KR101847224B1 - 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물 - Google Patents

인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101847224B1
KR101847224B1 KR1020127024509A KR20127024509A KR101847224B1 KR 101847224 B1 KR101847224 B1 KR 101847224B1 KR 1020127024509 A KR1020127024509 A KR 1020127024509A KR 20127024509 A KR20127024509 A KR 20127024509A KR 101847224 B1 KR101847224 B1 KR 101847224B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pro
glu
ser
seq
cys
Prior art date
Application number
KR1020127024509A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130075722A (ko
Inventor
리차드 에씨온
쉥마이 키
빈 왕
Original Assignee
온콜로직스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 온콜로직스 리미티드 filed Critical 온콜로직스 리미티드
Publication of KR20130075722A publication Critical patent/KR20130075722A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101847224B1 publication Critical patent/KR101847224B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

인간 확장-프로가스트린 종에 대한 면역원은 (B) 면역원성 담체에 커플링된, ii) 7개 아미노산 스페이서에 결합된 (i) 프로가스트린 또는 프로가스트린의 N-말단 및/또는 C-말단 프로세싱 종의 아미노산 서열로 구성된 (A) 모방체 펩티드를 포함한다. 예시적인 모방체 펩티드/스페이서 조합은 21개 아미노산 펩티드(서열번호 1) 및 다른, 연관 폴리펩티드(서열번호 2-5)이다. 이런 면역원을 함유하는 약제학적 조성물은 면역원의 초기 코스의 투여 후 즉시 효과적인 항체 수준을 유도하는 것을 포함하는, 개선된 면역학적 특성을 보인다. 그렇게 유도된 항체의 수준은 수개월 동안 상승된 상태로 유지되고 면역원의 단일 주사에 의한 후속적인 증폭시 더욱 높은 수준으로 용이하게 상승시킬 수 있다.

Description

인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물{Immunogenic compositions against human progastrin peptides}
관련 특허 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된, 2010년 3월 3일자로 출원된 중국 특허 출원 제2010/10116229호를 우선권으로 주장한다.
위장 (GI) 암은 전세계적으로 인간에서 가장 흔한 암으로 대부분의 나라에서 사망의 주요 원인이다. 다수의 성장 인자가 GI 악성종양의 증식을 야기하는 것으로 알려져 있는데, 그들 중 특히, 공통적으로는, 프리프로가스트린의 프로세싱(processing)으로부터 생성된 펩티드 호르몬 패밀리가 있다. 정상 조직에서 프리프로가스트린의 성숙은 중간체 프로가스트린의 다단계 프로세싱을 수반하여, 순환에서 발견되는 가스트린의 우세한 아미드화 형태를 유도하며; 이는 각각 "큰" 가스트린 및 "작은" 가스트린으로 알려진 가스트린-34(G34) 및 가스트린-17(G17)이다. 이들 호르몬은, 특히 음식 섭취 후, 점막 세포 성장 및 (식사-후) 위산의 분비를 조절한다. 프로가스트린 및 가스트린, 구체적으로 G17 및 G17의 글리신-확장된 형태(gly-G17)는, 시험관내 및 생체내 둘 다에서, GI 악성종양에 영양을 공급하는 역할을 하는 것으로 보고되었으며, 수많은 관찰들은 치료 목적을 위한 이들 가스트린의 표적화된 억제에 대한 경우를 뒷받침한다.
특이적 암-촉진 성장 인자 및 호르몬에 대한 면역화는 특정 암, 특히 유방암, 폐암, 및 특정 유형의 GI 암을 치료 및 예방하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 추가로, 위-식도 및 위-십이지장에 궤양이 생기는 질병을 치료 및 예방하는 면역학적 접근법은 이들 만성 상태를 치료하는데 또한 효과적일 수 있다.
몇몇 치료적 접근법이 성공적으로 적용되었는데, 특히 표적화된 인간 또는 인간화된 모노클론 항체(huMAb)를 사용하는 것이다. 그러나, 상업적 huMAb의 제조 및 전달을 설정하는 비용 및 어려움을 감안할 때, 좀더 저렴한 대안적인 전략이 특히 개발 도상국에서 요구되고 있다.
GI 암 및 질환의 경우, 이들 면역학적 접근은 질환 촉진 위장 펩티드 호르몬의 생물학적 활성을 중화하는 특이적 항체의 생성을 수반한다. 필요한 항체는 특정 성장 인자 또는 호르몬, 또는 호르몬 전구체에 대하여 특이적이어야만 한다. 하나 이상의 인자 또는 호르몬이 특정 질환을 치료하도록 선택적으로 표적화될 수 있다.
예를 들어, 인간 위장 호르몬 가스트린 17("huG17")은 산을 자극하고 따라서 위 및 십이지장 궤양을 야기하는 그의 능력 때문에, 위-식도 역류 질환을 포함하는 위장 질환 과정에 관련된다. 부가적으로, huG17은 일부 GI 암의 성장을 자극하는 것으로 나타났다.
특이적 항-huG17 항체는 huG17의 작용을 중화할 수 있으며, 따라서 huG17이 관련되는 질환을 치료하는 임상 시험에서 사용되어 왔다. 항-huG17 항체는 예를 들어, 수동 면역에 의해서 환자에게 투여될 수 있거나, 능동 면역에 의해서 환자에서 유도될 수 있다.
유사하게, 아미드화된 가스트린이 순환에서 가스트린의 유일한 생물학적 활성 형태라고 여겨졌음에도 불구하고, 인간 GI 암 환자 및 유도된 인간 암 세포-주를 이용한 연구를 기초로 프리프로가스트린의 프로가스트린 형태가 증식 잠재성을 갖는다는 상당한 증거가 현재 있다. 사실상, GI 암 세포는 일반적으로 프리프로가스트린 및 프로가스트린 같은 가스트린 전구체를 그들의 정상 아미드화된 형태로 프로세싱하는데 효과적이지 않다; 따라서, 암 환자에서 혈청 수준은 정상 아미드화된 형태보다 이들 가스트린의 전구체 형태의 수준이 더욱 높음을 보인다. 아미드화된 가스트린 또는 글리신 확장된 가스트린이 아닌 프로가스트린의 혈장 수준이 대장 용종을 가진 환자 또는 대조군과 비교할 때 대장암을 가진 환자에서 현저히 증가된다는 것이 보고되었다(Siddheshwar et al ., Gut 48: 47-52, 2001). 또한 프로가스트린, 아미드화된 가스트린, 총 가스트린, 및 글리신-확장된 가스트린은 대장암(CRC) 환자 종양의 각각 100%, 69%, 56%, 및 44%에서 검출되었으며(Ciccotosto et al ., Gastroenterology 109: 1142-53, 1995), 이는 암이 실제로 완전히 가스트린을 프로세싱하는데 결함이 있음을 시사한다.
하기에 자세히 설명한 바와 같이, 종래의 기술의 단점을 해결하기 위해, 본 발명은 그의 측면 중의 하나에 따라, (ii) 7개 아미노산 스페이서에 결합된, (i) 프로가스트린 또는 N-말단 및/또는 C-말단이 프로세싱 프로가스트린의 종의 아미노산 서열로 구성된 (A) 모방체 펩티드 및 (B) 상기 모방체 펩티드에 커플링된 면역원성 담체를 포함하는 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 전술한 폴리펩티드 면역원은 Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 모방체 펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에 따르면, 모방체 펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다:
pGlu-Gly-Pro-Trp-β-이소Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 2);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 3);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 4);
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 5); 및
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 6).
본 발명에 따르면, 면역원성 담체(immunogenic carrier)는 특히, 파상풍 톡소이드(toxoid), 디프테리아 톡소이드, 퍼투신(pertussin) 톡소이드, 및 투베르쿨린 순수 단백질 유도체로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 기술된 바와 같이, 유효량의 폴리펩티드 면역원 및 면역원에 대한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 면역원이 존재하는 수성 상, 및 오일 상의 에멀전을 포함한다. 오일 상은 스쿠알렌, 스쿠알란, 소르비탄 모노올리에이트, 폴리소르베이트 40, 및/또는 폴리소르베이트 80과 같은 적어도 하나의 생분해성 오일을 포함한다. 오일 상은 또한 별도의 유화제를 포함할 수 있다. 그 외에, 오일 상 또는 수성 상 중 하나는 하나 이상의 보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기술한 바와 같은, 모방체 펩티드와 연결하기에 특히 적합한 7개 아미노산 스페이서 펩티드를 제공한다. 예시적인 이러한 스페이서 펩티드의 예는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 것에 있다: Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 7); Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys(서열번호 8); Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 9); 및 Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys(서열번호 10).
성장 인자 또는 위장 펩티드 호르몬에 대한 능동 면역은 표적화된 인자 또는 호르몬에 결합하는 항체를 유도하는 화학 구조를 함유하는 면역원을 환자에게 투여함으로써 달성된다. 이런 화학 구조는 표적화된 인자 또는 호르몬의 면역학적 펩티드 모사체로서 작제되며, 그들은 표적 또는 그 표적의 에피토프와 면역학적으로 교차-반응하는 임의의 분자로 구성될 수 있다. 이들 면역원은 항체를 유도하기 위한 본질적인 능력을 가질 수 있는 면역학적 펩티드 모사체("면역모사체(immunomimic)")이며, 예를 들어 그들은 면역원성 일 수 있다. 그러나 면역모사체는 종종 내재적으로 면역원성이 아니고 따라서 강한 면역원성 특성을 가진 담체("면역원성 담체")와 결합 되어야만 하며, 이에 따라 복합 면역원성이 된다.
본 발명에 따르면, 임의의 화학 구조는 예를 들어, [Watson et al ., Expert Opin. Biol . 1: 309 - 17 (2001), 및 Watson et al ., Cancer Res . 56: 880-85(1996)]에 의해 예시된 바와 같은 huG17의 에피토프와 면역학적으로 교차-반응하는 면역모사체로서 작용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 펩티드 모방체는 인간 작은 가스트린 뿐만 아니라 글리신-확장된 가스트린에 결합할 교차-반응성 항체를 자극하도록 고안되는, huG17의 아미노 말단 에피토프를 그 안에 함유하는 huG17의 부분이다. 면역원의 스페이서 요소는 결합 점(point)으로서 작용하여 이를 통해 면역모사체가(펩티드 모방체 + 스페이서) 담체에 부착된다. 스페이서는 또한 면역원의 에피토프 부분에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다.
스페이서를 통해 디프테리아 톡소이드에 커플링된 huG17의 N-말단 노나펩티드 부분을 사용하는 면역화는 랫트에서의 실험적인 궤양과 면역손상 마우스에서의 GI 인간 암 이종이식편 둘 모두를 억제하는 것으로 보고되었다. GI 암을 가진 환자에서 "G17DT"로 공지된, 이 면역원을 사용하는 다수의 임상 시험은, 유의미한 결과를 나타냈으나(Watson 등(2001)을 참고), 최근 미국에서 이 면역원을 사용한 3상 임상 시험은 후기 췌장암의 치료에서 통계학적으로 유의미한 결과를 얻지 못했다.
초기 임상 시험에서 일부 성공을 보였다 할지라도, 특히 GI 악성 질환에서의, G17DT 접근은, 가스트린 유전자 발현의 눈에 띄는 이질성이 고려되지 않았다. 정상적인 위 세포 및 조직에서, 가장 풍부하게 분비된/순환되는 가스트린 종은 G17 및 G34이다. 그러나 수많은 과학적 보고는 이들 후자의 종들이 사실상 50% 미만을 구성하고, 특정한 경우에, 순환에서 가스트린 형태의 10% - 20% 만큼 적게 구성할 수 있음을 보여준다.
대다수의 종(species)은 예를 들어 [Rehfeld et al ., Regulatory Peptides 120: 177-83 (2004)]에 기술된, "프로가스트린"으로 공지된 프로세싱 중간체이다. 프로가스트린은 전통적인 가스트린 수용체와 독립적인 실질적인 성장 촉진 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 언급된, G17DT 면역원에 의해 만들어진 항체는 G17 및 C-말단 확장된 형태만을 포획할 것이며, GI 암 환자의 순환계에서 풍부한, 가스트린의 비프로세싱된/부분적으로 프로세싱된 형태(프로가스트린)의 주요한 순환 종은 점유하지 않을 것이다.
특히 종래 기술에서는, 본 발명의 신규한 면역원 조성물이 암 환자의 순환에서 발견되는 가스트린 및 프로가스트린 형태의 표적화에 의해 해결하는 이것이 단점이다. 이와 관련하여, huG17의 특정한 펩티드 모방체는 적합한 스페이서 펩티드와 커플링될 경우, 종래의 면역원과 비교할 때, 예상치 못한 개선된 면역 반응을 초래하는 면역원을 생성함을 밝혀냈다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 심지어 종종 선천적인 천연 아미노산을 함유하는 펩티드보다 훨씬 큰 수준으로 교차-반응 항체를 이끌어내는 것이 가능하다고 할지라도, 변형 아미노산이 인접한 펩티드의 "외래의" 고유한 특성을 강화시키는데 사용될 수 있음을 또한 밝혀냈다. 더욱 구체적으로, 침입하는 미생물 및 "외래" 항원의 대식세포 및 단핵구에 의한 프로세싱은 할로겐화 반응 및 산화 및 니트로실화 반응을 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서 결과적인 화학적 변형은 단백질 및 펩티드의 항원성 및 후속적인 면역원성을 증가시키는 것으로 이해되었다. 따라서, 본 발명은 펩티드 면역원의 면역원성을 증가시키기 위하여 파라-클로로 또는 파라-니트로-페닐알라닌 잔기와 같은 하나 이상의 할로겐화 또는 니트로실화된 아미노산 잔기를 포함시키는 것을 포함한다. 이는 예를 들어, 파라-NO2-페닐알라닌(nPhe)이 하기 상세하게 기술된 특정의 본 발명 면역원(서열 번호 1 및 6)에서 나타나는 이유이다.
따라서, 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 개선된 면역원은 각각, 프로가스트린 및 프로가스트린의 N-말단 및/또는 C-말단 프로세싱 종에 대한 폴리클로날 항체를 생성한다. 이러한 면역원의 예는 (ii) 면역원성 담체에 커플링된 (i) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(서열 번호 1)의 아미노산 잔기의 펩티드를 포함하는 것이다. (본 기술내용에서 열거된 서열목록에 적용된 규정에 대해서는 하기를 참조한다.) 따라서, 이 실시양태는 프로가스트린 성분(프리프로가스트린의 잔기 88-101)에 더해진 7개 아미노산 스페이서를 포함하여 21개 아미노산 (G21) 펩티드인 면역모사체를 구성한다.
본 문맥에서, 면역원성 담체는 임의의 적합한, 고 분자량 담체, 전형적으로 담체에 공유적으로 결합된 헵텐 또는 펩티드 서열에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 충분한 분자 복합성의 단백질 또는 큰 (즉, 일반적으로 6000 kD 보다 더 큰) 분자일 수 있다. 적합한 면역원성 담체의 종류는 디프테리아 톡소이드(DT), 파상풍 톡소이드(TT), 퍼투신 톡소이드, 및 투베르쿨린 순수 단백질 유도체(PPD)를 예로 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 중, 파상풍 톡소이드가 바람직한 면역원성 담체이다. 이런 부류에는 [Fifis et al ., J. Immunol . 173: 3148-54(2004)]에 의해 기술된 나노-비드와 같은 미립자 담체, 및 상업적으로 이용가능한 덴드리머, 예컨대, PAMAM 덴드리머 및 MAP 덴드리머가 또한 포함된다. [Aguilar et al ., J. Pept . Sci . 15: 78-88 (2009)]를 참조하라.
본 문맥에서, 구절 "약학적으로 허용가능한 비히클"은 그의 면역원성 효과의 감소 없이 면역원을 운반할, 의학적으로 안전하며, 비-독성인 물질을 나타낸다. 적합한 비히클은 하기 추가로 기술된 바와 같이, 액체 에멀전일 수 있거나, 또는 적합한 미립자 물질, 예컨대 약학적으로 안전한 동결건조 분말 또는 약학적으로 허용가능한 실리카겔 또는 합성적인, 비-감염성 바이러스 유사 입자(VLP)일 수 있다. [Fields Virology, Vol. 1, D.M. Knipe & P. Howley (eds.), Lippincott Williams & Wilkins (2007)]를 참고하라.
본 발명에 있어서, 약학적으로 허용가능한 비히클의 바람직한 형태는 폴리펩티드 면역원을 함유하는 수성 상, 및 오일 상의 에멀전이다. 오일 상은 의도된 투여의 투여량 범위에서 비-독성인, 수성 상과 혼합되지 않는, 적어도 하나의 생분해성 오일을 포함한다. 오일은 천연적이거나 합성적일 수 있으며, 일반적으로 치료 용도에 대한 국제 규제 기준을 충족하는 것으로 인정되는 입수가능한 다양한 오일이 있다. 이러한 적합한 오일의 예는 스쿠알렌, 스쿠알란, 소르비탄 모노올리에이트, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80이다. 바람직한 오일 상은 이러한 5개의 오일을 모두 포함한다.
추가로, 상기 오일 상은 알루미늄 모노스테아레이트 또는 보조제-활성인 사카라이드 올리에이트 또는 사카라이드 스테아레이트 에스테르와 같은 별도의 유화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 기술된 바와 같은 에멀전의 오일 또는 수성 상 중 하나는 폴리펩티드 면역원의 면역원성 담체 성분과 구별되는 적어도 하나의 보조제를 함유한다. 광범위한 공지된 보조제가 있는데, 이들 중 임의의 하나 이상이 본 발명에서 사용되는 것으로 고려될 수 있다. 이러한 공지된 보조제의 예는 Nor-MDP, 이미퀴모드, 사이클릭 디구아닐레이트, 트레오닐-N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, 이소프리노신, 트레할로스 디미콜레이트, QS-21, 알파-갈락토실세라미드(α-GalCer), 및 알파글루코실세라미드(α-GluCer)이다. 또한, 이러한 보조제 역할을 위해, 본 발명은 전형적으로 보조제 자체로 여겨지지 않는 경우, 그럼에도 불구하고 면역자극성인 물질의 사용을 포함한다. 이러한 물질의 예로는 에르가미솔, 시메티딘, 프라지퀀텔, 요산, 만난 및 만난의 유도체, 및 비타민 E이다.
본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 개선된 면역원은 huG17 및 gly-huG17의 아미노 말단 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 생성한다. 이들 면역원의 예는 상기 기술된 바와 같이, (ii) 면역원성 담체에 커플링된 (i) pGlu-Gly-Pro-Trp-이소Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열 번호　2)의 서열의 펩티드를 포함하는 것이다. 본 기술내용의 다른 부분에서와 같이 여기서, "이소Val"은 Leu의 베타 아미노산 모사체를 나타내며, 이는 일반적으로 Leu 대신 사용될 수 있으며, "pGlu"는 huG17 호르몬의 생활성 N-말단에서 발견되는 아미노산 유도체인 피로글루타메이트이다. 또한, 파상풍 톡소이드가 이 실시양태에서 바람직한 면역원성 담체이며, 여기서 N-말단 huG17(프리프로가스트린의 잔기 76-86) 변경에 7개 아미노산 스페이서가 더해져 G-18 펩티드인 면역모사체를 구성한다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 상기 기술된 바와 같이, (ii) 면역원성 담체에 커플링된 (i) pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 3)의 서열의 펩티드를 포함하는 면역모사체이다. 파상풍 톡소이드는 또한 본 발명의 실시양태에서 바람직한 면역원성 담체이며, 이는 N-말단 huG17(프리프로가스트린의 변형된 잔기 76-86)의 변형(modification)에 7개 아미노산 스페이서가 더해져 huG17의 면역모사체인 G-18 LV 펩티드를 구성한다. 대안으로서, 본 실시양태에 따르면, "G18 LI"로 표시되는 서열 pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys의 펩티드는 huG17의 상동성 면역모사체를 구성하는 데 있어서 펩티드 (i)로서 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 기술된 바와 같이, (ii) 면역원성 담체와 커플링된 (i) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 5)의 서열의 펩티드를 포함하는 면역모사체이다. 따라서, 본 실시양태는 huG17의 글리신-확장된 면역모사체이며, 이는 프리프로가스트린의 잔기 79-93에 7개 아미노산 스페이서가 더해져 G-20 펩티드를 구성한다.
또한 본 발명의 실시양태는 상기 기술된 바와 같이, (ii) 면역원성 담체와 커플링된 (i) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 6)의 서열의 펩티드를 포함하는 면역모사체이다. 따라서, 본 실시양태는 huG17의 변경된 글리신-확장된 면역모사체이며, 이는 프리프로가스트린의 잔기 79-93에 7개 아미노산 스페이서가 더해져 G-20 YF 펩티드를 구성한다.
하기 나열된 펩티드 서열의 나머지(서열번호 7-10)는 담체 상에 인접한 면역원 펩티드를 알맞은 위치에 제시하기 위해 중요한 것으로 본 발명자들이 밝혀낸 특징인, 하나 이상의 D-이성질체 프롤일 아미노산을 함유하는 스페이서이다. 본 문맥에서, D-아미노산 이성질체는 적절한 형태를 가능하게 할 뿐만 아니라 APC 제시에 대한 면역원의 지속성을 강화하여, 더 높은 역가의 항체를 산출하게 된다.
하기의 리스트에서 서열번호 7로서 확인된 펩티드는 스페이서 펩티드 Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys이다. 뿐만 아니라, 서열번호 8은 스페이서 펩티드 Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys이고, 서열번호 9는 스페이서 펩티드 Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys이며, 서열번호 10은 스페이서 펩티드 Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys이다.
종래의 기술에서, 면역모사체-담체 복합체를 사용한 면역화에 의한 효과적인 항체 반응의 유도는 전형적으로 두개 이상의 면역원의 투여를 필요로 하고, 바람직한 수준으로 항체 역가가 상승되기까지 수 주일 또는 수 개월이 걸린다. 그에 반해서, 본 발명의 개선된 면역원은 면역원의 초기 코스의 투여 후 즉시 효과적인 항체 수준을 유도한다. 그렇게 유도된 항체의 수준이 수개월 동안 상승된 상태로 유지되고 면역원의 단일 주사에 의한 후속적인 증폭시 더욱 높은 수준으로 용이하게 상승된다.
도 1은 각각의 컨쥬게이트 hG18-TT, hG18-DT, hG21-TT 및 hG21-DT(각각 a, b, c 및 d)를 포함하는 면역원을 사용한 세 가지 면역화에 대한, ELISA에 의해 측정된 마우스에서의 항체 반응을 도시한다.
도 2는 각각 하기 실시예 1 및 실시예 2의 펩티드 1(hG18-TT) 및 펩티드 2(hG21-TT)를 사용해 작제된 컨쥬게이트를 일회 투여하여 ELISA에 의해 측정시 토끼에서의 항체 반응을 에 따라 도시한다.
도 3은 면역원 G18-TT 및 G21-TT을 사용해 프로세싱된 마우스에서 인간 위 암 세포(BCG-823 세포)의 억제를 도시한다. 42일째 동물을 인간 위 암 세포를 함유하는 멸균된, 봉합, 중공사 세관을 사용해 이식시켰다. 도시된 바와 같이, 일부 동물은 면역원에 종래의 위 암 화학요법 약물이 더해져 투여되었다.
도 4는 G21 면역원을 사용해 수득한 결과와 비교하여, 본 발명의 상이한 면역원 컨쥬게이트를 사용해 면역화하여 마우스에 의해 수득된 결과를 도시한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술되며, 이는 예시적인 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
펩티드는 표준 고체 상태 합성 방법에 의해 준비하였다. 각각의 펩티드는 아미노산 함량 및 순도에 대하여 특성화하였다.
따라서 하기 나열된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 합성하였다. 본 기술내용의 다른 부분과 같이, 이들 서열에서, 대문자로 시작되는 아미노산은 L-이성질체가고, 반면 소문자로 시작되는 아미노산은 D-이성질체가다.
(1) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(서열번호 1), "G-21"으로 나타냄
(2) pGlu-Gly-Pro-Trp-이소Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 2), "G-18"으로 나타냄
(3) pGlu-Gly-Pro-Trp-이소Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 3), "G-18 LV"(인간 G17 상동체)으로 나타냄
(4) pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 4), "G18 LI"으로 나타냄
(5) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 5), "G-20"으로 나타냄
(6) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(서열번호 6), "G-20"으로 나타냄
(7) Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 7), 7개 아미노산 펩티드인 세릴-프롤일 스페이서
(8) Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys(서열번호 8), 7개 아미노산 펩티드인 세릴-모두 D-프롤일 스페이서
(9) Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 9), 7개 아미노산 펩티드인 트레오닐-프롤일 스페이서
(10) Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys(서열번호 10), 7개 아미노산 펩티드인 트레오닐-모두 D-프롤일 스페이서
펩티드 1(서열번호 1)은 프리프로가스트린 잔기 N-말단 측면의 88-101에 부착된 카르복시 말단 스페이서-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 7)에 의해 선행되는, 프로가스트린(-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn)의 파라-니트로페닐알라닌-변경된 아미노 말단 면역모사체를 함유한다. 펩티드 2(서열번호 2)는 Leu이 이소Val로 치환된 huG17의 상동체인, huG17의 11개 아미노산 면역모사체(pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-이소Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-), 이어서 huG17 면역모사체의 프리프로가스트린 잔기의 86번 아미노산에 부착된 스페이서 -Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-D-Pro-Cys(서열번호 7)를 포함한다. 펩티드 3(서열번호 3)은 Val이 이소Val을 대신하는 것을 제외하고는 펩티드 2와 동일한 11개 아미노산 면역모사체 상동체, 상기 기술된 바와 같이 프리프로가스트린 잔기의 86번 아미노산에 부착된 -Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys;(서열번호 8)를 포함한다. 펩티드 4(서열번호 4)는 이소Val이 Ile로 치환된 것을 제외하고는 펩티드 2와 유사한 huG17의 11개 아미노산 면역모사체인 pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, 이어서 huG17의 면역모사체의 프리프로가스트린 C-말단 잔기의 79번에 부착된 스페이서 -Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(서열번호 7)를 포함한다. 펩티드 5(서열번호 5)는 huG17의 글리신-확장된 면역모사체의 79번 잔기의 프리프로가스트린 N-말단에 부착된 스페이서 -Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys;(서열번호 7)에 의해 선행되는, gly-huG17의 15개 아미노산 면역모사체인 Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly를 포함한다. 펩티드 6(서열번호 6)은 huG17의 글리신-확장된 면역모사체의 79번 잔기의 프리프로가스트린 N-말단에 부착된 스페이서-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 7)에 의해 선행되는, 파라-니트로페닐알라닌-변경된, gly-huG17의 15개 아미노산 면역모사체인 Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly를 포함한다. 펩티드 9(서열번호 1)는 프리프로가스트린 N-말단 잔기 88-101 펩티드에 부착된 카르복시 말단 스페이서 -Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys,(서열번호 8)에 의해 선행되는, 프로가스트린의 아미노 말단 면역모사체인 -Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn을 함유하며, 프로가스트린의 인간 펩티드 모사체를 형성한다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 각각의 이들 펩티드는 파상풍 톡소이드(TT) 면역원성 담체 상에 존재하는 아미노 기에 컨쥬게이트된다. 결합은 말단 펩티드 시스테인 잔기를 통해서 이루어지고, 한쪽 말단에는 숙신이미딜 에스테르 및 결합제의 다른 한쪽 말단에는 말레이미드를 함유하는 헤테로이기능성 결합제를 사용하였다. 상기 펩티드 1 및 2 중 하나 및 담체 사이에 결합을 달성하기 위해, 펩티드의 시스테인을 먼저 환원시켰다. 건조 펩티드를 디티오트레이톨의 5-50 몰 초과로, pH를 7-9로 하여, 1.0 M 소디움 포스페이트 완충액에 용해시켰다. 펩티드는 동결건조하고 사용하기 전까지 진공하에 보관하였다.
TT는 TT의 105 분자량 당 대략 25개 유리 아미노기의 활성화에 도달하는데 충분한 비율로, 헤테로이기능성 결합제 입실론-말레이미도카프로익산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(EMCS)로 처리하여 활성화시켰다.
정제된 파상풍 톡소이드의 조제: TT는 한외여과에 의해 정제하였다. 회수된 정제 TT의 최종 농도는 5-40 mg/ml로 예상되었다. 순도는 크로마토그래피(SEC HPLC), 단백질 농도(Lowry), 및 유리-아미노 기(닌하이드린)에 의해 측정하였다.
펩티드는 상업적으로 (Biosyn Corp, USA) 입수하고, 공지된 순도 및 함량을 가진 환원 펩티드를 컨쥬게이션을 위해 사용하였다. 펩티드를 트리스(2-카르복시에틸)-포스핀-HCl(TCEP)로 환원시키고, 혼합물을 컨쥬게이션에서 사용하였다. 엘만분석(Ellmans assay)을 이용하여 유리(free) 설프하이드랄 기를 측정할 수 있다.
파상풍 톡소이드의 활성화: 활성화 완충용액에서 정제된 TT를 5-50 mg/ml로 희석하였다. 바람직한 양의 TT를 테플론-코팅된 교반 막대를 함유하는 유리 바이알로 옮기고, TT 용액에 EMCS(50-90mg/ml DMF)를 첨가하였다. EMCS/DT의 몰 비율은 활성화 수준을 결정한다. 최종 농축 단계에서, 총 용적은 > -5-50mg TT/ml를 제공하도록 감소되었다. TT 용액은 SEC HPLC에 의해 측정하였고, 단백질 농도는 Lowry에 의해, 엘만 분석에 의해 활성 수준을 측정하였다.
펩티드-TT의 컨쥬게이션: 말레이미도-TT와 반응하는 펩티드의 양을 계산한 후, 펩티드를 M-TT 용액에 첨가하였다. 펩티드-TT 컨쥬게이트는 한외여과 장치에 의해 정제하였다.
펩티드 G18 및 G21의 컨쥬게이트는 EMCS를 통해 TT에 결합시켰고, G50 세파덱스 컬럼에서의, 0.1-0.5M 암모늄 중탄산염으로 평형화시킨 4℃에서 저압 크로마토그래피에 의해 혼합물의 다른 성분으로부터 분리시켰다. 각각의 경우에 컨쥬게이트는 컬럼 공극 용적에서 용출시키고, 동결건조시키고 사용시까지 4-0℃에서 건조시키고 저장하였다.
컨쥬게이트는 중량 증가, 아미노산 분석, 등과 같은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다수의 방법에 의하여 면역모사체 펩티드 함량에 대해 특성화될 수 있다. 이들 방법에 의해 제조된 TT와 펩티드 G18 및 G21의 컨쥬게이트는 TT의 104-106 MW 당 10-30 몰의 펩티드를 갖는 것으로 아미노산 분석에 의해 측정되었고 모두가 시험된 동물의 면역화를 위한 면역원으로서 적합한 것으로 고려되었다. 유사하게 G18 및 G21의 DT 컨쥬게이트를, 동일한 방식으로 제조하여 항체 결합의 분석에 대한 기질로서 huG17을 사용하여 ELISA 역가를 측정하였다.
실시예 2
실시예 1의 펩티드-TT 컨쥬게이트는 하기와 같이 제조된 수성 및 오일 상 성분의 에멜전으로 투여하였다. 컨쥬게이트 및 보조제는 포스페스트 완충 식염수(PBS)에서 용해시켜 수성 상을 제조하였다. 수성 상은 컨쥬게이트의 농도가 이들 성분이 최종 에멜전에서 가지게 될 농도의 두배가 되도록 제조한다. 하기 실시예 4에서 사용된 면역원을 제조하기 위하여, 컨쥬게이트를 5-12 mg/ml의 농도로, pH 6.5-8.0의 PBS에 용해시켰다. (이러한 넓은 범위를 초과할 수 있으며, 이를 사용하여 컨쥬게이트 시키기를 원하는 담체의 정도를 조정할 수 있음)
수성 상을 오일 비히클 상과 1:1(용적:용적)로 배합하여 최종 면역원 제형을 구성하는 에멀전을 생성하였다. 이러한 하나의 비히클은 20-60 부의 스쿠알렌, 70-30 부의 스쿠알란, 2-12 부의 소르비탄 모노올리에이트, 0.6-2.0 부의 알루미늄 모노스테아레이트, 0.1-1 부의 폴리소르베이트 80, 및 0.2-1.2 부의 폴리소르베이트 40의 혼합물이다. 수성 상 및 오일 상 비히클은 안정하게 에멀전화된 혼합물을 형성하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 혼합될 수 있다. 에멀전은 저장시 안정해야만 하는데, 즉, 수 주일 내지 수 개월의 최소 저장 시간 동안 에멀전은 수성 및 비히클 상으로 유의미한 정도로 분리되지 않아야만 한다. 에멀전은 또한 용인되는 크기의 피하 바늘을 통해 용이하게 주사될 수 있는 농도(consistency)여야만 한다.
면역원을 함유하는 수성 상을 2개의 유리 시린지 사이에 18 게이지의 이중 커플링된 바늘을 통해 2개 용액의 오일 비히클 혼합물과 1:1(용적:용적)으로 에멜전화하였다. 혼합물을 바늘을 통해 50회 압착시켰다. 에멀전화된 혼합물을 그 후 동물에게 주사하기 위해 일회용 시린지내로 뽑아올렸다. 에멀전에서 최종 면역원 농도는, 실시예 4에서에 대해, 밀리리터 당 약 1 내지 약 5 mg의 농도 범위의 컨쥬게이트:hG18TT였다.
실시예 3
본 발명자들은 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, TT 및 DT에 연결된 실시예 1에 열거된 각각의 G18 및 G21 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 작제하였다. 본 발명자들은 그 후 펩티드 G18 면역원을 사용해 마우스 6마리를 면역시키고(도 1a, b) 및 펩티드 G21 면역원을 사용해 마우스 6마리를 면역시켰다(도 1c, d).
실시예 4
본 발명자들은 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, TT 및 DT에 연결된 상기한 각각의 G18 및 G21 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 작제하였다. 본 발명자들은 그 후 G18 면역원을 사용해 토끼 4마리를 면역시켰고(도 2a), G21 면역원을 사용해 토끼 4마리를 면역시켰다(도 2b).
도 1 및 2에서 나타난 바와 같이, 이들 ELISA 시험의 결과는 (실시예 1 및 2의)면역원 1 및 2가 다수의 동물 종에서 그들의 효능 및 그들의 항체 유도력 둘다에 대하여, 뿐만 아니라 유도된 항체 반응의 지속성에서도 효과적이었음을 보여준다.
실시예 5
본 발명자들은 상기 기술된 바와 같이, TT 및 DT에 연결된 각각의 G18 및 G21 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 작제하였다. 본 발명자들은 그 후 G18TT 면역원 및 G21TT 면역원을 사용해 마우스 6마리를 면역시켰다. 최고 역가에서(42일째) 모든 마우스는 5일 동안 50,000개 인간 위 암 세포/1-2 cm 튜브(BCG-823)를 함유하는 멸균된, 복강내 중공사 이식물이 삽입되었다. 중공사 세관은 500 KD 미만의 분자의 침투를 허용하지만 CTL 또는 NK 세포의 침투를 허용하지 않는데, 이는 면역 손상된 마우스에서 인간 암 세포의 생존을 가능케한다. 마지막 5일째에 각각의 마우스의 이식물을 제거하고, MTT 분석에 의해 생존가능한 세포의 수를 세어, 비-면역된 마우스에서의 대조군 이식물과 비교하였다. 지시된 바와 같이, 일부 동물은 또한 10 mg/kg의 시스플라틴(CP) 또는 20 mg/kg의 5-플루오로우라실(5-FU) 또는 각각 10 mg/mg의 CP + 5-FU(FUP)의 조합의 단일 투여로 처리하였다.
이 시험의 결과는 도 3에서 나타낸다. 항-가스트린/프로가스트린(G18 및 G21 면역원) 중 하나를 사용하는, (실시예 1, 및 2의) 면역원 1 및 2가 인간 위 암 세포의 성장을 억제하는 측면에서 효과적일 뿐만 아니라, 종래 위 암 화학치료법의 존재하에 효과적이었던 충분한 항체 반응을 유도함에 있어서도 효과적임을 볼 수 있다.
실시예 6
본 발명자들은 각각의 상기-언급된 G18-a, G-18-b, G20, 및 G20-a 펩티드(각각, 서열번호 3-6) 를 포함하는 컨쥬게이트를 작제하였고, 그들을 G21(서열번호 1)과 비교하였다. 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이, 컨쥬게이트를 모두 TT에 연결시켰다. 발명자들은 그 후 이들 면역원을 사용해 마우스 6마리를 면역시켰고(도 4a, b, c 및 d 참조), 비교를 위해 G21 면역원을 사용해 마우스 6마리를 면역시켰다.
그렇게 입증된 개선점은 본 발명에 따른 면역모사체에서 구체화된 변형 및 면역원 펩티드의 고유한 스페이서 영역으로부터 유래한다. 본 발명 펩티드 면역원을 임의의 상기-기술된 면역원성 모사체 및 스페이서를 통합하지 않은 면역원에 대해 시험하였고, 후자는 덜 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 종래의 면역원은 본 발명과 조화하여 그들의 면역모사체 및/또는 그들의 스페이서가 본 발명자들에 의해 변형됨으로써 개선되었다.
<110> ONKOLOGIX LTD <120> IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AGAINST HUMAN PROGASTRIN PEPTIDES <130> IPA120809 <150> CN 201010116229.3 <151> 2010-03-03 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Pro <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> nPhe <400> 1 Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser 1 5 10 15 Ala Glu Asp Glu Asn 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Beta-isoVal <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> D-Pro <400> 2 Glu Gly Pro Trp Val Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro Cys <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> D-Pro <400> 3 Glu Gly Pro Trp Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Cys <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> D-Pro <400> 4 Glu Gly Pro Trp Val Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Cys <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Pro <400> 5 Cys Pro Pro Pro Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp 1 5 10 15 Met Asp Phe Gly 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Pro <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> nPhe <400> 6 Cys Pro Pro Pro Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Phe Gly Trp 1 5 10 15 Met Asp Phe Gly 20 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Pro <400> 7 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> D-Pro <400> 8 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Pro <400> 9 Thr Thr Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> D-Pro <400> 10 Thr Thr Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> IsoVal <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> D-Pro <400> 11 Glu Gly Pro Trp Val Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Cys <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> D-Pro <400> 12 Glu Gly Pro Trp Val Glu Glu Glu Glu Glu Ala Thr Thr Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Cys <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> nPhe <400> 13 Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> IsoVal <400> 14 Glu Gly Pro Trp Leu Val Glu Glu Glu Glu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pGlu <400> 15 Glu Gly Pro Trp Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe Gly <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Trp Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> nPhe <400> 17 Trp Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ala Phe Gly Trp Met Asp Phe Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 1 5 10

Claims (23)

  1. (A) (ii) 7개 아미노산 스페이서에 결합된 (i) 프로가스트린 또는 프로가스트린의 N-말단 및/또는 C-말단 프로세싱된 종의 아미노산 서열로 구성된, 모방체 펩티드; 및
    (B) 상기 모방체 펩티드에 커플링된, 면역원성 담체를 포함하고,
    상기 모방체 펩티드가 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드 면역원:
    Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn (서열번호 1);
    pGlu-Gly-Pro-Trp-β-isoVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 2);
    pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 3);
    pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 4);
    Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (서열번호 5); 및
    Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (서열번호 6).
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 담체가 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 퍼투신(pertussin) 톡소이드, 및 투베르쿨린 순수 단백질 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 면역원.
  3. 제2항에 있어서, 상기 면역원성 담체가 파상풍 톡소이드인 것인, 폴리펩티드 면역원.
  4. 유효량의 제1항에 따른 폴리펩티드 면역원 및 상기 면역원에 대한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클이, 상기 면역원이 존재하는 수성(aqueous) 상, 및 오일 상의 에멀전을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 오일 상이 스쿠알렌, 스쿠알란, 소르비탄 모노올리에이트, 폴리소르베이트 40, 및 폴리소르베이트 80 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 오일 상이 유화제를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 오일 상 또는 상기 수성 상 중 하나가 적어도 하나의 보조제를 함유하는 것인, 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 보조제가 Nor-MDP, 이미퀴모드, 사이클릭 디구아닐레이트, 트레오닐-N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, 이소프리노신, 트레할로스 디미콜레이트, QS-21, 알파-갈락토실세라미드, 및 알파-글루코실세라미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 면역원성 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 보조제가 에르가미솔, 시메티딘, 프라지퀀텔, 요산, 만난 및 만난의 유도체, 및 비타민 E로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 면역원성 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 스페이서가 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 면역원:
    Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 7);
    Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys (서열번호 8);
    Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (서열번호 9); 및
    Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys (서열번호 10).
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
KR1020127024509A 2010-03-03 2011-03-03 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물 KR101847224B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010101162293A CN101797382B (zh) 2010-03-03 2010-03-03 抗人前胃液素多肽免疫组合物
CN201010116229.3 2010-03-03
PCT/US2011/000413 WO2011109106A2 (en) 2010-03-03 2011-03-03 Immunogenic compositions against human progastrin peptides

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177036258A Division KR101957894B1 (ko) 2010-03-03 2011-03-03 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130075722A KR20130075722A (ko) 2013-07-05
KR101847224B1 true KR101847224B1 (ko) 2018-04-10

Family

ID=42593323

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177036258A KR101957894B1 (ko) 2010-03-03 2011-03-03 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물
KR1020127024509A KR101847224B1 (ko) 2010-03-03 2011-03-03 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177036258A KR101957894B1 (ko) 2010-03-03 2011-03-03 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JP5960064B2 (ko)
KR (2) KR101957894B1 (ko)
CN (1) CN101797382B (ko)
WO (1) WO2011109106A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108700588A (zh) * 2015-12-31 2018-10-23 普莱戈斯瑞恩癌症有限责任公司 用于检测和治疗胃癌的组合物和方法
WO2019038671A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Onkologix Ltd TUMOR-ASSOCIATED PROLIFERATIVE PEPTIDES AND ANTICANCER IMMUNOGEN THEREFOR FOR THE TREATMENT OF LUNG CANCERS AND OTHER CANCERS

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997028821A1 (en) 1996-02-08 1997-08-14 Aphton Corp. Immunological methods for the treatment of gastrointestinal cancer
WO2008076454A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Immunogenic compositions comprising progastrin and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2005102A (en) * 1931-05-21 1935-06-18 Barrett Co Distillation of tar
US5023077A (en) * 1989-01-24 1991-06-11 Aphton Corporation Immunogenic compositions and methods for the treatment and prevention of gastric and duodenal ulcer disease
US6258550B1 (en) * 1993-04-23 2001-07-10 Virginia Commonwealth University Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
US6084066A (en) * 1993-10-29 2000-07-04 Virginia Commonwealth University Polypetides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
US5468494A (en) * 1993-11-12 1995-11-21 Aphton Corp. Immunogenic compositions against human gastrin 17
ES2237103T3 (es) * 1998-05-15 2005-07-16 Aphton Corporation Terapia de combinacion para el tratamiento de tumores.
DK1794586T3 (da) * 2004-09-22 2013-05-13 Cancer Advances Inc Monoklonale antistoffer til progastrin
CN100558747C (zh) * 2006-04-06 2009-11-11 海南天源康泽医药科技有限公司 以白喉毒素突变体crm197为载体的免疫原及其制备方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997028821A1 (en) 1996-02-08 1997-08-14 Aphton Corp. Immunological methods for the treatment of gastrointestinal cancer
WO2008076454A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Immunogenic compositions comprising progastrin and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN101797382A (zh) 2010-08-11
WO2011109106A2 (en) 2011-09-09
CN101797382B (zh) 2013-11-20
KR101957894B1 (ko) 2019-03-13
WO2011109106A3 (en) 2012-01-19
JP5960064B2 (ja) 2016-08-02
KR20170142214A (ko) 2017-12-27
KR20130075722A (ko) 2013-07-05
JP2013521282A (ja) 2013-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU645967B2 (en) Immunogenic compositions against gastrin peptides
JP3795914B2 (ja) ワクチン用免疫原性ｌｈｒｈペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器
US20210205446A1 (en) Conjugate vaccine targeting a disease-causing biological protein
Azmi et al. Self-adjuvanting vaccine against group A streptococcus: Application of fibrillized peptide and immunostimulatory lipid as adjuvant
KR20140138900A (ko) 펩티드를 포함한 의약 조성물
KR100335320B1 (ko) 황체호르몬방출호르몬에대한향상된펩티드,면역원성조성물및백신또는의학용제제,동물을면역시키는방법,및황체호르몬방출호르몬직렬반복펩티드의유사체및백신으로서이들의용도
US6861510B1 (en) Immunogenic compositions against gastrin peptides
KR101847224B1 (ko) 인간 프로가스트린 펩티드에 대한 면역원성 조성물
US8999931B2 (en) Pharmaceutical composition using gonadotropin-releasing hormone (GNRH) combined variants as immunogen
US11911451B2 (en) Composition of tumor-associated proliferative peptides and related anti-cancer immunogen for the treatment of lung cancers and other cancers
JP2837866B2 (ja) 口蹄疫に対する合成ワクチンおよびその製造方法
US9550806B2 (en) Immunogenic compositions against human progastrin peptides
JP4850321B2 (ja) アンギオテンシン誘導体
CA2233882A1 (en) Pseudomonas exotoxin as immunogenic carrier in synthetic conjugate vaccines
WO2015153883A1 (en) Vaccination using plant virus particles linked to her2 antigens
CN1322005C (zh) 具有偶联到b细胞表位上的人造t辅助细胞表位的分枝合成肽免疫原构建体
JP2002518033A (ja) 農場動物の成長促進のための合成ソマトスタチン免疫原
WO2013088141A1 (en) Polypeptide comprising the sequence egpwleeeeeayg linked to an immunogenic carrier
DK173981B1 (da) Farmaceutisk antigenetisk formulering

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20120919

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20160223

Comment text: Request for Examination of Application

AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20170421

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20170920

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20170421

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20171215

PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20170920

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20170621

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20160303

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20180103

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20171215

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20170920

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20170621

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20160303

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20180403

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20180403

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PC1903 Unpaid annual fee