos normales. Además, puede mejorarse la calidad de vida del paciente y prolongarse el tiempo de su supervivencia.

En una realización preferida, el método comprende la inmunización activa de un mamífero que posee un tumor dependiente de gastrina con un inmunógeno anti-G17, en combinación con la administración de uno o más agentes quimioterápicos, tales como 5-fluorouracilo, leucovorina, levamisol, cisplatino, factor de necrosis tumoral y proglumida. El inmunógeno anti-G17 puede administrarse a un paciente al comienzo del tratamiento y a intervalos posteriores, según lo requiera el paciente. Los anticuerpos anti-G17 producidos por el paciente tras la inmunización se unen a G17 y la neutralizan en su forma de G17 madura, amidada, así como en sus formas precursoras, por ejemplo, G17-Gly, in vivo y evitan la unión de G17 a sus receptores, evitando así el crecimiento de las células tumorales dependientes de gastrina. Los títulos de anticuerpos anti-G17 producidos por un paciente inmunizado pueden monitorizarse a intervalos predeterminados utilizando técnicas habituales. Además, los agentes quimioterápicos pueden administrarse tal como indican los regímenes habituales o pueden administrarse dosis inferiores según lo requiera el paciente.

En otra realización, la invención proporciona además un método para tratar un tumor dependiente de gastrina que comprende la inmunización pasiva de un paciente que posee un tumor dependiente de gastrina con anticuerpos anti-G17, en combinación con uno o más agentes quimioterápicos, tales como 5-fluorouracilo, leucovorina, levamisol, cisplatino, factor de necrosis tumoral y proglumida. En una realización preferida de este aspecto de la invención, los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales humanos que pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos pueden administrarse junto con los agentes quimioterápicos al comienzo del tratamiento y a intervalos posteriores tras el tratamiento inicial, según lo requiera el paciente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un gráfico que muestra una escala de tiempo de títulos de anticuerpos séricos tras la inmunización de ratas inmunizadas con 500 \mug/ml de inmunógeno anti-G17(1-9) de rata - TD.

La figura 2 representa un gráfico que muestra los efectos del tratamiento con una dosis de 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina sobre los títulos de anticuerpos anti-G17(1-9) obtenidos en ratas inmunizadas con el inmunógeno de la invención.

La figura 3 representa un gráfico de Scatchard que muestra los efectos de ciclos de tratamiento de 30 mg/kg de 5 FU/leucovorina sobre el recuento medio de glóbulos blancos en ratas BDIX.

La figura 4 representa un gráfico de barras que muestra el peso medio de los tumores de ratas no tratadas, tratadas con anti-G17(1-9) TD y tratadas con TD.

La figura 5 representa un gráfico de barras que muestra el peso medio de los tumores de ratas tratadas con 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina; 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina e inmunógeno TD; 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina y anti-G17(1-9)-TD; 25 mg/kg de 5-FU/leucovorina e inmunógeno TD; 25 mg/kg de 5-FU/leucovorina y anti-G17(1-9)TD; 20 mg/kg de 5-FU/leucovorina e inmunógeno TD; 20 mg/kg de 5-FU/leucovorina y anti-G17(1-9)TD; 12,5 mg/kg de 5-FU/leucovorina e inmunógeno TD; y 12,5 mg/kg de 5-FU/leucovorina y anti-G17(1-9)TD.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para tratar tumores, en particular los asociados con el cáncer colorrectal dependiente de gastrina, con una terapia de combinación que comprende inmunizar a un paciente con un inmunógeno anti-G17 y tratar al paciente con agentes quimioterápicos, tales como 5-FU y leucovorina. Se ha encontrado sorprendentemente que la terapia de combinación de inmunización con anti-G17 / 5-FU-leucovorina es más eficaz que las terapias anteriores en el tratamiento del cáncer colorrectal. Los agentes quimioterápicos útiles en la terapia de combinación no inhiben significativamente la producción de anticuerpos anti-G17 en un paciente inmunizado y pueden utilizarse dosis inferiores de agentes quimioterápicos para tratar el crecimiento del tumor. Además, los títulos de anticuerpos anti-G17 producidos por la inmunización son eficaces para neutralizar todas las formas de la hormona G17.

En una realización preferida, el método comprende inmunizar activamente a un paciente aquejado de cáncer colorrectal dependiente de gastrina aplicando una composición inmunogénica anti-G17 junto con la administración al paciente de agentes quimioterápicos. Pueden administrarse inmunizaciones con anti-G17 de refuerzo posteriores, según lo requiera el paciente, tal como se determine mediante el análisis de los títulos de anticuerpos anti-G17 séricos del paciente tras la inmunización, utilizando las técnicas habituales y las evaluaciones radiológicas habituales de los tumores. También puede proporcionarse inmunización con anti-G17 a un paciente antes de la cirugía tumoral.

Los inmunógenos anti-G17 comprenden un fragmento peptídico natural o sintético de los aminoácidos del extremo N-terminal de G17 como la parte inmunoimitadora ("immunomimic") del inmunógeno. Este fragmento peptídico se conjuga con un vehículo inmunogénico tal como el toxoide diftérico (TD). En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inmunógeno anti-G17 comprende los aminoácidos del extremo amino-terminal de G17 desde la posición 1 a la 9, que tienen la secuencia de aminoácidos pyroGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu, conjugada con el toxoide diftérico. Otros vehículos proteicos inmunogénicos adecuados incluyen la albúmina sérica bovina, hemocianina de la lapa californiana (Keyhole limpet), hemocianina y toxoide tetánico.

Los inmunógenos de la invención también pueden comprender una secuencia peptídica de extensión o espaciadora adecuada para proyectar el péptido inmunoimitador fuera del vehículo proteico y para potenciar su capacidad para unirse a los receptores de linfocitos. Una secuencia peptídica espaciadora adecuada tiene la secuencia de aminoácidos SSPPPPC (SEQ ID Nº: 2 en la Lista de Secuencias). Sin embargo, también serían adecuados otros péptidos espaciadores. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia espaciadora preferida se une al extremo carboxilo-terminal del péptido inmunoimitador. Los inmunógenos de la invención se producen mediante técnicas habituales y se describen en las patentes de los EE.UU. números 5.023.077; 5.468.494; 5.607.676; 5.609.870; 5.688.506 y 5.662.702. Tras la inmunización, los inmunógenos de la invención producen anticuerpos neutralizantes de alta afinidad para inhibir los efectos de G17, en sus formas madura y precursora, sobre el crecimiento tumoral en animales inmunizados. Los anticuerpos anti-G17 producidos se unen y neutralizan la G17 madura y precursora, evitando así la unión de G17 a los receptores sobre las células tumorales e inhibiendo en última instancia el crecimiento de las células tumorales. Los inmunógenos hacen surgir anticuerpos que neutralizan tanto la G17 amidada en el extremo carboxilo como la extendida con glicina y no muestran reactividad cruzada con G34 o CCK.

Las composiciones en las que se administran inmunógenos para la inmunización activa para el tratamiento de tumores dependientes de gastrina en pacientes pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas, tales como polvos, disoluciones líquidas, suspensiones, supositorios y disoluciones inyectables y para infusión. La forma preferida depende del modo deseado de administración y de las aplicaciones terapéuticas. Las composiciones comprenden los presentes inmunógenos y los componentes adecuados farmacéuticamente aceptables, y pueden incluir otros agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, excipientes, etc., que pueden mezclarse usando procedimientos habituales. Preferiblemente, las composiciones están en la forma de dosis unitarias. La cantidad de principio activo administrado para la inmunización o como un medicamento de una sola vez, o durante un periodo de tiempo, dependerá del sujeto que se esté tratando, de la manera y la forma de administración y del criterio del médico que le trate.

Para el tratamiento del cáncer gastrointestinal, se administra al paciente una dosis eficaz que oscila desde 0,001 hasta 2 mg de la composición inmunogénica. La dosis eficaz de composición inmunogénica puede provocar una respuesta inmunológica en un paciente que consiste en niveles eficaces de título de anticuerpos para unirse y neutralizar la G17 madura y precursora durante 1 - 3 meses tras la inmunización. Tras la inmunización y el tratamiento con el agente quimioterápico con, por ejemplo, 5-FU/leucovorina, de un paciente con cáncer colorrectal, la eficacia del tratamiento contra el crecimiento del tumor se ensaya mediante procedimientos clínicos habituales, tales como ecografía y resonancia magnética nuclear (RMN), para detectar la presencia y el tamaño de los tumores, si los hay. Los títulos de anticuerpos anti-G7 también pueden monitorizarse a partir de una muestra de sangre tomada del
paciente.

Deben administrarse inmunizaciones de refuerzo, según se requiera, para mantener un título de anticuerpos eficaz. El tratamiento eficaz del adenocarcimona colorrectal dependiente de gastrina y otros cánceres dependientes de gastrina, tales como los carcinomas estomacales, hepáticos, pancreáticos y de células pequeñas de los pulmones, según este método, debe dar como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y una disminución en el tamaño del
tumor.

Para la inmunización pasiva, los anticuerpos anti-G17 se administran a un paciente por vía intravenosa usando un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Los agentes quimioterápicos se administran a las dosis recomendadas en los regímenes habituales y pueden administrarse al comienzo del tratamiento, simultáneamente con el inmunógeno anti-G17, antes de la inmunización o después de la inmunización. En algunos casos, puede ser beneficioso administrar el agente quimioterápico tanto antes como después de la inmunización. También pueden administrarse tratamientos quimioterápicos posteriores según lo requiera el paciente tras la evaluación por RMN y ecografía.

Los siguientes experimentos se realizaron para demostrar los efectos de la presente terapia de combinación sobre los cánceres colorrectales.

Ejemplo 1

Los siguientes experimentos se realizaron para determinar el posible beneficio clínico ofrecido por anti-G17(1-9)-TD. Los objetivos de este estudio fueron los siguientes:

(a) determinar el efecto a largo plazo de la inmunización con anti-G17 de rata (1-9)-TD específica sobre el aspecto histológico del tracto GI de la rata.

(b) evaluar el efecto de las combinaciones de 5-FU/leucovorina sobre los títulos de anticuerpos obtenidos a partir de anti-G17 (1-9)-TD; y

(c) determinar el efecto terapéutico de las combinaciones anti-G17(1-9)-TD y FU/leucovorina sobre el modelo de colon de rata.

Línea celular

DHDK12 es una línea celular de tumor epitelial colónico de rata (Martin, 1983). La línea celular se mantuvo en medio de crecimiento RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Escocia) que contenía un 10% de suero de ternera fetal (FCS, Sigma, Poole, RU) en condiciones humidificadas a 37ºC y 5% de CO_{2}.

Inmunógeno

El inmunógeno anti-G17(1-9)-TD consiste en los residuos de aminoácidos 1-9 de G17 unidos a través del extremo carboxilo-terminal al espaciador peptídico SSPPPPC (SEQ ID Nº:1 en la Lista de Secuencias), que a su vez se conjuga con TD. El inmunógeno utilizado en estos estudios se hizo específico para la G17 de rata, sustituyendo el epítopo de la G17 humana por los 9 aminoácidos del extremo amino-terminal de la G17 de rata, unidos a través de un espaciador peptídico al toxoide diftérico (TD). El antisuero obtenido a partir de anti-G17(1-9)-TD se denominó anti-G17(1-9) de rata:TD.

Animales de experimentación

La Cancer Studies Unit (Unidad de Estudios sobre el Cáncer), Universidad de Nottingham, RU proporcionó ratas BDIX machos y hembras, de 6 - 10 semanas de edad, que pesaban 340 - 420 g. las ratas se alojaron por parejas y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, a 25ºC con el 50% de humedad.

Antes de cada experimento, los animales se agruparon para equiparar la distribución de pesos. Los tamaños de los grupos oscilaron desde 6 - 13 animales. Se cumplieron las directrices del UK Coordinating Committee for Cancer Research (UKCCCR) (Comité de Coordinación del RU para la Investigación del Cáncer) durante toda la experimentación con animales.

Procedimiento de inmunización

Se disolvió anti-G17(1-9) de rata - TD en solución salina estéril (0,9%), pH 7,3, hasta 1 mg/ml. Se añadió el dipéptido no muramilo adyuvante (Peninsula Labs., Belmont, CA, EE.UU.) a la disolución de conjugado para dar una concentración de conjugado final de entre 200 y 500 \mug/ml. La disolución acuosa se formuló con un vehículo oleoso (Montanide ISA 703; AMS Seppic Inc., París, Francia) a una razón de 1:2 (v/v) mediante emulsificación. Tras colocarla en una jeringuilla de vidrio que estaba unida a una segunda jeringuilla a través de una llave de paso de tres vías, la mezcla se forzó hacia atrás y hacia delante a través de las jeringuillas 40 veces hasta formar una emulsión. Se formuló de manera similar una emulsión que contenía el péptido TD y el dipéptido muramilo para las ratas control. Se inyectó un volumen de emulsión de 200 \mul (50 \mul/rata) por vía s.c. (en el costado derecho de los animales de experimentación). Los animales se inmunizaron con una única inyección o repetidamente a intervalos de 21 días tal como se detalla más adelante.

Régimen de tratamiento citotóxico

Las ratas recibieron 12,5 y 25 mg/kg de 5-fluorouracilo (5-FU, David Bull Labs., Warwick, RU) y 12,5 - 25 mg/kg de leucovorina (Lederle Labs., Gosport, Hants, RU) administrados por vía intravenosa (i.v.) en los días 1, 3 y 5, repitiéndose el ciclo cada 4 semanas durante la duración del periodo del estudio (Asao, 1992). La combinación citotóxica se administró a las ratas antes o después de la inmunización con anti-G17(1-9)-TD (200 \mug/ml).

Iniciación del crecimiento del tumor

Se suspendieron las células DHDK12 en la línea tamponada con fosfato estéril (PBS (solución salina tamponada con fosfato), Oxoid, Hants., RU) a una concentración de células de 2,5 x l0^{7}/ml. Las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 1 ml de Hypnorm (0,315 ng/ml de citrato de fentanilo y 10 mg/ml de fluanisona; Jannsen, Beerse, Bélgica), Hypnovel (5 ng/ml de midazolam; Roche, Basilea, Suiza), y agua destilada estéril a una razón de 1:1:5. Tras una incisión subcutánea (s.c.) en el costado derecho, se inyectó un volumen de 200 \mul de la suspensión celular en la capa muscular de la pared abdominal y la incisión quirúrgica se cerró mediante grapas. Cada grupo experimental estaba compuesto por entre 6 y 13 animales.

Determinación de niveles de anticuerpos específicos de ratas inmunizadas con anti-Gl7 de rata (1-9)-TD

Para obtener muestras de sangre para su análisis, se extrajo sangre de la cola de las ratas en varios puntos de tiempo durante todo el experimento y a la terminación mediante punción cardiaca bajo anestesia terminal. Los niveles séricos del anticuerpo anti-G17 de rata se determinaron mediante el ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA). Un conjugado de G17 de rata - albúmina sérica bovina (BSA) se disolvió hasta 2 \mug/ml en tampón glicina 0,1 M (pH 9,5) y se sembraron en placa 25 \mul por pocillo, en placas de 96 pocillos Immunulon U (Dynatech Labs., Sussex, RU). Los pocillos se incubaron durante la noche a 4ºC, tras lo que se apartó el conjugado no adsorbido y los pocillos se lavaron con tampón (0,9% de solución salina, 0,5% de Tween 20 [Sigma], 0,02% de NaN_{3} [Sigma], pH 7,3). Este tampón se utilizó para todas las etapas de lavado y las diluciones de reactivos. Los sueros se trataron en diluciones seriadas de 10 veces, comenzando a una dilución 1:100. El control positivo fue antisuero anti-G17(1-9) de rata - TD de rata de animales inmunizados previamente y los controles negativos fue suero de rata normal, y suero de ratas inmunizadas con TD solamente. Todos los sueros control se utilizaron con las mismas diluciones que los sueros de prueba. Los sueros diluidos se añadieron a los pocillos en alicuotas de 25 \mul en presencia o ausencia de 25 \mul/pocillo de G17 de rata - BSA a 100 \mug/ml (como un inhibidor soluble). Los pocillos control iniciales recibieron 25 \mul de tampón del ensayo solamente. Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de lavarlas con el tampón del ensayo. Se añadió inmunoglobulina anti-rata de cabra (H+L)-biotina (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.) a los pocillos a una dilución de 1:500, 50 \mul/pocillo y se incubó durante 60 minutos, en la oscuridad a temperatura ambiente. Tras el lavado, se añadió avidina-fosfatasa alcalina (Zymed), a una dilución de 1:100 (50 \mul/pocillo) y las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado adicional, se añadió el sustrato fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) (Sigma) a los pocillos a 50 \muI/pocillo y tras un tiempo de revelado de 5 minutos, se leyó la absorbancia a 405 nm. Se calculó la diferencia en la absorbancia entre los sueros no tratados y los sueros coincubados con G17 de rata - BSA, como la absorbancia
específica.

Determinación de los recuentos de glóbulos blancos

Se recogió sangre heparinizada de las ratas mediante extracciones de la cola durante el experimento y mediante punción cardiaca a la terminación del experimento. Los números de glóbulos blancos se analizaron por el Departamento de Hematología en el Hospital Universitario, Nottingham con el uso de un FACScan (citómetro de flujo analizador).

Histología

A la muerte de las ratas inmunizadas a largo plazo con anti-G17(1-9)-TD, se diseccionaron áreas representativas del estómago, colon y recto de las ratas inmunizadas y controles de la misma edad y se fijaron con formalina. Las secciones se embebieron en parafina y se cortaron secciones de 4 \mum mediante el uso de un micrótomo. Éstas se tiñeron mediante hematoxilina y eosina y se evaluaron por un histopatólogo que no tenía conocimiento de los grupos de tratamiento.

Tasa de proliferación de la cripta

Una hora antes de la muerte de los animales, se inyectó vincristina (2 mg/kg, Sigma) por vía intraperitoneal para inducir la interrupción de la metafase en el epitelio colónico, antes de la evaluación de la proliferación de las células de la cripta colónica (CCPR). Se contó el número de células en metafase por cripta. Se extrajeron el colon y el recto de cada rata, se abrieron longitudinalmente y la mucosa de cada uno se fijó con solución de Carnoy. Las criptas se aplastaron suave y longitudinalmente bajo un microscopio de disección y se enumeró el número de células en metafase (aumentos x 25).

Análisis estadístico

Se analizaron los resultados in vivo mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney mediante el uso del paquete estadístico SPSS para el PC IBM.

Estudios anti-G17(1-9)-TD a largo plazo

Se inmunizaron cinco ratas macho con inmunógeno anti-G17(1-9) de rata - TD tal como se describió anteriormente, y sus títulos de anticuerpos se midieron durante un periodo de 34 semanas tras una única inmunización. En este punto, se administró a las ratas una dosis de refuerzo con una segunda inyección de anti-G17(1-9) de rata - TD. Los resultados se muestran en la figura 1. La figura 1 muestra una escala de tiempo de hasta 40 semanas tras la inmunización de títulos de anticuerpos de ratas inmunizadas con 500 \mug/ml de anti-G17(1-9) de rata - TD. Cada punto representa un animal individual. Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo ELISA, tal como se describió anteriormente, utilizando una dilución de los sueros de 1:100. Las inmunizaciones se indican mediante la flecha. Tras la inmunización primaria, 4 de las 5 ratas respondieron al inmunógeno de anti-G17(1-9) de rata - TD. Tras esta única inyección, fueron detectables anticuerpos hacia la semana 7 en 3 de 5 ratas y en 4 de 5 ratas hacia la semana 9. A esta obtención inicial de anticuerpos le siguió una segunda obtención entre 15 - 20 semanas, tras lo que los títulos de anticuerpos disminuyeron de manera constante y se aproximaron a cero hacia la semana 34. En este punto, la figura 1 también muestra que tras una segunda inmunización con anti-G17(1-9) de rata - TD, todas las ratas tenían títulos de anticuerpos anti-G-17 de rata detectables en un plazo de 1 - 2 semanas tras la inmunización.

Ejemplo 2 Análisis histológico de ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD a largo plazo

Se evaluaron histológicamente muestras de estómago, colon y recto tras tinción con hematoxilina y eosina, tal como se describen en el ejemplo 1. Éstas se compararon con las muestras de ratas control de igual edad y sexo. Todas las áreas del tracto GI evaluadas fueron idénticas tanto en las ratas tratadas con anti-G17(1-9)-TD como en las ratas controles de igual edad con respecto a la longitud de las vellosidades / criptas / altura de la mucosa. En el estómago, las células similares a enterocromafines (ECL) fueron similares en número y aspecto en los dos grupos de animales objeto. Sin embargo, hubo cierta evidencia de granulación de las células G en la mucosa del estómago de las ratas tratadas con anti-G17(1-9)-TD.

Ejemplo 3 Tasa de proliferación de células de la cripta (CCPR) del epitelio colónico de ratas inmunizadas con anti-Gl77(1-9)-TD a largo plazo

Se analizó las CCPR del epitelio colónico y los títulos de anticuerpos anti-G17 de rata, tal como se describió anteriormente. La tabla I muestra los resultados obtenidos a partir de 4 de 5 ratas evaluadas en comparación con las CCPR para los títulos de anticuerpos anti-G17 de rata. Las CCPR medias para las ratas control fue de 18,93 (desviación estándar de 3,2) y para las ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD fue de 23,7 (desviación estándar de 7,9). No hubo diferencia estadística en las CCPR entre las ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD y las ratas control de igual edad. Estos resultados indican que la tasa de división de las células de la cripta en un epitelio colónico es la misma para las ratas control y para las ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)TD.

TABLA I Comparación de los títulos de anticuerpo anti-G17 de rata:TD con la proliferación de las células de la cripta del colon

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Ejemplo 4 Efecto del tratamiento citotóxico antes y después sobre los niveles de anticuerpos obtenidos por anti-G17(1-9) de rata - TD

Se inyectó a las ratas por vía intravenosa, a una razón de 1:1, 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina, tal como se describió en el ejemplo 1, antes o después de la inmunización con anti-G17(1-9)-TD. Cada grupo consistió en 6 ratas machos y 6 hembras por grupo y se midieron los títulos medios de anticuerpos mediante una técnica de ELISA utilizando una dilución de los sueros de 1:100. Se midieron los niveles de anticuerpos en cada rata a partir de muestras de sangre, tal como se describió en el ejemplo 1.

La figura 2 muestra el efecto del tratamiento citotóxico antes y después con ciclos de 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina sobre los títulos de anticuerpos obtenidos mediante la inmunización con anti-G17(1-9)-TD (500g/ml). En la figura, los datos se representan tal como sigue: -\Box- sin tratamientos citotóxicos, 7 inmunizaciones; -\blacklozenge- 2 inmunizaciones antes de 4 tratamientos citotóxicos; -\circ- 1 inmunización antes de 4 tratamiento citotóxicos; -\triangle- 1 tratamiento citotóxico antes de 4 inmunizaciones (2 tratamientos citotóxicos durante las inmunizaciones); -\boxplus- 2 tratamientos citotóxicos antes de 4 inmunizaciones; -*- 3 tratamientos citotóxicos antes de 3 inmunizaciones; y -\bullet- 4 tratamientos citotóxicos antes de 2 inmunizaciones.

La figura 2 muestra la media de 6 ratas hembras y 6 machos por grupo. Las desviaciones estándar fueron de aproximadamente el 10% de la media. No hubo efecto significativo sobre los títulos de anticuerpos por el pretratamiento con la combinación citotóxica 5-FU/leucovorina ni sobre los niveles de anticuerpos obtenidos ni sobre el tiempo que se tardó en lograr estos niveles cuando se comparó con las ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD no tratadas. El número máximo de ciclos de tratamiento evaluados fue de 4 ciclos de tratamiento citotóxico seguido por 2 inmuniza-
ciones.

La figura 3 muestra los efectos del tratamiento sobre los recuentos medios de glóbulos blancos (WBC), en ratas BDIX.

El efecto del tratamiento citotóxico con 30 mg/kg de 5-FU/leucovorina en ratas BDIX que recibieron 4 tratamientos citotóxicos antes de 2 inmunizaciones sobre los recuentos medios de glóbulos blancos (WBC), se muestra en la figura 3. Tal como se muestra en la figura, hubo una reducción significativa en los recuentos de WBC en las ratas representativas evaluadas, tras el tratamiento citotóxico (p < 0,005, prueba de la t de Student). Los recuentos se redujeron por el número de ciclos de tratamiento citotóxico, lo que indica cierta mielosupresión. Sin embargo, no hubo efecto sobre la respuesta de los anticuerpos frente a anti-G17(1-9)-TD producidos por las ratas, tal como se muestra en la figura 2.

Ejemplo 5 Efecto de la terapia de combinación de 5-FU, leucovorina y anti-G17(1-9)-TD sobre el crecimiento in vivo de tumores DHDK12

Se probaron los efectos de las terapias combinadas con 5-FU/leucovorina (12,5 - 30 mg/kg) y anti-G17(1-9) de rata – TD (200 \mug/ml) sobre el crecimiento de la línea celular DHDK12 de tumor de colon de rata, en la capa muscular de la pared abdominal de ratas BDIX, por comparación con tumores en animales control, tal como se describió en los ejemplos anteriores. Al final de los tratamientos, se sacrificaron las ratas, se extirparon sus tumores y se pesaron utilizando procedimientos habituales. Cada grupo consistió en 10 - 12 ratas/grupo de ambos sexos. Los pesos medios de los tumores se muestran con los intervalos intercuartílicos sobre las columnas. Se realizaron evaluaciones estadísticas mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney, tal como se describe en el ejemplo 1.

Las figuras 4 y 5 muestran el efecto de la inmunización con anti-G17(1-9)-TD sobre los pesos medios finales de los tumores de ratas BDIX a las que se implantaron células tumorales DHDK12 en la capa muscular de la pared abdominal. Esta vía de implantación da como resultado un tumor bien vascularizado que se puede tratar con tratamientos administrados en la circulación (Watson, 1996). Anteriormente se había demostrado que anti-G17(1-9) de rata - TD inhibía el peso final de los tumores DHDK12 en un 56,5%, cuando se administraba a una dosis de 500 \mug/ml (Watson, 1996). En los presentes experimentos, para detectar cualquier beneficio de la terapia de combinación con 5-FU/leucovorina, se disminuyó la dosis de anti-G17(1-9)-TD hasta 200 \mug/ml, lo que dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento de los tumores del 25,7%, tal como se muestra en la figura 4. La figura 4 muestra los datos de los tumores extirpados de las ratas control no tratadas, las tratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD y las ratas inmunizadas con TD. Tras un periodo de tiempo de 50 días, las ratas no tratadas tenían un peso medio de los tumores de 4,43 g. La inmunización con TD dio como resultado un peso medio de los tumores de 4,7 g, que no fue significativamente diferente de los pesos de los tumores de las ratas no tratadas, pero que fue significativamente mayor que el peso medio de los tumores de las ratas inmunizadas con anti-G17(1-9)-TD (3,49 g, p = 0,034, Mann-Whitney).

La figura 5 muestra que 5-FU/leucovorina sola, administrada a 30 mg/kg, redujo significativamente el peso de los tumores hasta una media de 1,01 g (p = 0,0106 cuando se comparó con las ratas control no tratadas). Cuando las ratas se trataron con la misma dosis citotóxica de 5-FU/leucovorina, junto con inmunización con TD, el peso medio de los tumores no fue significativamente diferente (0,945 g).

Una combinación de 5-FU/leucovorina a 30 mg/kg y inmunización con anti-G17(1-9) de rata - TD dio como resultado un peso medio de los tumores de 0,68 g, que no fue significativamente diferente del grupo tratado con 5-FU/leucovorina/TD (p = 0,27). La combinación de 25 mg/kg de 5-FU/leucovorina e inmunización con TD dio como resultado un peso medio de los tumores de 0,96 g, en comparación con un peso medio de los tumores de 0,68 g
en el grupo de terapia de combinación con 5-FU/leucovorina junto con inmunización con anti-G17(1-9)-TD, que no fue significativo (p = 0,409). Cuando se redujo la dosis de 5-FU/leucovorina hasta 20 mg/kg, la combinación 5-FU/leucovorina/inmunógeno TD dio como resultado un peso medio de los tumores de 1,23 g. El peso medio de los tumores se redujo significativamente hasta 0,71 g cuando se combinaron 20 mg/kg de 5-FU/leucovorina con inmunización con anti-G17(1-9)-TD (p = 0,027, Mann-Whitney).

Finalmente, la figura 5 también muestra que una dosis de 5-FU/leucovorina de 12,5 mg/kg, combinada con inmunización con anti-G17(1-9)-TD (p = 0,015, Mann-Whitney) reduce el peso medio de los tumores desde 1,34 g hasta 0,41 g. Se compararon las combinaciones 5-FU/leucovorina-anti-G17(1-9)-TD y no existió diferencia estadísticamente significativa entre anti-G17(1-9)-TD administrado en combinación con 12,5, 20 ó 30 mg/kg de 5FU/leucovorina.

Debido al limitado beneficio mostrado por la quimioterapia de combinación con 5-FU/leucovorina tanto en un estado de cáncer avanzado como, en particular, con una práctica de tratamiento de terapia complementaria (Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993; Petrioli, 1995), puede que se necesite administrar nuevas modalidades terapéuticas, o bien junto con 5-FU/leucovorina para mejorar el índice terapéutico (y posiblemente para reducir la dosis de agente quimioterápico para limitar la toxicidad) o bien como un tratamiento de segunda línea si la quimioterapia no es eficaz. Por tanto, debe haber nuevos tratamientos dispuestos para su uso. Anteriormente se pensaba que los enfoques inmunoterápicos, junto con la quimioterapia, serían un problema debido a la mielosupresión asociada con los agentes quimioterápicos, tal como la observada con 5-FU/leucovorina (Mahood, 1991). Sin embargo, en el presente estudio, la mielosupresión de ratas inducida con combinaciones de 5-FU/leucovorina de 30 mg/kg, administradas según Asao et al. a la dosis máxima tolerada, no afectó ni al nivel ni al tiempo para lograr títulos de anticuerpos anti-G17 de rata:TD tras la inmunización con el inmunógeno anti-G17(1-19)-TD.

En estudios de tratamiento utilizando 5-FU/leucovorina en combinación con anti-G17(1-9)-TD, se logró una potenciación de las dosis de 20 mg/kg y 12,5 mg/kg. La dosis de 20 mg/kg fue tan eficaz como la dosis máxima tolerada cuando se combinó con anti-G17(1-9)-TD, y la dosis de 12,5 mg/kg mostró una tendencia a un mayor efecto terapéutico. La razón para esta última tendencia no se conoce pero puede deberse a la dosis citotóxica que afecta al sistema inmunitario en un menor grado que los niveles de dosis superiores, lo que pueden ayudar en la respuesta inflamatoria general frente al tumor. 5-FU/leucovorina administrado en ciclos continuos parecería ejercer un efecto "todo o nada" sobre el crecimiento del tumor, ya que se encontró que disminuir la dosis hasta 1 mg/kg no ejercía inhibición del crecimiento tumoral. El efecto terapéutico puede valorarse más gradualmente reduciendo el número de ciclos tóxicos (Watson, comunicación personal). Por tanto, en las combinaciones según la presente invención pueden administrarse dosis inferiores a las habituales de 5-FU/leucovorina, reduciéndose así los efectos secundarios de los fármacos, mientras que al mismo tiempo, puede lograrse la destrucción eficaz de las células tumorales utilizando la presente combinación, puesto que el sistema inmunitario sólo está mínimamente afectado. Por tanto, se potencia el efecto inhibitorio del crecimiento de la inmunización con anti-G17(1-9)-TD. Estas características de la terapia de combinación son inesperadas y sorprendentes, en vista de los efectos mielosupresores de los propios agentes quimioterápicos.

Además, por la ausencia de efectos nocivos en el huésped, es probable que la inmunización con anti-G17(1-9)-TD sea un tratamiento a largo plazo, tal como se muestra por el espacio de tiempo en que los anticuerpos que se podían medir estaban presentes en las ratas que recibieron una única inmunización. Se demostró que la primera inmunización era eficaz en un 80%, en lo que se refiere a la inducción de anticuerpos anti-gastrina, y eficaz en un 100% tras la segunda inmunización con un aumento inmediato en los niveles de anticuerpos. Aunque puede lograrse la potenciación de la quimioterapia mediante una única inyección de anti-G17(1-9)-TD, en la mayoría de los huéspedes la ausencia de efectos secundarios, característicos de la inmunización con anti-G17(1-9)-TD, y la tasa de respuesta del huésped tras las dosis de refuerzo, indican que puede ser deseable un régimen de múltiples inyecciones. A pesar del periodo de tiempo en que los anticuerpos anti-G17 de rata permanecían en la circulación, no pareció haber efectos nocivos a largo plazo sobre el tracto GI, tal como se determinó mediante una simple evaluación histológica. Además, el índice de proliferación de células de la cripta de las células mucosas en el colon no reveló efecto significativo sobre su crecimiento.

Ejemplo 6 Tratamiento de pacientes humanos con cáncer de colon con una terapia de combinación de 5-FU/leucovorina y anti-G17(1-9)-TD

Se ha demostrado anteriormente que la inmunización con anti-G17(1-9)-TD sola es una opción terapéutica valiosa y segura en el tratamiento del cáncer dependiente de gastrina. Las presentes combinaciones de inmunógenos anti-G17 con 5-FU/leucovorina mejoran la eficacia del tratamiento contra el cáncer, en particular del tratamiento contra el cáncer de colon, y la posible reducción en la dosis de agente quimioterápico requerida en la combinación debe reducir los efectos secundarios citotóxicos nocivos de cualquiera de los agentes quimioterápicos en uso en este momento. Las presentes combinaciones de un inmunógeno con agentes quimioterápicos también pueden ser útiles como tratamiento de segunda línea en pacientes que no responden a la quimioterapia sola.

Los pacientes humanos con tumor colorrectal o cáncer de colon se tratan con una combinación de quimioterapia e inmunoterapia.

Específicamente, para los pacientes con tumores colorrectales o cáncer de colon que responden a gastrina, pueden tratarse con la administración concomitante de 5-FU/leucovorina y una composición de inmunógeno anti-G17 o anticuerpos anti-G17.

En particular, la inmunoterapia preferida proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de péptido G17(1-9) amino-terminal:TD en un vehículo farmacéuticamente aceptable que puede incluir un adyuvante para estimular adicionalmente la respuesta inmunitaria.

El régimen inmunoterápico preferido puede comenzar antes, durante o después del ciclo de quimioterapia dependiendo de consideraciones clínicas. Por ejemplo, en un paciente con una gran carga tumoral, puede ser ventajoso comenzar con varios ciclos de quimioterapia para reducir el volumen del tumor y después comenzar con la inmunoterapia.

Alternativamente, en un paciente con una pequeña carga tumoral o tras la cirugía curativa, la inmunoterapia puede comenzarse antes o durante la quimioterapia.

La dosis de inmunización activa puede oscilar entre 300 \mug hasta 1200 \mug del inmunógeno anti-G17, dependiendo del estado inmunitario del paciente (o de la capacidad de una respuesta inmunitaria). Los intervalos entre las inyecciones pueden ser en los días 1, 7 y 14; o en los días 1, 14 y 21, o en los días 1, 14, y después 28 y 56. Tales programas pueden dar como resultado títulos de anticuerpos similares. Los programas acelerados de inmunización proporcionan la posibilidad de un comienzo anterior de la respuesta inmunitaria.

El método preferido de la terapia anti-gastrina hace que se administre una dosis de refuerzo cada 6 meses tras el periodo de inmunización inicial, independientemente de qué protocolo se utilice.

Todavía otro método preferido de la neutralización eficaz de G17, Gly-G17 y G17-NH_{2} proporciona inmunización pasiva con anticuerpos anti-G17, preferiblemente en forma purificada. Más específicamente, la inoculación de 10 - 1000 \mug de anticuerpos anti-G17(1-9) se administra antes, durante y/o tras los ciclos de quimioterapia para el control de las actividades de la gastrina. La inmunización pasiva puede administrarse de forma diaria, semanal o cada dos semanas. Pueden seguirse otros protocolos dependiendo de la eficacia del tratamiento.

Otra combinación de tratamiento proporciona una inmunización pasiva inicial antes y/o durante el primer ciclo de quimioterapia, seguido por inmunización activa, tal como se describió anteriormente.

Están en uso muchos regímenes de quimioterapia. Estos regímenes reconocidos en la técnica, aunque no se han descrito en el presente documento, no se excluyen del tratamiento de combinación según esta invención. Un régimen de quimioterapia preferido proporciona bolos i.v. de 5-FU de 425 mg/m^{2} con infusión i.v. de leucovorina (ácido fólico, AF, 20 mg/m^{2}) durante 1 - 5 días por periodo hasta 4 semanas.

Otro régimen preferido proporciona 200 mg/m^{2} de AF durante un periodo de 2 h, seguido por bolos i.v. de 5-FU de 400 mg/m^{2} + 5-FU de 600 mg/m^{2} durante 22 horas, 1 ó 2 días, en un periodo de 2 semanas.

Todavía otro régimen preferido proporciona una infusión continua de 5-FU de 250 - 300 mg/m^{2} al día i.v. continua durante 4 - 6 semanas, seguido por 2 semanas de descanso.

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<110> APHTON CORPORATION

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<120> Terapia de combinación para el tratamiento de tumores

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<130> 1102865-0034

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<140> EE.UU.

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<141> 14-05-1999

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<150> US 60/085,687

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<151> 15-05-1998-

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> péptido humano o sintético

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> ácido piroglutámico

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<400> 1

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\sa{Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu}

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<210> 2

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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<400> 2

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\sa{Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys}

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Claims (9)

1. Combinación adecuada para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina, que comprende:

(i)

un inmunógeno que contiene el péptido inmunoimitador de gastrina G17, y

(ii)

uno o más agentes quimioterápicos para tratar el tumor.

2. Combinación según la reivindicación 1, en la que el agente quimioterápico se selecciona de 5-fluorouracilo, leucovorina, levamisol, cisplatino, factor de necrosis tumoral y proglumida.

3. Combinación según la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido inmunoimitador de gastrina G17 se conjuga con un vehículo de toxoide diftérico.

4. Combinación según la reivindicación 1 ó 2, en la que el inmunógeno que contiene el péptido inmunoimitador de gastrina G17 comprende el péptido inmunoimitador de gastrina G17, un vehículo proteico y un péptido espaciador adecuado para proyectar el péptido inmunoimitador de gastrina G17 fuera del vehículo proteico y para potenciar su capacidad para unirse a receptores de linfocitos.

5. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el péptido inmunoimitador de gastrina G17 tiene la SEQ ID Nº: 1.

6. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para tratar un tumor dependiente de gastrina en un paciente.

8. Combinación según la reivindicación 1, que contiene como agentes quimioterápicos 5-fluorouracilo y leucovorina, para tratar un tumor colorrectal dependiente de gastrina en un paciente.

9. Uso de una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de una formulación para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de gastrina.