ES2210756T3 - Utilizacion de agonistas del glp-2 para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior. - Google Patents

Utilizacion de agonistas del glp-2 para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior.

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ES2210756T3 ES98922546T ES98922546T ES2210756T3 ES 2210756 T3 ES2210756 T3 ES 2210756T3 ES 98922546 T ES98922546 T ES 98922546T ES 98922546 T ES98922546 T ES 98922546T ES 2210756 T3 ES2210756 T3 ES 2210756T3
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Abstract

La invención se refiere a péptidos relacionados con el glucagon y a su utilización para la prevención o el tratamiento de enfermedades que afectan al tracto gastrointestinal superior incluyendo el esófago y el estómago. En particular, se ha demostrado recientemente que la GLP-2 y los agonistas peptídicos de la GLP-2 pueden provocar la proliferación de tejidos del tracto gastrointestinal superior. De esta forma la invención proporciona procedimientos de proliferación del tracto gastrointestinal superior en un sujeto en el que sea necesario. Además, los procedimientos de la invención son útiles para el tratamiento o la prevención de condiciones inflamatorias del tracto gastrointestinal superior, incluyendo las enfermedades inflamatorias. La GLP-2 estimula el crecimiento del tejido gastrointestinal superior cuando se administra en conjunción con otras hormonas peptídicas. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas de GLP-2 con al menos otra hormona peptídica, procedimientos para mejorar el crecimiento del tejido gastrointestinal superior y las enfermedades gastrointestinales incrementando los niveles en suero de la GLP-2 y al menos otra hormona peptídica, además se suministran equipos para la realización de los procedimientos de la invención.

Description

Utilización de agonistas del GLP-2 para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior.
Campo de la invención
Esta invención trata de péptidos relacionados con el glucagón y sobre su utilización, bien sólos o en combinación con otras hormonas peptídicas, para la prevención o el tratamiento de desórdenes que involucran al tracto gastrointestinal superior.
Antecedentes de la invención
El péptido semejante al glucagón 2 (GLP-2) es un péptido de 33 aminoácidos que se expresa de forma específica en cada tejido a partir del gen pleiotrópico del glucagón. El GLP-2 presenta una notable homología en términos de secuencia aminoacídica con el glucagón y el péptido semejante al glucagón 1 (GLP-1). Además, las diferentes formas del GLP-2 en mamíferos están altamente conservadas. Por ejemplo, el GLP-2 humano y el GLP-2 del degú (un roedor sudamericano) se diferencian del GLP-2 de rata en uno y tres aminoácidos respectivamente. Cuando se administra de forma exógena, el GLP-2 puede producir un incremento notable en la proliferación del epitelio del intestino delgado en ratones, aparentemente sin efectos secundarios no deseados (Drucker et al., 1996, PNAS:USA 93:7911-7916). Posteriormente se demostró que los análogos peptídicos del GLP-2 nativo con ciertas modificaciones en la secuencia peptídica poseen una mejor actividad trófica en el intestino delgado (ver aplicación en trámite U.S. Serial No. 08/669,791, presentada el 28 de Junio del 1996, que se incorpora aquí como referencia). Además, también se ha demostrado que el GLP-2 puede hacer proliferar el tejido del intestino grueso (aplicaciones en trámite U.S. Serial No. 08/763,177, presentada el 10 de Diciembre del 1996, y U.S. Serial No. 08/850,664, presentada el 2 de Mayo del 1997, y Litvak et al., 1997, Gastroenterology, vol. 112 (4 Suppl.), pág. A1455, las cuales se incorporan aquí como referencia). Además, se ha demostrado que el GLP-2 también disminuye la razón de transporte máxima de D-glucosa a través de la membrana basolateral intestinal (Cheeseman and Tseng, 1996, American Journal of Physiology 271:G477-G482).
Se ha demostrado que determinadas hormonas peptídicas no relacionas estructuralmente con el GLP-2 poseen cierto grado de actividad trófica. Por ejemplo, se ha demostrado que el factor de crecimiento semejante a la insulina 2 (IGF-2) promueve la mitosis de las células de la cripta del intestino delgado in vivo (U.S. Patent No. 5,482,926). Se ha demostrado que el factor de crecimiento 1 semejante a la insulina (IGF-1), que comparte un 64% de identidad de secuencia con el IGF-2, y sus análogos peptídicos también incrementan la tasa de crecimiento del tejido del intestino in vivo (WO 91/12018). Se ha demostrado que la hormona del crecimiento (GH) posee ciertos efectos fisiológicos, entre los que se incluyen el incremento en la proliferación de la mucosa intestinal (ver, por ejemplo, Willmore, U.S. Patent No. 5,288,703), mejorando de esta manera la capacidad de absorción del intestino. Sin embargo, ninguna de las hormonas peptídicas anteriores posee la eficacia o la especificdad del GLP-2 en la promoción de la proliferación del tejido del tracto gastrointestinal inferior.
Resumen de la invención
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los agonistas del receptor del GLP-2 mejoran el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior. En particular, se ha demostrado que el GLP-2 puede hacer proliferar el tejido del esófago y del estómago. De esta forma, uno de los objetivos generales de la presente invención consiste en explotar los agonistas del receptor GCP-2 con objetivos terapéuticos u objetivos relacionados.
En particular, se ha demostrado que el GLP-2 y los análogos peptídicos del GLP-2 pueden provocar la proliferación del tejido del tracto gastrointestinal superior. Así pues, uno de los aspectos de la invención proporciona un método para hacer proliferar el tejido del tracto gastrointestinal superior en un individuo que lo necesite, comprendiendo la administración al tracto gastrointestinal superior del sujeto de una cantidad de GLP-2 o de un análogo del GLP-2 capaz de promover la proliferación del tracto gastrointestinal superior.
Además, se ha demostrado que el GLP-2 puede aliviar la toxicidad gastrointestinal inducida por los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID). Así pues, la invención proporciona métodos para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un sujeto con una condición inflamatoria, o con riesgo de padecerla, del gastrointestino que incluye el tracto gastrointestinal superior, comprendiendo la administración al tracto gastrointestinal superior de una cantidad efectiva del GLP-2 o de un análogo del GLP-2.
En particular, y de acuerdo con uno de los aspectos de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que sufra de una condición que involucre el tracto gastrointestinal superior, en el cual se administra GLP-2 o un análogo del GLP-2 al tracto gastrointestinal superior en una cantidad capaz de mejorar la condición.
En un aspecto relacionado de la invención, se proporciona un método para tratar a un sujeto con el esófago dañado, parcialmente resecado, erosionado o inflamado, comprendiendo el paso de administración al sujeto una cantidad de GLP-2 o de un análogo del GLP-2 en un vehículo aceptable para su uso farmacéutico o veterinario capaz de aliviar el daño o la inflamación en el tracto gastrointestinal superior. En otro aspecto adicional de la invención, se proporcionan GLP-2 o un análogo del GLP-2 en una forma aceptable para su uso farmacéutico o veterinario en una cantidad suficiente para provocar la proliferación del tracto gastrointestinal superior.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto con el estómago dañado, atrófico o inflamado comprendiendo el paso de administración al sujeto de GLP-2 o un análogo del GLP-2 en un vehículo adecuado para su uso farmacéutico o veterinario en una cantidad capaz de provocar una mejora del daño o la inflamación del estómago. En otro aspecto adicional de la invención, se proporciona GLP-2 en una forma aceptable para su uso farmacéutico o veterinario en una cantidad efectiva para provocar la proliferación del tejido del estómago.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar profilácticamente a un sujeto con riesgo de desarrollar una condición inflamatoria del gastrointestino que incluye el tracto gastrointestinal superior incluyendo los pasos de:
a) identificación del sujeto con riesgo de desarrollar una condición inflamatoria que incluya el tracto gastrointestinal superior; y
b) adiministración al sujeto de una cantidad de GLP-2 o de un análogo del GLP-2 efectiva para inhibir la aparición de la condición inflamatoria.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar péptidos útiles para el tratamiento de las condiciones inflamatorias que involucran el tracto gastrointestinal superior comprendiendo los pasos de:
a) la obtención de un análogo del péptido GLP-2 de vertebrados, teniendo dicho análogo al menos una sustitución o deleción en su secuencia de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) la inducción de una condición inflamatoria en el tracto gastrointestinal superior en un animal de prueba;
c) el ensayo en el animal de prueba con una condición inflamatoria inducida en el tracto gastrointestinal superior con el análogo, utilizando un régimen capaz de provocar una mejora de la condición inflamatoria del tracto gastrointestinal superior cuando se utiliza para [Gly2]GLP-2 humano; y
d) la determinación del efecto del análogo en el estado de salud o mortalidad del animal de prueba comparado con animales control que no han recibido el péptido o la determinación de la masa del tracto gastrointestinal superior de los animales de prueba comparada con animales control que no han recibido el péptido.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar los péptidos útiles para prevenir o aliviar las condiciones inflamatorias que involucran el tracto gastrointestinal superior comprendiendo los pasos de:
a) la obtención de un análogo del péptido GLP-2 de vertebrados, teniendo esta análogo al menos una sustitución, deleción o adición en su secuencia de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) el tratamiento del animal de prueba con el análogo utilizando un régimen capaz de provocar una mejora de la condición inflamatoria del tracto gastrointestinal superior cuando se utiliza para [Gly2]GLP-2 humano;
c) la inducción de una condición inflamatoria del tracto gastrointestinal superior en un animal de prueba;
e) la determinación del efecto del análogo en el estado de salud o en la mortalidad del animal de prueba comparado con animales control que no reciben el péptido o la determinación de la masa del tracto gastrointestinal superior de animales de prueba comparada con la de los animales control que no han recibido el péptido.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar de forma profiláctica a un sujeto con riesgo de desarrollar una condición inflamatoria del gastrointestino que incluye el tracto gastrointestinal superior comprendiendo los pasos de:
a) identificación de un sujeto con riesgo de desarrollar una condición inflamatoria que involucre al tracto gastrointestinal superior; y
b) la administración al sujeto de una cantidad de GLP-2 o de un análogo de GLP-2 efectiva para inhibir la aparición y/o aliviar el desarrollo de la condición inflamatoria.
En un aspecto relacionado de la invención, se proporciona un método útil para la identificación de péptidos capaces de hacer proliferar el tejido del tracto gastrointestinal superior comprendiendo los pasos de:
a) obtención de un análogo de péptido GLP-2 de vertebrado, teniendo dicho análogo al menos una sustitución, deleción o adición en su cadena de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) llevar el análogo al tracto gastrointestinal superior del animal de prueba utilizando un régimen capaz de hacer proliferar el tracto gastrointestinal superior cuando se utiliza para [Gly2]GLP-2 humano; y
c) evaluación del incremento en la masa, longitud o contenido total de proteína del tracto gastrointestinal superior o de una porción representativa una vez se ha completado el régimen de tratamiento.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para cultivar tejido o las células del tracto gastrointestinal superior, que comprende el paso del cultivo del tejido o de las células en un medio de cultivo al que se ha añadido una cantidad de GLP-2 o de un análogo del GLP-2 capaz de promover el crecimiento.
La invención también se basa, en parte, en la esperanza que el GLP-2 o bien un análogo del GLP-2 actuen de forma sinérgica con las hormonas peptídicas IGF-1 y/o GH para promover la proliferación de las células. Además, la co-administración de GLP-2 con IGF-1 o bien con GH resulta en la proliferación celular. Los efectos tróficos en el intestino delgado y en el intestino grueso de esta terapia combinada son mayores que los vistos con cualquiera de GLP-2, IGF-1 o GH administrados en solitario. Un aspecto adicional de la invención es la co-administración del GLP-2 con IGF-2 o GH para promover el crecimiento.
Por lo tanto, un aspecto de la invención consiste en una composición capaz de promover el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en mamíferos que contenga GLP-2, o un análogo trófico del GLP-2, mezclado con al menos otra hormona peptídica seleccionada de entre el grupo formado por IGF-1, IGF-2, y GH, y un vehículo adecuado para su uso farmacéutico. Estas composiciones de la invención pueden incluír, de forma alternativa, análogos del GLP-2, IGF-1, IGF-2 y/o GH que muestren actividades tróficas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la promoción del crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en un mamífero, que comprende el tratamiento del mamífero para elevar los niveles en suero del GLP- 2, o de un análogo del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos del IGF-1, IGF-2, análogos del IGF-2, GH, y análogos del GH. Tales métodos de la invención incluyen la co-administración al mamífero de una cantidad efectiva del GLP-2 y una cantidad efectiva de al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos del IGF-1, IGF-2, análogos del IGF-2, GH, y análogos del GH, el tratamiento del mamífero con hormonas o moléculas orgánicas pequeñas que actúen elevando los niveles en suero de GLP-2, IGF-1, IGF-2, y/o GH, y la utilización de terapia génica para inducir en el mamífero células que produzcan de forma endógena GLP- 2, IGF-1, IGF-2, o GH, solos o en cualquiera de sus combinaciones, que pueden ser implantadas entonces en el mamífero para provocar el efecto biológico deseado.
La invención también proporciona un método para el tratamiento de un sujeto para mejorar el funcionamiento de su tracto gastrointestinal superior, que comprende el tratamiento del mamífero para elevar los niveles en suero de GLP-2, o de un análogo del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH.
Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la restauración o el mantenimiento de la función gastrointestinal, para promover la curación y la regeneración de la mucosa intestinal dañada o ulcerada/inflamada, para reducir el riesgo de enfermedad entérica, para mejorar el estado nutricional de un mamífero y para el tratamiento o la prevención de desórdenes nutricionales o del aparato gastrointestinal superior en mamíferos, en concreto en humanos.
De forma alternativa, las composiciones y métodos de la invención pueden utilizarse para promover la proliferación del tracto gastrointestinal superior en mamíferos con buen estado de salud, por ejemplo para permitir un incremento de la absorción de los nutrientes en el ganado permitiendo así un destetado temprano o un incremento en la producción de leche y de carne.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una utilización del GLP-2, o de análogos del GLP-2, para la fabricación de una preparación farmacéutica o veterinaria para la mejora del crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior. En un aspecto particularmente preferido de la invención, tales preparaciones también incluyen otras hormonas peptídicas seleccionadas del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH.
Además, la invención proporciona kits que contienen GLP-2, o análogos del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH. Tales composiciones se proporcionan en dosis con efecto terapéutico o en cantidades de multi-dosis.
Esta invención también proporciona un método para promover el crecimiento del tejido o de las células del tracto gastrointestinal superior que comprende el paso del cultivo de dicho tejido o células en un medio de cultivo que contenga una combinación promotora del crecimiento de GLP-2, o de un análogo del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH. Estos métodos pueden llevarse a cabo en cultivos celulares e in vivo.
En otro aspecto adicional de la invención, se proporciona un método en el cual se trata un paciente para restaurar el tejido de su tracto gastrointestinal superior, que comprende los siguientes pasos: (a) cultivo del tejido o las células obtenidas del paciente con una cantidad capaz de promover el crecimiento del tejido de una combinación de GLP-2 o un análogo de GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH, y a continuación (b) implantación de dicho tejido o células en el paciente a tratar.
Finalmente, la invención también proporciona un método para la determinación de la actividad de una hormona cuando se utiliza en combinación con GLP-2 que comprende los siguientes pasos: (1) co-administración de la hormona con una cierta cantidad de GLP-2, o de un análogo de GLP-2, a un mamífero de prueba; (2) evaluación del consiguiente crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en el mamífero de prueba; y (3) determinación de si el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en el mamífero de prueba ha mejorado en relación a mamíferos control tratados sólo con GLP-2.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra el cambio en el número de células que se tiñen con bromodeoxiuridina, en el epitelio de la mucosa y el la capa de músculo del esófago, después del tratamiento con GLP-2.
La Figura 2 ilustra el cambio en el contenido total de proteína del esófago después del tratamiento con GLP-2.
La Figura 3 ilustra el cambio en el peso del estómago después del tratamiento con GLP-2.
Descripción detallada de la invención
La invención trata de la utilización terapéutica, profiláctica y usos relacionados del GLP-2 y de los análogos del GLP-2, en particular para la mejora de condiciones médicas o veterinarias en las cuales el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior se ve afectado por enfermedad o lesión. Por ejemplo, el método se aplica al tratamiento de sujetos que sufren de una condición inflamatoria que incluye el tracto gastrointestinal superior, sujetos que han sufrido una resección del tracto gastrointestinal superior, o sujetos cuyo tracto gastrointestinal superior ha sido dañado por toxinas y similares.
Tal como se utiliza aquí el término "tracto gastrointestinal superior" se refiere a la sección del tracto gastrointestinal (GI) que incluye el esófago y el estómago. El esófago es la sección del tracto GI que surge proximalmente en la unión faringoesofágica y continua distalmente a través del mediastino hasta el final de la unión faringoesofágica. El estómago es una estructura distensible que se extiende desde la unión faringoesofágica hasta el duodeno.
Tal como se utiliza aquí, el término "sujeto" incluye a humanos u otros mamíferos, e incluye ganado y animales de compañía.
Tal como se utiliza aquí, el término "agonista del receptor de GLP-2 " se refiere a cualquier molécula que al unirse al receptor de GLP-2 resulte en una activación del receptor de GLP-2, e incluye por ejemplo el GLP-2 o los análogos peptídicos de GLP-2. Recientemente, se ha demostrado que el receptor de GLP-2 es un receptor acoplado a proteína G. Se ha aislado el ácido nucleico que codifica el receptor de GLP-2 (ver las aplicaciones en trámite U.S. Serial No.08/767,224, presentada el 13 de Diciembre de 1996, correspondientes a WO 98/25955, y U.S. Serial No.08/845,546, presentada el 24 de Abril de 1997 correspondiente a EP97951013.8). Así pues, los métodos utilizados de forma habitual en este campo para identificar a los receptores acoplados a proteína G pueden aplicarse al receptor GLP-2. Una metodología particularmente útil para evaluar los compuestos con actividad agonista hacia el receptor GLP-2 se revela en las aplicaciones en trámite mencionadas anteriormente. Brevemente, se transforman las células apropiadas, como células COS, con el ácido nucleico que codifica el receptor de GLP-2 de tal manera que se obtiene el receptor funcional en la superficie celular. Después de eso, se puede evaluar la actividad agonista de los compuestos de prueba poniendo en contacto las células transformadas con el compuesto de prueba; un incremento del nivel de monofosfato de adenosina cíclico intracelular como respuesta a la unión del compuesto de prueba en las células transformadas es un indicador de la actividad agonista.
Se puede buscar actividad agonista hacia el receptor GLP-2 de los péptidos análogos al GLP-2 y en determinadas librerias de compuestos químicos utilizando este procedimiento. Una guía sobre los tipos de análogos peptídicos que pueden utilizarse provechosamente en este método se proporciona aquí y en las aplicaciones en trámite U.S. Serial Nos. 08/632,533, correspondiente a EP96908973.9, y 08/631,273, correspondiente a EP97916280.7, ambas presentadas el 12 de Abril de 1996. Además, se puede buscar pequeñas moléculas con actividad agonista hacia el receptor GCP-2 en cualquiera de las librerias de compuestos químicos asequibles comercialmente utilizando técnicas de rastreo de alto rendimiento o de ultra-alto rendimiento. Pueden rastrearse los análogos peptídicos del GLP-2 y las pequeñas moléculas con actividad agonista hacia el receptor GCP-2 en busca de usos terapéuticos y relacionados para tratar condiciones que involucren al tracto gastrointestinal superior utilizando los modelos descritos aquí y en la literatura científica.
Cualquier sujeto que requiera una mejora en la actividad del tracto gastrointestinal superior puede ser un candidato potencial al tratamiento con un agonista del GLP-2 de acuerdo con la invención. En particular, un grupo de condiciones que pueden ser tratadas de forma beneficiosa de acuerdo con la invención son las enfermedades que involucran al esófago. A los pacientes humanos se les diagnostica típicamente esta condición después de manifestar uno o más de los siguientes síntomas: dolor o molestias al tragar, dolor o molestias al tragar líquidos o sólidos, acidez, sabor amargo en la boca, sensación de tener comida pegada en la garganta o al tragar (que a menudo se manifiesta como un bulto en la garganta) y sensación de falta de aliento. Se puede utilizar la técnica de visualización del esófago utilizando un esofagogastroscopio para confirmar la presencia de daño o enfermedad del esófago. De forma alternativa, puede visualizarse radiológicamente el esófago utilizando rayos X de contraste con bario, o un escáner CT con un producto de contraste oral. También se puede evaluar la función del esófago mediante manomería. La presencia de una enfermedad en el esófago, en particular de esofagitis, se puede evaluar funcionalmente utilizando la prueba de Bernstein. Para un diagnóstico más preciso de la enfermedad del esófago, pueden tomarse biopsias de la mucosa del esófago en busca de evidencias histológicas de la inflamación, y, además, se pueden hacer cultivos de este material para determinar la presencia de infección bacteriana, viral, o de hongos e inflamación.
Las condiciones inflamatorias del esófago incluyen: inflamación-vasculitis, inflamación post-infección, desorden infiltrativo, por ejemplo, escleroderma y amiloide, así como condiciones en las cuales la inflamación resulte de la acción de una toxina como el alcohol, ácidos y álcalis, como en el caso de una sobredosis accidental.
Otro grupo de condiciones que pueden tratarse de forma beneficiosa de acuerdo con la invención son las enfermedades del estómago, por ejemplo la úlcera peptídica. En pacientes humanos los desórdenes del estómago se diagnostican típicamente después de manifestar síntomas de dolor abdominal, bien en reposo, al comer o en ambos casos. De todas formas, los síntomas de los desórdenes estomacales pueden ser no específicos, y puede ser difícil distinguir entre dolor de esófago y de estómago.
Además, puede administrarse GLP-2 con resultados beneficiosos a pacientes que se pueda demostrar que padecen riesgo de desarrollar una disfunción del tracto gastrointestinal superior para protejerlos de la aparición de la condición o para reducir la severidad del ataque. Tales pacientes incluyen fumadores y pacientes del grupo sanguíneo O, que se encuentra asociado con úlceras duodenales y úlceras prepilóricas, pacientes que reciben o van a recibir uno o más NSAIDS, pacientes que reciben o van a recibir quimioterapia, y pacientes que sufren de ulceración inducida por el estrés.
Se ha demostrado que el tratamiento con agonistas del GLP-2 incrementa el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior. Los modelos apropiados para la determinación de qué análogos del GLP-2 con actividad proliferadora del tracto gastrointestinal superior son potencialmente útiles para su uso terapéutico en el tratamiento de condiciones médicas o veterinarias del tracto gastrointestinal superior se describe en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 3.
Los modelos animales apropiados para el estudio de las condiciones que involucran el esófago se hayan descritos en la literatura (ver, por ejemplo, Ann. Surg. Oncol. 1(3):252-261 (1994); Ann. Emerg. Med. 22(2):178-182 (1993)) e incluyen lesiones del esófago mecánicas o inducidas por ácido. Así pues, los modelos animales descritos en estas técnicas pueden utilizarse para evaluar la capacidad de los compuestos identificados como agonistas del GLP-2 para aliviar las condiciones inflamatorias que involucran al tracto gastrointestinal superior.
Los modelos animales apropiados para el estudio de las condiciones que involucran al estómago se hayan descritas en la literatura (ver, por ejemplo, Experimental and Molecular Pathology 59:136-154(1993)). Estos modelos incluyen la administración de anti-inflamatorios no específicos para provocar gastroduodenitis, y la administración de etanol, sólo o en combinación con otros agentes que provocan daño gástrico. Así pues, los modelos animales descritos en estas técnicas pueden utilizarse para evaluar la capacidad de los compuestos identificados como agonistas del GLP-2 para aliviar las condiciones que involucran al estómago.
Las diversas formas del GLP-2 de vertebrados incluyen, por ejemplo, el GLP-2 de rata y sus homólogos incluyendo GLP-2 de buey, GLP-2 porcino, GLP-2 de degú, GLP-2 bovino, GLP-2 de cobaya, GLP-2 de hámster, GLP-2 humano, GLP-2 de trucha arco iris, y GLP-2 de pollo. Las secuencias de estas formas del GLP-2 han sido presentadas por diversos autores, entre los cuales se incluyen Buhl et al. en J. Biol. Chem., 1988, 263(18):8621, Nishi and Steiner, Mol. Endocrinol., 1990, 4:1192-8, y Irwin and Wong, Mol. Endocrinol., 1995, 9(3):267-77.
Se pueden generar análogos del GLP-2 de vertebrados utilizando las técnicas convencionales en la química de péptidos, y se puede evaluar su actividad trófica en el tracto gastrointestinal superior, de acuerdo con la guía que se ha proporcionado. Los análogos que se prefieren especialmente en la invención son aquellos que se basan en la secuencia del GLP-2 humano, que es como sigue:
1
en la cual uno o más aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otro aminoácido, con tal que el análogo mantenga todavía su actividad trófica en el tracto gastrointestinal superior medida como un incremento en al menos uno de los siguientes parámetros: longitud del tracto gastrointestinal superior, contenido en proteína, masa o razón de mitosis/división celular de las células del tracto gastrointestinal superior, medida, por ejemplo, mediante la utilización de un indicador indirecto de la mitosis como bromodeoxiuridina (BrDU).
Las sustituciones conservativas en cualquiera de los GLP-2 naturales, preferiblemente en la secuencia del GLP-2 humano, se definen como los cambios dentro de cualquiera de los siguientes cinco grupos:
I. Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. Asn, Asp, Glu, Gln
III. His, Arg, Lys
IV. Met, Leu, Ile, Val, Cys
V. Phe, Tyr, Trp.
La invención también abarca las sustituciones no conservativas de los aminoácidos de cualquier secuencia de GLP-2 de vertebrados, mientras que las sustituciones no conservativas ocurran en una posición que se sepa que es distinta en el GLP-2 aislado de diferentes especies. Las posiciones no conservadas se pueden determinar de forma inmediata alineando todas las secuencias conocidas de GLP-2 de vertebrados. Por ejemplo, en Buhl et al., J. Biol. Chem., 1988, 263(18):8621, se comparan las secuencias de GLP-2 humana, porcina, de rata, de hámster, de cobaya y bovina GLP-2, y se encuentra que las posiciones 13, 16, 19, 27 y 28 no están conservadas (los números de las posiciones hacen referencia a las posiciones análogas en la secuencia del GLP-2 humano). En Nishi and Steiner, Mol. Endocrinol., 1990, 4:1192-8, se encuentra que una posición adicional en la secuencia que codifica el GLP-2, el residuo 20 en la secuencia humana mostrada anteriormente, también cambia en el degú, una especie de roedor indígena de Sudamérica. Así pues, bajo este estándar, las posiciones que varían en mamíferos y que es preferible que se sustituyan por residuos no conservativos son las posiciones 13, 16, 19, 20, 27 y 28. Los residuos adicionales que varían en vertebrados y que también pueden ser sustituídos con residuos no conservados ocurren en las posiciones 2, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 17, 21, 22, 23, 24, 26, 29, 30, 31, 32 y 33.
De forma alternativa, las sustituciones no conservativas pueden realizarse en cualquier posición en la que la técnica de mutagénesis con rastreo de alanina revele cierta tolerancia a la mutación, en cuanto esa sustitución del aminoácido con alanina no elimina por completo la actividad en el tracto gastrointestinal superior. La técnica de mutagénesis con rastreo de alanina se describe en Cunningham and Wells, Science, 1989, 244:1081, que se incorpora aquí como referencia en su integridad. Ya que la mayoría de las secuencias de GLP-2 contienen aproximadamente 33 aminoácidos (y en el GLP-2 humano hay cuatro posiciones que poseen una alanina), cualquiera con experiencia en la técnica puede poner a prueba el efecto en un análogo con alanina en cualquiera de las posiciones restantes, tal como se muestra en los ejemplos que siguen.
En un ejemplo específico preferido de la invención, el péptido GLP-2 se selecciona de entre
1) GLP-2 de rata, con la secuencia que se presenta a continuación:
2
2) GLP-2 humano, el equivalente Thr^{19} a Ala^{19} del GLP-2 de rata, que se presenta a continuación
3
3) [Gly^{2}]GLP-2 humano (GLP-2 humano en el cual la alanina de la posición 2 se reemplaza por una glicina);
4) GLP-2s, y análogos de GLP-2, que incorporan un grupo protector N-terminal y/o una extensión N-terminal como Arg o Arg-Arg; y/o incorporan un grupo protector C-terminal y/o una extensión C-terminal como Arg o Arg-Arg.
Además, pueden utilizarse en los métodos de la invenciión un gran número de péptido agonistas del GLP-2 que se describen en la PCT Application PCT/CA97/00252, correspondiente a EP97916280.7, presentada el 11 de Abril de 1997.
Los "grupos protectores" representados por R1 y R2 son grupos utilizados rutinariamente en química de péptidos para proporcionar estabilidad química y resistencia a la digestión por exopeptidasa. Entre los grupos protectores N- terminales se incluyen, por ejemplo, grupos alcanoílo C_{1-5} como el acetilo. Otros grupos protectores N-terminales apropiados son los análogos de aminoácidos a los que les falta la funcionalidad amino. Entre los grupos protectores C- terminales apropiados se incluyen grupos que capaces de formar cetonas o amidas en el átomo de carbono del carboxilo C-terminal, o grupos capaces de formar ésteres en el átomo de oxígeno del carboxilo. Entre los grupos capaces de formar cetonas y ésteres se incluyen los grupos alquilo, especialmente grupos alquilo C_{1-5} ramificados o no ramificados, por ejemplo grupos metilo, etilo y propilo, mientras que los grupos capaces de formar amidas incluyen funciones amino como aminas primarias o funciones alquilamina, por ejemplo grupos mono-alquilamino C_{1-5} y di- alquilamino C_{1-5} como metilamino, etilamino, dietilamino,dimetilamino, dietilamino, metiletilamino y similares. Los análogos de aminoácidos también son apropiados para la protección del extremo C-terminal de los presentes compuestos, por ejemplo, análogos de aminoácidos descarboxilados como la agmatina.
Entre los péptidos GLP-2 útiles se incluyen formas derivatizadas de las especies de GLP-2 acabadas de describir, en las cuales diversos grupos funcionales están acoplados al péptido, por ejemplo, para prolongar la vida media, mejorar la solubilidad, dirigir la acción del GLP-2, etc. En uno de los ejemplos preferidos, el GLP-2 se modifica en aminoácidos existentes o sustituídos, como lisina y arginina, para incorporar un motivo lipofílico con el propósito de prolongar su vida media. Tal como se describe en WO98/08872, publicada en 5 de Marzo de 1998, tales motivos lipofílicos incluyen el grupo tetradecanoílo y el grupo carboxinonadecanoílo, unidos, por ejemplo, al grupo amino epsilon de una lisina adicional C-terminal o en una lisina que ha reemplazado al aminoácido en la posición 20 del GLP-2(1-33).
La forma concreta del GLP-2 seleccionada para promover el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior puede prepararse mediante una variedad de técnicas suficientemente conocidas para generar los productos peptídicos. Las formas del GLP-2 de vertebrados pueden obtenerse, por supuesto, mediante extracción a partir de la fuente natural, utilizando una combinación apropiada de técnicas de aislamiento de proteínas. Tal como se describen en Buhl et al., supra, el aislamiento y la purificación de GLP-2 porcino a partir de extractos ácido-etanol de mucosa ileal se consigue mediante una combinación de selección de tamaño y fraccionamiento basado en HPLC, con la ayuda de un anticuerpo dirigido hacia el proglucagón sintético 126-159, para monitorizar el proceso. De forma alternativa a la extracción del GLP-2, aquellas formas del GLP-2 que sólo incorporan L-aminoácidos, bien el GLP-2 de vertebrados o sus análogos, pueden producirse en cantidades comerciales mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante. Para este propósito, el ADN que codifica el GLP-2 o el análogo de GLP-2 deseado se incorpora en un vector de expresión y se transforma en un microbio, por ejemplo levadura, u otro huésped celular, que se cultiva entonces bajo condiciones apropiadas para la expresión del GLP-2. Se han adaptado una variedad de sistemas de expresión génica para este propósito, y típicamente conducen la expresión del gen deseado a partir de controles de expresión utilizados naturalmente por el huésped escogido. Ya que el GLP-2 no requiere glicosilación post-traslacional para su actividad, su producción puede llevarse a cabo de forma más conveniente en huéspedes bacterianos como E. coli. Para tal tipo de producción, el ADN que codifica el péptido GLP-2 seleccionado puede introducirse bajo los controles de expresión de los genes lac, trp o PL de E. coli. Como alternativa a la expresión del ADN que codifica el GLP-2 per se, el huésped puede ser adaptado para expresar el péptido GLP-2 como una proteína de fusión en la cual el GLP-2 está unido, de forma que pueda ser posteriormente liberada, a una proteína transportadora que facilite su aislamiento y la estabilidad del producto de expresión.
En una aproximación aplicable universalmente a la producción del GLP-2 o de los análogos de GLP-2 seleccionados, y utilizada necesariamente para producir péptidos GLP-2 que incorporen aminoácidos no codificados genéticamente y formas derivatizadas en los extremos N- y C- terminales, se emplean las técnicas suficientemente establecidas de la síntesis automática de péptidos, que se han descrito de forma general en, por ejemplo, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984 Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; y en M. Bodanszky and A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc. Foster City, California. En estas técnicas, el péptido GLP-2 se hace crecer a partir del residuo C-terminal, unido a una resina, mediante la adición secuencial de aminoácidos protegidos de forma adecuada, utilizando los protocolos Fmoc o tBoc, tal como se describe por ejemplo en Orskov et al., Febs Letters, 1989, 247(2):193-196.
Pueden aplicarse los protocolos convencionales en la síntesis de péptidos en fase sólida convencionales para la incorporación de los grupos protectores N- y/o C-. Por ejemplo, para la incorporación de grupos protectores C-terminales, la síntesis del péptido deseado se lleva a cabo típicamente utilizando, como fase sólida, una resina de soporte que ha sido modificada químicamente de tal manera que la separación de la resina resulta en un péptido GLP-2 que tiene el grupo protector C-terminal deseado. Por ejemplo, para conseguir péptidos en los que el extremo C-terminal soporte una amina primaria como grupo protector, la síntesis se lleva a cabo utilizando como resina p-metilbenzidrilamina (MBHA) de tal manera que cuando se ha completado la síntesis del péptido, el tratamiento con ácido fluorhídrico libera el péptido con el grupo amino en el extremo C-terminal deseado. De forma similar, se consigue la incorporación de un grupo protector N-metilamino en el extremo C-terminal utilizando resina N-metilaminoetil-derivatizada DVB, que, después de tratamiento con HF libera el péptido con un grupo N-metilamida en el extremo C-terminal. También puede conseguirse la protección del extremo C-terminal mediante esterificación utilizando cualquiera de los métodos convencionales. Ello implica la utilización de una combinación de resina /grupo protector que permita la liberación del péptido protegido en su cadena lateral de la resina, para permitir la consiguiente reacción con el alcohol deseado, para formar el la función éster. Pueden utilizarse para este propósito los grupos protectores FMOC, en combinación con resina DVB derivatizada con alcohol metoxialcoxibencílico o un eslabón equivalente, en cuyo caso la separación del soporte se realiza mediante TFA en diclorometano. Seguidamente, se puede llevar a cabo la esterificación de la función carboxilo activada de forma apropiada, por ejemplo utilizando DCC, mediante la adición del alcohol deseado, seguido de desprotección y aislamiento del péptido GLP-2 esterificado.
Puede llevarse a cabo la incorporación de grupos protectores en el extremo N- terminal mientras el péptido GLP-2 sintetizado todavía está unido a la resina, por ejemplo mediante tratamiento con un anhídrido y nitrilo apropiados. Por ejemplo, para incorporar un grupo protector acetilo en el extremo N-terminal, el péptido acoplado a la resina puede tratarse con anhídrido acético 20% en acetonitrilo. Seguidamente, el péptido GLP-2 bloqueado en el extremo N-terminal puede separarse de la resina, desprotegerse y posteriormente aislarse.
Una vez que el péptido GLP-2 deseado se ha sintetizado, separado de la resina y desprotegido totalmente, el péptido se purifica para asegurar la recuperación de un sólo oligopéptido con la secuencia de aminoácidos deseada. La purificación puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de los métodos convencionales, entre los que se incluyen la cromatografía líquida de alta presión en fase reversa en columnas de sílice alquilada, por ejemplo sílice C_{4}-, 
\hbox{C _{8} -,}
o C_{18}-. Tales fraccionamientos en columna se realizan generalmente utilizando gradientes lineales, por ejemplo 10-90%, con % creciente en el disolvente orgánico, por ejemplo acetonitrilo, en tampón acuoso, que generalmente contiene una pequeña cantidad (por ejemplo, 0.1%) de TFA o TEA. De forma alternativa, se puede utilizar HPLC de intercambio iónico para separar los péptidos en base a su carga característica. Se recogen las fracciones de la columna, y, opcionalmente, se pueden reservar aquellas que contienen el péptido de pureza deseada/requerida. En uno de los ejemplos preferidos de la invención, el péptido GLP-2 se trata entonces de la forma habitual para intercambiar el ácido de separación (por ejemplo, TFA) con un ácido adecuado para su utilización en el ámbito farmacéutico, como por ejemplo ácido acético, clorhídrico, fosfórico, maleico, tartárico, succínico y similares, para generar un sal de adición del ácido del péptido adecuada para su utilización en el ámbito farmacéutico.
En uno de los aspectos de la invención, el péptido GLP-2 o su sal se proporcionan en una forma adecuada para su utilización en el ámbito farmacéutico para su adiministración a pacientes, por ejemplo, como una preparación que se ha filtrado de forma estéril, por ejemplo, a través de un filtro de 0.22\mu, y sustancialmente libre de pirógeno. Preferiblemente, el péptido GLP-2 a formular migra como un píco único o individualizado en la HPLC, muestra una composición de aminoácidos uniforme y auténtica al ser analizado, y, por otra parte, cumple con los estándares fijados por los diversos organismos nacionales que regulan la calidad de los productos farmacéuticos.
Para su uso terapéutico, el GLP-2 o análogo de GLP-2 escogido se formula con un vehículo adecuado para su utilización en el ámbito farmacéutico y apropiado para la administración del péptido al sujeto mediante la ruta de administración deseada para llevar el péptido al tracto gastrointestinal superior. Los vehículos adecuados para su utilización en el ámbito farmacéutico son aquellos utilizados de forma convencional en fármacos basados en peptidos, de igual forma que los eluyentes, excipientes y similares. Puede utilizarse como guía de referencia general de formulación de fármacos "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985. En uno de los ejemplos preferidos de la invención, los compuestos se formulan para su adiministración por infusión, por ejemplo, cuando se utilizan como suplementos nutricionales líquidos para pacientes bajo terapia nutricional parenteral total, o mediante inyección, por ejemplo subcutánea, intramuscular o intravenosa, y se utilizan en consecuencia como disoluciones acuosas estériles y libres de pirógeno y, opcionalmente, con un pH ajustado de forma que sea fisiológicamente tolerable, por ejemplo, a pH ligeramente ácido o fisiológico. Así pues, los compuestos se pueden administrar a través de un vehículo como agua destilada o, mejor, en salino, salino ajustado con tampón de fosfato o solución de dextrosa al 5%. Puede mejorarse la solubilidad en agua del GLP-2 o de los análogos de GLP-2 mediante la incorporación de sustancias que mejoren la solubilidad, como ácido acétido o hidróxido sódico.
El vehículo o vehículo acuoso se puede proporcionar en forma inyectables con una cantidad de gelatina que sirva para alcanzar el efecto depósito, que se espera que esté en el rango de 10-20%. Otros agentes gelificantes alternativos, como el ácido hialurónico, pueden ser útiles como agentes depósito (también en aplicaciones veterinarias).
Como alternativa a las formulaciones inyectables, el GLP-2 o el análogo de GLP-2 puede formularse para su administración a pacientes y su distribución al tracto gastrointestinal superior a través de otras rutas. Las formas de dosificación oral, como tabletas, cápsulas y similares, pueden formularse de acuerdo con las prácticas farmacéuticas habituales.
Los compuestos pueden formularse también en forma líquida para proporcionar un contacto directo con el esófago, en forma de pastillas u otras formulaciones similares que permitan un contacto directo del revestimiento del esófago o del estómago y el compuesto. Además, pueden distribuirse formulaciones estándar para la rápida obtención de altos niveles del compuesto en la circulación.
Los GLP-2s y análogos de GLP-2 de la invención pueden formularse también en forma de implante de liberación lenta para una administración prolongada y sostenida del GLP-2. Algunos ejemplos de tales formulaciones de liberación sostenida incluyen compuestos de polímeros biocompatibles, como poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno, y similares. La estructura,selección y utilización de polímeros degradables como vehículos para la administración de fármacos ha sido revisada en diversas publicaciones, entre las cuales se incluye A. Domb et al., Polimers for Advanced Technologies 3:279-292 (1992). Se puede encontrar orientación adicional sobre la selección y la utilización de polímeros en formulaciones farmacéuticas en el texto de M. Chasin y R. Langer (eds.), "Biodegradable Polimers as Drug Delivery Systems", Vol. 45 de "Drugs and the Pharmaceutical Sciences", M. Dekker, New York, 1990. También pueden utilizarse liposomas para conseguir la liberación sostenida del GLP-2 o del análogo de GLP- 2. Se pueden encontrar detalles relativos a como obtener y utilizar formulaciones con liposomas de fármacos de interés en, entre otras fuentes, U.S. Pat. No. 4,921,706; U.S. Pat. No. 5,008,050; U.S. Pat. No. 4,921,706; U.S. Pat. No. 4,927,637; U.S. Pat. No. 4,452,747; U.S. Pat. No. 4,016,100; U.S. Pat. No. 4,311,712; U.S. Pat. No. 4,370,349; U.S. Pat. No. 4,372,949; U.S. Pat. No. 4,529,561; U.S. Pat. No. 5,009,956; U.S. Pat No. 4,725,442; U.S. Pat. No. 4,737,323; U.S. Pat. No. 4,920,016. Las formulaciones de liberación sostenida son particularmente interesantes cuando se desea proporcionar una alta concentración local de GLP-2 o del análogo de GLP-2, por ejemplo, cerca o en el tracto gastrointestinal superior para promover el crecimiento del tracto gastrointestinal superior en el tracto gastrointestinal superior inflamado.
Para el uso en la estimulación del crecimiento del tracto gastrointestinal superior, y/o la mejora del funcionamiento del tracto gastrointestinal superior en mamíferos incluyendo los humanos, la presente invención proporciona en uno de sus aspectos un envase, en la forma de un vial o ampolla rellenada de forma estéril, que contiene una cantidad de GLP-2 o de un análogo de GLP-2 capaz de promover el crecimiento del tejido, bien como una dosis única o en la forma de dosis múltiples, donde el envase incorpora una etiqueta con instrucciones sobre el uso de su contenido para promover tal crecimiento. En uno de los ejemplos preferidos de la invención, el envase contiene el GLP-2 o el análogo de GLP-2 y el vehículo deseado, en la forma de una formulación lista para su uso. De forma alternativa, y de acuerdo con otro de los ejemplos preferidos de la invención, el envase proporciona el GLP-2 o el análogo de GLP-2 en una forma, como por ejemplo una forma liofilizada, apropiada para su reconstitución en un vehículo apropiado, como por ejemplo tampón salino de fosfato.
En un ejemplo de realización preferido, el envase es un vial o una ampolla rellenada de forma estéril que contiene una solución inyectable que contiene una cantidad de GLP-2 o del análogo de GLP-2 capaz de promover la proliferación del tracto gastrointestinal superior disuelta en un vehículo acuoso.
De acuerdo con la presente invención, se administra el GLP-2 o el análogo de GLP-2 para tratar pacientes que se beneficiarían del crecimiento del tejido de su tracto gastrointestinal superior. Además, los pacientes que se beneficiarían de un mejor funcionamiento de su tracto gastrointestinal superior, sea o no resultado del incremento en el crecimiento del tejido, son candidatos para el tratamiento con la invención. En general, los pacientes que se beneficiarían de un incremento en la masa del tracto gastrointestinal superior y/o bien de una mejora en el funcionamiento de la mucosa del tracto gastrointestinal superior son candidatos para el tratamiento con GLP-2 o con el análogo de GLP-2. Las condiciones específicas que pueden tratarse con GLP-2 incluyen las diversas formas de las enfermedades inflamatorias del estómago o del esófago, así como los pacientes que han sufrido una excisión parcial o subtotal del tracto gastrointestinal superior. Por comodidad, en las siguientes tablas se proporciona una lista no exhaustiva de las condiciones del tracto gastrointestinal superior incluyendo el estómago y el esófago, que pueden ser tratadas con GLP-2 sólo o en combinación con otro compuesto.
TABLA 1 
\hrule
\hskip5.5cm
Transtornos del Estómago 
\hrule
1. Gastritis Aguda
A.
Gastritis hemorrágica y erosiva aguda
1.
Gastritis erosiva aguda
2.
Gastritis hemorrágica aguda
3.
Gastritis aguda
4.
Gastritis aguda por estrés
5.
Fármacos antiinflamatorios no esteroides
6.
Gastropatía (aguda)
7.
Gastropatía hemorrágica
B.
Gastritis aguda por Helicobacter pylori
1.
Gastritis Tipo B
2.
Gastritis por hipersecreción
3.
Gastritis no específica secundaria a Helicobacter pylori
4.
Helicobacter pylori - gastritis asociada
C.
Gastritis de origen químico
1.
Gastritis Tipo C (es decir, de origen químico)
2.
Gastritis reactiva
3.
Gastritis por reflujo
4.
Gastritis por bilis
5.
Gastropatía por fármacos antiinflamatorios no esteroides (crónica)
D.
Otras gastritis infecciosas agudas (Ver Formas Poco Comunes de Gastritis)
II. Formas Comunes de Gastritis Crónica
A.
Gastritis por Helicobactor pylori
B.
Gastritis de origen químico
1.
Reflujo de bilis
2.
Gastritis Tipo C (es decir, de origen químico)
3.
Gastritis reactiva
4.
Gastritis de reflujo
5.
Gastropatía por aspirina y fármacos antiinflamatorios no esteroides (crónica)
C.
Gastritis atrófica metaplásica
1.
Gastritis atrófica metaplásica autoimmune
a.
Gastritis atrófica
b.
Gastritis Tipo A
c.
Gastritis corporal difusa
d.
Gastritis crónica autoimmune
e.
Gastritis autoimmune asociada
2.
Gastritis atrófica metaplásica por entorno
a.
Gastritis crónica por entorno
b.
Gastritis por entorno multifocal
c.
Gastritis atrófica multifocal
d.
Gastritis atrófica
e.
Gastritis atrófica crónica
f.
Gastritis Tipo B
g.
Pangastritis Idiopática
III. Formas poco comunes de gastritis
A.
Gastritis atrófica postantrectomía
B.
Gastritis eosinofílica
C.
Gastritis infecciosas
1.
Bacterianas (distinta a Helicobacter pylori)
a.
Gastrospirillum hominis
b.
Flegmonosas
c.
Micobacterianas
d.
Sifiltícas
2.
Víricas
3.
Por parásitos
4.
Por hongos
D.
Enfermedad de Crohn
E.
Sarcoidosis
F.
Gastritis granulomatosa aislada
G.
Gastritis Linfocítica (NOTA: A L'ORIGINAL DIU "LYMPHOCYLIC", PERÒ CREC QUE ES TRACTA D'UN ERROR, I HAURIA DE SER "LYMPHOCYTIC")
H.
Enfermedad de Ménétriere
\hrule
Ver, "Gastritis, Duodenitis, and Associated Ulcerative Lesions", de John H. Yardley y Thomas R. Hendrix, en "Textbook on Gastroenterology" Vol. I, editado por Tadataka Yamada M.D. (2a ed. 1985). TABLA 2 
\hrule
\hskip5.5cm
Transtornos del Esófago 
\hrule
I. Esofagitis infecciosa
A.
Organismos asociados con infecciones
1.
Hongos
a.
Especie Candida (esp.albicans)
b.
Especie Aspargillus
c.
Histoplasma capsulatum
d.
Blastomyces dermatitides
2.
Virus
a.
Virus Herpes simplex (tipo 1)
b.
Citomegalovirus
c.
Virus Varicela-zoster
3.
Bacterias
a.
Mycobacterium tuberculosis
b.
Actinomyces Israelii
c.
Streptococcus viridans
d.
Lactobacillus acidophilus
e.
Treponema pallidum
II. Esofagitis no infecciosas
III. Reflujo ácido
IV. Reflujo de bilis
V. Daño químico
A.
Medicinas
B.
Toxinas
C.
Ácidos
D.
Álcalis
VI. Sarcoidosis
VII. Enfermedad de Crohn
VIII. Enfermedad de Behcet
IX. Enfermedad de injerto contra huésped
X. Infecciones relacionadas con el SIDA
A.
Cryptosporidium sp 
\hskip1cm
Microsporidium sp 
\hskip1cm
Isospora beill 
\hskip1cm
Glardia Lamblia 
\hskip1cm
Salmonella sp 
\hskip1cm
Shigella sp 
\hskip1cm
Campylobacter sp 
\hskip1cm
Mycobacterium tuberculosis 
\hskip1cm
Mycobacterium avium complex (MAC) 
\hskip1cm
Clostridium difficile 
\hskip1cm
Cytomeglavorius 
\hskip1cm
Herpes simplex 
\hrule
Ver "Miscellaneous Diseases del esophagus", en "Textbook on Gastroenterology" Vol. I, editado por Tadataka Yamada M.D. (2a ed. 1985).
La eficacia terapéutica del tratamiento con GLP-2 en el esófago se puede monitorizar, por ejemplo, mediante endoscopia, prueba de bario o CT. Por ejemplo, se administra GLP-2 o un análogo de GLP-2 a un paciente con una condición inflamatoria en el tracto gastrointestinal superior en una cantidad suficiente como para mejorar la molestia en el esófago, disminuir el dolor, mejorar la capacidad de tragar, reducir el dolor en el pecho, disminuir la sensación de acidez, disminuir la regurgitación de sólidos o líquidos después de tragar o comer, disminuir los vómitos o mejorar el peso o mejorar la vitalidad. Se puede monitorizar la eficacia terapéutica del GLP-2 en las proximidades del estómago según la disminución del dolor o el malestar. Además, el GLP-2 o el análogo de GLP-2 se pueden administrar a pacientes que se han identificado como susceptibles de desarrollar una condición inflamatoria que involucre el tracto gastrointestinal superior como por ejemplo pacientes tratados con anti-inflamatorios no esteroideos ("NSAIDS"). Algunos ejemplos de NSAIDS son aspirina, ibuprofeno, sulindac, y indometocina.
La dosificación terapéutica y el régimen mas apropiado para el tratamiento de cada paciente variará, por supuesto, con la enfermedad o condición a tratar, y de acuerdo con el peso del paciente y otros parámetros. Los resultados que se presentan a continuación el los Ejemplos 1-3 demuestran que el tratamiento con GLP-2 o análogos del GLP-2 administrados dos veces al día durante 2 días resulta en una proliferación celular y en un incremento de la síntesis de proteínas en el tracto gastrointestinal superior. El tratamiento durante 12 días resulta en un incremento en la masa del estómago. El Ejemplo 4 demuestra que el tratamiento con GLP-2 es capaz de aliviar la toxicidad gastrointestinal de los fármacos antiinflamatorios no esteroides. Se espera que dosis mucho menores, y menores o mayores duración o frecuencia del tratamiento, también tendrán resultados terapéuticamente útiles, por ejemplo, un incremento estadísticamente significativo en la masa del tracto gastrointestinal superior en particular, y/o un mejor funcionamiento del tracto gastrointestinal superior. La cantidad de dosificación y el régimen de dosificación más apropiados para el uso en humanos están guiados por los resultados presentados aquí, y se pueden confirmar en ensayos clínicos diseñados de forma apropiada.
Se pueden determinar una dosificación eficaz y el protocolo de tratamiento mediante métodos convencionales, empezando con una dosis baja en animales de laboratorio, e incrementando entonces la dosis mientras se monitorizan los efectos, (por ejemplo, mediante histología, indicadores de la actividad de la enfermedad, actividad enzimática de la mucosa, expresión génica específica del tejido epitelial del intestino delgado y grueso, marcadores de la respuesta inflamatoria como la expresión de citoquinas y mieloperoxidasa, contenido de GLP-2) y variando también de forma sistemática el régimen de las dosis. El médico puede tener en cuenta numerosos factores al determinar la dosis óptima para un determinado sujeto. El principal de ellos es la cantidad de GLP-2 que circula normalmente en el plasma, que es del orden de 151 pmol/mL en estado de reposo, que aumenta hasta 225 pmol/mL después de la ingestión de nutrientes en humanos adultos con buen estado de salud (Orskov, C. and Holst, J. J., 1987, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47:165). Otros factores adicionales son el tamaño del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad concreta que está siendo tratada, la gravedad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, la actividad in vivo del péptido GLP-2 y similares. Las dosis de prueba se escogerían después de considerar los resultados de los estudios en animales y la literatura clínica. Las personas con familiarizadas con este tema apreciarán que también puede utilizarse otra información, como constantes de unión y y Ki derivadas de ensayos de competición de unión in vitro de GLP-2 para calcular las dosis.
Una dosis típica el péptido GLP-2 en humanos sería desde alrededor de 10 \mug/kg de peso corporal/día hasta alrededor de 10 mg/kg/día, preferiblemente desde alrededor de 50 \mug/kg/día hasta alrededor de 5 mg/kg/día, y más preferiblemente desde alrededor de 100 \mug/kg/día hasta 1 mg/kg/día.
En otro de sus aspectos, la invención proporciona tratamiento a pacientes candidatos identificados utilizando implantes celulares que han sido preparados in vitro o in vivo mediante una incubación previa o bien con tratamiento con GLP-2 o un análogo del GLP-2, o han sido modificados genéticamente para producirlo. La preparación de células ex vivo se puede llevar a cabo simplemente haciendo crecer las células o el tejido a transplantar en un medio al que se le ha proporcionado una cantidad de GLP-2 o de análogo del GLP-2 capaz de promover el crecimiento y que, por otra parte, es apropiado para el cultivo de esas células. Después de un período apropiado de condicionamiento, las células pueden implantarse directamente al paciente o bien encapsularse utilizando cualquiera de las técnicas consolidadas de encapsulación celular, para, posteriormente, ser implantadas.
Otro aspecto adicional de la invención abarca el tratamiento de animales in vivo con péptidos GLP-2 para promover el crecimiento del tejido del esófago. Después del consiguiente aumento del tracto gastrointestinal superior estos tejidos pueden utilizarse en técnicas de xenotransplante. Este tratamiento con el péptido GLP-2 antes del xenotransplante del tejido de un animal no humano a un humano puede representar una ventaja debido a que el tamaño del órgano o tejido transplantado normalmente limita el éxito de esta técnica. Por ejemplo, un cerdo donante puede tratarse con el péptido GLP-2 para aumentar el tamaño del tracto gastrointestinal superior antes del xenotransple del tejido del tracto gastrointestinal superior porcino a un humano que necesite este órgano.
De forma alternativa, las células a implantar pueden cultivarse in vitro a partir de una célula que haya sido modificada genéticamente para expresar o sobre expresar bien el gen glucagón o, más directamente, el ADN que codifica solamente el GLP-2. La secuencia de este ADN puede determinarse de forma inmediata a partir de la secuencia de aminoácidos del GLP-2 seleccionado, con la limitación que de esta manera sólo se pueden producir formas del GLP-2 que contengan aminoácidos codificados genéticamente. Se pueden utilizar diversos vectores víricos, apropiados para la introducción de información genética en células humanas, e incorporarán el ADN que codifica al GLP-2 bajo controles de expresión funcionales en las células huésped. Una vez alteradas genéticamente, las células modificadas pueden implantarse utilizando los procedimientos consolidados en la técnica. (Ver, por ejemplo, Drucker et al., 1996, PNAS:USA 93:7911-7916.)
Coadministración del GLP-2 y otras hormonas peptídicas
La invención trata de combinaciones con utilidad terapéutica del GLP-2 y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2, y GH. Sorprendentemente, el GLP-2 (y sus análogos) administrados en solitario a un mamífero inducen el crecimiento del tracto gastrointestinal superior. Tal como se ha predicho, cuando se administra el GLP-2 en combinación con al menos otra hormona peptídica seleccionada de entre el grupo formado por IGF-1, IGF-2, y GH, se observan claros efectos en el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior.
Los GLP-2s y los análogos de GLP-2 de la invención también pueden administrarse a un sujeto mezclados con al menos otra hormona peptídica que se sepa que es un factor de crecimiento del esófago o gástrico. Algunos factores de crecimiento del esófago y gástricos incluyen el factor de crecimiento epidermal (EGF), el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1), el factor de crecimiento de hepatocito (HGF) y el factor de crecimiento de queratinocito (KGF).
Entre las terapias con GLP-2 adjuntas y específicas que son de utilidad para el tratamiento de las condiciones que involucran el estómago, por ejemplo, la úlcera peptídica se incluyen: (1) agentes que actúan bloqueando la secreción de ácidos del estómago, por ejemplo, antagonistas del receptor H2, inhibidores de la bomba de protones y prostaglandinas; (2) agentes que actúan formando una barrera protectora en el estómago, por ejemplo, sucralfato; (3) compuestos que contienen bismuto, y (4) agentes que controlan la Helicobacter pylori.
En particular, la invención trata de los usos terapéuticos y usos relacionados del GLP-2 cuando se co-administra con al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1 y GH. Todavía más específicamente, la invención trata de la utilización de las combinaciones anteriormente mencionadas para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior. Más particularmente, la invención trata de los usos terapéuticos y usos relacionados de las combinaciones mencionadas anteriormente para promover la proliferación de las células de la mucosa epitelial o del músculo del tracto gastrointestinal superior.
A no ser que se especifique de otra forma, el término "GLP-2" hace referencia de forma colectiva a las diversas formas producidas de forma natural del GLP-2, en particular las formas de mamíferos. La invención también abarca aquellos análogos del GLP-2 que muestran actividad. Puede medirse la actividad de los análogos del GLP-2 utilizando el modelo de ratón que se describe aquí y en la aplicación en trámite U.S. Serial No. 08/631,273. Brevemente, esta prueba consiste en un régimen de inyecciones subcutáneas durante de 10 a 14 días dos veces al día (b.i.d.) de 2.5 mg del análogo de GLP-2 (en PBS) por kg de peso corporal con un control de animales sin tratar que reciben solamente PBS. De forma alternativa, los análogos se pueden administrar una vez al día, o cada dos días. Una vez ha finalizado el régimen, se sacrifican los animales y se extrae y pesa su tracto gastrointestinal superior. De esta forma se puede valorar el efecto del los análogos del GLP-2 sobre el tracto gastrointestinal superior.
Se proporciona cierta guía sobre análogos concretos y variantes del GLP-2 que pueden utilizarse provechosamente en la presente invención, y también guía sobre cómo producir otros, en las aplicaciones en trámite U.S. Serial Nos. 08/632,533 y 08/631,273, ambas presentadas el 12 de Abril de 1996, cuyas revelaciones se incorporan aquí como referencia. Brevemente, cualquier sustitución, adición o deleción del GLP-2 que no elimine la actividad del GLP-2 puede utilizarse de forma provechosa en esta invención. En los ejemplos preferidos los análogos del GLP-2 son al menos como el GLP-2 humano nativo. En los ejemplos más preferidos, el análogo de GLP-2 tiene una mejor actividad en comparación con el GLP-2 humano nativo. Por ejemplo, tales análogos pueden mostrar una mejor estabilidad en suero, una mejor unión al receptor y una mejor actividad de transducción de señal. Otras modificaciones del GLP-2 y de los análogos del GLP-2 que pueden utilizarse de forma provechosa en esta invención son aquella que proporcionan moléculas resistentes a la oxidación.
Los análogos GLP-2 son análogos apropiados del GLP-2 humano ( [Gly^{2}] GLP-2 humano) o del GLP-2 de rata (rGLP-2). En un ejemplo preferido de la invención, el GLP-2 humano o de rata se altera en la posición 2 para conferir resistencia al DPP-IV mediante la sustitución de una Gly por una Ala. El GLP-2 humano que tiene la Gly sustituída por Ala en la posición 2 recibe aquí el nombre de [Gly 2] [Gly^{2}] GLP-2 humano.
De forma similar, los términos "IGF-1", "IGF-2" y "GH" tal como se utilizan aquí abarcan los análogos y variantes efectivas de los péptidos producidos de forma natural así como los péptidos nativos. Se proporciona cierta guía sobre los análogos y variantes concretos de IGF-1, IGF-2, y GH que pueden utilizarse de forma provechosa en la presente invención en las siguientes publicaciones que se incorporan aquí como referencia: Vanderhoof et al. (1992) Gastroenterology 102:1949-1956; Steeb et al. (1994) Am. J. Physiol. 266:G1090-G1098; y Jones et al. (1995) Endocrine Reviews 16:3-34; Conlon et al. (1995) Journal of Endocrinology 146:247-253; Francis et al. (1993) Biochemical Journal 293:713-719; Lewis et al., WO 93/20836; y Bozyczko-Coyne et al., WO 93/08826.
Los secretagogos, factores capaces de mejorar la producción endógena, de las hormonas peptídicas, también pueden incluírse como parte del régimen terapéutico, bien sustituyendo o como suplemento de las hormonas peptídicas cuya liberación estimulan. Así pues, la inclusión de tales factores, que son bien conocidos por aquellos con conocimientos de esta técnica, está dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la producción de GH endógeno se ve incrementada por el factor liberador de la hormona del crecimiento (GHRF) y por arginina. De forma similar, los técnicos familiarizados con estos procedimientos se darán cuenta que compuestos tales como moléculas pequeñas, que interaccionan con el receptor apropiado causando un incremento en los niveles en suero de cualquiera de las hormonas peptídicas, podrían utilizarse de forma provechosa en la presente invención.
Tal como se utiliza aquí el término, se dice que un compuesto, como un péptido, se "co-administra" o se administra "en combinación" con otro compuesto cuando los efectos fisiológicos de ambos compuestos, o bien la elevada concentración en suero de ambos compuestos puede medirse simultáneamente. En los compuestos que incrementan el nivel de producción endógena, también pueden medirse simultáneamente la concentración en suero de la hormona producida de forma endógena y el otro agente administrado cuando se "co-administran" o se administran "en combinación". Así pues, los compuestos se pueden administrar de forma simultánea, en composiciones separadas o mezcladas, o bien se pueden administrar de forma secuencial, mientras que ello resulte en un incremento constante de sus niveles en suero.
A menos que se especifique de otro modo, los términos "terapia de combinación" y "tratamientos de combinación" se utilizan aquí para describir un régimen terapéutico que incluye la co-administración de las hormonas peptídicas que resulta en una mejora del estado nutricional, o un incremento en la masa intestinal del paciente.
Tal como se utilizan aquí, los términos "estado nutricional mejorado" y "funcionamiento del intestino mejorado" se definen como cualquier incremento en la absorción fisiológica de nutrientes por encima de los niveles anteriores al tratamiento. Tales nutrientes incluyen, pero no están limitados a, carbohidratos, proteinas y amino ácidos, grasa, colesterol y vitaminas liposolubles, vitaminas hidrosolubles, y minerales. Los minerales, cuya absorción puede incrementarse mediante los métodos de la presente invención, incluyen, pero no están limitados a, Na, Ca, Mg, K, Zn, y Fe. Las vitaminas, cuya absorción puede incrementarse mediante los métodos de la presente invención, incluyen vitaminas liposolubles como por ejemplo las vitaminas A, D, E y K así como las vitaminas hidrosolubles como por ejemplo B^{12} y ácido fólico.
Tal como se utiliza aquí el término "paciente" se pretende que incluya a humanos, ganado y animales domésticos, sin que ello represente una limitación.
Se dice que un mamífero sufre de desórdenes, enfermedades y condiciones médicas del intestino cuando las propiedades de absorción del intestino del animal se hayan disminuídas, y/o cuado está presente una inflamación o lesión en el tracto gastrointestinal, de tal manera que causa molestias y enfermedad. Se pueden emplear diversas pruebas para determinar si un mamífero sufre un síndrome de mala absorción. Entre ellos se incluyen el contenido de grasa en las heces, la absorción de xilosan, estudios de rayos X gastrointestinales, biopsias del intestino delgado, la prueba de Schilling de absorción de la vitamina B^{12} y la prueba de la secretina.
En uno de los aspectos de la invención, se proporciona el GLP-2 para su administración a pacientes mezclado con al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2, y GH en una forma adecuada para su utilización en el ámbito farmacéutico (por ejemplo, como una preparación que se ha filtrado de forma estéril a través de un filtro de 0.22 \mum y considerablemente libre de pirógeno). Preferiblemente, los péptidos a mezclar migran como picos individuales en HPLC.
Las formas particulares de GLP-2, IGF-1, IGF-2 y GH seleccionadas para la invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas bien conocidas para la generación de productos peptídicos. Aquellas formas de GLP-2, IGF-1, IGF-2 y GH que ocurren naturalmente puede obtenerse, por supuesto, mediante extracción de la fuente natural, utilizando una combinación apropiada de técnicas de aislamiento de proteínas. Por ejemplo, tal como se describe en Buhl et al., (1988) J. Bio. Chem. 263(18):8621-8624, se consigue el aislamiento y la purificación del GLP-2 porcino y a partir de extractos ácido-etanol de la mucosa ileal mediante una combinación de selección de tamaño y fraccionamiento basado en HPLC, con la ayuda de un anticuerpo dirigido al proglucagon sintético 126-159, para monitorizar el proceso. De forma similar, el GH se puede extraer de cadáveres, tal como se describe en U.S. Patent No. 2,974,088.
Como alternativa a la extracción, se pueden producir estas formas de GLP-2, IGF- 1, IGF-2 y GH que incorporan solamente L-amino ácidos de forma reproducible y en cantidades comerciales mediante la aplicación de técnicas de ADN recombinante. Para este propósito, los ácidos nucleicos que codifican la forma deseada de GLP- 2, IGF-1 (ver, por ejemplo, U.S. Patent No. 5,288,931), IGF-2 y GH (ver, por ejemplo, Goeddel et al. (1979) Nature 281:544-548) se expresan en un huésped celular, que se cultiva entonces bajo las condiciones apropiadas para la expresión de este péptido o proteina en particular. Se han adaptado una variedad de sistemas de expresión génica para este propósito, y típicamente conducen a la expresión del gen deseado a partir de los controles de expresión utilizados de forma natural por el huésped escogido. Ya que GLP-2, IGF-1, IGF-2 y GH no requieren una modificación post-translacional para que sean activos, su producción se puede conseguir de forma conveniente en huéspedes bacterianos, como E. coli. Para una producción de este tipo, se encuentra útil el colocar el ADN que codifica el GLP-2, IGF-1, IGF-2 o GH seleccionado bajo controles de expresión de los genes lac, trp o PL de E. coli. Como alternativa a la expresión del ADN que codifica a GLP-2, IGF-1, IGF-2 o GH per se, se puede adaptar el huésped para expresar GLP-2, IGF-1, IGF-2 o GH como una proteína de fusión en la que GLP-2, IGF-1, IGF-2 o GH estén unidos, de forma que se puedan separar, a una proteína vehículo que facilite el aislamiento y la estabilidad del producto de expresión.
Para el uso terapéutico, las hormonas peptídicas escogidas para su utilización en terapia de combinación se formulan con al menos un vehículo que sea adecuado para su uso en el ámbito farmacéutico y que sea apropiado para conducir los péptidos por la ruta de administración escogida. Algunos vehículos adecuados para su utilización en el ámbito farmacéutico son aquellos utilizados de forma convencional con fármacos basados en péptidos, como diluyentes, excipientes y similares. Se puede consultar "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, como guía para la formulación general de fármacos. En uno de los ejemplos preferidos de la invención, los compuestos se formulan para su administración por infusión o por inyección, bien subcutánea o intravenosa, y por lo tanto se utilizan como soluciones acuosas en formas estériles y sustancialmente libres de pirógeno, y opcionalmente ajustadas a un pH ligeramente ácido o fisiológico. Así pues, los compuestos se pueden administrar en agua destilada, o, mejor aún, en salino, salino ajustado o solución de dextrosa al 5%. Si se desea, se puede mejorar la solubilidad en agua de estos compuestos incorporando una sustancia que mejore la solubilidad, como por ejemplo, incluyendo ácido acético para las formulaciones de GLP-2.
La invención también proporciona diversos conjugados de hormonas peptídicas. Las composiciones de hormonas peptídicas de la invención comprenden hormonas peptídicas unidas de forma covalente a uno o más polímeros solubles en agua. Los polímeros solubles en agua, especialmente el polietilen glicol, han sido conjugados a proteínas para proporcionar propiedades adicionales deseables mientras retienen, al menos en parte, las propiedades inductoras del crecimiento de la hormona peptídica. Estas propiedades deseables incluyen una mejor solubilidad en soluciones acuosas, una mejor estabilidad frente al almacenamiento, una menor inmunogenicidad, una mayor resistencia a la degradación proteolítica, y un mayor tiempo de vida media in vivo. Los polímeros solubles en agua apropiados para su uso en estas composiciones incluyen homopolímeros de polietilen glicol, homopolímeros de polipropilen glicol, copolímeros de etilen glicol con propilen glicol, en los cuales los homopolímeros y copolímeros no se hayan sustituídos o están sustituídos en un extremo con un grupo alquilo, polioles polioxetilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, éteres de polivinil etilo, y \alpha,\beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida]. Se prefiere en especial el polietilen glicol. Los métodos para fabricar conjugados de polímeros solubles en agua con proteínas se describen, entre otros lugares, en U.S. Pat. No. 4,179,337; U.S. Pat. No. 4,609,546; U.S. Pat. No. 4,261,973; U.S. Pat. No. 4,055,635; U.S. Pat. No. 3,960,830; U.S. Pat. No. 4,415,665; U.S. Pat. No. 4,412,989; U.S. Pat. No. 4,002,531; U.S. Pat. No. 4,414,147; U.S. Pat. No. 3,788,948; U.S. Pat. No. 4,732,863; U.S. Pat. No. 4,745,180; EP No. 152,847; EP No. 98,110 (publicadas el 11 de Enero del 1984); JP No. 5,792,435.
Otro aspecto de la invención son las formulaciones que proporcionan una liberación sostenida de las hormonas peptídicas. Ejemplos de tales formulaciones de liberación sostenida incluyen compuestos de polímeros biocompatibles, como poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno, y similares. Se han revisado la estructura, selección y uso de polímeros degradables como vehículos para la distribución de fármacos en diversas publicaciones, incluyendo, A. Domb et al. (1992) Polimers for Advanced Technologies 3:279-292. Se puede encontrar guía adicional en la selección y uso de polímeros en formulaciones farmacéuticas en el texto de M. Chasin y R. Langer (eds.), "Biodegradable Polimers as Drug Delivery Systems," Vol. 45 de "Drugs and the Pharmaceutical Sciences," M. Dekker, New York, 1990. También se pueden utilizar liposomas para proporcionar la liberación sostenida de hormonas peptídicas. Los detalles concernientes al uso y fabricación de formulaciones con liposomas de fármacos de interés se pueden encontrar, entre otros lugares, en U.S. Pat. No 4,944,948; U.S. Pat. No. 5,008,050; U.S. Pat. No. 4,921,706; U.S. Pat. No. 4,927,637; U.S. Pat. No. 4,452,747; U.S. Pat. No. 4,016,100; U.S. Pat. No. 4,311,712; U.S. Pat. No. 4,370,349; U.S. Pat. No. 4,372,949; U.S. Pat. No. 4,529,561; U.S. Pat. No. 5,009,956; U.S. Pat. No. 4,725,442; U.S. Pat. No. 4,737,323; U.S. Pat. No. 4,920,016. Las formulaciones de liberación sostenida son de especial interés cuando se desea proporcionar una alta concentración local de las composiciones de la invención, por ejemplo, cerca del tracto gastrointestinal superior.
Para su uso en la estimulación del crecimiento del gastrointestino superior y/o la mejora de la función del tejido del gastrointestino superior en mamífero, incluyendo humanos, la presente invención proporciona en uno de sus aspectos un envase, en la forma de una ampolla o un vial rellenados de forma estéril, que contenga una cantidad de GLP-2 capaz de promover el crecimiento del tejido mezclado con al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH bien en dosis unitarias o en forma de multidosis, donde el envase incorpora una etiqueta con instrucciones sobre el uso para la promoción de la función gastrointestinal, por ejemplo, para la promoción del crecimiento del tracto gastrointestinal superior. En uno de los ejemplos preferidos de la invención, el envase contiene GLP-2 y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH, y el vehículo deseado, como una formulación lista para su administración. De forma alternativa, y de acuerdo con otro ejemplo preferido de la invención, el envase proporciona el GLP-2 y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH en una forma, como por ejemplo una forma liofilizada, apropiada para su reconstitución en un vehículo apropiado, como por ejemplo un tampón salino. En otro ejemplo de realización preferido, el envase es un vial o ampolla rellenada de forma estéril que contiene una solución inyectable que contiene una cantidad efectiva del GLP-2 y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH disueltas en un vehículo acuoso.
De acuerdo con la presente invención, el GLP-2 en combinación con al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH se administra para tratar pacientes que se beneficiarían de un mejor funcionamiento del tracto gastrointestinal superior. En uno de los aspectos, los candidatos a pacientes son aquellos que se beneficiarían de la proliferación del tejido del tracto gastrointestinal superior. Además, otros candidatos a pacientes son aquellos que se beneficiarían de una mejora del funcionamiento del tejido en el tracto gastrointestinal superior, ya sea resultado de un incremento en la tasa de crecimiento del tejido o no. Los efectos de la terapia de combinación sobre estos tejidos beneficiaría claramente a aquellos pacientes que sufran enfermedades o condiciones marcadas por anormalidades. En general, los pacientes que se beneficiarían de un aumento en la masa del tracto gastrointestinal superior o de la regeneración y cura del epitelio de la mucosa normal preexistente son candidatos para el tratamiento con la invención. Además, los pacientes que se beneficiarían de una mejora del funcionamiento del tejido del tracto gastrointestinal superior, ya sea resultado de un incremento en la tasa de crecimiento de tejido o no, son candidatos para el tratamiento con la invención. Por ejemplo, se pueden tratar los pacientes antes o después de un régimen de quimioterapia o radioterapia, antes, durante o después de la aparición de la inflamación gastrointestinal, después de un período de nutrición parenteral, después o durante una enfermedad gastrointestinal activa, o si el paciente es un recién nacido prematuro con una maduración insuficiente del tracto gastrointestinal, y/o en la inflamación del tracto GI ejemplificada por la condición de enterocolitis necrotizante.
Otros candidatos para la terapia con GLP-2 incluyen los pacientes hospitalizados, a menudo en unidades de cuidados intensivos, que se sabe que sufre un mayor riesgo de padecer una inflamación y ulceración del tracto GI superior, o pacientes bajo el efecto de fármacos, com NSAIDs y/o glucocorticoides, que aumentan el riesgo de inflamación/ulceración del tracto GI superior.
Un médico puede tomar en cuenta numerosos factores para determinar la dosis óptima para un sujeto determinado. El principal de ellos es la cantidad de hormonas peptídicas producidas normalmente por el cuerpo. Otros factores adicionales incluyen el tamaño del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad concreta a tratar, la gravedad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, la actividad in vivo del péptido o del análogo del péptido y similares. Las dosis de prueba deberían ser escogidas después de considerar los resultados de estudios en animales y la literatura clínica respecto a la administración de hormonas peptídicas y de secretagogos de hormonas peptídicas. Las personas con cierta habilidad en estas técnicas apreciará que también se puede utilizar otra información, como constantes de unión y Ki derivadas de ensayos de competición de unión in vitro para calcular las dosis. Se espera que las dosis de la combinación equivalente a alrededor de 0.1 mg/kg de GLP-2 y análogos de GLP-2 dos veces al día, con aproximadamente 2 mg/kg de IGF-1 dos veces al día y/o 1 mg/kg de GH una vez al día, co-administrados durante 10 días puedan generar un aumento muy significativo del tracto gastrointestinal superior. Se espera que dosis mucho más pequeñas, en el ranto de \mug/kg y quizás en el rango de ng/kg, y quizás una duración o frecuencia menor o mayor del tratamiento, también produciran resultados con utilidad terapéutica, por ejemplo, un aumento estadísticamente significativo en particular en la masa del intestino delgado.
Una dosis típica en humanos de un péptido GLP-2 sería desde alrededor de 10 \mug/kg de peso corporal/día hasta alrededor de 10 mg/kg/día, preferiblemente desde alrededor de 50 \mug/kg/día hasta alrededor de 5 mg/kg/día, y más preferiblemente alrededor de 100 \mug/kg/día hasta 1 mg/kg/día. Como los análogos de GLP-2 de la invención pueden ser desde 10 hasta incluso 100 veces más potentes que el GLP-2, una dosis típica de tal análogo de GLP-2 puede ser menor, por ejemplo, desde alrededor de 100 ng/kg de peso corporal/día hasta 1 mg/kg/día, preferiblemente 1\mug/kg/día hasta 500\mug/kg/día, y todavía más preferiblemente de 1 \mug/kg/día hasta 100 \mug/kg/día.
Para la administración de GH a un mamífero, en particular a humanos, se puede utilizar un rango de dosis de 0.02-2.5 mg/kg/día; preferiblemente, las dosis de GH pueden estar en el rango de desde alrededor de 0.1-2 mg/kg/day. Para la administración de IGF's, las dosis pueden estar en el rango de 1 \mug hasta 1 g/kg/día. El IGF-1 se administra preferiblemente a humanos en el ranto de alrededor de 0.03-10 mg/kg/día, más preferiblemente desde alrededor de 0.1-4 mg/kg/día, y más preferiblemente desde alrededor de 0.5-1 mg/kg/día. Las dosis típicas para el IGF-2 son de alrededor de 0.5-5 mg/kg/día. La dosis requerida para los análogos del IGF puede ser un 20-50% menor que el IGF-1 natural. Además, el tamaño de las dosis y el régimen de dosificación más apropiados para humanos se puede determinar en ensayos clínicos diseñados adecuadamente.
En otro de sus aspectos, la invención proporciona tratamiento a pacientes identificados utilizando células intestinales implantadas que han sido regeneradas o estimuladas para proliferar in vitro o in vivo antes de la reimplantación o transplante al destinatario. Se puede conseguir el condicionamiento de las célular ex vivo simplemente haciendo crecer las células o el tejido a transplantar en un medio que se ha complementado con una cantidad de las combinaciones capaz de promover el crecimiento y que, por lo demás, es apropiada para el cultivo de esas células. Las células pueden, después de un período de condicionamiento apropiado, ser implantadas directamente al paciente o bien encapsuladas utilizando la tecnología consolidada de encapsulación de células, para ser posteriormente implantadas. Los procedimientos análogos en otros órganos, como la piel, se encuentran bastante avanzados clínicamente en ensayos humanos. Por ejemplo, se puede regenerar piel in vitro tomando células de la piel de un donante, haciéndolas crecer en un cultivo de tejido, y transplantándo entonces de nuevo la masa aumentada de piel al paciente para su uso terapéutico (por ejemplo, para el tratamiento de quemaduras, úlceras, etc).
Además, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo utilizando terapia génica. Las células del mamífero o paciente destinatario (que pueden ser cualquier tipo de células pero que son preferiblemente fibroblastos o queratinocitos) se pueden modificar para que expresen uno o más de los factores de crecimiento, o combinaciones del GLP-2 con IGF-1 y/o IGF-2 y/o GH in vitro, seguido de reimplantación, preferiblemente en una capsula, in vivo para distribuir de esta manera cantidades terapéuticas de estos péptidos. Actualmente hay disponibles y se utilizan una gran variedad de técnicas de transfección para transfectar ADN en células in vitro; incluyendo precipitación de fosfato de calcio-ADN, transfección DEAE-dextrano, electroporación, transferencia de ADN mediada por liposoma o transducción con vectores víricos recombinantes. Tales protocolos de tratamiento ex vivo han sido propuestos para transferir ADN en diversos tipos de células, incluyendo células epiteliales (U.S. Patent 4,868,116; Morgan and Mulligan WO87/00201; Morgan et al., 1987, Science 237:1476-1479; Morgan and Mulligan, U.S. Patent No. 4,980,286); células endoteliales (WO89/05345); hepatocitos (WO89/07136; Wolff et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344-3348; Ledley et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84:5335-5339; Wilson and Mulligan, WO89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.87:8437-8441); fibroblastos (Palmer et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1055-1059; Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4:11-20; Rosenberg et al., 1988, Science 242:1575-1578; Naughton & Naughton, U.S. Patent 4,963,489); linfocitos (Anderson et al., U.S. Patent No. 5,399,346; Blaese, R.M., et al., 1995, Science 270:475-480); y células madre hematopoyéticas (Lim, B., et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:8892-8896; Anderson et al., U.S. Patent No. 5,399,346).
Se espera que la terapia génica sea un método viable para proporcionar las hormonas de crecimiento que constituyen la práctica de la invención. En concreto, se puede llevar a cabo un experimento en el cual las células de una línea celular que secreta todos los glucagones se implantan en un ratón. Las células immplantadas crecen en la forma de un tumor que segrega GLP-2 e induce el crecimiento del intestino delgado. Ya que el GLP-2 es el único péptido derivado de glucagón que se sabe que estimula de forma notable el crecimiento del intestino delgado, el efecto sobre el crecimiento del intestino delgado observado en este experimento es debido muy probablemente a la secreción de GLP-2. De forma similar, se pueden modificar células para producir solamente GLP-2, y/o al menos una hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH, e implantarse en un mamífero.
De forma alternativa, se puede utilizar terapia génica para transfectar in vivo las células del destinatario. Las formulaciones de ácido nucleico a utilizar en tales métodos in vivo pueden incluir: ADN desnudo; ácido nucleico encapsulado en liposomas o en liposomas combinados con receptores de la cápsula viral (Nicolau et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1068); ADN acoplado a un complejo transportador polilisina-glicoproteina; y precipitantes de ácido nucleico. Las preparaciones de ácido nucleico se pueden introducir in vivo utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en este campo, como inyección directa, electroporación y bombardeo de partículas. Además, se han utilizado "pistolas génicas" para introducir genes en células (Australian Patent No. 9068389).
Se puede plantear un planteamiento parecido utilizando una modificación de la terapia génica y vectores víricos que codifiquen los productos génicos para el GLP-2 y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2 y GH. Tales vectores víricos pueden ser útiles para infectar el epitelio intestinal remanente en pacientes con problemas en el intestino, de esta manera llevando de forma local, dirigida y terapéutica estas sustancias al intestino in vivo. Sin embargo, no es necesario para la practica de la invención que todas las células sean transformadas, o incluso que las células intestinales sean transformadas. De hecho, las células de cualquier tejido que puedan secretar la hormona escogida en el sistema circulatorio, por ejemplo células musculares, pueden utilizarse para producir hormonas de forma endógena.
Se puede determinar fácilmente la secuencia de los ADNs para la puesta en práctica de los métodos de terapia génica a partir de las secuencias de aminoácido de los GLP-2, IGF-1, IGF-2 y GH seleccionados, con la limitación de esta manera sólo se pueden producir las formas que contengan aminoácidos codificados genéticamente. Se pueden emplear diversos vectores de expresión, incluyendo vectores víricos, apropiados para la introducción de información genética en células humanas, e incorporarán los ADNs que codifican GLP-2, IGF-1, IGF-2 y GH bajo controles de expresión funcionales en las células huésped. Una vez alterados genéticamente, las células modificadas pueden implantarse utilizando cualquiera de las técnicas convencionales en este campo.
Una vez descrita la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración, sin que sean limitantes.
Ejemplo 1
En este experimento, se examinó el efecto del GLP-2 en la proliferación celular de la mucosa del epitelio y de la capa muscular del esófago.
Se alojaron hembras de ratones CD1 (de 6 semanas de edad, aprox. 25g, Charles River) en cajas con el suelo de plástico y la tapa de rejilla y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les dejó comer y beber ad libitum. Los ratones se pesaron utilizando una balanza Mettler PJ300 y se asignaron de forma aleatoria al grupo control (inyección de tampón de fosfato salino ("PBS")) o bien al grupo de tratamiento (inyección de [Gly^{2}]GLP-2 humano). Cada grupo de control o tratamiento consistió en 2 ratones alojados juntos en 1 jaula.
Se trataron las hembras de ratones CD1 (subcutáneamente) con 2.5 \mug de [Gly2]GLP-2 humano o sólo con PBS, dos veces al día (8 a.m. y 6 p.m.) durante 2 días antes de la inyección de bromodeoxiuridina ("BrdU") (50 ug/g de peso corporal, en 0.5 ml). Los ratones recibieron un total de 5 inyecciones de [Gly2]GLP-2 humano o bien de salino durante las 50 horas previas. Se hizo ayunar a los ratones 21 horas antes de su sacrificio. Los ratones se sacrificaron 2 horas después de recibir la Inyección de BrdU. Después del sacrificio, se tomaron secciones del esófago distal (los últimos 2 cm del esófago adyacentes a la unión gastroduodenal) para realizar un análisis histológico.
Los tejidos del esófago se fijaron en un tampón de formalina al 10% durante 24 horas y seguidamente se pusieron en alcohol 70% antes de su tratamiento. Los tejidos se trataron y se incluyeron en parafina utilizando técnicas habituales. Se cortaron secciones de cuatro a seis micras de grosor y se tiñeron con hematoxilina y eosina y un segundo juego de cortes se tiñó para células BrdU- immunopositivas. La micrometría intestinal se llevó a cabo utilizando un Leica Q500MC Image Analysis System. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Los resultados de este experimento muestran claramente que la administración de [Gly2]GLP-2 humano durante un período de 50 h produce un aumento significativo de la proliferación celular de la mucosa del epitelio y capa muscular del esófago tal como se muestra por el número de células BrDU-positivas.
Ejemplo 2
En este experimento, se examinó el efecto del [Gly^{2}] GLP-2 humano sobre la síntesis de proteínas en el esófago de ratón. Se alojaron y alimentaron hembras de ratones CD1 (de 6 semanas de edad) y tal como se describe en el Ejemplo 1. Se trataron dos grupos de ratones (n=5 por grupo) dos veces al día (subcutáneamente) con 0.5 ml de PBS (control) o con 2.5 ug en 0.5 ml de PBS durante 10 días. Después del tratamiento, los ratones se anestesiaron con CO_{2} y se sacrificaron para su análisis. Se recogieron segmentos de tejido del esófago de un (1) cm, entre 2-4 cm proximales a la unión gastroduodenal, para el análisis de proteína celular total. Los segmentos de esófago de 1 cm se pusieron en 1 ml de PBS y se homogeneizaron utilizando un Politron. Se tomaron alícuotas del homogenato para la determinación del contenido de proteína utilizando el ensayo de Bradford modificado (BIORAD). Los resultados se muestran en la Figura 2.
El ensayo de contenido de proteína muestra un incremento en la síntesis de proteína en el tejido del esófago después del tratamiento con [Gly2]GLP-2 humano. Estos resultados confirman la acción celular del [Gly2]GLP-2 humano en su receptor diana en este tejido.
Ejemplo 3
En este experimento, se examinó el efecto del GLP-2 sobre la masa del estómago. Se trataron hembras de ratones CD1 (de 6 semanas de edad) con [Gly2]GLP-2 humano mediante administración oral en el agua para beber. El agua para beber contenía 4.3\mug/ml de [Gly2]GLP-2 humano y se preparaba de nuevo cada día. Cada ratón recibió aproximadamente 100\mug de [Gly2]GLP-2 humano al día. Después de 12 días de tratamiento se hizo ayunar a los ratones durante 24 horas, se anestesiaron con CO_{2} y se sacrificaron. Se sacó y pesó el estómago de cada ratón. Los resultados se muestran en la Figura 3.
El peso de los estómagos aumenta significativamente con el tratamiento con [Gly^{2}] GLP-2 humano (p<0.05) al compararse con los ratones control que recibieron agua normal para beber.
Ejemplo 4
En este experimento, se estudió el efecto profiláctico y terapéutico del GLP-2 en el daño epitelial en la mucosa inducido por indometacina.
Los fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs) se encuentran entre las medicinas utilizadas de forma más común en América del Norte. Terapéuticamente, tienen efectos analgésicos, anti-inflamatorios, antipiréticos y antiplaquetarios. La toxicidad gastrointestinal permanece como una de las principales causas de morbilidad a pesar de los intentos de profilaxis utilizando agentes dirigidos a la supresión del ácido gástrico o a través de prostaglandinas exógenas. Las estimaciones de incidencias de gastropatía inducidas por NSAID, desde erosiones gástricas asintomáticas o hemorragias intestinales que ponen en peligro la vida, varían entre un 15% y 20% entre los usuarios crónicos de NSAID. Se desconoce la incidencia exacta de pequeños daños intestinales (enteropatía inducida por NSAID).
Los NSAIDs bloquean el acceso del ácido araquidónico al lugar de unión de la ciclo-oxigenasa (prostaglandin sintasa) previniendo la formación de prostaglandinas y tromboxano. Sin embargo, la supresión de la síntesis de prostaglandinas no parece que sea uno de los principales contribuyentes al daño en la mucosa del intestino delgado inducido por NSAID. Más bien, son las alteeraciones en la permeabilidad epitelial, un aumento de la carga bacteriana luminal, y la bilis los factores que contribuyen al daño epitelial. En roedores a los que se ha administrado NSAIDs se detectan, además de gastropatía, una ligera inflamación transmural del intestino y del colon y ulceración, y, así pues, se puede utilizar la administración de NSAID para generar modelos animales de enfermedades inflamatorias de los intestinos.
La administración de GLP-2 a ratones y ratas estimula el crecimiento de la mucosa en el intestino delgado y grueso a través de la activación de la proliferación de las células de la cripta y la inhibición de la apoptosis en enterocitos. Para poner a prueba la posibilidad de que el GLP-2 pueda ser útil para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del daño en la mucosa epitelial, hemos estudiado la utilización de un nuevo análogo del GLP-2 humano, h[Gly^{2}]-GLP-2, en ratones con gastroenterocolitis inducida por indometacina experimental.
Materiales y métodos Animales
Hembras de ratones CD1 de seis a ocho semanas de edad (aproximadamente 22-28 g, Charles River) se alojaron en cajas con el suelo de plástico y la tapa de rejilla y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les dejó comer y beber ad libitum durante el estudio. El día antes de empezar el experimento, se pesaron los ratones utilizando una balanza Mettler PJ300 y se asignaron de forma aleatoria a un grupo de tratamiento. Cada grupo de tratamiento consistía en 5 ratones alojados juntos. Se les pusieron inyecciones subcutáneas de PBS o del péptido h[Gly^{2}]-GLP-2 en el cuarto trasero derecho dos veces al día a las 9 am y 7 pm. Las inyecciones empezaron 4 días antes de la administración de indometacina. Se hizo ayunar a los ratones la noche anterior a que recibieran la primera dosis de indometacina.
Se sacrificaron los ratones entre las 9 am y 5 pm. Se midió el peso del estómago, del intestino delgado, y del intestino grueso. También se midieron las longitudes del intestino delgado y grueso. Se tomó sangre mediante una punción cardíaca y se aisló el plasma mediante centrifugación a 10,000 g durante 10 minutos. Se congeló el plasma a -70ºC para futuros análisis de los niveles de GLP-2. Se recogieron tejidos para llevar a cabo análisis histológicos, de proteína, de peso seco y húmedo, de ARN y el ensayo de la mieloperoxidasa.
Administración de GLP-2
50.4 mg de h[Gly^{2}]GLP-2 (ALX-0600) obtenido de Allelix el 1 de Agosto de 1997 disueltos en H_{2}O estéril; se utilizó NaOH 5N para ajustar el pH de la solución a un pH final de 7. Se utilizó este lote del péptido en todos los experimentos. Se congelaron alícuotas de 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml a -80ºC. Se virtieron alícuotas de 600 \mug de h[Gly^{2}]-GLP-2 en una solución de 1 ml en 399 ml de tampón salino de fosfato (PBS -NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4\cdot7H2O 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM, pH 7.3) para obtener una concentración final de 1.5 ug/mL. Se almacenaron alícuotas de 14 ml a -80ºC y se descongelaron en un baño de agua a 37ºC antes de su inyección. El volumen de inyección fué de 0.5 ml por inyección utilizando 1/2 cc U-100 Insulin Syringes (Becton Dickinson and Company, NJ). Los animales a los que se había inyectado PBS recibieron la misma solución de PBS utilizada para diluír el péptido h[Gly^{2}]-GLP-2 a través de la misma ruta de administración.
Administración de indometacina
Se preparó una solución de indometacina(ácido 1-[p-clorobenzoíl]-5-metoxi-2- metilindol-3-acético) (Sigma Chemical Co., St Louis MO, lot 74H1212), y se tomaron alícuotas 1 h antes de la primera inyección. Los ratones se pesaron, se les hizo ayunar durante toda la noche, y se les dió comida una hora antes de la primera inyección de indometacina. No se hizo ayunar a los ratones para la segunda inyección de indometacina. Se pesó la indometacina (14.5 mg) utilizando una balanza Mettler AE166 y se disolvió en 1 mL de alcohol etílico anhidro. La solución se calentó a 37ºC durante 5 minutos y se agitó vigorosamente cada minuto hasta una completa disolución. Se diluyeron 998.1 uL de la solución de indometacina inicial en 41 ml de NaHCO_{3} 5% pH 7.3. Los animales recibieron inyecciones 0.5 ml a las 10:00 AM O.D. durante dos días. La indometacina utilizada en la segunda inyección se almacenó a -20ºC durante toda la noche y se dejó descongelar a temperatura ambiente antes de la inyección. Los ratones recibieron las inyecciones al mismo tiempo (10:00 AM) los dos días aproximadamente 1 h después de recibir h[Gly^{2}]-GLP-2. A los animales que no recibieron indometacina se les administró solamente el vehículo (250 \mul de alcohol etílico anhidro en 10.5 mL de NaHCO_{3} pH 7.3 - se dió un volumen de inyección final de 0.5 ml diariamente durante 2 días). Los animales fueron sacrificados en una cámara de CO_{2} 14 días después de la administración de PBS o de h[Gly^{2}]-GLP-2.
Resultados
Se llevaron a cabo experimentos piloto para determinar una dosis de indometacina que produjera de forma reproducible una mortalidad del 50% en ratones. Para todos los grupos que recibían tratamiento de indometacina en este estudio, se administró una dosis de indometacina de 7 mg/kg s.c. a hembras de ratones CD1 de 7-8 semanas de edad, durante dos días y seguido de ayuno durante toda una noche. Esta dosis resultó de forma consistente en una mortalidad del 50% en animales control tratados con salino. En cada grupo de tratamiento, se administraron inyecciones subcutáneas de PBS o h[Gly^{2}]-GLP-2, .75 \mug dos veces al día a los animales que recibían indometacina y a los controles negativos.
El grupo de tratamiento I se utilizó para caracterizar el tipo y la extensión del daño en el intestino producido por la indometacina (dosis de 7 mg/kg). Los animales fueron pretratados con salino o h[Gly^{2}]-GLP-2 durante 4 días, seguido de otros 2 días de salino o de h[Gly^{2}]-GLP-2 e indometacina, y entonces se sacrificaron dos días después de la dosis inicial de indometacina.
El grupo de tratamiento II se utilizó para examinar el efecto de cuatro días de pretratamiento con h[Gly^{2}]-GLP-2 o bien con salino seguido de diez días de tratamiento adicional con salino o h[Gly^{2}]-GLP-2.
El grupo de tratamiento III se utilizó para examinar el efecto en ratones tratados con salino o con h[Gly^{2}]-GLP-2 durante 4 días antes y 2 días con administración concurrente de indometacina.
Los grupos de tratamiento IV y V del estudio involucran ratones que reciben salino o h[Gly^{2}]-GLP-2 empezando de manera concurrente (IV) o el día después (V) de la administración de indometacina y continuada hasta que se sacrificaron los animales al final del período experimental de 10 días.
Todos los ratones tratados con h[Gly^{2}]-GLP-2 en los grupos II-V mostraron un marcado incremento en la supervivencia, del 75-95%, en contraste con la supervivencia en los controles tratados con salino que fue del 45-50%. Se encontró que esta diferencia es altamente significativa desde el punto de vista estadístico (p<.05-.01). Al final de los experimentos se lleva a cabo el pesado del intestino delgado y grueso, histología, resultados de la actividad de la enfermedad, actividad de los enzimas de la mucosa, expresión génica específica del epitelio del intestino delgado y grueso, marcadores de la respuesta inflamatoria tales como la expresión de citoquinas y mieloperoxidasa y contenido de GLP-2. La mayoría de los parámetros medidos, especialmente los marcadores del daño/inflamación epitelial, mejoraron significativamente en los ratones tratados con h[Gly^{2}]-GLP-2.

Claims (55)

1. La utilización de un agonista del receptor GLP-2 en la fabricación de un medicamento para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior incluyendo el esófago y el estómago, donde dicho medicamento está destinado a llevarse al tracto gastrointestinal superior.
2. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el agonista del receptor de GLP-2 es el GLP-2 o un análogo peptídico del GLP-2 , que está destinado a llevarse al esófago.
3. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el agonista del receptor de GLP-2 es GLP-2 o un análogo peptídico del GLP-2, que está destinado a llevarse al estómago.
4. La utilización de un análogo peptídico del GLP-2, en la fabricación de un medicamento para hacer proliferar el tejido del tracto gastrointestinal superior, donde el medicamento está destinado a llevarse al tracto gastrointestinal superior.
5. La utilización de acuerdo con las Reivindicaciones 1 ó 4, donde el sujeto sufre de una condición inflamatoria que involucra al tracto gastrointestinal superior.
6. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 5, donde la condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior es una condición inflamatoria que involucra el esófago.
7. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 6, donde la condición inflamatoria que involucra el esófago se encuentra dentro del grupo formado por inflamación-vasculitis, inflamación post-infección, desorden infiltrativo, esofagitis infecciosa, esofagitis no infecciosa, sarcoidosis, enfermedad de Chrohn, enfermedad de Behcet, enfermedad de injerto contra huésped, reflujo ácido, reflujo de bilis, lesión inducida por fármacos, lesión química, lesión inducida por radiación, miositis o enfermedades vasculares del colágeno.
8. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 5, donde la condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior es una condición inflamatoria que involucra el estómago.
9. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 8, donde la condición que involucra el estómago se encuentra dentro del grupo formado por gastritis hemorrágica y erosiva, gastritis por Helicobacter pylori, gastritis de origen químico, gastritis atrófica metaplásica, gastritis atrófica post-antrectomía, gastritis eosinofílica, gastritis infecciosa, enfermedad de Crohn, sarcoidosis, gastritis granulomatsa aislada, gastritis linfocítica, y enfermedad de Ménétriere.
10. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 4, donde el sujeto ha sufrido una resección parcial o subtotal del tracto gastrointestinal superior.
11. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 10, donde la resección parcial o total del tracto gastrointestinal superior incluye al esófago o al estómago.
12. La utilización de acuerdo con las Reivindicaciones 1-11, donde el sujeto es un ser humano.
13. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 12, donde el análogo del GLP-2 tiene una mejor actividad de proliferación celular del tracto gastrointestinal superior comparado con el GLP-2 de rata nativo.
14. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 13, donde el análogo del GLP-2 es un análogo del GLP-2 humano.
15. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 14, donde el análogo del GLP-2 está destinado a llevarse al tracto gastrointestinal superior mediante administración oral, subcutánea, o intravenosa.
16. Un método para identificar péptidos útiles para tratar condiciones inflamatorias que involucran al tracto gastrointestinal superior, comprendiendo los pasos de:
a) obtención de un análogo del péptido GLP-2 de vertebrados, teniendo dicho análogo al menos una sustitución, deleción o adición en su cadena de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) la inducción de una condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior en un animal de prueba; y
c) la determinación del efecto del análogo en el estado de salud o en la mortalidad de los animales de prueba que tienen una condición inflamatoria inducida del tracto gastrointestinal superior comparados con animales control que no reciben el péptido o la determinación del efecto del análogo en el peso del tracto gastrointestinal superior de animales de prueba comparado con animales control que no reciben el péptido.
17. Un método para identificar péptidos útiles para prevenir o aliviar condiciones inflamatorias que involucran el tracto gastrointestinal superior, comprendiendo los pasos de:
a) obtención de un análogo de péptido GLP-2 de vertebrado, teniendo dicho análogo al menos una sustitución, deleción o adición en su cadena de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) la inducción de una condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior en un animal de prueba que tiene una condición inflamatoria inducida del tracto gastrointestinal superior comparado con control animal; y
c) determinación del efecto del análogo en el estado de salud o mortalidad del animal de prueba comparado con animales control que no reciben el péptido o determinación del efecto del análogo en el peso del tracto gastrointestinal superior de los animales de prueba comparado con los animales control que no reciben el péptido.
18. Un método útil para identificar péptidos capaces de hacer proliferar el tejido del tracto gastrointestinal superior, comprendiendo los pasos de:
a) obtención de un análogo de péptido GLP-2 de vertebrado, teniendo dicho análogo al menos una sustitución, deleción o adición en su cadena de aminoácidos, o un aminoácido con un grupo protector;
b) llevar el análogo al tracto gastrointestinal superior del animal de prueba utilizando un régimen capaz de provoca la proliferación del tracto gastrointestinal superior cuando se utiliza por GLP-2 nativo; y
c) evaluar el incremento en la masa, longitud o contenido total de proteína del tracto gastrointestinal superior o de una porción representativa una vez completado el régimen del tratamiento.
19. Utilización del GLP-2 o de un análogo del GLP-2 en la fabricación de un medicamento para la inhibición de la aparición y/o para la mejora del desarrollo de una condición inflamatoria que incluye la inflamación del tracto gastrointestinal superior en un sujeto con riesgo de desarrollar tal condición.
20. La utilización de un agonista del receptor de GLP-2 y al menos una hormona peptídica en la fabricación de un medicamento para la promoción del crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en un mamífero de tal forma que se eleven los niveles en suero de dicho agonista y de las hormonas peptídicas, y donde el agonista del receptor GLP-2 es GLP-2 o un análogo del GLP-2 y se selecciona al menos otra hormona peptídica del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, análogos de GH, EGF, análogos de EGF, HGF, análogos de HGF, KGF y análogos de KGF.
21. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 comprendiendo la co-administración a un mamífero de una cantidad efectiva del GLP-2, o de un análogo del GLP-2, y una cantidad efectiva de al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, y análogos de GH.
22. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20, donde las células han sido modificadas genéticamente ex vivo para producir GLP-2 y/o la otra hormona peptídica, y son para la implantación al mamífero.
23. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 donde el GLP-2 y/o las otras hormonas peptídicas son producidas en el mamífero in vivo por células modificadas.
24. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 donde las hormonas peptídicas son IGF-1 o LRIGF-1.
25. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 donde la hormona peptídica es IGF-2.
26. La utilización de acuerdo con la Reivindicación20 donde la hormona peptídica es GH.
27. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 para promover el crecimiento del esófago.
28. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 20 para promover el crecimiento del estómago.
29. La utilización de un agonista del receptor GLP-2 y al menos una hormona peptídica en la fabricación de un medicamento para mejorar el funcionamiento del tracto gastrointestinal superior de tal manera que se elevan los niveles en suero de dicho agonista del receptor y de las hormonas peptídicas y donde el agonista del receptor GLP-2 es GLP-2, o un análogo del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica se selecciona del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, análogos de GH, EGF, análogos de EGF, HGF, análogos de HGF, KGF, y análogos de KGF.
30. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 29 para preservar, restaurar o mantener la función del tracto gastrointestinal superior:
después de un régimen de quimioterapia o radioterapia;
después de un período de nutrición parenteral;
después de una enfermedad gastrointestinal; o
cuando dicho paciente es un recién nacido prematuro.
31. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 29, donde el sujeto sufre de una condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior.
32. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 31, donde la condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior es una condición inflamatoria que involucra el esófago.
33. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 32, donde la condición inflamatoria que involucra el esófago se encuentra dentro del grupo formado por inflamación-vasculitis, inflamación post-infección, desorden infiltrativo, esofagitis infecciosa, esofagitis no-infecciosa, sarcooidosis, enfermedad de Crohn, enfermedad de Behcet, enfermedad de injerto contra huésped, reflujo ácido, reflujo de bilis, lesión inducida por fármacos, lesión química, lesión inducida por radiación, miositis o enfermedades vasculares del colágeno.
34. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 31, donde la condición inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal superior es una condición inflamatoria que involucra el estómago.
35. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 34, donde la condición inflamatoria que involucra el estómago se encuentra dentro del grupo formado por gastritis hemorrágica y erosiva, gastritis por Helicobacter pylori, gastritis de origen químico, gastritis atrófica metaplásica, gastritis atrófica postantrectomía, gastritis osinofílica, gastritis infecciosa, enfermedad de Crohn, sarcoidosis, gastritis granulomatosa aislada, gastritis linfocítica, ulceración gástrica y enfermedad de Ménétriere.
36. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 29, donde el sujeto ha sufrido una resección parcial o subtotal del tracto gastrointestinal superior.
37. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 36, donde la resección parcial o total del tracto gastrointestinal superior involucra al esófago o al estómago.
38. La utilización de acuerdo con las Reivindicaciones 29-37, donde el sujeto es un ser humano.
39. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 38, donde el análogo del GLP-2 tiene una mejor actividad en la proliferación celular del tracto gastrointestinal superior comparado con el GLP-2 de rata nativo.
40. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 39, donde el análogo del GLP-2 es un análogo del GLP-2 humano.
41. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 40, donde el análogo del GLP-2 está destinado a llevarse al tracto gastrointestinal superior mediante administración oral, subcutánea o intravenosa.
42. Un kit que contiene GLP-2 o uno de sus análogos y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, IGF-2, GH, EGF, HGF y KGF en una dosis unitaria o en forma de multidosis, con eficacia terapéutica.
43. Un método para la promoción del crecimiento del tejido o las células del tracto gastrointestinal superior que comprende el paso de cultivar dicho tejido o células en un medio de cultivo que contiene una combinación promotora del crecimiento de GLP-2, o de un análogo del GLP-2, y al menos otra hormona peptídica seleccionada del grupo formado por IGF-1, análogos de IGF-1, IGF-2, análogos de IGF-2, GH, análogos de GH, EGF, análogos de EGF, HGF, análogos de HGF, KGF, y análogos de KGF.
44. La utilización de un agonista del receptor GLP-2 y al menos una hormona peptídica para la fabricación de tejido cultivado del tracto gastrointestinal superior tal como se ha obtenido en la Reivindicación 43 para su uso en la restauración del tracto gastrointestinal superior de un paciente, donde el tejido es para ser implantado en el paciente.
45. Un método para la determinación de la actividad de una hormona cuando se utiliza en combinación con GLP-2, comprendiendo dicho método los pasos de:
(a) co-administración de la hormona con una cierta cantidad de GLP-2, o de un análogo del GLP-2, a un mamífero de prueba,
(b) evaluación del crecimiento consiguiente del tejido del tracto gastrointestinal superior en el mamífero de prueba, y
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(c) determinación de si el crecimiento del tejido del tracto gastrointestinal superior en el mamífero de prueba ha mejorado comparado con los animales control tratados solamente con GLP-2.
46. La utilización del GLP-2 o de un análogo del GLP-2, y al menos otro agente efectivo para el tratamiento de la úlceras peptídica en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con úlcera peptídico, donde el medicamento está destinado a llevarse al tracto gastrointestinal superior del sujeto y el otro agente eficaz en el tratamiento de la úlcera peptídica se selecciona de entre el grupo formado por: agentes que actúan bloqueando la secreción de ácido del estómago, agentes que actúan formando una barrera protectora en el estómago, o compuestos que contienen bismuto, en una cantidad terapéuticamente efectiva.
47. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 46 donde los agentes que actúan bloqueando la secreción de ácido del estómago incluyen antagonistas del receptor H_{2}, inhibidores de la bomba de protones y prostaglandinas.
48. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 46 donde los agentes que actúan formando una barrera protectora en el estómago incluye sucralfato.
49. La utilización de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-12, 19-38 y 43-48, donde el GLP-2 es un GLP-2 de vertebrado.
50. La utilización de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-12, 19-38 y 43-48, donde el GLP-2 es un GLP-2 de mamífero.
51. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 50, donde el GLP-2 es GLP-2 humano.
52. La utilización de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-12, 19-38, y 43-48, donde el GLP-2 es un análogo del GLP-2 que incorpora al menos una adición, sustitución o deleción de un aminoácido.
53. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 52, donde el análogo de GLP-2 incorpora una sustitución de un aminoácido.
54. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 53, donde el análogo de GLP-2 es un análogo de GLP-2 humano o de rata e incorpora una sustitución de un aminoácido en la posición 2 que confiere a dicho análogo resistencia a la ruptura por el enzima DPP-IV.
55. La utilización de acuerdo con la Reivindicación 54, donde el análogo de GLP-2 es un análogo del GLP-2 humano e incorpora una sustitución por glicina en la posición 2.
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