KR20010052355A - 종양 치료를 위한 조합 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가스트린-의존 종양을 치료하기 위한 조합 치료 방법에 관한 것이다. 이 방법은 5-플루오로우라실 및 류코보린과 같은 화학요법제의 투여와 조합하여 항-가스트린 17 면역원 조성물로 환자를 면역시키는 것을 포함하여 이루어진다.
Description
〈110〉 APHTON CORPORATION
〈120〉 Combination Therapy for the Treatment of Tumors
〈130〉 1102865-0034
〈140〉 US
〈141〉 1999-05-14
〈150〉 US 60/085,687
〈151〉 1998-05-15
〈160〉 2
〈170〉 PatentIn Ver. 2.0
〈210〉 1
〈211〉 9
〈212〉 PRT
〈213〉 human or synthetic peptide
〈220〉
〈221〉 MOD_RES
〈222〉 (1)
〈223〉 pyroglutamic acid
〈400〉 1
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu
1 5
〈210〉 2
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:Synthetic
peptide
〈400〉 2
Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys
1 5
가스트린은 펩티드 호르몬으로서, 두 성숙한 형태인 테트라트리아콘타가스트린(G34) 및 헵타데카가스트린(G17)으로 발생하며, 위강(stomach antrum)에 위치한 분화된 세포인 G 세포에 의해 합성 및 분비된다. 가스트린-생성 세포에서, 이 가스트린 호르몬은 번역 후에 신호 펩티드를 함유한 "프리프로가스트린(preprogastrin)"이라는 일반적인 전구체 분자로부터 진행된다. 혈류로 분비되기 전에, 신호 펩티드 "프리(pre)"는 세포의 소포체에서 제거되어, "프로가스트린" 펩티드가 되고, 세포 내에서 차례로 더욱 처리되어 성숙한 가스트린 G34 및 G17이 생성된다(Dickinson 1991). (여기서 인용한 참고 문헌에 대한 전체 인용문은 청구항 앞의 참고 문헌 부분에 제공되었다). 성숙한 형태의 G34 및 G17은 모두 카르복시-말단(-NH2)에서 아미드화된다. 인체 내에서, 전구체 분자의 차별적인 작용에 따라 다양한 형태의 G17가 발견되었고, 이들 각각은 서로 다른 생물학적 활성을 지닌다(Dickinson 1995 및 Ciccotosto 등, 1995). 가스트린의 번역 후 작용에서, 펩티드의 카르복시 말단을 통해 CCK-B/가스트린 수용체라 불리는 특정 세포 수용체에 결합하는 것은 "성숙한" 카르복시-아미드화 형태이다(Kopin 등, 1992).
가스트린 호르몬은 순환하는 혈액에 분비되고, 위장 내의 특정 세포, 즉, 엔테로크로마핀-유사(enterochromaffin-like;ECL) 세포 및 외벽 세포에 결합하여 간접 또는 직접적으로 위산 분비에 영향을 미친다. 역사적으로, 두 가스트린 호르몬은 가스트린산 분비의 자극과 관련이 있었다(Edkins, J.S. 1905). 최근에는, 가스트린이 위장관 내의 영양 인자로도 작용하고(Johnson, L. 1997), 폐의 소세포암을 포함하는 비-위장암(Rehfeld 등, 1989) 뿐만 아니라 위장암의 성장을 촉진시킨다(Watson 등, 1989, Dickinson,C.J.1995)는 것을 입증하는 증거가 쌓이고 있다.
결장직장, 위, 췌장 및 간세포 선암을 포함하는 다양한 형태의 종양은 이들 세포질막 내에 CCK-B/가스트린 수용체를 가지고, 종양 세포는 강력한 세포 분열 증식으로 가스트린에 반응한다(Rehfeld,J.F. 1972, Upp 등, 1989 및 Watson 등, 1993). 결장직장암 환자에게서 총 가스트린의 혈장 수준이 증가하고, 특히, 가스트린 항혈청을 사용하여 많은 결장직장종양에서 호르몬 전구체 프로가스트린의 증가량이 검출되었다(Ciccotosto 등, 1995). 더욱 최근에는, 상당수의 이들 암세포가 또한 가스트린을 분비하여, 자발적 세포 증식 경로에 영향을 미친다는 것이 발견되었다(Van-Solinge 등, 1993, Nemeth 등, 1993 및 Seva 등, 1994).
펩티드 호르몬 G17 및 G34는 정상 세포의 세포막 상에서 CCK-B/가스트린 수용체에 결합한다. 그러나, G34는 말고, G17은 가스트린-의존성 암세포의 성장을 자극한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 혈청-관련 G17은 암세포 내의 CCK-B/가스트린 수용체로 매개된 내분비 방법으로 결장직장 종양의 성장을 자극할 수 있다(Watson 등, 1993). G17은 다른 가스트린 호르몬종에 비해 종양 세포상에 CCK-B/가스트린 수용체에 대한 친화력이 증가될 수 있기 때문에, 특히 결장직장 선암의 성장을 자극하는 것과 관련된다(Rehfeld 1972 및 1993). CCK-B/가스트린 수용체는 인간의 초기 결장직장 종양의 56.7%에 높은 친화 형태로 발현되는 것으로 밝혀졌다(Upp 등, 1989).
수많은 연구들은, 인간 가스트린 및 결장직장 종양이 외인성 내분비 가스트린에 반응할 수 있을 뿐만 아니라, 가스트린 및 이의 전구체를 생성하여(Ciccotosto 등, 1995; Finley 등, 1993; Kochman 등, 1992; Nemeth 등, 1993; Van Solinge 등, 1993), 자동분비(autocrine) 성장 자극 경로에 영향을 준다는 것을 보여준다. 종양 세포 내의 가스트린 생성은 내분비 G 세포의 가스트린 생성과 다르다. 특히, 이들 종양 세포는 저농도의 성숙한 펩티드와 함께 전구체 프로가스트린을 고비율로 함유한다. 이러한 비정상적인 비율로 인해 펩티딜글리신 α-아미드화 모노옥시제나아제의 제한된 활성과 결합된 가스트린의 구성적인 조절되지 않은 방출이 일어날 수 있다(Ciccotosto 등, 1995; Kelly, 1985). 따라서, 조절되지 않은 가스트린의 방출로 인해 상이한 분자 형태의 호르몬이 비정상적으로 생성 및 분비된다. 특히, 결장암 세포는 효율적으로 가스트린을 처리하지 못해, 전구체 가스트린을 성숙한 펩티드로 덜 전환시켜, 대부분 불완전하거나 이상한 가스트린을 생성한다(Dickinson 1993 및 Rehfeld 등, 1993). 또한, 결장직장 종양 내의 증가된 가스트린 수준은 일부분 결장직장 종양 세포 내의 가스트린 유전자의 이상 발현때문이다(Hoosein 등, 1990, Baldwin 등, 1992 및 Finley 등, 1993). 가스트린-유사 펩티드가 이러한 세포 내에서 확인되었고(Hoosein 등, 1988, Watson 등, 1991 및 Finley 등, 1993), 전구체 가스트린 종으로 확인되었다(Van-Solinge 등, 1993 및 Nemeth 등, 1993).
어떤 결장직장암 내에 아미드화-G17(G17-NH2)가 존재하면(Ciccotosto 등, 1995; Van Solinge 등, 1993), 가스트린의 아미드화는 단지 분비기관 미립자 내에서만 일어나기 때문에, 어떤 종양은 진행 경로를 그대로 유지한다는 것이 증명된다(Varro 등, 1994). 결장직장 세포 계통의 기초 성장은 항-가스트린 항체에 의해 억제되는 것으로 보이므로, 내생적으로 생성된 가스트린은 또한 자동분비 성장 인자로 작용한다(Hoosein 등, 1988). 이는 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)이 동일한 세포 계통에서 가스트린 mRNA를 나타내고, 표시 면역 검정법(radioimmunoassay)이 세포 배양 상청액에서 가스트린-유사 면역활성을 나타낸 두번째 연구에서 확인되었다(Hoosein 등, 1990). 가스트린 펩티드는 또한 파라크린(paracrine) 역할을 하는데(Watson 등, 1991b), 이는 악성 결장직장 점막 세포의 부차 집단에서 더욱 우세한 가스트린 면역활성을 나타내는 실험에서 확인되었다(Finley 등, 1993).
G17이 이의 수용체에 결합하는 경우, 세포 기능을 조절하기 위해 제 2 전달자로 세포 성장을 자극하는 G17/수용체 조합체가 형성된다(Ullrich 등, 1990). G17이 CCK-B/가스트린 수용체에 결합하면 포스파티딜이노시톨 파괴가 활성화되고, 단백질 키나아제 C가 활성화되어 결과적으로 세포내 칼슘 이온의 농도가 증가되고, 및 세포 분열 증식 조절과 관련된 마이토젠-활성 단백질 키나아제를 통해 c-fos 및 c-jun 원종양유전자가 유도된다(Tadisco 등, 1995). 이외에도, CCK-B/가스트린 수용체에 결합한 가스트린은 마이토젠 신호를 전달하는 역할을 할 수 있는 티로신 키나아제, pp125FADK(병소 부착 키나아제)에 의한 인산화의 이어지는 증가와 관련이 있다(Tanaguchi 등, 1994).
최근 몇년 동안 생존면에서 단지 약간의 개선만이 이루어짐에 따라, 결장직장암은 치료하기 만만찮은 질병으로 남아있다. 수술이 주된 질병의 치료에는 효과적이지만, 빈발하는 잔존하는 잠재성 질병에 대해서는 효과적이지 못하다. 일반적으로, 질병 재발의 위험을 줄이기 위해 직장암 환자에게 수술 후 방사선 치료를 권한다. 5-플루오로우라실(5-FU)를 사용하는 화학요법은 더욱 진전된 결장직장암 환자의 수술 후에 행하는 가장 전통적인 효과적인 치료법이다. 그러나, 5-FU는 독성이 높고, 치료비가 비싸고, 또한 단독으로 또는 다른 세포독성 약제와 조합하여, 수명을 크게 연장하는 것 같지 않기 때문에, 5-FU 요법은 환자에게 최소한의 이득만을 나타내는 것으로 보인다. 대부분의 경우, 잠재성 또는 수술 불가능한 결장직장종양은 화학요법 또는 방사선에 잘 반응하지 않으므로, 이러한 방법을 보완하기 위한 새로운 치료법이 필요하다.
최근에, 몇몇 연구는 5-FU 및 류코보린을 사용한 보조 조합 화학요법이 진전된 결장직장암 환자에서의 5-FU의 효능을 개선한다고 보고하고 있다. 류코보린은 폴산 유도체이고, 폴린산, 시트로보룸 인자, 또는 5-포르밀-5,6,7,8-테트라히드로폴산이라고도 알려져있다. 이들 연구는 듀크 단계 C(Dukes' stage C) 환자들에서, 5-FU/류코보린 조합 치료가 사망률을 10 내지 15% 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다(Moertel, 1994). 같은 환자 그룹에서, 5-FU/류코보린을 사용한 결합된 정맥 및 내복막 치료는 질병-없는(disease-free) 생존 및 전체 생존으로의 효과가 크지 않았다(Scheithauer 등, 1995). 진전된 질병에서, 동일한 약제의 조합은 생존 이득을 증가시킬 수 있는데(Taylor, 1993), 이는 5-FU-치료된 환자의 생존 중앙값이 7.5개월인데 비해, 조합 그룹에서는 13.5개월로 나타난다(Petrioli 등, 1995). 그러나, 이 조합 화학요법은 상당한 질병을 수반하고, 구내염, 설사 및 골수억제를 포함하는 유해한 부작용의 원인이 되며(Mahood 등, 1991; Erichman 등, 1988; Pietnelli 등, 1989), 특히, 질병이 진전된 환자의 경우에 삶의 질이 문제가 된다.
다수의 고친화 CCK-B/가스트린 수용체 길항제는 다수의 실험 위장암에서 in vitro 및 in vivo 모두에서 치료적으로 평가되었다. 예를 들면, 프로글루마이드, 글루탐산 유도체(Seva 등, 190; Harrison 등, 1990 및 Watson 등, 1991a); 벤조트립트, 트립토판의 N-아실 유도체; L-365,260, 아스페르실린의 유도체(Bock 등, 1989); 및 CI-988, CCK의 C-말단 펜타펩티드 서열을 닮은 분자(Hughes 등, 1990)가 in vitro 및 in vivo 모두에서 위장의 종양 성장에 대한 외인성 가스트린의 영향을 효과적으로 중화하는 것으로 나타났다(Watson 등 및 Romani 등, 1994). 그러나, 이러한 길항제들은 정상 세포에서 G34 및 CCK와 같은 수용체의 모든 잠재적인 리간드의 작용을 차단하므로, 심각한 독성 부작용이 있고, 특이성이 부족하다. 최근에, YM022(Yuki 등, 1997) 및 YF476(Takinami 등, 1997)과 같이 고도로 효능이 있고, 선택적인 CCK-B/가스트린 수용체 길항제가 또한 거론되었다.
잠복기 연구에서, 프로글루마이드 및 벤조트립트가 광범위하게 평가되었다. 이들 화합물의 주요 문제는 G17을 치환하는데 비교적 고농도가 필요한데 효능은 결여된 것이다(Watson 등, 1992a; Watson 등, 1992b). 그럼에도 불구하고, 프로글루마이드 및 벤조트립트는 다수의 세포 계통의 기초 및 가스트린-자극된 세포 분열 증식을 억제한다(Seva 등, 1990; Watson 등, 1990a). 게다가, 프로글루마이드는 가스트린-민감성 마우스 결장 종양 MC26을 가진 이종 이식 마우스의 생존을 대조 동물에 대해 25일로부터 치료된 동물에 대해 39일로 증가시켰다.
가스트린/CCK-B 수용체에 대한 가스트린 길항제의 이들 종의 특이성이 낮기 때문에, 가스트린-수용체-의존 작용에 의해 성장 억제가 유도될 것으로 생각된다. 또한, 가스트린을 인지하고 결합하는 세포 수용체는 시험된 모든 억제제와 결합하지 않는다(Seva 등, 1994). 따라서, 자동분비 성장 캐스케이드에서 수용체에 결합한 가스트린이 완전히 억제되지 않으면, 가스트린 길항제가 종양 성장 촉진 기전을 차단하지 못할 수도 있다.
따라서, 신규한 치료적 접근은 그 자체의 양식으로서 및 화학요법과의 조합치료를 위해서 필요하다. 조합 치료는 치료 지수를 올리고, 및/또는 요구되는 화학요법의 투여량을 줄여서, 불리한 부작용을 제한할 수 있다.
선택적으로 면역학적으로 가스트린 호르몬의 생물학적 활성을 중화하는 치료 방법은 결장직장암과 관련된 과량의 가스트린 호르몬 생산으로 인해 치료 변화를 조절하거나 억제하는 효과적인 방법을 제공한다.
함께 특허된 미국 특허 제 5,023,077호; 제 5,468,494호; 제 5,607,676호; 제 5,609,870호 및 제 5,622,702호에는 항-가스트린 항체를 생성하여 환자의 G17 및 G34 수준을 조절하는데 유용한 면역원 및 면역원 조성물이 개시되었고, 또한 위 궤양 및 십이지장 궤양 및 가스트린-유도된 암의 치료를 위한 이러한 조성물의 용도가 개시되었다. 본 발명은 가스트린-의존성 결장직장암을 치료하기 위한 화학요법제와의 조합 치료에서, 특허 제 5,023,077호; 제 5,468,494호; 제 5,607,676호; 제 5,609,870호 및 제 5,662,702호에 개시된 항-G17 면역원 및 면역원 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 암 치료 방법은 기존의 결장직장암 치료 방법을 넘어서는 몇가지 잇점이 있다. 5-FU 및 류코보린과 같은 화학요법제과 조합한 항-G17 면역은, 화학요법을 단독으로 하는 경우보다 결장직장종양 성장을 조절 및 억제에 대해 치료적 효과를 증대시킨다.
본 발명은 5-플루오로우라실 유도체 및 류코보린을 적용하는 화학요법과 조합한, 성장 자극 펩티드 호르몬을 면역학적으로 중화하여 성장을 억제하는 종양 치료법에 관한 것이다.
도 1은 래트 항-G17(1-9)-DT 면역원 500㎍/㎖로 래트를 면역시킨 후의 혈청 항체 역가의 시간 스케일을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 면역원으로 면역시킨 래트에서 얻은 항-G17(1-9) 항체 역가에 미치는 5-FU/류코보린 30mg/kg 투여량의 치료 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 BDIX 래트의 평균 백혈구 수에 미치는 5-FU/류코보린 30mg/kg의 치료사이클 효과를 보여주는 스크래치 그래프이다.
도 4는 미처리, 항-G17(1-9)DT-치료 및 DT-치료된 래트의 종양 무게 중앙값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 5는 5-FU/류코보린 30mg/kg; 5-FU/류코보린 30mg/kg 및 DT 면역원; 5-FU/류코보린 30mg/kg 및 항-G17(1-9)DT; 5-FU/류코보린 25mg/kg 및 DT 면역원; 5-FU/류코보린 25mg/kg 및 항-G17(1-9)DT; 5-FU/류코보린 20mg/kg 및 DT 면역원; 5-FU/류코보린 20mg/kg 및 항-G17(1-9)DT; 5-FU/류코보린 12.5mg/kg 및 DT 면역원; 및 5-FU/류코보린 12.5mg/kg 및 항-G17(1-9)DT로 치료된 래트의 종양 무게 중앙값을 보여주는 막대 그래프이다.
하기 실험들은 결장직장암에 대한 본 발명의 조합 치료의 효과를 설명하기 위해 수행하였다.
발명의 요약
본 발명은 종양 세포 분열을 촉진시키는 펩티드 호르몬 및 인자의 면역학적 중화를 포함하여 이루어지는, 화학요법과 조합한 종양 치료를 위한 조합치료를 제공한다. 특히, 본 발명은 결장직장 선암과 같은 가스트린-의존성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료가 필요한 환자에게 하나 이상의 화학요법제의 투여와 함께 항-G17 면역을 포함하는 조합 치료를 포함하여 이루어진다. 놀랍게도, 가스트린-의존성 종양을 치료하기 위한 항-G17 면역은, 공지된 화학요법제의 사용으로 인한 골수억제 효과에도 불구하고, 항-G17 항체를 생성하는데 효과적이다.
항-G17 면역은 환자의 G17 수준을 조절하기 위해 호르몬 G17에 대한 항-G17 면역원을 사용하는 환자의 능동 또는 수동 면역을 포함하여 이루어진다. 환자에게 항-G17 항체를 유도한 결과, G17 호르몬은 in vivo에서 중화되고, 이의 생리학적 효과가 억제되어, G17-의존성 종양 세포 성장을 억제한다.
또한, 항-G17 면역을 표준 화학요법과 조합하여 사용하면, 조합시에 환자를 치료하기 위해 화학요법제를 소량 사용할 수 있으므로, 정상 조직에 대한 이의 독성 효과가 줄어들어, 결장직장암 치료의 효능이 증가한다. 또한, 환자의 삶의 질이 개선되고, 수명이 연장될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 이 방법은 5-플루오로우라실, 류코보린, 레바미솔(levamisole), 시스플라틴, 종양 탈저 인자(tumor necrosis factor) 및 프로글루마이드와 같은 하나 이상의 화학요법제의 투여와 조합하여 항-G17 면역원을 사용하여 가스트린-의존성 종양을 가진 포유류를 능동 면역하는 것을 포함하여 이루어진다. 항-G17 면역원은 환자의 필요에 따라 치료 개시에서 및 이어서 간격을 두고 환자에게 투여할 수 있다. 면역 후에 환자에 의해 생성된 항-G17 항체는 in vivo에서 이의 전구체 형태, 예를 들어, G17-Gly 뿐만 아니라 아미드화된-G17, 성숙한 형태의 G17에 결합하여 중화하고, G17와 이의 수용체의 결합을 억제하여, 가스트린-의존성 종양 세포 성장을 억제한다. 면역된 환자에 의해 생성된 항-G17 항체 역가는 표준 기술을 사용하여 소정 간격으로 측정할 수 있다. 또한, 화학요법제는 환자의 필요에 따라 표준 섭생법에 지시된 대로 투여하거나, 더 낮은 분량을 투여할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 또한 5-플루오로우라실, 류코보린, 레바미솔, 시스플라틴, 종양 탈저 인자 및 프로글루마이드와 같은 하나 이상의 화학요법제와 조합하여, 항-G17 항체를 사용하는 가스트린-의존성 종양을 가진 환자의 수동 면역을 포함하여 이루어지는 가스트린-의존성 종양의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체는 본 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있는 키메릭한, 인간화된, 또는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 이들 항체는 환자의 필요에 따라 치료 개시에서 및 초기 치료 후 이어서 간격을 두고 화학요법제와 함께 환자에게 투여할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 환자를 항-G17 면역원으로 면역하고, 5-FU 및 류코보린과 같은 화학요법제를 사용하여 환자를 치료하는 것을 포함하여 이루어지는 조합치료를 사용하여, 종양 특히, 가스트린-의존성 결장직장암과 관계된 종양의 치료 방법을 제공한다. 놀랍게도, 항-G17 면역원/5-FU-류코보린 조합치료는 결장직장암의 치료에 있어서, 기존의 치료보다 더욱 효과적인 것으로 드러났다. 조합 치료에 유용한 화학요법제는 면역된 환자 내의 항-G17 항체 생성을 크게 억제하지 않고, 소량의 화학요법제를 사용하여 종양 성장을 치료할 수 있다. 또한, 면역에 의해 생성된 항-G17 항체 역가는 모든 형태의 G17 호르몬을 중화하는데 효과적이다.
바람직한 실시형태에서, 본 방법은 환자에게 화학요법제의 투여와 조합하여 항-G17 면역원 조성물을 사용하여, 가스트린-의존성 결장직장암에 걸린 환자를 능동 면역하는 것을 포함하여 이루어진다. 이어서, 종양의 표준 방사성 평가 및 표준 기술을 사용하여, 면역-후 환자의 혈청 항-G17 항체 역가 분석에 의해 측정된 대로, 환자의 필요에 따라 항-G17 면역 추가 자극제(booster)를 투여할 수 있다. 또한, 종양 수술 전에 환자에게 항-G17 면역을 할 수도 있다.
항-G17 면역원은 면역원의 면역모조(immunomimic) 부분으로서 G17의 N-말단 아미노산의 천연 또는 합성 펩티드 단편을 포함하여 이루어진다. 이러한 펩티드 단편은 디프테리아 톡소이드(DT)와 같은 면역원 캐리어에 결합한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항-G17 면역원은 디프테리아 톡소이드에 결합한 아미노산 서열, pyroGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu를 갖는 1 내지 9 위치의 G17의 아미노-말단 아미노산을 포함하여 이루어진다. 다른 적당한 면역원 단백질 캐리어는 소 혈청 알부민, 키림페트 헤모사이아인(keylimpet hemocyain), 헤모사이아닌(hemocyanin) 및 파상풍 톡소이드를 포함한다.
또한, 본 발명의 면역원은 면역모조 펩티드를 단백질 캐리어로부터 떨어뜨리고, 림프구 수용체에 결합하기 위한 이의 능력을 강화시키기에 적당한 연장 또는 스페이서 펩티드 서열을 포함하여 이루어진다. 적당한 스페이서 펩티드 서열은 아미노산 서열 SSPPPPC(서열 목록에서 SEQ ID NO.:2)이다. 그러나, 다른 스페이서 펩티드가 적당할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 바람직한 스페이서 서열은 면역모조 펩티드의 카르복시-말단에 부착된다. 본 발명의 면역원은 표준 기술에 의해 생성되며, 본 명세서에 참고 문헌으로 통합된 개시물인 미국 특허 제 5,023,077호; 제 5,468,494호; 제 5,607,676호; 제 5,609,870호; 제 5,688,506호 및 제 5,662,702호에 개시된다. 면역 후에, 본 발명의 면역원은, 면역된 동물 내의 종양 성장에 미치는 성숙 및 전구체 형태의 G17의 효과를 억제하기 위한 고도의 친화력을 가진 중화 항체를 생성한다. 생성된 항-G17 항체는 성숙 및 전구체 G17과 결합하고 중화하여, G17이 종양 세포 상의 수용체에 결합하는 것을 억제하고, 결국 종양 세포 성장을 억제한다. 면역원은 카르복시-아미드화 및 글리신-연장된 G17을 모두 중화하는 항체를 증가시키고, G34 또는 CCK와 교차-반응성을 나타내지 않는다.
환자 내의 가스트린-의존성 종양을 치료하기 위해 능동 면역용 면역원이 투여되는 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들면, 산제, 액제, 현탁제, 좌제, 및 주입가능하고, 용해되지 않는 용액과 같은, 고체, 반-고체 및 액체 제형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 적용법에 따라 다르다. 조성물은 존재하는 면역원 및 약제학적으로 허용가능한 적절한 성분을 포함하여 이루어지며, 다른 약제, 캐리어, 보조 부형제 등을 포함하며, 이들은 표준 방법을 사용하여 혼합할 수 있다. 조성물이 단위 투여량 형태인 것이 바람직하다. 면역용으로 또는 약제로서, 한번에 또는 시간 간격을 두고 투여되는 활성 화합물의 양은 치료할 환자, 투여 방법 및 투여 형태, 및 치료자의 판단에 따라 다르다.
위장암 치료를 위해 면역원 조성물을 0.001 내지 2mg 범위의 유효 투여량으로 환자에게 투여한다. 면역원 조성물의 유효 투여량은 면역 후 1 내지 3개월 동안 성숙 및 전구체 G17에 결합하고 중화하기에 유효한 항체 역가 수준으로 환자에게서 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 결장직장암을 가진 환자에게 면역 및 5-FU/류코보린과 같은 화학요법제 치료한 후, 만약 있다면, 종양의 존재 및 크기를 검출하기 위한 초음파 및 자기 공명 영상법(MRI)과 같은 표준 임상 절차를 사용하여 종양 성장에 미친 치료 효과를 평가한다. 항-G17 항체 역가는 또한 환자에게서 취한 혈액 샘플로부터 측정할 수 있다.
면역 추가 자극제는 유효 항체 역가를 유지하는데 필요한만큼 주어져야한다. 가스트린-의존성 결장직장 선암 및 위암, 간암, 췌장암 및 폐의 소세포 암종과 같은 다른 가스트린-의존성 암의 본 방법에 따른 효과적인 치료는 종양 성장을 억제하고 종양의 크기를 감소시켜야 한다.
수동 면역을 위해서, 염수, 예를 들면, 인산염-완충 염수와 같은 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 사용하여 항-G17 항체를 환자에게 정맥 투여한다.
화학요법제는 표준 섭생법에서 권하는 투여량으로 투여하고, 치료 개시에서, 면역 전 또는 면역 후에 항-G17 면역원과 동시에 투여할 수 있다. 어떤 경우에는, 면역 전과 후에 화학요법제를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 이어서 화학요법 치효제는 또한 MRI 및 초음파 영상법으로 평가한 후 환자에게 필요한 때 투여할 수 있다.
실시예 1
하기 실험은 항-G17(1-9)-DT에 의해 나타난 잠재적 임상 이득을 측정하기 위하여 수행하였다. 본 연구의 목적은 다음과 같다:
(a) 래트 GI관의 조직학적 외관에 미치는 특정 래트 항-G17(1-9)-DT 면역의 장기간의 효과 측정.
(b) 5-FU/류코보린 조합이 항-G17(1-9)-DT에 의해 증가된 항체 역가에 미치는 영향 평가; 및
(c) 래트 결장 모델에 미치는 항-G17(1-9)-DT 및 5-FU/류코보린 조합의 치료 효과 측정.
세포 계통
DHDK12는 래트 결장 상피 종양 세포 계통이다(Martin, 1983). 세포 계통은 37℃의 습윤화 조건에서 태중의 송아지 혈청(FCS, Sigma, Poole, UK) 10% 및 CO25%를 함유하는 RPMI 1640 성장 배지(Gibco, Paisley, Scotland)에서 유지하였다.
면역원
항-G17(1-9)-DT 면역원은 카르복시-말단을 통하여 펩티드 스페이서 SSPPPPC(서열 목록에서 SEQ ID NO.:1)에 연결되고 차례로 DT에 결합된 G17의 아미노산 잔기 1-9로 구성된다. 이들 연구에서 사용된 면역원은 인간 G17 에피토프를 펩티드 스페이서를 통하여 디프테리아 톡사이드(DT)에 연결된, 래트 G17의 아미노 말단 9 아미노산으로 교체하여 래트 G17를 위해 특별히 만들었다. 래트 항-G17(1-9)-DT에 의한 항혈청은 항-래트 G17(1-9):DT로 표시하였다.
실험 동물
영국 노팅험 대학의 암 연구 단체(Cancer Studies Unit, University of Nottingham, UK)에서 무게가 340-420g인 6-10주된 수컷 및 암컷 BDIX 래트를 제공하였다. 래트를 두마리씩 짝지워 우리에 넣고, 25℃ 및 50% 습도에서 12시간 낮과 12시간 밤의 주기로 유지시켰다.
각 실험 전에, 동물들을 그룹으로 나누어 중량 분포를 동등하게 했다. 그룹 크기는 6-13 마리의 범위였다. 처음부터 끝까지 모든 동물 실험에는 영국 암연구 조정 위원회(UKCCCR) 가이드라인을 따랐다.
면역 방법
멸균 염수(0.9%), pH 7.3에 1mg/ml로 래트 항-G17(1-9)-DT를 용해하였다. 보조 노르-무라밀 디펩티드(Peninsula Labs., Belmont, CA, USA)를 결합 용액에 첨가하여 최종 결합 농도가 200 내지 500㎍/ml가 되었다. 수용액과 유성 비히클(montanide ISA 703; AMS Seppic Inc., Paris, France)을 1:2(v/v)의 비율로 에멀젼화하여 조성하였다. 혼합물을 세 방향 콕 마개를 통해 제 2 주사기에 부착된 유리 주사기에 넣은 후, 주사기를 40회 앞뒤로 힘을 주어 에멀젼을 형성하였다. 대조군 래트를 위해 DT 펩티드 및 무라밀 디펩티드를 함유하는 에멀젼을 유사하게 조성하였다. 에멀젼 200㎕ 부피(50㎍/래트)를 s.c.(실험 동물의 오른쪽 옆구리)에 주입하였다. 한 번만 주입하거나, 하기한 대로 21일 간격으로 반복 주입하여 동물을 면역시켰다.
세포독성 섭생법
12.5 및 25mg/kg의 5-플루오로우라실(5-FU, David Bull Labs., Warwick, UK) 및 12.5-25mg/kg의 류코보린(Lederle Labs., Gosport, Hants, UK)을 실험 기간동안 4주마다 반복된 주기로 1, 3 및 5일에 래트에 정맥(iv) 투여하였다(Asao, 1992). 항-G17(1-9)-DT 면역(200㎍/ml) 전 또는 후에 세포독성 혼합물을 래트에 투여하였다.
종양 성장 개시
DHDK12 세포를 2.5x107/ml의 세포 농도에서 멸균 인산염 완충 라인에 현탁하였다(PBS, Oxoid, Hants., UK). 1:1:5의 비율의 히프놈(Hypnorm; 0.315 ng/ml fenatanyl citrate and 10mg/ml fluanisone; Jannsen, Berrse, Belgium), 히프노벨(Hypnovel; 5ng/ml midazolam; Roche, Basel, Switzerland) 및 멸균 증류수 1ml를 내복막에 래트에 주입하여 마취하였다. 오른쪽 옆구리에서 피하(s.c.) 절개한 후, 세포 현탁액 200㎕ 부피를 복부 벽의 근육층에 주입하고, 수술 절개 부위를 상처 클립(wound clips)으로 봉하였다. 각 실험군은 6 내지 13 마리의 동물로 구성되었다.
래트 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트의 특정 항체 수준 측정
전체 실험의 다양한 시점에서의 말단-출혈 및 종국에 마지막 마취 하에서 심장 상처에 의해 분석용 혈액 샘플을 얻었다. 효소-결합된 면역소르벤트 시험(ELISA)으로 혈청 항-래트-G17 항체 수준을 측정하였다. 래트 G17-소 혈청 알부민(BSA) 결합을 0.1M 글리신 완충액(pH 9.5) 2㎕/ml에 용해하고, 웰 당 25㎕를 96-웰 이뮤눌론 U 플레이트(Dynatech Labs.,Sussex, UK)에 플레이트하였다. 미흡착된 결합을 친(flick out) 후, 웰들을 4℃에서 밤새 배양하고, 완충액(0.9% 염수, 0.5% Tween-20[Sigma], 0.02% NaN3[Sigma], pH 7.3)으로 세척하였다. 이 완충액은 모든 세척 단계 및 시약 희석에 사용하였다. 혈청을 1:100의 희석에서 시작하여 10-중복(fold) 연속 희석 처리하였다. 양성 대조물은 이전에 면역된 동물로부터의 래트 항-래트 G17(1-9)-DT 항혈청이었고, 음성 대조물은 보통 래트 혈청, 및 DT로만 면역된 래트로부터의 혈청이었다. 모든 대조 혈청은 실험 혈청과 동일하게 희석하여 사용하였다. 희석된 혈청은 100㎍/ml(가용성 억제제로서)에서 25㎕/웰 래트 G17-BSA의 존재 또는 부재하에 25㎕ 분취액으로 웰에 첨가하였다. 바셀린 대조 웰에는 25㎕ 검정 완충액만을 넣었다. 플레이트는 검정 완충액으로 세척하기 전에 실온에서 60분 동안 배양하였다. 염소 항-래트 면역글로불린(H+L)-비오틴(Zymed, San Francisco, CA, USA)을 1:500 희석, 50㎕/웰로 웰에 첨가하고, 어둠 속에 실온에서 60분 동안 배양하였다. 세척한 후, 아비딘-알칼리성 포스파타아제(Zymed), 1:100 희석액을 첨가하고(50㎕/웰), 플레이트를 실온에서 60분 동안 배양하였다. 더욱 세척한 후, ρ-니트로페닐포스페이트(pNPP) 기질(Sigma)을 웰에 50㎕/웰로 첨가하고, 5분이 지난 후, 405nm에서 흡광도를 읽었다. 미처리한 혈청과 래트 G17-BSA와 함께 배양한 혈청의 흡광도 차이는 특정 흡광도로서 계산하였다.
백혈구 수 측정
실험하는 동안의 말단 출혈 및 실험 종국의 심장 상처에 의해 래트로부터 헤파린화된 혈액을 수집하였다. 노팅험 대학 병원의 혈액학과에서 FACScan을 사용하여 백혈구 수를 분석하였다.
조직학
장기간 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트의 치사시에, 면역된 래트 및 나이-관계된 대조물들로부터 위, 결장 및 직장의 표본 영역을 절개하고, 포르말린-고정하였다. 그리고 나서, 이 부분들을 파라핀에 함침시키고, 마이크로톰을 사용하여 4㎛ 부분으로 절단하였다. 이들을 헤마톡실린 및 에오신으로 착색하고, 치료군에 대해 지식이 없는 조직 생리학자들이 평가하였다.
소낭선 세포 분열 증식 속도
동물 치사 한시간 전에, 빈크리스틴(2mg/kg, Sigma)을 내복막으로 주입하여, 결장 상피에서 중기 정지를 유도한 후, 결장 소낭선 세포 분열 증식(CCPR)을 평가하였다. 소낭선 당 중기의 세포의 수를 세었다. 세로로 절개해 각 래트로부터 결장 및 직장을 꺼내고, 카노이(Carnoy's) 용액으로 각각의 점막을 고정시켰다. 해부 현미경 하에서 소낭선을 부드럽게 세로로 납작하게 만들어, 중기 세포의 수를 계산하였다(확대 x 25).
통계 분석
IBM PC용 SPSS 통계 패키지를 사용하여 Mann Whitney 비-모수적 시험(non-parametric test)에 의해 in vivo 결과를 분석하였다.
장기간 항 G17(1-9)-DT 연구
상기한 바와 같이 다섯 마리의 수컷 래트를 래트 항-G17(1-9)-DT 면역원으로 면역시키고, 한 번 면역에 따른 이들의 항체 역가를 34주 동안 측정하였다. 이 시점에서, 래트에 래트 항-G17(1-9)-DT를 두번째 주입하여 추가자극하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 래트 항-G17(1-9)-DT 500㎍/ml으로 면역된 래트로부터 항체 역가의 면역 후 40주까지의 시간을 나타낸다. 각 점은 각각의 동물을 나타낸다. 항체 역가는 상기한 바와 같이 1:100 희석 혈청을 사용한 ELISA 검정으로 측정하였다. 면역은 화살표로 나타내었다. 제 1 면역 후에, 5마리의 래트 중 4마리가 래트 항-G17(1-9)-DT 면역원에 반응하였다. 단 한번의 주입 후, 7주에는 5마리 중 3마리 및 9주에는 5마리 중 4마리에서 항체를 검출할 수 있었다. 항체의 초기 증대에 이어, 15 내지 20주에 두번째 증대가 있었고, 그 후에는 항체 역가가 끊임없이 감소하고, 34주에는 영에 근접했다. 도 1은 또한 이 시점에서, 래트 항-G17(1-9)-DT로 두번째 면역한 후, 면역-후 1-2주 이내에 모든 래트에서 항-래트-G-17 항체 역가를 검출할 수 있었다는 것을 보여준다.
실시예 2
장기간 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트의 조직학적 분석
실시예 1에 기재한 바와 같이, 헤모톡실린 및 에오신 착색 후에, 위, 결장 및 직장으로부터 취한 표본을 조직학적으로 평가하였다. 이를 나이 및 성별-관계된 대조군 래트의 표본과 비교하였다. 평가된 GI 관의 모든 영역은 빌레(villae)/소낭선/점막 높이의 길이에 대하여 항-G17(1-9)-DT-처리된 래트 및 나이-관계된 대조군 래트 모두에서 동일하였다. 위(胃)에서, 엔테로크로마핀-유사(ECL) 세포는 상기 두 실험 동물군에서 수 및 외관이 유사했다. 그러나, 항-G17(1-9)-DT-처리된 래트의 위 점막에 G 세포가 과립화된 약간의 증거가 있었다.
실시예 3
장기간 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트로부터의 결장 상피의 소낭선 세포 분열 증식 속도(DDPR)
상기한 바와 같이 결장 상피 및 항-래트 G17-항체 역가의 CCPR을 분석하였다. 표 1은 5마리 중 4마리에서 얻은 항-래트 G17 항체 역가와 CCPR를 비교하여 평가한 결과를 나타낸다. 대조군 래트에 대한 CCPR 평균은 18.93(표준 편차 3.2)이고, 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트에 대해서는 23.7(표준 편차 7.9)였다. 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트와 나이-관계된 대조군 래트에서 CCPR의 통계적 차이는 없었다. 이 결과로부터 결장 상피 내의 소낭선 세포 분열 속도는 대조군 및 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트에서 동일하다는 것을 알 수 있다.
| 래트 | 항-래트 G17:DT 항체에 대한 특정 흡광도(1:1000 희석) | 소낭선 세포 분열 증식 속도(빈크리스틴 치료 2시간 후 평균 중기/소낭선) |
| 대조 1대조 2대조 3대조 4면역 래트 1면역 래트 2면역 래트 3면역 래트 4 | 00000.2800.3400.4150.420 | 21.919.414.420.029.730.313.621.1 |
실시예 4
전- 및 후-세포독성 처리가 래트 항-G17(1-9)-DT에 의한 항체 수준에 미치는 영향
실시예 1에 기재한 바와 같이, 항-G17(1-9)-DT 면역 전 또는 후에 30mg/kg의 5-FU/류코보린을 1:1 비율로 정맥으로 쥐에 주입하였다. 각 그룹은 그룹 당 수컷 6마리와 암컷 6마리로 이루어졌고, 1:100 희석 혈청을 사용하여 ELISA 기술로 항체 역가 평균을 측정하였다. 실시예 1에 기재한 바와 같이 혈액 샘플로부터 각 래트에서 항체 수준을 측정하였다.
도 2는 30mg/kg의 5-FU/류코보린 주기를 사용한 전- 및 후-세포독성 치료가 항-G17(1-9)-DT 면역(500㎍/ml)에 의한 항체 역가에 미치는 영향을 보여준다. 도면에서, 데이타는 다음과 같이 표시된다: ━□━ 세포독성 없음, 7 면역; ━◆━ 2 면역 후 4 세포독성 처리; ━ｏ━ 1 면역 후 4 세포독성 처리; ━△━ 1 세포독성 후 4 면역(면역 중 2 세포독성 처리); ━田━ 2 세포독성 처리 후 4 면역; ━★━ 3 세포독성 처리 후 3 면역; 및 ━●━ 4 세포독성 처리 후 2 면역.
도 2는 그룹 당 암컷 6마리 및 수컷 6마리의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 평균의 약 10% 이었다. 미처리된 항-G17(1-9)-DT-면역된 래트와 비교해 볼 때, 달성된 항체 수준이나 이들 수준을 달성하기 위해 걸린 시간에 대해 세포독성 5-FU/류코보린 조합을 사용한 전-처리가 항체 역가에 미친 효과는 거의 눈에 띄지 않았다. 평가된 처리 주기의 최대수는 4 세포독성 처리 주기 후 2 면역이었다.
도 3은 BDIX 래트에서 평균 백혈구(WBC) 수에 미치는 치료 효과를 보여준다.
4 세포독성 처리 후 2 면역된 BDIX 래트에서 30mg/kg 5-FU/류코보린을 사용한 세포독성 처리가 평균 백혈구(WBC) 수에 미치는 영향은 도 3에 도시하였다. 도면에서 보는 바와 같이, 세포독성 처리(p〈0.005, Student't-test) 후, 평가된 래트가 나타낸 WBC 수는 눈에 띄게 감소하였다. 약간의 골수억제를 나타내는 세포독성 처리 주기 횟수에 의해 백혈구 수가 감소하였다. 그러나, 도 2에 나타난 바와 같이, 래트에 의해 생성된 항-G17(1-9)-DT에 대한 항체 반응에는 아무런 영향이 없었다.
실시예 5
5-FU/류코보린 및 항-G17(1-9)-DT가 DHDK12 종양의 in vivo 성장에 미치는 조합 치료 효과
5-FU/류코보린(12.5-30mg/kg) 및 래트 항-G17(1-9)-DT(200㎍/㎖)이 BDIX 래트 복부벽 근육층에 있는 래트 결장 종양 DHDK12 세포선의 성장에 미치는 조합 치료 효과를, 상기 실시예에 기재된 동물 대조군의 종양과 비교 시험하였다. 치료 완료 후, 래트를 치사시키고, 이들의 종양을 절제하여 표준 절차대로 칭량하였다. 성별 구별없이 그룹당 10-12 래트로 그룹을 지었다. 종양 무게 중앙값은 상기 칼럼에서 4분위범위로 나타낸다. 실시예 1에서와 같이 Mann Whitley U 비-모수적 시험(non-parametric test)을 통하여 통계적으로 평가하였다.
도 4 및 5는, DHDK12 종양 세포가 복부벽 근육층에 이식된 BDIX 래트의 최종 종양 무게 중앙값에 미치는 항-G17(1-9)-DT 면역 효과를 나타낸다. 이러한 경로로 이식하면 순환 적용 치료법이 가능한 혈관형성이 잘 된 종양(well-vascularized tumor)이 생긴다(Watson, 1996). 종래에, 래트 항-G17(1-9)-DT는 500㎍/㎖의 투여량으로 투여되는 경우 최종 DHDK12 종양 무게를 56.5% 억제하는 것으로 나타났다(Watson, 1996). 본 실험에서는, 5-FU/류코보린 조합 치료 효과를 알아보기 위하여 항-G17(1-9)-DT 투여량을 200㎍/㎖까지 줄였는데, 도 4에서와 같이 종양 성장이 25.7%로 크게 억제되었다. 도 4는 미처리 래트 대조군, 항-G17(1-9)-DT 면역 래트 및 DT-면역 래트에서 절제된 종양으로부터의 데이터이다. 50일 후 미처리 래트는 종양 무게 중앙값 4.43g였다. DT 면역의 경우, 종양 무게 중앙값 4.7g 로 미처리 래트의 중양 무게와 별로 다르지 않았으나, 항-G17(1-9)-DT-면역 래트(3.49g, p=0.034, Mann Whitney)의 종양 무게 중앙값보다 훨씬 컸다.
도 5는, 30mg/kg로 주어진 5-FU/류코보린이 중앙값 1.01g(미처리 래트 대조군과 비교시 p=0.0106)으로 종양 무게를 크게 감소시켰음을 나타낸다. 래트를 DT-면역과 동일한 5-FU/류코보린 세포독성 투여량으로 처리하는 경우, 종양 중량 중앙값은 별로 다르지 않았다(0.945g).
30mg/kg의 5-FU/류코보린과 항-G17(1-9)-DT 면역을 조합하면, 종양 무게 중앙값이 0.68g이 되었고, 5-FU/류코보린/DT-처리 그룹(p=0.27) 과 크게 다르지 않았다. 25mg/kg의 5-FU/류코보린 및 DT 면역을 조합하면, 항-G17(1-9)-DT-면역과 함께 5-FU/류코보린 조합 치료 그룹의 크지 않은 평균 종양 무게 0.68g과 비교하여, 종양 무게 중앙값 0.96g였다(p=0.409). 5-FU/류코보린 투여량이 20mg/kg으로 감소하는 경우, 5-FU/류코보린/DT 면역원을 조합하면 종양 무게 중앙값이 1.23g이 되었다. 20mg/kg의 5-FU/류코보린이 항-G17(1-9)-DT 면역과 조합된 경우 종양 무게 중앙값은 0.71g으로 크게 감소하였다(p=0.027, Mann Whitney).
마지막으로, 도 5는 12.5mg/kg의 5-FU/류코보린 투여량을 항-G17(1-9)-DT 면역과 결합시키면(p=0.015, Mann Whitney) 종양 무게 중앙값이 1.34g에서 0.41g으로 감소한다는 것을 나타낸다. 5-FU/류코보린-항-G17(1-9)-DT 조합을 비교하면, 12.5, 20 또는 30mg/kg의 5-FU/류코보린과 조합시킨 항-G17(1-9)-DT 간에는 통계적으로 큰 차이가 없었다.
암이 진전된 상태 및 특히 보조 치료 처리 세팅시에 모두 5-FU/류코보린을 이용한 조합 화학 요법의 효과가 제한되므로(Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Tayor, 1993; Petrioli, 1995), 화학 요법이 효과적이지 못한 경우에 2차적 치료 방법으로서 또는 치료 인덱스를 개선하기 위하여(또한 화학치료 투여량을 가능한 한 감소시켜 독성을 제한하기 위하여) 5-FU/류코보린과 함께 새로운 치료법이 필요하다. 따라서, 새로운 치료법은 이런 용도에 사용할 수 있어야 한다. 화학 요법과 함께 면역 요법은 종래에 문제가 있는 것으로 생각되었는데, 5-FU/류코보린(Mahood, 1991)에서와 같이 화학요법제와 관련있는 골수억제 때문이었다. 그러나, 본 연구를 통하여, Asao 등에 따라 최대 허용가능 투여량으로 투여된 30mg/kg의 5-FU/류코보린 조합제로 유도된 래트의 골수 억제는, 항-G17(1-9)-DT 면역원으로 면역 후 항-래트 G17:DT 항체 역가를 얻기 위한 시간 및 이의 수준에 영향을 주지 않았다.
5-FU/류코보린을 항-G17(1-9)-DT와 조합하여 사용한 치료 연구에서, 20mg/kg 및 12.5mg/kg 투여용량으로 효능이 있었다. 20 mg/kg의 투여량이 항-G17(1-9)-DT과 결합시킨 경우에 최대 허용가능한 투여량만큼 효과적이었으며, 12.5mg/kg의 투여량이 치료 효과가 큰 경향을 보였다. 이러한 경향의 이유는 밝혀지지 않았으나, 이 세포독성 투여량이 투여량 수준이 높을 때보다 면역계에 더 적게 영향을 주기 때문일 수 있으며, 이는 종양에 대한 일반적인 염증 반응에 도움이 될 수 있다. 투여량을 1mg/kg으로 낮추면 종양 성장 억제 효과가 전혀 나타나지 않는 것으로 밝혀졌으므로, 연속적인 주기로 5-FU/류코보린을 적용하면 종양 성장에 나타나는 효과는 '전부 또는 전혀(all or nothing)'일 것이다. 치료 효과는, 독성 주기 수를 감소시킴으로써 좀더 점진적으로 알아낼 수 있다(Watson, 면담). 따라서, 본 발명에 따라 조합하면, 통상보다 낮은 5-FU/류코보린 투여량을 투여할 수 있으며, 이에 따라 본 조합물을 사용하여 약물의 부작용을 감소시키는 동시에 종양 세포를 효과적으로 죽일 수 있는데, 면역계가 최소한의 영향만을 받기 때문이다. 따라서, 항-G17(1-9)-DT 면역의 성장 억제 효과가 촉진된다. 이러한 본 조합 치료의 특징은, 화학요법제만의 골수억제 효과 견지에서 볼 때 놀랍고도 예상 밖이다.
또한, 항-G17(1-9)-DT 면역은 숙주에 대한 유해 효과가 없어, 단일 면역 래트에서 항체 수준을 측정가능한 기간으로 알 수 있는 바와 같이, 장기 치료가 가능할 것으로 보인다. 항-가스트린 항체 유도의 견지에서 1차 면역은 80% 유효하고, 2차 면역 후에는 항체 수준이 즉시 상승하면서 100% 유효하였다. 단일 항-G17(1-9)-DT 주사로 화학 요법의 상승작용을 얻을 수 있으나, 대부분의 숙주에서 부작용 무, 항-G17(1-9)-DT 면역 특성 및 추가자극(boosts) 후의 숙주 반응 속도를 고려하면 다중-투여 섭생이 바람직하다. 항-래트-G17 항체가 순환계에 잔류하는 기간에도 불구하고, 단순한 조직학적 평가를 통하여 측정시, GI 관에 유해작용을 오래 미치지 않는 것으로 보인다. 또한, 결장의 점막 세포의 소낭선 세포 증식 지수에 따르면, 이들의 성장에 별 효과가 없는 것으로 나타났다.
실시예 6
5-FU/류코보린 및 항-G17(1-9)-DT의 조합 치료를 통한 인간 결장 암 환자의 치료
종래에는 항-G17(1-9)-DT 면역 단독이 가스트린-의존성 암의 치료에 유용하고 안전한 치료법으로 생각되었다. 본 항-G17 면역원과 5-FU/류코보린의 조합 방법은 암 치료, 특히 결장암 치료 효과를 높이며, 이러한 조합에 필요한 화학요법제의 투여량이 감소되어, 현재 사용되는 화학요법제의 유해한 세포독성 부작용이 감소될 것이다. 본 면역원과 화학요법제와의 조합 방법은, 화학 요법 단독으로 치료되지 않는 환자의 2차적 치료에도 유용할 수 있다.
인간 결장직장 종양 또는 결장암 환자를 화학요법 및 면역요법을 조합하여 치료한다.
특히, 가스트린 반응성 직장결장 종양 또는 암 환자를 5-FU/류코보린 및 항-G17 면역원 조성물 또는 항-G17 항체를 동시 투여하여 치료할 수 있다.
특히, 바람직한 면역요법은 아미노말단 G17(1-9)펩티드: DT 결합을 면역 반응을 더욱 자극하는 보조체를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 캐리어 중에 포함하여 이루어지는 면역원 조성물을 제공한다.
임상적 고려사항에 따라 화학요법 과정 전, 중 또는 후에 바람직한 면역치료 섭생을 시작할 수 있다. 예를 들어, 큰 종양을 가진 환자는 여러 주기의 화학요법을 시작하여 종양 크기를 감소시킨 후 면역 요법을 시작하는 것이 유리하다.
이와 달리, 종양이 작거나 외과적인 치료 후의 환자는 면역 요법을 화학 요법 전 또는 중에 시작할 수 있다.
능동 면역 투여량은 300㎍ 내지 1200㎍의 항-G17 면역원 범위가 가능하며, 이는 환자의 면역 상태(또는 면역 반응 능력)에 달려있다. 주사 간격은 1, 7 및 14일 또는 1, 14 및 21일, 또는 1, 14, 28 및 56일이 가능하다. 이들은 모두 유사한 항체 역가가 될 수 있다. 면역 가속 스케쥴로 더욱 빠르게 면역 반응시킬 수 있다.
바람직한 항-가스트린 치료 요법은, 사용되는 프로토콜에 상관 없이 초기 면역 기간 후 6개월마다 추가 자극제(booster)를 투여하는 것이다.
다른 바람직한 G17, Gly G17 및 G17 NH2의 효과적인 중화 방법은, 수동 면역법에 바람직하기는 정제된 형태의 항-G17 항체를 제공한다. 더욱 구체적으로, 가스트린 활성 조절을 위하여 면역 요법 주기 전, 중 및/또는 후에 10-100㎍의 항-G17(1-9) 항체를 접종한다. 수동 면역법은 매일, 매주 또는 2주 간격으로 적용할 수 있다. 치료 효과에 따라 다른 프로토콜을 따를 수 있다.
다른 조합 치료법에서는, 상기와 같이, 화학 요법 제1 주기 전 및/또는 중에 최초 수동 면역법을 제공한 후 능동 면역법을 제공한다.
많은 화학요법 섭생이 사용된다. 이러한 알려진 섭생법은 본 명세서에 기재하지 않더라도 본 발명에 따른 조합 치료법에서 제외되지 않는다. 이중 바람직한 한 화학요법 섭생법은, 5-FU i.v. 농축괴 425mg/m2와 류코보린(폴산, FA, 20mg/m2) i.v. 주입을 4주 이하로 주기당 1-5일간 제공하는 것이다.
다른 바람직한 섭생법은 mg/m2FA를 2시간 주기로 제공한 후, 5-FU i.v. 농축괴 400mg/m2+ 5-FU 600mg/m2를 2주 주기로 1 또는 2일 22시간에 걸쳐 제공한다.
다른 바람직한 섭생법은 5-FU 250-300mg/m2일 연속 i.v. 4-6주간 연속주입 후, 2주 쉰다.
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Claims (11)
- 종양 성장 인자를 면역학적으로 중화하는 단계, 하나 이상의 화학요법제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 환자의 종양 치료 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 종양이 가스트린-의존성 종양인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 종양-성장 인자가 가스트린인 것을 특징으로 하는 방법.
- 하나 이상의 화학요법제와 조합하여 항가스트린 17 면역원을 치료가 필요한 포유류에 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 조합 치료법을 사용하는 가스트린-의존성 종양 치료 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항가스트린-G17 면역원이 디프테리아 톡소이드와 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항가스트린-G17 면역원이 스페이서 펩티드를 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항가스트린-G17 면역원이 아미노산 서열 pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu(서열 목록에서 SEQ ID NO.: 1)을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 화학요법제가 5-플루오로우라실 및 류코보린임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 화학요법의 5-플루오로우라실 및 류코보린을 투여하기 전에 항가스트린-G17 면역원을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항 또는 제 9항에 있어서, 상기 화학요법제가 치료하는 동안 수회의 사이클로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 하나 이상의 추가자극 면역을 실시하는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 방법.
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