KR20160088891A - 골다공증 치료 및 예방을 위한 가스트린 길항제(ｅｇ ｙｆ476, 네타제피드) - Google Patents

Abstract

제공하는 실시양태는 일부 측면에서, 노화 소화관-난소 축을 조절하는 데 있어서 가스트린의 역할, 및 가스트린 매개 골 손실을 역전시키는 데 있어서 가스트린 활성을 표적화하는 것의 효과에 관한 본원의 증거에 기초하는 것이다. 골 질환 및 병태를 치료, 호전, 및 예방하기 위한 가스트린 길항제, 예컨대, CCK2 수용체 길항제(특히, YF476)를 포함하는 방법, 조성물, 및 작용제를 제공한다. 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에서 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 피험체에게 치료학상 유효량의 가스트린 수용체 표적화제를 1회 이상의 용량으로 투여하여 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함할 수 있다.

Description

골다공증 치료 및 예방을 위한 가스트린 길항제(ＥＧ ＹＦ476, 네타제피드) {GASTRIN ANTAGONISTS (EG YF476, NETAZEPIDE) FOR TREATMENT AND PREVENTION OF OSTEOPOROSIS}

관련 출원

본 출원은 2013년 11월 22일 출원된 미국 가출원 번호 제61/907,980호의 이점을 주장하고, 그를 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

기술 분야

제공하는 실시양태는 일부 측면에서, 노화 소화관-난소 축을 조절하는 데 있어서 가스트린의 역할, 및 가스트린 매개 골 손실을 역전시키는 데 있어서 가스트린 활성을 표적화하는 것의 효과에 관한 본원의 증거에 기초하는 것이다. 골 질환 및 병태를 치료, 안정화, 호전, 및 예방하기 위한 가스트린 길항제를 포함하는 방법, 조성물, 및 작용제를 제공한다.

골 손실 및 골절 위험이 높은 것을 특징으로 하는 골다공증은 특히 노인에서는 가장 흔한 질환 중 하나이며, 이는 전세계적으로는 대략 1억 여명의 사람이 병에 걸린 것으로 추정된다. 노인에서의 뼈 골절 발생률은 일반적으로 증가하고 있지만, 치료학상의 선택 범위는 한정되어 있다. 현재, 골흡수 억제제(예컨대, 비스포스포네이트, 데노수맙, 호르몬 요법)가 가장 보편적으로 사용되는 골다공증 치료법이다. 상기 작용제는 골 재형성을 저속화시키고, 골 밀도를 증가시키도록 디자인된 것이다. 그러나, 이는 턱의 골괴사, 비정형 골절, 심방 세동, 및 뇌졸중 또는 암의 위험 증가를 비롯한, 유의적인 부작용과 연관되어져 왔다. 동화제는 골다공증 환자에서 새로 골을 생성하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 골량을 증가시키고, 골아세포매개 골 형성과 골수 지방축적 사이의 균형을 조절하는 동화 인자를 찾는 것이 도전 과제가 되어 왔다. 추가로, 상업적으로 이용가능한 유일의 동화제(테리파라티드)는 매우 비싸고, 투여하기 어려울 뿐만 아니라, 혈압 하락, 구역, 통증, 쇠약, 및 우울증을 비롯한 부작용과도 관련이 있다. 또한, 래트에서의 테리파라티드의 사용은 악성 종양 성장(골원성 암종)을 유발하는 것으로 나타났다. 일반적으로, 골다공증을 위한 치료학상의 선택 범위는 한정되어 있고, 골 형성을 자극하는 새로운 치료학적 접근법의 개발이 우선시되고 있다.

비록 난소 부전 및 골 탈광물화가 골다공증에서 중요한 요소로서 널리 인식되고 있지만, 정확한 병인에 대해서는 여전히 불완전하게 해명된 상태이다. 골다공증 및 관련된 골 질환 또는 병태의 병인에 대한 한층 더 깊은 이해는 골다공증 및 다른 골 질환 및 병태 치료를 위한 신규의 대안적 방법 및 조성물로 이어질 수 있다.

골다공증 및 다른 골 질환 및 병태 치료를 위한 방법 및 조성물이 요구되고 있다. 본 출원은 상기 언급된 문제점들을 극복하고, 가스트린 효과를 조절함으로써 골 질환 또는 병태를 치료, 안정화, 및/또는 그의 진행을 예방하기 위한 신규한 수단을 제공한다.

본 출원은 골 질환 또는 장애의 치료, 예컨대, 안정화, 및/또는 예방, 예컨대, 그의 진행의 예방을 필요로 하는 피험체에게로의 작용제 투여를 통해 골 질환 또는 장애의 치료, 예컨대, 안정화, 및/또는 예방, 예컨대, 그의 진행을 예방하기 위한 방법, 용도, 화합물, 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 골 질환 또는 장애는 골다공증을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 그를 필요로 하는 피험체에게 투여되는 작용제는 가스트린 및/또는 가스트린 수용체, 예컨대, 가스트린 또는 가스트린 수용체 길항제를 표적화, 예컨대, 억제 또는 길항시킨다. 한 실시양태에 따라, 투여되는 작용제는 CCK2 수용체를 표적화한다.

제공하는 실시양태는 일부 측면에서, 호르몬 가스트린이 골 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 조절함으로써 골 손실을 촉진시키고, 그 결과로 골다공증성 변경과 일치하는 골 병태생리가 일어난다는 본원의 증거에 관한 것이다(도 57 참조). 제공하는 실시양태는 일부 측면에서, 예를 들어, CCK2 수용체를 표적화하는 가스트린 길항제를 사용하여 상기 가스트린 효과를 차단하는 것이 골다공증을 앓는 동물 모델에서 유익한 효과를 발휘하고, 따라서, 이는 골다공증 및 다른 골 질환 및 병태를 치료, 예방, 및 호전시키는 데 유용하다는 본원의 증거에 관한 것이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 골 질환 및 병태, 예컨대, 임상적으로, 병리학적으로, 또는 방사선학적으로 골다공증을 특징으로 하는 것에서 가스트린 길항제, 예컨대, 가스트린 활성을 길항시키는 작용제에 관한 방법, 화합물, 조성물, 및 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법 및 용도는 질환 및 병태를 비롯한, 질환 및 병태의 치료, 호전, 및/또는 예방을 포함한다. 일부 측면에서, 예를 들어, i) 노인(남성 또는 여성), 예컨대, 노인성 질환자; ii) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성, iii) 자연 고가스트린혈증(예컨대, 신생물성, 또는 위 점막 위축증과 관련된 고가스트린혈증) 및/또는 산 억제성 약물요법(예컨대, 모든 양성자 펌프 억제제, 또는 모든 단기 또는 장기 작용성 히스타민 2 수용체 길항제를 비롯한 작용제 부류) 사용 결과로서 발생하는 고가스트린혈증을 앓는 개체를 비롯한, 고가스트린혈증을 앓는 개체 및/또는 iv) 위 절제술을 받은 개체에서, 가스트린 및/또는 가스트린 수용체를 표적화하는 작용제, 예컨대, 가스트린 길항제를 사용하여 골 질환/병태, 예컨대, 골다공증을 특징으로 하는 것의 치료, 호전을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료, 호전, 및/또는 예방은 가스트린 표적화제, 예컨대, 가스트린 길항제, 예컨대, 가스트린 표적화제 또는 가스트린 수용체 표적화제, 예컨대, 가스트린 또는 가스트린 수용체 길항제, 예를 들어, CCK2 수용체를 표적화하는 작용제를 사용하여 수행된다.

일부 실시양태에서, 피험체에게 가스트린 또는 가스트린 수용체 표적화제를 투여함으로써 질환 또는 병태, 또는 그의 진행을 치료 또는 예방하는, 피험체에서 골 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법, 용도, 및 작용제를 제공한다. 일부 측면에서, 가스트린 또는 가스트린 수용체 표적화제는 가스트린 길항제 또는 가스트린 수용체 길항제, 예컨대, 선택적 가스트린 수용체 길항제, 예컨대, 선택적 CCK2 수용체 길항제, 예컨대, 다른 수용체 또는 다른 가스트린 수용체는 길항시키지 않는 것이다. 선택적 CCK2 수용체 길항제의 예로는 YF476이 있다.

일부 측면에서, 골 질환 또는 병태는 골다공증을 특징으로 하는 질환 또는 병태, 예를 들어, 임상적으로, 병리학적으로, 또는 방사선학적으로 골다공증을 특징으로 하는 것이다. 일부 측면에서, 피험체는 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이다. 다른 측면에서, 피험체는 (a) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이고, (b) 고가스트린혈증을 앓는 피험체이다. 일부 측면에서, 피험체는 (a) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이고, (b) 고가스트린혈증을 앓고, (c) 위 절제술을 받은 경험이 있는 피험체이다. 일부 측면에서, 피험체는 자연 고가스트린혈증, 예컨대, 신생물성 고가스트린혈증인 고가스트린혈증, 또는 산 억제성 약물요법, 예컨대, 양성자 펌프 억제제 또는 히스타민 2 수용체 길항제 투여와 관련된 고가스트린혈증을 앓는 피험체이다. 일부 측면에서, 본 방법은 피험체에게 가스트린 또는 가스트린 수용체 표적화제를 양성자 펌프 억제제 또는 히스타민 2 수용체 길항제와 함께 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 본 방법은 작용제와 동시에 또는 그에 대해 순차적으로 임의의 순서로 또 다른 골다공증 치료법을 실행하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 피험체에서 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 피험체에게 치료학상 유효량의 가스트린 수용체 표적화제를 1회 이상의 용량으로 투여하여 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 방법은 가스트린 수용체 표적화제를 용량으로 정맥내로 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 방법은 가스트린 수용체 표적화제를 용량으로 경구 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 골다공증을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 방법은 선택적 CCK2 수용체 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 방법은 선택적 CCK2 수용체 길항제 YF476을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성인 피험체를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 (a) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이고, (b) 고가스트린혈증을 앓는 피험체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 (a) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이고, (b) 고가스트린혈증을 앓고, (c) 위 절제술을 받은 경험이 있는 피험체를 추가로 포함한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 고가스트린혈증은 신생물성 고가스트린혈증, 또는 산 억제성 약물요법과 관련된 고가스트린혈증이다.

다른 실시양태에서, 본 방법은 선택적 가스트린 수용체 표적화제를 치료학상 유효량의 양성자 펌프 억제제(PPI) 또는 히스타민 2 수용체(H₂R) 길항제와 함께 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 PPI가 오메프라졸이고, H₂R 길항제가 록스티딘인 것을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 방법은 피험체 체중 1 kg당 0.2-14 ㎍의 치료학상 유효량으로 가스트린 수용체 표적화제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가의 실시양태에서, 가스트린 수용체 표적화제의 치료학상 유효량은 10-25 나노몰이다.

일부 실시양태에서, 가스트린 수용체 표적화제는 피험체에게 피하 주사에 의해 투여된다.

추가의 실시양태에서, 가스트린 수용체 표적화제는 정맥내 주사에 의해 피험체에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 가스트린 수용체 표적화제는 1일 정제 용량으로서 20-100 mg 용량으로 피험체에게 경구 투여된다.

제공된 방법에서 사용하기 위한 작용제 및 조성물, 예컨대, 제약 조성물, 및 키트, 예컨대, 가스트린 및 가스트린 수용체 표적화제, 예컨대, 길항제를 포함하는 작용제 및 조성물, 및 상기 피험체에게 투여하기 위한 설명서와 함께 상기 작용제 및 조성물을 포함하는 키트 또한 제공한다.

도 1은 골 재형성의 조절인자를 보여주는 다이어그램이다. 난소 기능(및 에스트로겐 분비)은 골 유지와 양의 관련성을 가진다. 비타민 D는 상기를 보충하는 것으로 간주되지만, 낮은 비타민 D는 골다공증과 관련이 있으며, 비타민 D 수용체 돌연변이가 골절 위험의 증가와는 관련이 없는 바, 이는 부수 현상일 수 있다. 부갑상선 생산된 PTH는 낮은 수준의 순환 칼슘에 의해 증폭되는 효과인 골 생리를 음성 방식으로 조절한다. 에스트로겐은 PTH의 음성 효과를 길항시킨다. 가스트린 호르몬의 역할은 명확하지는 않지만, 위 제거는 골 손실을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이는 산 손실, 및 결과적으로 칼슘 흡수 감소를 반영하는 것으로 간주된다.
도 2는 골 생리 및 구조 및 강도 측정을 보여주는 도해이다. 마이크로 전산화 단층 촬영법(마이크로CT: Microcomputed tomography) 및 골 굽힘 뿐만 아니라, 오스뮴 흡수 및 PCR을 사용하여 상이한 동물에서 골 역학적 성질 및 골다공증성 특징을 평가하였다. 마이크로CT는 해면질 골 및 피질 골, 둘 모두의 밀도 및 부피를 평가한다. 피질 골의 반경 및 둘레 측정에 착수할 수 있다. 골의 결합 밀도, 구조 모델 지수(SMI: structural model index) 뿐만 아니라, 강성도(구조의 모든 척도)를 계산할 수 있다. 극 관성 모멘트(pMOI: polar moment of inertia) 뿐만 아니라, 골절 및 운동 하중을 통해 기본 골 강도를 확인할 수 있다. 오스뮴 흡수를 통해 지방생성 표현형의 변경을 확인할 수 있는 반면, PCR은 골 활성화에 관여하는 전사체의 활성화를 평가할 수 있다.
도 3은 G 세포가 칼슘 센서로서의 역할을 한다는 것을 입증하는 일련의 그래프(3A-3D)이다. CaCl₂(4 mM)는 칼슘 유입(FITC 이동: >5배 우측 방향으로 - 유세포측정법을 사용하여 측정)을 자극하였으며, 이는 CaCl₂ 부재하에서는 관찰되지 않았다(3A). CaCl₂는 용량에 의존하는 방식으로 가스트린 방출(EC₅₀=4.1 mM, 8배)을 자극하였고, 이는 칼슘 채널 길항제, 니페디핀(1 μM)과의 사전 인큐베이션(10 분)에 의해 억제되었다(3B). 이러한 칼슘 매개 가스트린 분비는 cAMP 생산과는 관련이 없었고(3C), 이는 둘 모두가 cAMP/MAPK 매개 가스트린 분비와 관련이 있는 것인 PKA 억제제 H-89(10 μM) 또는 MAPK 억제제 PD98059(0.1 μM)에 의해서는 억제될 수 없었다(3D). 반대로, PI3K 신호전달의 억제제인 보르트만닌(1 nM)은 CaCl₂ 매개 가스트린 방출을 유의적으로 억제시켰다. 이러한 결과는 가스트린 분비가 PI₃K 신호전달을 통하여 신호전달되는 칼슘 채널 조절된 칼슘 감지 기전과 커플링되어 있다는 것을 입증한다. 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극 세포, WORT: 보르트만닌.
도 4는 G 세포 기능의 PTH 자극을 입증하는 일련의 그래프(4A-4D)이다. PTH가 가스트린 방출을 ~8배 자극시켰고(EC₅₀ 추정치 = 60 nM)(4A), 상기 효과는 10 분 동안 PKA 억제제인 H-89(10 μM)와의 사전 인큐베이션에 의해 억제될 수 있다(4B). PTH는 또한 용량에 의존하는 방식으로 cAMP 생산을 자극시켰으며(E₅₀=4 nM, 250%)(4C), 이 반응은 H-89(사전 인큐베이션: 10 분 - 10 μM)에 의해 역전되었다(4D). 이러한 결과는 가스트린 분비가 PTH 수용체 매개 PKA 활성화 및 cAMP 신호전달과 커플링되어 있다는 것을 입증한다. 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극 세포 또는 대 PTH 단독.
도 5는 칼시토닌이 G 세포 기능을 억제시킨다는 것을 입증하는 두 그래프(5A-5B)이다. 칼시토닌은 가스트린 방출을 억제시켰고(IC₅₀ 추정치 = 1.9 nM(~20%, 5A)), 이 효과는 PKA 억제제인 H-89(10 μM)와의 사전 인큐베이션에 의해 역전되었다. 칼시토닌은 용량에 의존하는 방식으로 cAMP 생산을 억제시켰다(I₅₀=3.8 nM, 20%)(5B). 이러한 결과는 가스트린 분비가 cAMP 신호전달의 칼시토닌 수용체 매개 PKA 억제와 커플링되어 있다는 것을 입증한다. 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극, #p<0.05 대 칼시토닌 매개 억제.
도 6은 G 세포 기능의 에스트로겐 억제를 입증하는 일련의 그래프(6A-6C)이다. G 세포는 ESRα 전사체를 발현하고(6A), 17β-에스트라디올은 cAMP 합성(IC₅₀=1.1x10^-12 M, ~15%) 및 가스트린 방출(IC₅₀=4.6x10^-12 M, ~20%), 둘 모두를 억제시킨다(6B). 추가로, 상기 ESRα 효능제와의 사전 인큐베이션으로 MAPK 인산화가 억제되었다(75%, 6C). 이러한 결과를 통해 가스트린 분비가 PKA/cAMP 생산 및 MAPK 신호전달의 에스트로겐 수용체-α 매개 억제에 의해 억제된다는 것을 확인하게 되었다. 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 17β-에스트라디올(1 nM) 단독.
도 7은 G 세포 조절의 모델이다. 식이성 칼슘을 비롯한 루멘 작용제는 Gα에의 커플링을 통해 아데닐레이트 사이클라제(AC)의 활성화를 통하여 직접 또는 간접적으로 ERK 인산화를 유도하고, 이로써, 가스트린 분비를 초래한다. G 단백질 커플링된 PTH1 수용체를 통한 PTH 또한 상기 경로를 통하여 가스트린 방출을 자극한다. ERK 인산화는 섭식에 의해 직접 증가되는 Ca2+ 유입에 양성 방식으로 영향을 미칠 수 있다. L형 칼슘 채널은 PKC의 활성화를 통해 분비를 유사하게 조절한다. 가스트린 분비의 억제제로는 (cAMP의 억제를 통해 이루어지는) 칼시토닌, 및 ERα를 활성화시켜 cAMP 및 MAPK 경로, 둘 모두를 억제하는 에스트로겐을 포함한다. AC: 아데닐레이트 사이클라제; GAS: 가스트린; PDK: 포스포이노시티드 의존성 키나제; PKA: 단백질 키나제 A; 점선 표시는 억제를 나타내고, 실선은 자극을 나타낸다.
도 8은 인간 PTH 분비의 가스트린 자극을 보여주는 두 그래프이다. 가스트린(CCK2) 및 히스타민(H1)에 대한 수용체는 임상적 수술상의 절제로부터 단리된 PTH 주세포에서 발현된다(8A). 상기 세포는 PTH를 고수준(3배)으로 발현한다(5A). 가스트린은 PTH 합성(EC₅₀=10^-9 M, 40%) 및 방출(EC₅₀=4.2x10^-10 M, 50%)을 자극하였다(8B). 이러한 결과는 PTH 합성 및 분비가 가스트린 수용체(CCK2) 매개 활성화와 커플링되어 있음을 입증한다. 평균±SEM(n=4회 실험).
도 9는 가스트린이 갑상선 C 세포(MTC-SK) 기능을 자극시킨다는 것을 보여주는 일련의 그래프(9A-9D)이다. 가스트린 자극받은 cAMP 생산(EC₅₀=6.7x10^-13 M, ~5배)은 선택적 CCK₂ 수용체 길항제인 YF476에 의해 역전되었다(9A). YF476은 단독으로는 유의적인 효과가 없었다. cAMP에 대한 가스트린의 자극성 효과는 PKA 억제제인 H-89(10 μM)와의 사전 인큐베이션에 의해 억제될 수 있다(9B). 칼시토닌 분비는 용량에 의존하는 방식으로 가스트린에 의해 영향을 받았고, 이 효과는 YF476에 의해 역전되었다(9C). 가스트린(0.1 nM)은 칼시토닌 유전자 전사를 (~3배) 자극시켰고, 이 효과는 H-89(10 μM)와의 사전 인큐베이션에 역전되었다(9D). CCK2 수용체 발현은 H-89에 의해 억제되지 않았다(9D). 이러한 결과를 통해 칼시토닌 합성 및 방출이 가스트린 수용체(CCK2) 매개 PKA 활성화 및 cAMP 신호전달에 의해 조절된다는 것을 확인할 수 있다. 평균±SEM(n=4회 실험). #p<0.05 대 비자극, *p<0.05 대 가스트린(0.1 nM) 단독.
도 10은 가스트린이 PTH 및 MTC-SK 합성 및 분비 - 공동 배양 모델 시스템에 미치는 효과를 보여주는 도해(10A), 현미경 사진(10B) 및 일련의 그래프(10C-10F)이다. 수술 표본으로부터 단리된 인간 PTH 세포를 MTC-SK 세포주와 함께 공동 배양하였다. 세포 위치 및 표적 위치 부위를 상세하게 나타낸 다이어그램은 10A에 포함되어 있는 반면, 현미경 사진은 상기 세포유형들 각각의 성장을 보여주는 것이다(10B). 가스트린을 공동 배양 시스템에 첨가하였을 때, PTH 전사(~75%, 10C) 및 분비(~60%, 10D)를 자극시켰다. 상기 효과는 선택적 CCK₂ 수용체 길항제인 YF476(10 nM)과의 사전 인큐베이션(10 분)에 의해 역전될 수 있다. 반대로, 가스트린은 칼시토닌 전사(기준선까지 - 10E) 및 방출(~70% - 10F)을 억제시켰다. 이러한 결과를 통해 모델 시스템에서 가스트린이 미치는 주된 효과는 PTH를 자극하고, 칼시토닌을 억제시키는 것임을 확인할 수 있었다. 후자 효과는 단일 배양(MTC-SK 세포단독) 실험에서 가스트린의 자극성 효과와 대조를 이룬다. CON = 대조군, GAS = 가스트린(10^-10 M), G+INH = 가스트린 + YF476(10^-11 M). PET = 폴리에스테르 막(0.4 mm). 평균±SEM, n=3. *p<0.05 대 대조군(비자극), **p<0.05 대 가스트린(10^-10 M).
도 11은 단리된 골 유래 세포에서 및 골에서의 CCK2 수용체 발현을 입증하는 입증하는 그래프(11A) 및 일련의 현미경 사진(11B-11H)이다. 두개관 골아세포(OB), hFOB 세포주(hFOB) 및 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BMMSC: bone marrow derived mesenchymal stem cell)에서 CCK2 수용체의 전사체 수준을 확인하였다(11A). 면역조직화학법을 이용하여, 골단판(EP: epiphyseal plate)에서 뿐만 아니라, 골수 세포(화살표 표시)에서도 특이적인 면역염색을 확인하였다(11B, 11C - 100x 확대 배율). 연골내 골화에 관여하는 세포는 골아세포(11F)와 같이, 수용체(11D, E, F)를 발현한다. 골내막(11G) 뿐만 아니라, 치유 골(11H) 중의 CCK2R 양성 골아세포 세포 내층에 관한 증거가 있었다. 본 발명자들은 이 결과는 CCK2R이 연골 세포, 골아세포 및 중갑엽 골수 세포 상에서 발현되고, CCK2R이 골화 및 골 치유 조절에 관여한다는 것을 나타내는 것으로 해석하였다. 수용체를 표적화하는 것이 상기 현상을 조절할 수 있는 가능성도 있다. CCK2R 면역염색 = 갈색 세포(DAB), 대조 염색 = 헤마톡실린. 11D-H: 확대 배율 = 400x.
도 12는 인간 골수 샘플에서의 가스트린/CCK2의 발현을 보여주는 사진(12A), 서열 분석(12B), 및 사진(12C)이다. 표준 PCR 결과, 죽상동맥경화증 유도성 사지 허혈(골수염의 증거는 없음)에 대한 절단으로부터 유래된 단리된 피질 골수 샘플 중 ~320 염기쌍 밴드(화살표 표시)가 확인되었다(12A). 서열 분석(바이오에디트(BioEdit) 결과, 정규 CCK2 유전자와 92% 상동성인 것으로 확인되었다(12B). 웨스턴 블롯 결과, 연구된 10개의 샘플 중에서 CCK2의 발현이 확인되었다(화살표 표시 - 50 kD)(12C).
도 13은 가스트린 및 표적 CCK2가 골 유래 세포 증식에 미치는 효과를 입증하는 그래프 세트(13A 및 13B)이다. 가스트린은 용량에 의존하는 방식으로 모든 세포 유형에서 BrdU 흡수를 자극하였다(EC₅₀=1-2x10^-11 M)(13A). 이는 선택적 CCK2 수용체 길항제인 YF476에 의해 역전되지 않았고, 특히 BMMSC에서 증식을 증강시키는 것으로 보였다(13B). 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극, #p<0.05 대 가스트린(0.1 nM).
도 14는 가스트린 및 표적 CCK2가 골 유래 세포 광물화에 미치는 효과를 입증하는 그래프 세트(14A 및 14B)이다. 가스트린은 용량에 의존하는 방식으로 모든 세포 유형에서 골 광물화(오스테말지(Ostemalge)를 사용하여 측정)를 억제시켰다(IC₅₀=3.2x10^-11 - 1.3x10^-10 M)(14A). 이는 선택적 CCK2 수용체 길항제인 YF476에 의해 역전되지 않았고, 특히 두개관 골아세포에서 광물화를 증강시키는 것으로 보였다(14B). 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극, #p<0.05 대 가스트린(0.1 nM).
도 15는 가스트린 및 표적 CCK2가 골 유래 세포 유전자 발현에 미치는 효과를 입증하는 그래프 세트이다. 가스트린(1 nM)은 모든 세포 유형에서 골아세포 분화 유전자인 알칼리성 포스파타제(ALKP)의 발현을 억제시켰다(상단 줄). 이는 선택적 CCK2 수용체 길항제인 YF476(1 nM)에 의해 역전되었다. 가스트린은 또한 골아세포에서 M-CSH 및 RANKL를 억제시켰다(YF476에 의해 정규화됨)(하단 줄). 평균±SEM(n=4회 실험). *p<0.05 대 비자극, #p<0.05 대 가스트린(1 nM).
도 16은 마스토미스(Mastomys) 모델에서의 단기간 및 만성 고가스트린혈증이 순환 호르몬 수준에 미치는 효과를 입증하는 것이다. 가스트린 수준은 8주(~2배) 및 16주(~3.5배) 처리, 둘 모두에서 유의적으로 상승하였다. 에스트로겐(에스트라디올)은 단기간 및 장기간 고가스트린혈증 동물, 둘 모두에서 감소되었다(~50%). PTH는 8주(~75%)에는 유의적으로 상승하였지만, 16주(~3배)에는 유의적으로 감소되었다. 이러한 결과는 생체내 모델에서 단기간 고가스트린혈증이 에스트로겐 방출은 억제시키고, PTH 분비는 상호간에 활성화시킨다는 것을 입증한다. 장기간 고가스트린혈증 또한 에스트라디올 감소와 관련이 있지만, 이는 PTH를 상승시키지는 않는다. 후자 경우의 기전은 공지되어 있지 않지만, 장기간 가스트린 자극에 노출된 PTH 선에서의 CCK2 수용체 또는 그의 신호전달 반응의 하향 조절을 반영할 수 있다. 평균±SEM, *p<0.05 대 대조군 동물. #p<0.05 대 8주 처리된 동물. CON =대조군 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 17은 마스토미스 모델의 위에서의 칼슘 축 관련 수용체인 PTH1R, ERα 및 CaSR의 발현을 보여주는 한 쌍의 그래프(17A 및 17B) 및 사진(17C)이다. 각각 8주(n=4) 및 16주(n=5) 동안 록스티딘으로 처리된 동물과 비교하였을 때, 정상(n=4) 동물로부터의 위 점막의 PCR 및 웨스턴 블롯 결과. 기저부에서, 단기간(8주) 및 장기간(16주) 고가스트린혈증, 둘 모두, 이는 각각 HDC는 유의적으로 증가시켰지만, PTH1R 및 ERα 발현은 유의적으로 감소시켰다(17A). 방에서, 고가스트린혈증은 가스트린 전사체의 유의적인 증가 뿐만 아니라, PTH1R, ERα 및 CaSR 발현의 상승과 관련이 있었다(17B). 이러한 효과는 장기간 고가스트린혈증에서 더 뚜렷하게 나타났다. RNA 효과는 단백질 수준으로 개괄되었다(웨스턴 블롯 - 17C). 구체적으로, PTH1R 발현은 기저부(F)에서는 감소되었지만, 방(A)에서는 증가되었다 - 상단 패널. CaSR(하단 패널)과 같이 방 ERα 발현은 16주에 상승되었다(가운데 패널). 이러한 결과는 기저부 및 방이 칼슘:골 축과 관련된 수용체를 차별적으로 합성 및 발현시키면서, 단기간 및 장기간 고가스트린혈증에 대해 반응한다는 것을 입증한다. 구체적으로, 기능성 수용체는 위의 히스타민 합성부(기저부)에서는 하향 조절되지만, 이는 가스트린 분비(방) 위에서는 증가된다. 일부 측면에서, 이는 방 및 칼슘 감지 G 세포의 감작화를 반영한다. 평균±SEM, *p<0.05 대 대조군(비처리) 동물. CON =대조군 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 18은 부갑상선 및 갑상선에서의 CCK2 수용체 발현을 보여주는 것이다. CCK2 수용체에 대한 면역염색을 통해 부갑상선 내의 부갑상선 세포 대다수는 CCK2 양성인 것으로 확인되었다(다른 염색은 막 결합 발현[화살표 표시] 및 세포 핵을 반영하다, 18A). 갑상선 내에서, CCK2 항체에 의해 염색되는 개별 C 세포가 확인될 수 있다(염색은 막 결합 발현[화살표 표시]을 반영한다 - 18B, 18C(하단의 2개의 화살표 표시)). 대조적으로, 마스토미스 갑상선 내의 침윤성 면역 세포는 CCK2 음성이다(상단의 3개의 화살표 표시, 청색 오직 핵만)(18C). 이러한 결과는 PTH 및 갑상선 세포, 둘 모두에서의 CCK2 수용체의 막 발현을 입증한다. 이는 상기 구조체로부터 단리된 세포에 대하여 가스트린이 미치는 효과를 보여주는 시험관내 결과와 일치한다. 핵 염색 = DAPI, 다른 염색 = FITC 표지된 CCK2. 에이빔(Abeam)으로부터 입수한 항체(ab14439, 토끼 폴리클로날, 희석률 1:100).
도 19는 마이크로 전산화 단층 촬영법(마이크로CT)을 이용하여 측정된, 단기간 및 만성 고가스트린혈증 동물 모델에서의 해면질 골 변화를 보여주는 것이다. 골 부피(19A) 및 해면질 부피에 대한 골 부피의 비(19B)는 단기간 및 장기간 고가스트린혈증 동물, 둘 모두에서 감소되었지만, 이는 단기간 처리된 동물에서 더욱 뚜렷하게 나타났다(50% 대 30%). 밀도에 관한 2가지 척도, 겉보기 밀도(19C) 및 조직 밀도(19D)는 두 가스트린 군 모두에서 유의적으로 감소되었다(~100%). 결합 밀도(단위 부피당 해면질 개수에 관한 척도)는 장기간 고가스트린혈증 군에서 유의적으로 감소되었다(~60%)(19E). 단기간 가스트린은 플레이트 유사 구조가 더 많은 것에서부터(SMI이 0에 가까움) 로드 유사 구조가 더 많은 것으로(SMI 증가 > 1)의 골 전환과 관련이 있었다(19F). 이는 장기간 고가스트린혈증 동물에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 가스트린이 마스토미스 모델에서 골 표현형을 유의적으로 변경시킨다는 것을 입증한다. 변경은 "골다공증성" 표현형과 일치한다. BV=골 부피, TV = 해면질 부피, ConnDens = 결합 밀도, SMI = 구조 모델 지수(로드:플레이트 기하학적 구조의 척도). 평균±SEM, *p<0.05 대 대조군 동물. CON =대조군 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 20은 골 지방 조직 활성화에 대한 오스뮴 기반 염색을 보여주는 일련의 사진이다. 지방세포는 오스뮴을 흡수하고, 골에서 쉽게 확인된다. 대조군 동물(우측 대퇴골, n=5, 상단 패널)은 대개 경골 골단에서 오스뮴 흡수를 보였다. 단기간 고가스트린혈증 동물 또한 골단에서 오스뮴 흡수를 보였지만, 유의적인 흡수는 또한 골간단에서 관찰되었다(n=5, 하단 패널). 이러한 결과는 지방 조직의 가스트린 활성화 및 "노화" 표현형과 일치한다.
도 21은 대조군, 8주 및 16주 록스티딘으로 처리된 마스토미스로부터의, 톨루이딘 블루, TRAP로 염색된 대퇴골을 보여주는 일련의 현미경 사진으로서, 이는 골 광물화 패턴 및 흡수 강을 나타내는 것이다. 한 측면에서, 록스티딘으로 처리된 동물에서의 변화는 골다공증성 표현형과 일치하는 특징인, 골 광물화 손실 및 흡수 증가를 반영한다. BM = 골 광물화(bone mineralization), RC(resorption cavity) = 흡수 강.
도 22는 마스토미스 모델에서 마이크로CT와 골 파괴 사이의 비교를 보여주는 일련의 그래프(22A-22C)이다. 서보유압 시험 장치(인스트론 모델 8874)를 사용하여 대퇴골에 하중을 부하하여 파괴시켰다(4점 굽힘). 골의 강성도와 골절 하중 사이에 유의적인 상관관계(R²=0.86, p<0.01)가 있는 것으로 관찰되었고(22A), 이는 골 강성도를 증가시키기 위해서는 더욱 큰 골절 하중이 요구된다는 것을 입증한다. 본 발명자들은 해면질 및 피질 밀도, 둘 모두에 대한 마이크로CT 척도와 골 굽힘 사이의 관계를 평가하였다. 이를 통해서 해면질 밀도는 뼈를 골절시키는 데 필요한 힘과 역의 상관관계(R²=-0.54)가 있는 반면(22B), 피질 밀도를 증가시키는 것은 더 높은 골절 하중과 관련이 있었다(R²=0.71, 22C). 이러한 결과는 뼈를 파괴시키는 데 필요한 기계적 힘은 골 구조 및 밀도와 관련이 있으며, 이들 두 접근법의 조합이 본 모델에서 생리학상 관련된 정보를 제공한다는 것을 입증한다. N=7마리의 동물, uCT = 마이크로CT.
도 23은 마스토미스 모델에서의 가스트린 매개 변경을 요약한 차트이다. 대조군(비처리, 정상가스트린혈증 동물)과 비교하여, 단기간 록스티딘 처리는 순환 가스트린 및 PTH를 상승시켰지만, 에스트라디올은 감소시켰다. 이는 골 밀도 감소 및 골다공증성 표현형과 관련이 있었다. 위에서, PTH1R의 발현은 상향 조절된 반면, ERα는 감소되었다. 칼슘 감지 수용체(CaSR: calcium sensing receptor)에서는 어떤 변화도 검출되지 않았다. 대조군과 비교하여, 장기간 록스티딘 처리는 순환 가스트린은 상승시켰지만, PTH 뿐만 아니라, 에스트라디올, 둘 모두를 감소시켰다. 이는 골 밀도 감소 및 골다공증성 표현형과 관련이 있었다. 위에서, PTH1R, ERα 및 CaSR의 발현은 상향 조절되었는데, 이는 칼슘 대사 표현형의 활성화와 일치하는 것이었다. 8주 = 8주 록스티딘 처리, 16주 = 16주 록스티딘 처리, 골 δ = 골 밀도 측정, 오스테오 = 골다공증성 표현형.
도 24는 마스토미스 모델에서 가스트린 매개 골 표현형 변경의 개요를 보여주는 차트이다. 대조군(비처리, 정상가스트린혈증 동물)과 비교하여, 단기간 처리된 동물은 상승된 순환 가스트린 및 PTH를 보인 반면, 에스트라디올은 감소된 것을 보였다. 이는 골 밀도 감소 및 골다공증성 표현형과 관련(비틀림 강도도 낮은 약한 골 포함)이 있었다. 장기간 처리된 동물에서, 순환 가스트린의 상승이 관찰되었지만, PTH 및 에스트라디올은 감소되었다. 이는 약하지만, 강직성인 골을 특징으로 한 골다공증성 표현 및 골 밀도와 관련이 있었다. pMOI = 극 관성 모멘트, PTH = 부갑상선 호르몬.
도 25는 마스토미스 모델에서 난소 적출술이 단기간 및 만성 고가스트린혈증 매개 순환 PTH 수준에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. 난소 적출술은 PTH 수준을 ~100%만큼 증가시켰다. 단기간 고가스트린혈증은 유사하게 PTH 수준을 상승시켰다. 이는 OVX/8주 처리된 동물에서 증가되었다(대조군보다 300%). 장기간 가스트린 처리는 수준을 ~60%만큼 유의적으로 감소시켰다. 난소 적출술은 이러한 정상화된 PTH 수준을 역전시켰다. 이러한 결과를 통해 (에스트로겐 손실과 일치하는) 난소 적출술 매개의 PTH 방출의 활성화와, 이것이 생체내 모델에서 단기간 고가스트린혈증에 의해 증폭된다는 것을 확인할 수 있었다. 장기간 고가스트린혈증은, 난소 적출된 동물에서도 또한 관찰되는 효과인 것으로서, PTH 방출을 감소시키는 것으로보였다. 상기 기전은 장기간 가스트린 자극에 노출된 PTH 선에서 CCK2 수용체 또는 그의 신호전달 반응의 하향 조절을 반영할 수 있다. 상기 효과는 에스트로겐 손실을 무효화하며, 이는 가스트린이 PTH 선 기능에 있어 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다. 평균±SEM, *p<0.05 대 대조군 동물, #p<0.05 대 OVX 단독. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 26은 정상가스트린혈증 및 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델의 위에서의 신경내분비 관련된 전사체의 발현을 보여주는 일련의 그래프(26A-26D)이다. 난소 적출된(OVX; n=8) 마스토미스와 비교된 정상 마스토미스(n=11)(상단), 및 OVX 및 단기간(n=4) 및 장기간(n=4) 고가스트린혈증 OVX-동물 사이(하단)의 위 점막의 PCR 결과. 난소 적출술은 위 점막 CgA(4배) 및 HDC(~6배) 발현을 유의적으로 증가시켰다(26A). 단기간 및 장기간 고가스트린혈증 중 어느 것도 OVX 매개 CgA 합성에 대해 임의의 추가적인 영향을 미치지 않았다(4.3배인 것과 비교하여 2.8-4.2배)(26B). 단기간 고가스트린혈증은 가스트린 발현(~40배 - 26C) 및 HDC(~40배 - 26D)를 상승시켰다. 장기간 고가스트린혈증은 가스트린 뿐만 아니라, HDC, 둘 모두를 상승시켰지만, 이러한 효과는 ECL 세포 유래 HDC 발현에서 가장 뚜렷하게 나타났다(~45배 - 26D). 이러한 결과를 통해 에스트로겐이 HDC의 ECL 세포 전사를 조절하고(이로써, 히스타민 합성을 조절하며), 가스트린 합성이 유사하게 에스트로겐에 의해 조절된다는 것이 확인할 수 있었다. 순환 가스트린은 추가로 발현을 상향 조절시킨다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. #p<0.05 대 OVX. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 =단기간 고가스트린혈증, 16주 =장기간 고가스트린혈증.
도 27은 정상가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델의 위에서의 칼슘 축 관련 수용체, PTH1R, ERα 및 CaSR의 발현을 보여주는 그래프이다. 난소 적출된(OVX) 마스토미스와 비교된 정상 마스토미스로부터의 위 점막의 PCR 결과이다. 난소 적출술은 안드로겐 수용체(~6배) 뿐만 아니라, 에스트로겐 수용체 둘 모두(ESR1 및 ESR2, 둘 모두 ~4배)의 위 점막 발현을 증가시켰다. CaSR 및 PTH1R 또한 에스트로겐 손실에 의해 증가되었다(각각 5배 및 4배). 이러한 결과를 통해 에스트로겐 손실이 칼슘 감지 및 부갑상선:난소 축과 관련된 전사체의 상향 조절과 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 순환 가스트린은 발현을 추가로 상향 조절시킨다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. CON = 모의 수술을 받은 대조군 동물(n=11), OVX=난소 적출술(n=8). AR = 안드로겐 수용체, ESR = 에스트로겐 수용체, CaSR = 칼슘 감지 수용체, PTH1R = 부갑상선 1형 수용체.
도 28은 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델의 위에서의 칼슘 축 관련 수용체, PTH1R, AR, ERα 및 CaSR의 발현을 보여주는 일련의 그래프(28A-E)이다. OVX 및 단기간(n=4) 및 장기간(n=4) 고가스트린혈증 OVX 동물로부터의 위 점막의 PCR 결과. 단기간 및 장기간 고가스트린혈증 동물, 둘 모두에서 난소 적출술 유도성의 안드로겐 수용체 상승을 정상화시켰는데, 이 효과는 단기간 동물에서 더 뚜렷하게 나타났다(28A). 두 에스트로겐 수용체 모두에 대해서 유사한 결과가 관찰되었다(28B, C). CaSR(28D) 및 PTH1R(28E)은 고가스트린혈증에 의해 유의적으로 감소되었다. 이러한 결과를 통해 위 점막에서 난소 적출술에 의해 상향 조절된, 칼슘:골 축과 관련된 수용체의 발현은 단기간 및 장기간 고가스트린혈증, 둘 모두에 의해 "정상화된다"는 것을 확인할 수 있었다. 이는 높은 가스트린 환경에서의 칼슘 감지를 조절 또는 재조정하고자 하는 생리학적 시도를 반영한다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출된 동물, #p<0.05 대 단기간 고가스트린혈증 동물. CON =대조군 동물, OVX =난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증. AR = 안드로겐 수용체, ESR = 에스트로겐 수용체, CaSR = 칼슘 감지 수용체, PTH1R =부갑상선 1형 수용체.
도 29는 해면질 골 및 피질 골의 마이크로 전산화 단층 촬영(마이크로CT) 특징을 보여주는 일련의 스크린 숏(29A-H)이다. 대조군 골(29A)과 비교하였을 때, 난소 적출된 동물로부터의 해면질 골은 유의적인 손실(29B)을 보였다. 단기간(29C) 및 장기간(29D) 고가스트린혈증 둘 모두가 이를 감소시켰는데, 상기 효과는 장기간 고가스트린혈증 동물에서 더욱 명백하게 나타났다. 피질 골에서, 난소 적출술은 정상 동물, 난소 적출된 동물(OVX) 및 각각 8 및 16주 동안 록스티딘으로 처리된 OVX 동물로부터의 해면질 골 및 피질 골의 영상과 관련이 있었다. OVX 이후의 골 손실, 특히, 대퇴골의 해면질 영역에서의 골 손실이 주목된다. 일부 측면에서, 이는 가스트린 상승에 의해 증가될 수 있다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 30은 정상가스트린혈증 및 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델 중 해면질 골 및 피질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프(30A-D)이다. 해면질 밀도는 정상 동물과 비교하였을 때 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다(~50%)(30A). 이는 장기간 고가스트린혈증에 의해 증폭되었다(85%). 해면질 부피 또한 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다(~50%)(30B). 이는 장기간 고가스트린혈증에 의해 증폭되었다(~70%). 피질 골 밀도는 난소 적출술에 의해 감소되지는 않았지만, 장기간 고가스트린혈증 동물에서는 유의적으로 더 낮았다(~5%, 30C). 피질 부피는 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다(~30%)(30D). 이는 단기간 고가스트린혈증에 의해 증폭되었다(~30%). 이러한 결과는 가스트린이 난소 적출술 모델에서 골 손실을 증폭시키고, 골다공증성 표현형과 일치하는 마이크로CT 특징을 유도한다는 것을 입증한다. 장기간 고가스트린혈증의 효과는 주로 해면질 변경으로 반영된다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 31은 정상가스트린혈증 및 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델에서의 피질 골 중 골내막 및 골막 크기의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프(31A-D)이다. 골내막 반경은 정상 동물과 비교하였을 때 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다(~20%)(31A). 이는 단기간 고가스트린혈증에 의해 유의적으로 증폭되었다(30%). 골내막 둘레 또한 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다(~18%)(31B). 이는 단기간 고가스트린혈증에 의해 유의적으로 증폭되었다(~27%). 유사하게, 골막 반경이 난소 적출된 동물에서 감소되었으며(~20%, 31C), 이 효과는 단기간 고가스트린혈증에 의해 유의적으로 증폭되었다(~30%). 골막 둘레 또한 난소 적출술에 의해 감소되었으며(~20%), 이 효과는 단기간 고가스트린혈증에 의해 증폭되었다(~30%)(31D). 이러한 결과는 가스트린이 피질 골 크기를 증폭시키며, 이 효과는 주로 단기간 고가스트린혈증에 의해 가속화된다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 32는 골 광물화 및 흡수 강 뿐만 아니라, 파골세포인 세포의 개수 및 위치를 확인시켜 주는, 난소 적출된 마스토미스로부터의, 톨루이딘 블루, TRAP로 염색된 대퇴골을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. TRAP 염색은 적혈구를 나타내고; 파골세포는 적색으로 염색된 다핵 세포(황색 화살표 표시)이다. 좌측 패널(100x 확대 배율), 우측 패널(400x 확대 배율). RC = 흡수 강.
도 33은 정상가스트린혈증 및 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델로부터의 대퇴골의 인스트론 4점 굽힘 결과를 보여주는 일련의 그래프(33A-D)이다. 강성도는 난소 적출술에 의해 증가되었고(~15%), 이 효과는 장기간 고가스트린혈증 에 의해 유의적으로 증폭되었다(33A). 단기간 고가스트린혈증은 정상 수준과 비교하여 강성도 감소와 관련이 있었다. 뼈를 골절시키는 최대 하중은 난소 적출된 동물에서 유의적으로 더 낮았다(~20% - 33B). 고가스트린혈증은 이러한 변경을 보이지 않았지만, 장기간 고가스트린혈증 동물은 단기간 동물과 비교하였을 때, 뼈를 골절시키는 데 더 큰 하중을 필요로 하였다. 골절 하중은 유사하게 난소 적출된 동물에서 감소되었고(~25%), 가스트린에 의해 변경되지 않았다(33C). 그러나, 장기간 고가스트린혈증 동물은 단기간 고가스트린혈증 동물보다 골절시키는 데 더 높은 하중을 필요로 한다. 뼈를 골절시키는 데 필요한 총 운동량은 난소 적출된 동물에서 증가되었다(~20%)(33D). 장기간 고가스트린혈증은 운동량을 변경시키지 않은 반면, 단기간 고가스트린혈증 동물로부터의 골은 골절시키는 데 ~50% 더 낮은 운동량을 필요로 하였다. 이러한 결과는 난소 적출술 이후 골의 강도의 단기간 가스트린(약한 골 초래) 및 장기간 가스트린(강직성인 골)에 의해 차별적인 영향을 받는다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 34는 정상가스트린혈증 및 고가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델에서 골의 전체 강도를 보여주는 일련의 그래프(34A-E)이다. 극 관성 모멘트(pMOI)는 난소 적출된 동물에서 유의적으로 감소되었다(25%, 34A). 이러한 비틀림 하중 파괴 측정값은 단기간 고가스트린혈증에 의해 특이적으로 증폭되었다(~50%). pMOI는 강성도(R²=0.23 - 34B), 최대 하중(R²=0.33 - 34C) 및 골절 하중(R²=0.3 - 34D)과 유의적인 상관관계를 가졌다. 총 운동량은 pMOI와 상관관계가 없었다(34E). 이러한 결과는 난소 적출술 이후의 골의 비틀림 강도가 감소되고, 단기간 가스트린이 이러한 파라미터를 특이적으로 증폭시킨다는 것을 확인시켜준다. 강성도 및 최대/골절 하중과의 전반적인 상관관계는 난소 적출술이 마스토미스에 미치는 영향을 반영하는 것이다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증.
도 35는 정상가스트린혈증 마스토미스 난소 적출술 모델에서 피질 유래 골수 중의 골 재형성 관련 전사체의 발현을 보여주는 일련의 그래프(35A-I)이다. 난소 적출된(OVX) 마스토미스와 비교되는 정상 마스토미스로부터의 골수의 PCR 결과. 난소 적출술은 TCF4(35C - TGFβ 매개 골 형성에 관여), IGF-1(35D - 골 형성), PTGS2(35E - 염증) 또는 RANKL(35F - 골 손실)은 아니지만, ALOX5(35A - 염증: ~20%) 및 RUNX2(29B - 골아세포 분화: ~100% - 35B)의 발현을 유의적으로 감소시켰다. CXCL12(35G - 골아세포 활성화: ~20%), PPARγ(35H - 지방세포 분화: ~60%) 및 HIF-1a(35I - 저산소증 매개 골 손상: ~250%)에서는 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 에스트로겐 손실이 재형성 및 골 손실과 관련된 골수 유래의 전사체의 상향 조절과 관련이 있다는 것을 확인시켜 준다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. CON = 모의 수술을 받은 대조군 동물(n=11), OVX=난소 적출술(n=8).
도 36은 난소 적출된 마스토미스 모델에서 가스트린 매개 골 표현형 변경의 개요를 보여주는 차트이다. 난소 적출술만을 단독으로 받은 것(정상가스트린혈증 동물, 에스트로겐 감소, PTH 상승, 골다공증성 특징, 예컨대, 강직성이고, 약한 골)과 비교하여, 단기간 고가스트린혈증 동물은 더 낮은 비틀림 강도와 함께 더 약한 골과 관련된 감소된 피질 골 특징을 보였다. 이러한 표현형은 난소 적출술만을 단독으로 받은 것에서 더욱 뚜렷하게 나타났다. (정상 PTH를 보이는) 장기간 고가스트린혈증 동물에서, 해면질 골 손상은 유의적으로 강직성인 골을 유도하는 것으로 관찰되었다. 이러한 표현형은 난소 적출술만을 단독으로 받은 것에서 더욱 뚜렷하게 나타났다. pMOI = 극 관성 모멘트, PTH = 부갑상선 호르몬.
도 37은 난소 적출된 마우스 모델에서 가스트린 넉아웃, 히스티딘 데카르복실라제 넉아웃 또는 이중 넉아웃이 순환 호르몬 수준에 미치는 효과를 보여주는 일련의 그래프이다. 에스트로겐 수준은 모든 동물에서 난소 적출술에 의해 ~50%만큼 유의적으로 감소되었다. 가스트린 수준은 난소 적출술에 의해 영향을 받지 않았지만, HDC KO 동물은 가스트린 KO 또는 이중 KO 동물에 비하여 ~3배 증가된 수준을 발현하였다. PTH는 가스트린 KO 동물에서 유의적으로 감소되었다(~80%). 이에 반해, HDC 및 이중 KO 동물, 둘 모두에서 난소 적출술 이후 수준은 유의적으로 증가되었다(~100%). 이러한 결과는 에스트로겐 손실이 가스트린 KO 동물에서 PTH 방출을 활성화시키지 못한다는 것을 입증한다. 이는 가스트린이 부갑상선에서 에스트로겐의 기능을 변형시킨다는 것을 시사한다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. G = 가스트린 KO, GH = 가스트린/HDC 이중 KO, H = HDC KO, KO = 넉아웃, N = 난소 적출술을 받지 않은 것, O = 난소 적출술을 받은 것.
도 38은 난소 적출된 마우스 넉아웃 모델의 위에서 신경내분비 및 칼슘 감지 수용체의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. 기저부에서, 가스트린 KO 및 난소 적출술의 조합이 CCK2(ECL 세포 가스트린 반응: ~3배) 및 HDC(ECL 히스타민 합성: ~20배)를 유의적으로 증가시켰다. 이에 반해, 난소 적출된 HDC KO 마우스의 기저부에서는 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 방에서, CaSR은 난소 적출된 가스트린 KO 동물의 경우에 유의적으로 감소된 반면(~60%), CaSR(~60%) 뿐만 아니라, 가스트린, 이 둘 모두 발현 그 자체(~70%)가 난소 적출된 HDC KO 마우스의 방에서 감소되었다. 한 측면에서, 이는 가스트린 KO 동물에서 난소 적출술 및 에스트로겐 손실이 유의적으로 ECL 세포를 활성화시키고, G 세포의 칼슘 감지 반응을 감소시킨다는 것을 반영한다. HDC KO 동물에서 난소 적출술의 효과는 방으로 제한된다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. G = 가스트린 KO, H = HDC KO, KO = 넉아웃, N = 난소 적출술을 받지 않은 것, O = 난소 적출술을 받은 것
도 39는 난소 적출된 마우스 모델 중 피질 및 해면질 측정에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프(39A-F)이다. 가스트린 KO 동물에서, 골내막 반경(39A) 및 둘레(39B), 둘 모두 난소 적출술 이후에 유의적으로 증가되었다(~30%). 이는 에스트로겐 손실 및 가스트린의 부재의 조합이 피질 골 두께를 증가시켰다는 것을 반영한다. 이러한 환경하에서, 가스트린 손실은 골에서 부정적인 영향을 미치지는 않는다. HDC KO 동물에서, 난소 적출술이 피질 골 부피를 유의적으로 감소시켰지만(~25% - 39C), 이를 통해 골의 비틀림 강도는 더 높아졌다(39D). 이를 통해 히스타민 손실이 골에 미치는 에스트로겐 효과를 악화시킨다는 것을 확인할 수 있다. 이중 KO 또한 해면질 골(~50% - 39E) 및 피질 골 부피(~15% - 39F)의 감소와 관련이 있었지만, 이것은 유의적인 골 쇠약으로 해석되지 않았다. 이를 통해 비록 골 표현형에 있어서 약간의 변화가 있기는 하지만, 가스트린 및 히스타민의 손실의 조합이 골의 생물학적 성질을 유의적으로 변경시키지는 않는다는 것을 확인할 수 있었다. G = 가스트린 KO, GH = 가스트린/HDC 이중 KO, H = HDC KO, N = 난소 적출술을 받지 않은 것, O = 난소 적출술을 받은 것.
도 40은 넉아웃 마우스 난소 적출술 모델에서 피질 유래 골수 중의 골 재형성 관련 전사체의 발현을 보여주는 일련의 그래프(40A-D)이다. 난소 적출된 마우스와 비교하여 난소 적출되지 않은 마우스로부터의 골수 세포의 PCR 결과. 난소 적출술은 오직 가스트린 KO 동물에서만 ALOX5(40A - 염증: ~100%), CXCL12(40B - 골아세포활성화: ~70%), HIF-1a(40C - 저산소증 매개 골 손상: ~5배) 및 IGF-1(40D - 골 형성: ~100%)의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 이러한 결과는 에스트로겐 손실 및 가스트린의 조합이 재형성과 관련된 골수 유래 전사체의 상향 조절과 관련이 있다는 것을 시사한다. 값은 난소 적출되지 않은 동물의 것으로 정규화하였다. 평균±SEM, *p<0.05 대 난소 적출되지 않은 동물. G = 가스트린 KO, GH = 가스트린/HDC 이중 KO, H = HDC KO, N = 난소 적출술을 받지 않은 것, O　= 난소 적출술을 받은 것.
도 41은 난소 적출된 마우스 넉아웃 모델에서의 골 표현형 변경의 개요를 보여주는 차트이다. "골감소증 유발성" 호르몬 환경(에스트로겐 손실, PTH 상승)에도 불구하고, 가스트린 넉아웃 동물은 난소 적출술 이후에 골내막 특징의 증가 및 상대적으로 정상적인 골 표현형을 보였다. HDC KO 마우스는 감소된 피질 부피를 보였지만, 골의 강도는 더 컸다. 이중 넉아웃 또한 해면질 및 피질 특징에 있어 약간의 변화를 보였고 - 이는 골 강도를 변경시키지는 않았다. 난소 기능의 손실 및 PTH 상승에도 불구하고, 조합 손실(가스트린 및 히스타민 둘 모두)은 비정상적인 골 표현형을 일으키지는 않았다. 가스트린 감소는 골 표현형을 보호하는 것으로 보였다. GAS = 가스트린, pMOI = 극 관성 모멘트, PTH = 부갑상선 호르몬.
도 42는 대조군, 난소 적출된 CD-1 마우스 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 CD-1 마우스 중 해면질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프이다. BV/TV 비, 결합 밀도(Conn-Dens), 해면질 개수(TB.N), 골 표면적 및 밀도 모두 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다. 구조 모델 지수(SMI), 해면질 두께(Tb.Th) 및 해면질 간격(Tb.Sp) 모두 증가되었다. 가스트린 길항제 처리가 해면질 두께 및 간격을 제외한, 상기 효과들 대부분을 역전시켰다. 이러한 결과는 가스트린 수용체를 선택적으로 억제시키는 것이 난소 적출술 모델에서 골 손실을 호전시키고, 정상적인 표현형과 일치하는 마이크로CT 특징을 유도한다는 것을 입증한다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 43은 대조군, 난소 적출된 CD-1 마우스 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 CD-1 마우스 중 피질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프이다. 피질 밀도 및 골 표면적(BS) 모두 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다. 피질 두께(Ct.TH)는 증가되었다. 가스트린 길항제 처리가 밀도에 미치는 효과는 역전시켰지만, 두께는 변경시키지 않았다. 이러한 결과는 가스트린 수용체를 선택적으로 억제시키는 것이 난소 적출술 모델에서 피질 밀도 손실을 역전시킨다는 것을 입증한다. CON = 대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 44는 대조군, 비처리 마우스 및 가스트린 길항제로 처리된 마우스에서의 전반적인 골 강도를 보여주는 일련의 그래프이다. 난소 적출술은 강성도, 항복 강성도, 최대(최대(max)) 하중 및 파괴시키기 위한 골절 하중을 비롯한, 골 강도를 유의적으로 감소시켰고, 뼈를 파괴시키는 필요한 총 운동량을 증가시켰다. 가스트린 길항제 처리가 하중을 제외한, 상기 효과를 역전시켰다. 이러한 결과를 통해 난소 적출술 이후의 골 강도는 감소되고, 가스트린 수용체를 표적화하는 것이 에스트로겐 손실 매개 효과를 호전시켰다는 것을 확인할 수 있었다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 45는 대조군, 및 가스트린 길항제(OVX+GA) 또는 비히클(OVX)로 처리된 난소 적출된 CD-1 마우스로부터의, 톨루이딘 블루, TRAP로 염색된 대퇴골을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 골 광물화(BM: 감소), 흡수 강(RC: 증가) 및 파골세포(염색된 다핵 세포(2개의 화살표 표시): 증가) 패턴은 OVX에 의해 영향을 받았다. 이러한 효과는 약물 처리에 의해 역전되었다. 한 측면에서, 이는 CCK2 수용체를 표적화하는 것이 낮은 에스트로겐 수준과 상관없이 골 형태를 정상화한다는 것을 의미힌다.
도 46은 난소 적출된 마우스 모델에서 가스트린 길항제 처리가 순환 호르몬 수준에 미치는 효과를 보여주는 일련의 그래프이다. 난소 적출술에 의해 에스트로겐은 유의적으로 감소된 반면, PTH 및 가스트린, 둘 모두 상승되었다. 가스트린 길항제 처리가 PTH에는 어떤 영향도 미지치 않은 반면, 가스트린 수준은 정상화시켰다. 난소 적출술이 3개의 골 마커, PINP, CTX1 및 오스테오칼신 모두 증가시켰다. 가스트린 길항제는 각각의 이들 효과를 억제시켰다. 본 발명자들은 이러한 결과는 난소 적출술에 유발된 골 활성의 마커는 가스트린 수용체를 표적화함으로써 정상화된다는 것을 반영하는 것이라고 해석하였다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 47은 대조군, 난소 적출된 CD 래트 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 CD 래트 중 해면질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프이다. BV/TV 비, 해면질 개수(TB.N), 해면질 두께(Tb.Th), 골 표면적 및 밀도 모두 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다. 구조 모델 지수(SMI), 해면질 두께(Tb.Th) 및 해면질 간격(Tb.Sp) 모두 증가되었다. 가스트린 길항제 처리가 SMI을 제외한, 상기 효과들 대부분을 역전시켰다. 이러한 결과는 가스트린 수용체를 선택적으로 억제시키는 것이 CD 래트에서 골 손실을 호전시키고, 정상적인 표현형과 일치하는 마이크로CT 특징을 유도한다는 것을 입증한다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 48은 대조군, 난소 적출된 CD 래트 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 CD 래트 중 피질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프이다. 피질 밀도 및 골 표면적(BS) 및 극 관성 모멘트(pMOI) 모두 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소되었다. 가스트린 길항제 처리가 밀도에 미치는 효과는 역전시켰고, BV/TV 비 뿐만 아니라, 피질 두께(Ct.TH) 증가, 둘 모두와 관련이 있었다. 이러한 결과는 가스트린 수용체를 선택적으로 억제시키는 것이 난소 적출술 모델에서의 피질 밀도 손실을 역전시킨다는 것을 입증한다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 49는 대조군, 비처리 래트 및 가스트린 길항제로 처리된 래트에서의 전반적인 골 강도를 보여주는 일련의 그래프이다. 난소 적출술은 강성도, 항복 강성도 뿐만 아니라, 파괴시키기 위한 골절 하중을 비롯한, 골 강도를 유의적으로 감소시켰다. 가스트린 길항제 처리가 상기 효과를 역전시켰다. 이러한 결과를 통해 난소 적출술 이후의 골 강도는 감소되고, 가스트린 수용체를 표적화하는 것이 상기 에스트로겐 매개 효과를 호전시켰다는 것을 확인할 수 있었다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 50은 대조군, 및 가스트린 길항제(OVX+GA) 또는 비히클(OVX)로 처리된 난소 적출된 CD 래트로부터의, 톨루이딘 블루, TRAP로 염색된 대퇴골을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 골 광물화(가변적으로 감소), 흡수 강(RC)(증가) 및 파골세포(염색된 다핵 세포(2개의 화살표 표시): 증가) 패턴은 OVX에 의해 영향을 받았다. 이러한 효과는 약물 처리에 의해 역전되었다. 한 측면에서, 이는 CCK2 수용체를 표적화하는 것이 낮은 에스트로겐 수준과 상관없이 골 형태를 정상화한다는 것을 반영힌다.
도 51은 난소 적출된 래트 모델에서 가스트린 길항제 처리가 순환 호르몬 수준에 미치는 효과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 난소 적출술에 의해 에스트로겐은 유의적으로 감소된 반면, PTH은 상승되었다. 가스트린 길항제 처리가 유의적인 영향을 미치지는 못했다. 난소 적출술이 PINP 및 오스테오칼신을 증가시켰다. 가스트린 길항제는 이들 효과를 억제시켰다. 한 측면에서, 이러한 결과는 난소 적출술에 유발된 골 활성의 마커는 가스트린 수용체를 표적화함으로써 정상화된다는 것을 입증한다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 52는 대조군, 난소 적출된 마스토미스 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 마스토미스 중 해면질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 일련의 그래프이다. BV/TV 비, 해면질 개수(TB.N), 밀도 및 골 표면적 모두 난소 적출술에 의해 유의적으로 감소된 반면, 구조 모델 지수(SMI), 및 해면질 간격(Tb.Sp)은 증가되었다. 가스트린 길항제 처리가 상기 효과를 역전시켰고, 해면질 두께(Tb.Th) 증가와 관련이 있었다. 이러한 결과는 가스트린 수용체를 선택적으로 억제시키는 것이 마스토미스에서 골 손실을 호전시키고, 정상적인 표현형과 일치하는 마이크로CT 특징을 유도한다는 것을 입증한다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 53은 대조군, 난소 적출된 마스토미스 및 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출술을 받은 마스토미스 중 피질 골에서의 마이크로CT 측정을 보여주는 한 세트의 그래프이다. 측정된 카테고리 중 어느 것도 난소 적출술에 의해 유의적인 영향을 받지 않았거나, 가스트린 길항제 처리에 의해 변경되지 않았다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM.
도 54는 대조군, 비처리 마스토미스 및 가스트린 길항제로 처리된 마스토미스에서 전반적인 골 강도를 보여주는 한 세트의 그래프이다. 난소 적출술은 강성도, 항복 강성도 뿐만 아니라, 최대 하중 및 파괴시키기 위한 골절 하중을 비롯한, 골 강도를 유의적으로 감소시켰다. 총 운동량은 증가되었다. 가스트린 길항제 처리가 상기 효과를 역전시켰다. 이러한 결과를 통해 난소 적출술 이후의 골 강도는 감소되고, 가스트린 수용체를 표적화하는 것이 에스트로겐 매개 효과를 호전시켰다는 것을 확인할 수 있었다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, 8주 = 단기간 고가스트린혈증, 16주 = 장기간 고가스트린혈증. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 55는 대조군, 및 가스트린 길항제(OVX+GA) 또는 비히클(OVX)로 처리된 난소 적출된 마스토미스로부터의, 톨루이딘 블루, TRAP로 염색된 대퇴골을 보여주는 한 세트의 현미경 사진이다. 골 광물화(BM: 감소), 흡수 강(RC: 증가) 및 파골세포(염색된 다핵 세포(2개의 화살표 표시): 증가) 패턴은 OVX에 의해 영향을 받았다. 이러한 효과는 약물 처리에 의해 역전되었다. 본 발명자들은 이는 CCK2 수용체를 표적화하는 것이 낮은 에스트로겐 수준과 상관없이 골 형태 및 구성적 가스트린 수용체 활성화를 정상화한다는 것을 반영하는 것이라고 해석하였다.
도 56은 난소 적출된 마스토미스 모델에서 가스트린 길항제 처리가 순환 호르몬 수준에 미치는 효과를 보여주는 한 세트의 그래프이다. 난소 적출술에 의해 에스트로겐은 유의적으로 감소된 반면, PTH 및 가스트린은 상승되었다. 가스트린 길항제 처리가 PTH 및 가스트린에 미치는 효과를 역전시켰다. 난소 적출술이 PINP, CTX-1 및 오스테오칼신을 유의적으로 증가시켰다. 가스트린 길항제는 이들 효과를 억제시켰다. 본 발명자들은 이러한 결과는 난소 적출술에 의해 유발된 골 활성의 마커는 가스트린 수용체를 표적화함으로써 정상화된다는 것을 반영하는 것이라고 해석하였다. CON =대조군 동물, OVX = 난소 적출된 동물, OVX+GA = 가스트린 길항제로 처리된 난소 적출된 동물. 평균±SEM. *p<0.05 대 CON, **p<0.05 대 OVX 단독.
도 57은 본원에 입증된 결과에 기초한 골 재형성의 조절을 위한 통합 모델을 보여주는 것이다. 난소 기능(및 에스트로겐 분비) 및 부갑상선 PTH 분비의 효과는 방 가스트린 분비 G 세포에 의해 조절되는 것으로 본원에 제시되어 있다. 위 중의 주요 칼슘 감지 세포 및 위 내에서의 PTH 및 에스트로겐 신호전달, 둘 모두에 대한 관계와 같이, 가스트린은 골 재형성(파골세포 활성화)에 미치는 그의 음성 효과를 통해 골 표현형을 조절하는 중요한 조절인자이다. 이 가스트린의 역할은 칼시토닌 및 갑상선에 의해 변형될 수 있고, ECL 세포로부터의 히스타민 방출에 의해 증폭될 수 있다. 더 진한 회색선 = 자극 효과, 더 옅은 회색선 = 억제 효과.
도 58은 신체에서 가스트린/CCK2 수용체 표적의 분포를 보여주는 다이어그램이다. 수용체는 갑상선(부갑상선 포함)에서, 위 내에서 뿐만 아니라, 골에서 발현된다. CCK2는 갑상선에서 칼시토닌 분비 C 세포 뿐만 아니라, 부갑상선에서 PTH 분비 세포, 둘 모두에서 발현된다. CCK2는 소화관에서는 히스타민 분비 ECL 세포에서 발현되지만, 골에서 수용체 발현은 골아세포 및 골 전구 세포를 비롯한 다중 세포 상에 존재할 수 있다. 특이적인 길항제로 가스트린/CCK2 수용체를 표적화하는 것이 직접적으로(골) 또는 위 및 갑상선/부갑상선 축을 통해 간접적으로 골 질환, 예컨대, 골다공증을 억제시킬 것이다. PTH = 부갑상선.

한 실시양태에 따라, 본 출원은 골 질환 또는 병태를 치료, 안정화, 및/또는 그의 진행을 예방하기 위한 신규한 수단을 제공한다. 상기의 신규한 수단은 호르몬 가스트린이 골 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 조절함으로써 골 손실을 촉진시키고, 그 결과로 골다공증성 변경과 일치하는 골 병태생리가 일어난다는 관찰 결과에 의해 뒷받침된다(도 57 참조).

본 출원의 한 측면에 따라, CCK2 수용체를 표적화하는 가스트린 길항제를 사용하여 상기 가스트린 효과를 차단하는 것이 골다공증을 특징으로 하는 골 질환 또는 병태를 보이는 동물 모델에서 유익한 효과를 발휘한다는 것을 발견하게 되었다.

따라서, 본 출원은 골 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 가스트린 표적화제, 예컨대, 가스트린 길항제, 또는 가스트린 활성을 길항시키는 작용제의 용도에 관한 것이다(도 58 참조).

A. 정의

본원에서 사용되는 바, "병태"라는 용어는 일반적으로 질환, 이벤트, 또는 건강 상태 변화를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "골 질환 또는 병태"라는 용어는 골량 및/또는 골 성장을 증가시킴으로써 치료될 수 있는, 골 이상과 관련된 질환 또는 병태를 의미한다. 예를 들어, 골 질환 또는 병태로는 원발성 골다공증; 속발성 골다공증; 불완전 골생성증; 골형성장애; 골감소증; 파제트병(Paget's disease); 골 전이, 방사선 요법, 화학요법에 의해 발생된 골용해성 병변; 치주 질환; 치조골 손실; 부동화 또는 성 호르몬 결핍에 기인하는 골 손실; 전이성 암에 기인하는 골 손실; 염증성 질환에 의해 유발된 골 및 연골 손실; 골관절염; 절골술 골 손실; 소아 특발성 골 손실; 척추 만곡; 및 뼈 골절을 포함할 수 있다. 골 질환 또는 병태는 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태일 수 있다. 골 질환 또는 병태는 또한 하기 문단에 기술되어 있는 바와 같이, 특정 상황하에 있는 피험체에 의해 나타날 수도 있다.

본원에서 사용되는 바, "피험체"라는 용어는 포유동물, 바람직하게, 인간을 의미한다. 예를 들어, 이들 피험체로는 i) 노인 (남성 또는 여성); i) 노인 (남성 또는 여성); ii) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성, iii) 자연 고가스트린혈증(예컨대, 신생물성, 또는 위 점막 위축증과 관련된 고가스트린혈증)을 앓는 임의의 개체 또는 iv) 산 억제성 약물요법(모든 양성자 펌프 억제제, 또는 모든 단기 또는 장기 작용성 히스타민 2 수용체 길항제를 비롯한 작용제 부류) 사용 결과로서 발생하는 고가스트린혈증을 앓는 임의의 개체 또는 v) 위 절제술을 받은 개체인 피험체를 포함할 수 있다. 상기 모든 경우에서, 골 질환 또는 병태는 상기 피험체에서 가스트린 표적화제 부류의 사용에 의해 호전될 수 있다. 예를 들어, 가스트린 표적화제 부류는 CCK2 수용체를 표적화하는 가스트린 길항제이다.

본원에서 사용되는 바, "가스트린 표적화제"라는 용어는 가스트린 길항제, 예컨대, 가스트린 표적화제 또는 가스트린 수용체 표적화제 뿐만 아니라, 가스트린 또는 가스트린 수용체 길항제, 예를 들어, CCK2 수용체를 표적화하는 작용제를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량"이라는 용어는 골 질환 또는 병태를 치료하거나, 그의 효과를 호전시키거나, 또는 그를 예방하고자 하는 목적을 달성할 수 있거나, 또는 질환 또는 병태 중증도 및 발병 빈도를 개선시킬 수 있는, 본 출원에 기술된 바와 같은 가스트린 표적화제의 양을 의미한다. 골 질환 또는 병태 중증도 개선은 질환 또는 병태의 역전 뿐만 아니라, 질환 또는 병태의 진행을 저속화시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 상기 질환 또는 병태, 또는 본원에 기술된 질환 또는 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 진행, 발생, 발병, 또는 중증도를 완화시키거나, 그의 정지를 유도하거나, 또는 연기시키거나, 또는 감소시키거나, 또는 현존하는 비조절 또는 원치않는 증상을 호전시키거나, 추가 증상을 예방하거나, 또는 증상의 근본적인 대사상의 원인을 호전 또는 예방하는 것을 의미한다. 따라서, 본 용어는 질환 또는 증상을 앓거나, 또는 상기 질환 또는 증상이 발생할 잠재성이 있는 피험체에게 유익한 결과가 부여된다는 것을 의미한다. 피험체가 질환, 병태, 또는 질병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 부분적인 또는 전체적인 경감, 또는 감소, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 골 손실의 역전 또는 예방, 골량 손실의 역전 또는 예방, 뼈 골절 또는 그의 위험의 역전 또는 예방, 골 밀도의 증가 또는 그의 감소의 예방, 골 재형성 증가, 골 흡수 감소, 및/또는 골 재생을 경험하였을 때, 반응이 달성되는 것이다.

본원에서 언급된 수치 값과 관련하여 "약"이라는 용어는 언급된 수치 값 및 언급된 값의 ±10% 범위 내의 수치 값을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 수치 값의 범위를 언급할 때 "사이"라는 용어를 사용하는 것은 범위의 각 종점의 수치 값을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 길이가 10개의 염기쌍 내지 20개의 염기쌍 사이인 핵산 서열은 길이가 10개의 염기쌍인 핵산 서열 및 길이가 20개의 염기쌍인 핵산 서열을 포함한다.

B. 칼슘 감지 및 골 질환에서의 G 세포 및 가스트린 역할

골 손실 및 골절 위험이 높은 것을 특징으로 하는 골다공증은 특히 노인에서는 가장 흔한 질환 중 하나이며, 이는 전세계적으로는 대략 1억 여명의 사람이 병에 걸린 것으로 추정된다. 비록 난소 부전 및 골 탈광물화가 상기 질환에서 중요한 요소로서 널리 인식되고 있지만, 정확한 병인에 대해서는 여전히 불완전하게 해명된 상태이다. 도 1을 참조하면, 골 재형성의 공지된 호르몬 및 광물질 조절인자가 제시되어 있다.

정상적인 환경하에서 골 재형성은 강도 및 광물질 항상성(특히 칼슘)을 유지시키기 위하여 생리학적 또는 기계적 반응으로서 발생한다. 이는 골아세포 및 파골세포 활성에 의해 영향을 받는 형성 및 흡수의 상호 관련된 현상을 포함한다. 전형적으로, 이는 파골세포 전구체 활성화, 활성 흡수, 흡수 역전 및 새 골 형성을 포함하는 4 단계를 포함한다. 처음 두 단계는 2-4주가 소요되고, 마지막 단계는 완료되는 데 4-6개월이 소요된다.

골 재형성은 폐경전후기 여성 및 조기 폐경 후 여성에서 증가한 후, 이어서, 추가로 노화되면서 그 속도는 저속화되지만, 여전히 그 속도는 폐경 전 여성보다는 더 빠르다. 골 재형성은 또한 노인 남성에서도 증가되는 것으로 여겨진다.

도 2를 참조하여, 피질 골은 조밀하고, 고형이고, 골수강 주변을 감싸고 있다. 이는 외부 골막 표면 및 내부 골내막 표면을 가진다. 전형적으로, 해면질 골보다는 대사상 더 작은 활성을 띤다. 골막 표면 활성은 부가 성장 및 골절 수복에 중요하다. 골내막 표면은 골막 표면보다 더 높은 재형성 활성을 가지며, 이는 가능하게는 생체역학적 변형이 더 크거나, 인접한 골수 구획으로부터의 신호전달에의 노출이 더 큰 것의 결과이다.

피질 재형성의 증가는 피질 다공성을 증가시키고, 피질 골량을 감소시킨다. 골 흡수는 전형적으로 골내막 표면 상에서 골 형성을 초과하는 반면, 골 형성은 전형적으로 골막 표면 상에서의 골 흡수를 초과한다.

해면질 골은 골수 구획에 산재된 해면질 플레이트 및 로드로 된 벌집 모양과 유사한 망으로 이루어져 있다. 이는 피질 골보다 대사상 더 큰 활성을 띤다. 상기 골 유형에서의 전환이 광물질 대사 및 기계적 강도 유지를 위해서 가장 중요하다.

골 재형성의 생물학적 성질은 복잡하고, 다양한 활성화 인자, 예컨대, PTH, 에스트로겐, 성장 인자 및 염증성 시토카인 뿐만 아니라, 식이 섭취, 예컨대, 칼슘 및 비타민 D를 포함한다. 이를 통해 현재 관리를 위해 이용가능한 매우 광범위한 요법이 개발되게 되었다. 이는 호르몬 대체 요법, 비스포스포네이트, 고칼슘 및 비타민 D 식단, 스타틴, 섬유아세포 성장 인자 1, 또는 부갑상선 호르몬(PTH) 그 자체의 사용을 포함한다.

PTH는 흡수 과정을 통해 골 저장소로부터 Ca^{2 +}의 방출을 증진시키기 때문에, 이는 골 대사의 중요한 조절인자인 것으로 간주된다. 그러나, 파골세포가 PTH 수용체를 가지고 있지 않기 때문에, PTH의 효과는 간접적이다. 대신 PTH는 골아세포에 결합하여 RANKL의 발현을 유도한다. RANKL은 수용체 RANK를 통해 파골세포 전구체 세포를 활성화시켜 융합시킴으로써 골 흡수를 담당하는 새 파골세포를 형성한다.

골다공증에서의 PTH의 역할을 지지하는 증거는 PTH 값이 어린 성인보다 노인에서 더 높다고 보고한 여러 연구의 결과이다. 신장 기능 감소, 아마도 식욕 상실에 기인하는 칼슘(Ca^{2 +})의 덜 효율적인 장 흡수, PTH의 칼슘혈증 작용에 대한 저항성, 비타민 D 부족의 더 큰 유병률, 및 더욱 특히, 노인에서 관찰되는 위 pH 증가를 비롯한 다수의 인자가 더 높은 PTH 값의 원인이 된다고 제안되어 왔다.

후자의 것은 위 pH 상승을 동반하는 벽 세포괴의 손실(점막 위축증) 뿐만 아니라, 방 신경내분비 G 세포로부터의 가스트린 분비 증가, 둘 모두를 반영한다.

위 점막 완전성 및 기능의 연령 관련 변경이 노인의 위장병 호소에서 중요한 문제가 되고, 그뿐만 아니라, 이는 약물에 대한 감수성 증가, 출혈, 및 부적절하게 Ca²⁺ 및 철을 흡수하지 못하는 흡수 장애의 원인이 되는 것으로 간주된다.

Ca^{2 +}/PTH/비타민 D 축이 부수적으로 혈청 인 수준은 증가시키지 않으면서, 혈청 Ca^{2 +}를 증가시키기 위해 부갑상선, 신장, 골, 및 위장관의 기능을 조정함으로써 전신 Ca^{2 +} 항상성을 유지하는 것으로 간주된다. 상기 축은 주로 골격으로부터 Ca^{2 +}를 동원하고, 신장에 의해 Ca^{2 +}를 보존하고, 위장 Ca^{2 +} 흡수를 증가시킴으로써 저칼슘혈증으로부터 보호하도록 디자인되어 있다.

혈청 Ca^{2 +} 농도 감소에 대한 반응으로 부갑상선 중의 칼슘 감지 수용체(CaSR)는 PTH 분비를 증가시키는 반면, 신장 중의 PTH 분비는 신장 Ca^{2 +} 배출을 감소시킨다. 그러나, 칼슘 감지가 부갑상선에 한정되는 것은 아니며, CaSR은 방 가스트린 생산 G 세포를 비롯한, 각종의 다른 세포 유형에 존재한다. 상기 신경내분비 세포는 그의 위 위치를 고려하여 식이성 Ca^{2 +} 섭취를 감지하고, 그에 대해 반응하도록 독특하게 위치한다.

CaSR은 세포외 Ca^{2 +} 농도 변화를 검출하고, 적응 호르몬 반응 및 이온 수송 반응을 개시하여 전신 칼슘 항상성을 유지한다. 부갑상선, 갑상선 C 세포 및 신장은 현재 생리학상 관련된 CaSR 발현 부위를 나타내는 것으로 간주된다. 일반적으로, 낮은(<1 mM) 순환 세포외 Ca^{2 +}이 부갑상선 세포로부터의 PTH 분비에 대한 주된 자극이다. 더 높은 농도에서 Ca^{2 +}는 CaSR 인산화, 및 이어서, 불활성화를 통해 PTH 합성 및 분비를 억제시킨다.

CaSR은 양 소포곁 C 세포에서 및 수질성 갑상선 암종(MTC: medullary thyroid carcinoma) 세포주, TT에서 확인되었다. 후자의 것은 칼시토닌 분비와 함께 Ca²⁺에 대해 반응한다.

CaSR이 골아세포 및 파골세포에서 확인되기는 하였지만, 이들은 상기 세포에서 매우 낮은 수준으로 발현되기 때문에, Ca^{2 +} 감지에 대한 생리학적 역할은 불명확하다. 골 세포와 달리, 생리학상 관련된 CaSR은 위에서 확인되었다. 최근 CaSR을 클로닝하고, 인간 방 G 세포로부터 서열분석하였고, Ca^{2 +} 농도 > 2 mM에서 작용한다.

하기 섹션(1-8)은 본원 실시예에서 제시하는 연구에 관한 간략한 개요 및 논의를 제공한다. 이들 서브섹션은 실시예를 추가로 설명하기 위해 제공되는 것이며, 그에 포함된 결과 및 결론을 제한하고자 하는 것은 아니다.

1. 단리된 G 세포 연구

본원에서는 Ca^{2 +} 센서로서의 G 세포의 생리학적 역할을 입증한다(실시예 1, 도 3 참조). 일반적으로, 식사하는 동안 섭취된 칼슘(1-10 mM)이 가스트린 방출을 자극한다. 기계론적으로, 세포외 Ca^{2 +}는 칼슘 유도성 경로를 통해 가스트린 방출을 활성화하는 위 CaSR에 의해 흡수된다. 본원에서 제시한 결과를 통해 G 세포가 소화관/부갑상선 칼슘 항상성에서 중요한 신경내분비 세포라는 것이 추가로 확인된다.

G 세포 상의 PTH 수용체의 존재, 및 cAMP 활성화 이후의 PTH 매개 가스트린 방출을 확인하기 위한 연구를 수행하였다(도 4 참조). 본 연구는 다른 연구에 의해 뒷받침된다. 예를 들어, PTH 주입(40 단위/20 분)은 마취시킨 돼지에서 전신 고칼슘혈증을 유도하지 않고 방 및 혼합 정맥혈 중의 가스트린 수준을 증가시켰다. 또한, 천연 소 PTH 및 합성 인간 1-34 PTH(0.02-4 U/분)는 마취시킨 어린 돼지에서 가스트린 방출을 빠르고(10-30 분 이내), 현저하게(대략 10배) 증가시켰다.

17β-에스트라디올(ESRα 효능제)이 가스트린 방출을 억제시켰다는 것을 보여주는 연구 또한 단리된 가스트린 세포에서 수행하였다(도 6 참조). 에스트로겐의 비게놈 표적화 효과는 다른 세포 유형, 예컨대, 유방 조직에서도 잘 정의되어 있다. ERα 매개 MAPK 신호전달인 이러한 효과는 또한 G 세포에서 입증가능하며, 여기서, 에스트로겐이 가스트린 분비의 강력한 억제제가 된다.

이러한 정보는 폐경 상태와 일치하는 에스트로겐 환경을 변경시키는 것이 G 세포 기능(신호전달 및 분비)을 크게 변경/자극시킬 것이라는 것을 나타낸다. 이는 G 세포 기능 증가 및 높은 PTH를 포함하는 환경이 노화된 래트에 실제 존재한다는 이전 보고와 일치한다. 이러한 조합은 골다공증 발생과 관련이 있다고 널리 인정되고 있다.

추가의 시험관내 연구에서 가스트린 분비는 히스타민 및 세로토닌의 소화관 생산에 의해 조절될 수 있다는 것이 확인되었다. 골격계 조절에서 히스타민의 역할에 관한 제안은 불분명한 정보와 관련되어 있다. 비만 세포증 및 알레르기성 질환에서의 과량의 히스타민 방출은 골다공증 발생을 유도할 수 있다. 이에 반해, 히스타민은 파골세포 전구체 및 파골세포를 통하여 직접적으로, 및 골아세포에서 RANKL(파골세포 활성화 수용체)의 발현을 증가시킴으로써 간접적으로, 이 둘 모두로 골 흡수를 증가시킬 수 있다. 추가로, 생체내 연구에서, H1 및 H2 수용체 길항제는, 비록 모든 실험 모델에서 일관되게 재현되는 것은 아니지만, 골 조직에 대하여 보호 효과를 발휘할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 히스타민은 생체외 뿐만 아니라, 시험관내에서 가스트린 방출을 조절한다.

골 대사에서 세로토닌의 역할은 완전히 명확하지는 않다. 래트에서 세로토닌 주사는 세로토닌 매개 골아세포 증식(상기 세포는 5-HT₂ 수용체를 발현한다)을 통해 골 광물질 밀도를 증가시킨다. 동물 모델에서, 세로토닌은 Lrp5에 의존하는 방식으로 골 형성을 억제시키는 것으로 보였다. Lrp5는 속도 제한 세로토닌 합성 효소인 트립토판 하이드록실라제 1(Tph1: tryptophan hydroxylase 1)의 억제를 통해 세로토닌 생산을 제한한다. 그러나, 임상 연구에서, LRP5 돌연변이는 순환 세로토닌의 변화가 없는 것과 관련이 있으며, 환자는 높은 골량을 보인다. 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI: Serotonin re-uptake inhibitor)는 골아세포 증식과 관련이 있지만, 중년 여성에서의 SSRI의 사용은 골 손실의 속도 증가와는 관련이 없었다. 추가로, 카르시노이드 증후군에서 높은 순환 세로토닌은 임상적으로 유의적이게 더 낮은 골 밀도, 불량한 골 구조, 또는 더 낮은 골 형성 마커와와 관련이 없었다. 별법으로, 세로토닌의 임의의 효과는 G 세포를 통해 이루어질 수 있고; 가스트린 방출은 5-HT₃ 수용체에 의해 자극받게 된다. 그러므로, 아민은 G 세포에의 활성을 통하여 골 형성을 조절할 수 있다.

종합적으로 평가하였을 때, 본원에 제시된 데이터 및 관찰 결과, 예컨대, 루멘 칼슘 감지 수용체의 존재, 부갑상선 및 갑상선 기능 조절을 위한 수용체의 선택적 발현, 및 비타민 D 및 (히스타민 및 세로토닌에 의해 양성적으로 조절되는) 아민성 수용체 발현을 통해 G 세포가 소화관/부갑상선 칼슘 항상성 축에서 중요한 신경내분비 세포인 것으로서 확인된다.

2. 가스트린 표적 연구( 시험관내 )

본원에 제시된 연구에서는 어느 세포가 잠재적 가스트린 표적이 될 수 있는지를 조사한다. 추가로, 본 연구에서는 가스트린 세포가 가스트린 방출을 통해 칼슘 항상성 축을 조절할 수 있는지 여부를 조사하였다(실시예 2 참조).

PTH 주세포 중 CCK₂ 수용체의 존재 여부는 명확하지는 않지만, 다수의 생리학적 연구에서 제안되어 왔다. 단리된 소 부갑상선 세포에서, 고농도(>1 μM)의 가스트린은, PTH 방출을 위해 필요한 전제 조건인 cAMP 축적을 증가시켰다(실험 중 ~50%에서 40-60%).

조류 모델 또한 상기 관찰 결과를 지지하였다. 닭에서 (5주 동안 양성자 펌프 억제제(PPI), 오메프라졸(400 μM/kg/일)을 이용하여) 고가스트린혈증을 유도한 결과, PTH 선의 크기가 증가하였을 뿐만 아니라, PTH 전사도 증가하였다. 이러한 효과는 가스트린 주사(3주 동안 연속, 5 nmol/kg/시간)에 의해 재현되었다.

본원에 기술된 연구는 (인간 수술 표본으로부터) 단리된 인간 PTH 주세포 상의 가스트린/CCK₂ 수용체의 발현, 및 가스트린이 인간 PTH 합성 및 방출에 대하여 자극성 효과를 가진다는 것을 입증한다(도 8 참조). 따라서, 본원에서는 부갑상선 세포가 가스트린 표적이라는 것이 입증된다. PTH가 가스트린 방출을 자극하는 바(도 4 참조), 부갑상선(PTH) 분비 활성화가 피드 포워드 자극 루프(G 세포에서 PTH)를 나타낸다. 본원에 제시된 연구에서 자극성 히스타민 H₁ 수용체의 발현 또한 상기 세포 상에서 확인되었다.

자극성 히스타민 H₁ 수용체의 발현 또한 G 세포 상에서 확인되었다. 히스타민은 정상 및 과형성성 PTH 선에서 cAMP 생산 및 PTH 분비의 공지된 활성인자이다. C 세포 및 C 세포 유래 종양(수질성 갑상선 암종)은 가스트린/CCK₂ 수용체를 발현한다. 추가로, 가스트린은 인간 갑상선 절편에서 cAMP 생산 및 칼시토닌 방출을 유도한다.

3. 골에서의 기능성 가스트린 표적 확인

가스트린이 골 그 자체에 미치는 직접적인 효과를 평가하기 위해, 골 세포 상의 가스트린 수용체 존재 및 가스트린이 골 유래 세포에 대하여 영향을 미치는지 여부를 평가하였다(실시예 3 참조).

가스트린의 효과를 3개의 상이한 모델, 1) 마우스 두개관 골아세포; 2) 인간 태아 골아세포 세포주, hFOB 1.19; 3) 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BMMSC)에서 조사하였다. 두개관 골아세포는 증식, 광물화 및 세포 신호전달을 비롯한 골아세포 기능을 연구하기 위한 것으로서 알려져 있는 모델이다. hFOB는 정상적인 인간 골아세포 분화, 골아세포 생리학적 성질, 및 골아세포 기능 및 분화에 미치는 호르몬, 성장 인자, 및 다른 시토카인 효과를 연구하기 위한 모델로서 사용되는, SV40 큰 T 항원으로 형질감염된 인간 세포주이다. BMMSC는, 골아세포 및 연골 세포를 비롯한, 조직 재생에 필요한 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있고, 연령 관련 골관절염에서 병리학적 역할을 하는 것으로 보이는 다능성 골수 기질 세포이다.

본원에 제시된 결과는 골 내의 다중의 세포 유형이 가스트린에 의해 활성화/조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 가스트린을 함유하는 순환 혈액은 골수를 통해서 삼출되기 때문에, 순환 가스트린의 수준 변경은 CCK2 수용체를 발현하는 임의의 골 유래 세포와 생물학적으로 관련이 있다.

가스트린은 공지된 증식성 조절인자인 바, 이에 가스트린이 증식(BrdU 흡수)에 미치는 효과 또한 3개의 상이한 세포 모델에서 연구하였다. 본원에 제시된 결과는 다른 것 중에서도 가스트린은 선택적 가스트린 길항제(GA: gastrin antagonist)에 의해 역전되지 않는 골아세포 및 BMMSC의 증식을 자극시킨다는 것을 나타낸다. 본 결과는 가스트린이 광물화 손실과 함께 골아세포 탈분화를 유발한다는 것을 추가로 나타낸다. GA 길항제는 증식을 감소시키지는 못하지만, 골 표현형은 그대로 유지된다. 본원에 제시된 결과에 따르면, 가스트린은 2가지 수준: 골아세포 및 골수 유래 줄기 세포로 골 세포 기능에 직접적으로 영향을 미치고, 가능하게는 연골 세포 거동의 조절을 통해 성장판에서도 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다.

4. 가스트린 연구: 양성자 펌프 억제제가 G 세포 기능에 미치는 효과

가스트린 분비는 골다공증과 관련된 노화 - 노화, 및 산 분비 벽 세포의 손실에 기인하여 장기간 동안 상승된 위 pH와 관련된 것인 위 점막 위축증으로 이루어진 2가지 측면에 의해 조절되는 역학적인 생리학적 반응이다. 지속된 위 pH의 상승은 순환 가스트린의 수준을 상승시키는데, 이는 또한 장기간의 PPI 또는 H2 수용체 길항제 사용과 관련이 있다. 상기 작용제는 대개, 둘 모두가 특히 노인 여성 집단에서 관련이 있는 것인 소화 불량성 위 증상 또는 위식도 역류를 치료하는 데 사용된다.

산성 위 환경(낮은 위 pH) 또한 GI 관에 의해 최적으로 흡수되는 이온화된 칼슘의 생산을 촉진시키는 데 중요하다.

인간에서, 위절제(산 부족) 및 악성 빈혈(낮은 산 상태에서 절정에 달하는 벽 세포의 손실), 둘 모두, 골감소증 및 골절의 위험이 증가된 것과 관련이 있는 것으로 충분히 입증되어 있다. 위절제는 보통 산 분비 세포의 절제를 포함하며, 이로써 위산은 유의적으로 감소되고, 악성 빈혈은 (산을 생산하는) 벽 세포의 손실, 상승된 위 pH(>4)와 관련이 있지만, 위는 기저부(ECL 세포) 및 방(가스트린 세포), 둘 모두에 기능성 신경내분비 세포를 보유한다.

노화된 위 뿐만 아니라, 장기간의 PPI 사용에서도 위 pH 상승 및 가스트린 수준 상승이 또한 일어난다. PPI는 골 흡수 및 골절 위험의 증가와 연루되어 왔다. G 세포 기능 및 가스트린 분비에서의 산 억제(위 pH 상승)의 역할이 본원에서 입증된다(실시예 4 참조). 본 결과는 다른 암시들 중에서도 위 pH 증가가 G 세포 기능에 유의적으로 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 특히, G 세포 Ca^{2 +} 감지 활성 및 생리학적 조절에 대한 반응이 영향을 받는다.

5. 산 차단이 골 역학적 성질에 미치는 효과: 마스토미스 고가스트린혈증 모델

강력한 산 억제 약물, 예컨대, PPI의 출현은 산 관련 질환 관리에 혁신을 일으켰다. 수백만 개체가 지속적으로 또는 장기간 동안 상기 약물을 사용하고 있다.

특히, 감소된 PPI 제거도 보이고, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 감염의 유병률이 더 높은 노인 집단 중에서의 유의적인 위산 감소증(높은 위 pH)은 칼슘 흡수 장애를 유발하는 것으로 널리 알려져 있다. 이는 PPI 요법이 불용성 칼슘 흡수 뿐만 아니라, 골 밀도, 이 둘 모두를 감소시킨다고 밝힌 다수의 연구를 통해 뒷받침된다. 그러므로, 둔부 골절 위험의 유의적인 증가는 장기간 PPI 요법, 특히, 고용량의 PPI의 장기간 사용자 중에서의 것과 관련이 있다.

PPI 사용에 관한 상기 언급된 문제점들을 고려해 볼 때, 본원에 제시된 결과는 마스토미스 모델에서 산 억제가 위, 순환 호르몬, 부갑상선 뿐만 아니라, 골 생리에 미치는 효과를 조사한다(실시예 5 참조). 본 결과는 다른 암시들 중에서도 산 억제 약물에 의해 유도되는 고가스트린혈증이 골다공증으로 확인되는 형태학적 외관과 유사한 골 변경과 관련이 있다는 것을 확인시켜 준다.

6. 난소 적출된 마스토미스에서 산 차단이 골 역학적 성질에 미치는 효과

마스토미스 모델에 대해 난소 적출술을 수행하여 골 연구를 위한 "폐경 이후의" 표현형을 생성하였다. 본원에서 에스트로겐 손실이 G 세포를 조절하는 것으로 나타났는 바, 골 표현형에 대한 에스트로겐 손실의 구체적인 역할을 평가하였다(실 시예 6 참조). 본 결과는 다른 암시들 중에서도 순환 가스트린 수준이 에스트로겐 손실 매개 골 변화를 증폭시킨다는 것을 뒷받침한다.

7. 위 신경내분비 기능 및 골 역학적 성질에 미치는 효과: 유전자

넉아웃 마우스 모델(난소 적출술을 받은 것 및 받지 않은 것)

래트에서, 위절제술(방 G 세포 및 기저부 히스타민 분비 ECL 세포 둘 모두를 포함하는 위 전체 제거) 또는 PPI, 예컨대, 오메프라졸의 사용은 인산칼슘의 흡수 장애 및 골 광물질 밀도 손상 및 골감소증을 유도한다. 추가의 관찰 결과는 가스트린 17의 주입은 래트에서 저칼슘혈증을 유도한다는 것이다.

실험 동물에서, 부분 및 전체 위절제술 및 위 미주신경절단술(체간/선택 미주신경절단술 등)(이는 신경내분비 세포 분비를 변경시킨다)은 세포외 광물질 항상성에 영향을 미치고, 추후 후유증으로서 골감소증을 일으킨다.

미주신경절단술 이후 또는 위절제술 이후의 골감소증의 기초가 되는 기전은 알려져 있지 않다. 가정컨대, 가스트린이 PTH/Ca^{2 +} 축 또는 골 기능에 미치는 직접적인 효과, 또는 예컨대, 히스타민에 의한 간접적인 효과를 반영한다. 동측 미주신경절단술이 폐암과 관련된 비대성 폐 골관절병(HPOA: hypertrophic pulmonary osteoarthropathy)에 대해 치유력이 있다는 것은 흥미롭다. 유사하게, 침습성 첨단 신생물성 폐 병변(판코스트(Pancoast) 증후군)에 의해 유도되는 미주신경절단술은 팔에서의 동측 골 변화와 관련이 있다.

히스타민은 위 기저부 장크롬친화성 유사 세포(ECL: enterochromaffin-like cell)에 의해 분비되고, 산 분비의 중요한 조절인자가 되는데, 그 이유는 그의 분비가 주로 순환 가스트린에 의해 구동되기 때문이다. 산분비성(위 기저부) 점막의 ECL 세포는 국재화된 "폐쇄형" 내분비 세포이며 - 즉, 이는 위 루멘에 접근성하지 못하고, 그러므로, 식이성 칼슘에 대해 직접적으로 반응하지 않는다.

ECL 세포의 분비성 생성물로는 히스타민, 크로모그라닌 A 및 판크레아스타틴, 및 칼슘 결합 단백질, 칼빈딘을 포함한다. ECL 세포는 가스트린 및 히스타민 수용체를 발현하고, 주로 (히스타민 분비에 의해) 가스트린 신호를 신호전달하여 인접한 벽 세포 매개 산(HCL) 분비를 조절한다.

히스타민 그 자체는 골 세포 기능에 대해 독립적인 영향을 보이는 것으로 입증되었다. 그러나, 연구는 히스타민이 보호성인지 또는 골감소증성인지 여부에 관해서는 불분명하다. 비만 세포증 및 알레르기성 질환에서의 과량의 히스타민 방출은 골다공증 발생과 관련이 있는 것으로 주목되어 왔다. 이는 히스타민이 골 재형성에서 부정적인 역할을 한다는 것을 제안한다. 상기 제안 내용은 ECL 세포를 함유하는 위의 산 생산 부분(산분비성/기저부 점막)의 수술상의 절제가 래트에서 골량을 감소시킨다는 관찰 결과에 의해 추가로 뒷받침된다. 이러한 관찰 결과는 시험관내 연구에 의해 추가로 뒷받침된다. 따라서, 히스타민 H_1-3 수용체를 발현하는 골아세포성 MC3T3-E1(E1) 세포에서, 히스타민은 RANKL 전사체의 발현 및 단백질 생산을 증가시킨다. 이러한 효과는 H₁ 수용체 길항제에 의해 억제된다. 골수 세포(마우스 두개관으로부터 유래된 MC3T3-E1(E1) 세포)와의 공동 배양에서, 히스타민은 비타민 D₃의 존재하에서 파골세포 형성을 자극시켰다. 이러한 효과는 ODF/RANKL에 대한 중화 항체와의 사전 인큐베이션에 의해 차단된다. 골수 조혈 전구체 세포의 골 재흡수 파골세포로의 분화를 조사하는 마이크로어레이 접근법을 사용하였을 때, RANKL이 H₁ 수용체를 비롯한 70종의 표적 유전자를 자극시킨 것으로 나타났다. 난소 적출된 래트에서의 H₂ 수용체 길항제인 파모티딘을 이용한 연구 결과, 파골세포 활성 감소를 통한 척추 골량 손실의 억제가 입증되었다. 이러한 효과는 단기간의 효과였고, 6개월 경에 잃었다. 상기 데이터에 관한 요약은 히스타민이 골 흡수 조절에서 활발한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰 결과는 히스타민 H1 수용체 길항제의 장기간 사용이 뼈 골절의 위험을 감소시켰다는 것을 입증하는 큰 등록 기반 사례:대조군 연구로부터의 데이터에 의해 뒷받침된다.

ECL 세포에서, 히스타민 분비 조절을 담당하는 중요한 효소는 히스티딘 데카르복실라제(HDC)이다. HDC 널 마우스는 히스타민 합성의 완전한 결여 뿐만 아니라, 기저 위산 분비 및 가스트린 저항성 감소를 특징으로 한다. 상기 동물은 골 광물질 함량 상승 및 골 흡수 감소와 관련된, 유의적으로 증가된 대퇴부 두께 및 흉추 두께를 보인다. 파골세포는 개수 뿐만 아니라, 활성, 둘 모두 감소되었다. HDC 널 마우스에 대하여 난소 적출을 수행하였을 때, 피질 골 및 해면질 골 손실은 50%만큼 감소되었고, 이는 히스타민 결핍이 에스트로겐 구동 골다공증으로부터 골격을 보호한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 히스타민이 에스트로겐 매개 골 재형성을 증강시키는 역할을 한다고 추론될 수 있다.

ECL 세포가 대안적인 골 친화성 아민 또는 펩티드를 생산한다고 간주하는 것도 타당해 보이지만, 상기 호르몬 중 어느 것도 확인된 것은 없다. 그러므로, 상기 아민의 합성 및 분비는 가스트린과 매우 불가분한 관계를 가지는 바, 이에 히스타민의 역할은 가스트린, ECL 세포 및 골 병태생리 사이를 연결하는 연결 인자라는 개연성이 있는 것으로 보인다.

가스트린 및 히스타민의 넉아웃 모델을 사용한 본원의 연구를 통해 골 대사(완전성) 조정에서 히스타민과 가스트린의 관계가 입증되었다(실시예 7 참조).

췌장암, 위 신경내분비 종양 및 소화 궤양을 비롯한 질환에서 가스트린/CCK2 수용체를 표적화하는 것이 약리학적 수준에서 연구되어 왔다. 후자의 발생은 히스타민의 합성 및 방출을 통한 ECL 세포의 산 자극 기능, 및 가스트린 수용체 차단에 의한 히스타민 분비의 억제는 산 분비를 감소시킬 것이라는 개념에 관한 것이다. 상기와 같은 한 길항제는 전형적인 유사체 L365,260에 관한, YF476인, 1,4-벤조디아제핀-2-온-기반 가스트린/CCK2 수용체 길항제이다. YF476은 시험관내 및 생체내, 둘 모두에서 ECL 세포 히스타민 합성 및 방출에 대하여 효능이 있는 것으로 입증되었다. 히스타민 분비는 가스트린 매개 CCK2 수용체 자극에 의해 활성화되는 바, 산 분비 효과와 별개의 생리학적 이벤트로는 골에 미치는 히스타민 방출 관련 효과 뿐만 아니라, 골 그 자체에 대한 가스트린의 임의의 직접적인 효과를 차단할 수 있는 CCK2 수용체 길항제의 능력을 포함할 것이다.

8. 원리 증명 연구: 3개의 설치류 모델에서 가스트린 길항제가

난소 적출술 매개 골 표현형에 미치는 효과

본원에 기술된 연구에서는 골 강도 연구, 형태학적 성질 및 순환 바이오마커(실시예 8 참조)에 중점을 두고, 3개의 설치류 모델에서 가스트린 길항제인 YF476이 OVX 매개 골 밀도 손실/골 변경에 미치는 효과를 평가하였다.

C. 가스트린 표적화제를 이용한 골 질환 및 병태 치료

본원에서 제시한 연구에서는 다른 암시들 중에서도 골 중 CCK2 수용체의 존재 및 골 질환 치료에서 가스트린 표적화제의 효능을 입증한다. 골다공증을 특징으로 하는 것을 비롯한, 골 질환 또는 병태 치료 및 예방을 위한 상기 가스트린 표적화제의 사용을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 적합한 가스트린 표적화제로는 가스트린 조절인자, 예컨대, 가스트린 방출 펩티드(GRP: gastrin-releasing peptide)(봄베신), 소마토스타틴, 및 소마토스타틴 유사체, 예컨대, 옥트레오티드(OCTR) 및 RC-160을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 적합한 가스트린 표적화제로는 CCK2 수용체 길항제, 예컨대, 네타제피드(YF476) 및 다른 1,4-벤조디아제핀-2-온-바스틴 가스트린/CCK2 수용체 효능제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가스트린 표적화제는 CCK2 수용체 효능제: Z-360, L-740093, YM022, RP73870, JB93182, AG041R, 프로글루미드(및 유사체), JNJ-2607109(및 유도체), CI-988, PD-135158, L-365260, LY-288513, L-364718, GW-5823, 로르글루미드(Lorglumide), CR 2194(스피로글루미드(Spiroglumide)), PD-149164, PD-135666, CI-1015, RP-69758, TP-680, PD-140548 및 이트리글루미드(Itriglumide)(및 유도체)로부터 선택된다.

가스트린 표적화제는 피험체에게 피하 투여 수단을 통해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가스트린 표적화제는 얕은 근육내 주사를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 가스트린 표적화제는 졍맥내로 또는 경구 투여된다.

실시예

하기 실시예는 청구하는 본 발명을 더욱 잘 설명하기 위해 제공하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 구체적인 물질을 언급하는 정도까지도, 이는 단지 예시 목적이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 당업자는 본 발명의 능력에 관해 실습하지 않고도, 및 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 등가의 수단 또는 반응물질을 개발할 수 있다.

실시예 1: 단리된 G 세포 연구

도 3을 참조하여, Ca^{2 +} 센서로서의 G 세포의 생리학적 역할을 입증하는 연구를 수행하였다. 외부 Ca^{2 +} 농도를 증가시킴으로써 디하이드로피리딘 감수성 칼슘 채널을 통한 Ca^{2 +} 유입 및 PKC 경로를 포함하는 기전에 의해 단리된 G 세포로부터의 가스트린 방출을 자극시켰다. EC₅₀은 4.1 mM이었고, 이는 주로 PKC 조절된 경로를 통해 발생하였다. 이러한 결과는 G 세포가 식이성(루멘) 칼슘 센서로서 작용한다는 것과 일치한다.

추가로, G 세포 상에 PTH 수용체가 존재한다는 것을 확인하였다. 도 4를 참조하여, cAMP 활성화 이후에 PTH 매개된 가스트린 방출이 입증되었다. PTH는 PKA 활성화 및 세포내 cAMP의 생산을 통하여 가스트린 방출을 유의적으로 자극시켰으며(EC₅₀=60 nM), 이는 G 세포 상의 PTH 수용체가 작용성이고, 상기 루멘 칼슘 감지 방 세포에 의한 가스트린 분비는 PTH에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증하는 것이다.

G 세포에서 칼시토닌 수용체 또한 확인되었다. 도 5를 참조하여, PTH와 달리, (갑상선 C 세포로부터의) 칼시토닌은 cAMP 생산 억제를 통해 가스트린 방출을 억제시켰다.

이는 다른 PTH/칼시토닌 표적(예컨대, 골아세포)과 같이, G 세포가 위에 존재하지 않는 신경내분비 세포 시스템에 의해 자극을 받을 수 있거나(PTH), 또는 억제될 수 있다는(칼시토닌) 것을 입증하는 것이다.

이러한 관찰 결과는 칼슘 항상성의 공지된 조절인자(혈장 Ca^{2 +} 수준 감지를 통해서 - PTH/갑상선 세포)는 위의 루멘 칼슘 감지 세포 - 가스트린 생산 G 세포에 직접적으로 영향을 줄 수 있고, 그의 분비 프로파일을 변형시킬 수 있다는 증거를 제공한다.

난소 호르몬인 에스트로겐이 G 세포 기능에 미치는 효과를 평가하였다. 도 6을 참조하여, 실시간 PCR을 사용하여 가스트린 세포 상에 에스트로겐 수용체(ESRα)가 존재한다는 것을 확인하였다. 단리된 가스트린 세포에서 17-에스트라디올(ESRa 효능제)이 가스트린 방출(IC₅₀=4.6x10^-12 M), cAMP 생산(IC₅₀=1.1x10^-12 M) 및 MAPK 활성을 억제시켰다는 것이 추가로 입증되었다(도 6).

이러한 정보는 폐경 상태와 일치하는 에스트로겐 환경을 변경시키는 것이 G 세포 기능(신호전달 및 분비)을 크게 변경/자극시킬 것이라는 것을 나타낸다. 이는 G 세포 기능 증가 및 높은 PTH를 포함하는 환경이 노화된 래트에 실제 존재한다는 이전 보고와 일치한다. 이러한 조합은 골다공증 발생과 관련이 있다고 널리 인정되고 있다.

하기 표 1을 참조하여, 신경내분비 EC 및 ECL 세포의 단리된 제제와 전사체를 비교한 결과, G 세포는 칼빈딘이 아닌, CaSR을 발현하는 유일의 신경내분비 세포인 바, 이에 G 세포는 루멘 칼슘을 감지할 수 있는 유일의 세포인 것으로 입증되었다. 도 7을 참조하여, G 세포 가스트린 분비는 부갑상선 주세포에 의해 분비되는 PTH, 갑상선 C 세포로부터의 칼시토닌, 및 난소 세포로부터의 에스트로겐에 의해 직접적으로 조절될 수 있다는 것을 나타낸다.

트랜스크립톰(U133A 마이크로어레이) 분석에 의해 측정된, G 세포, EC 세포 및 ECL 세포에서의 칼슘 대사 관련 전사체 및 신경내분비 수용체의 존재에 관한 비교
	G 세포	EC 세포	ECL 세포
칼슘 대사
PTH 수용체	존재	부재	부재
칼시토닌 수용체	존재	부재	부재
비타민 D 수용체	존재	부재	부재
CaSR	존재	부재	부재
ESRα	존재	존재	존재
세포내 칼슘 전위
칼빈딘	부재	존재	존재
신경내분비 수용체
히스타민 H3 수용체	존재	부재	존재
세로토닌 5-HT3 수용체	존재	부재	부재
CaSR: 칼슘 감지 수용체; ESRα = 에스트로겐 알파; H3 = 히스타민 서브타입 3; 5-HT3: 세로토닌 서브타입 3; PTH: 부갑상선

본 결과를 통해 G 세포가 소화관/부갑상선 칼슘 항상성 축에서 중요한 신경내분비 세포인 것으로서 확인되었다.

실시예 2: 가스트린 표적 연구( 시험관내 )

세포 유형들을 잠재적 가스트린 표적으로서 평가하였다. 가스트린 방출을 통해 이루어지는 칼슘 항상성 축의 가스트린 세포에 의한 조절을 평가하였다.

(인간 수술 표본으로부터) 단리된 인간 PTH 주세포 상에서 가스트린/CCK₂ 수용체의 발현이 입증되었다. 도 8을 참조하여, 가스트린이 인간 PTH 합성 및 방출에 대하여 자극성 효과를 가진다는 것이 추가로 입증되었다. 이러한 결과는 부갑상선 세포가 가스트린 표적이라는 것을 나타낸다. PTH가 가스트린 방출을 자극시키는 바(도 4 참조), 부갑상선(PTH) 분비 활성화가 피드 포워드 자극 루프(G 세포에서 PTH)를 나타낸다. 자극성 히스타민 H₁ 수용체의 발현 또한 상기 세포 상에서 확인되었다.

도 9를 참조하여, 가스트린은 잘 분화된 인간 MTC 세포주, MTC-SK로부터의 cAMP 뿐만 아니라, 칼시토닌 방출, 둘 모두를 자극시켰고, 이 효과는 선택적 CCK₂ 길항제인 YF476에 의해 역전되었다(IC₅₀ = 8.6x10^-13 M). 이러한 결과는 갑상선 C 세포가 가스트린 표적을 나타낸다는 것을 제시한다. 칼시토닌이 가스트린 방출을 억제시키는 바(도 5 참조), C 세포활성화는 피드백 억제성 루프를 제공할 것이다.

가스트린에 대한 갑상선/부갑상선 시스템의 전반적인 반응성(자극성 및 억제성)을 평가하기 위해, 가스트린이 부갑상선/MTC-SK 공동 배양 시스템에 대해 미치는 효과를 평가하였다. 가스트린이 (증가된 PTH 합성 및 방출을 통한) 골 흡수의 자극제인지, 또는 칼시토닌 방출을 통한 상기 과정의 억제제인지 여부를 평가하였다.

도 10을 참조하여, (부갑상선 및 갑상선 C 세포, 둘 모두에서 발현된) CCK₂ 수용체를 자극시킨 결과, 배양된 PTH 세포로부터 PTH 전사 및 분비가 유의적으로 상승하였다. 이에 반해, 가스트린은 칼시토닌 합성 및 방출을 유의적으로 억제시켰다. 이러한 효과는 선택적 CCK₂ 길항제인 YF476과의 사전 인큐베이션에 의해 역전되었다.

이러한 결과는 갑상선 C 세포의 가스트린 자극이 부갑상선 세포로부터 방출된 PTH에 의해 역전된다는 것을 나타낸다. 이는 상기 모델 공동 배양 시스템 내에서 가스트린의 효과는 대개 PTH 매개 효과라는 것을 입증하는 증거가 된다. 건강한 지원자에서, 가스트린 주입이 미치는 효과는 칼시토닌보다는 PTH 분비를 증가시키는 것이다(유의적으로 더 낮은 방출). 이는 가스트린이 갑상선에 미치는 임의의 생체내 효과는 주로 부갑상선 및 PTH 방출과 관련이 있다는 것을 시사하는 것이다.

이러한 결과는 루멘 감지 세포(G 세포)에 의한 소환관(위) 호르몬 방출이 부갑상선을 직접적으로, 및 갑상선 C 세포 칼시토닌 분비를 간접적으로 조절한다는 것을 뒷받침한다.

실시예 3: 골에서의 기능성 가스트린 표적 확인

가스트린이 골 그 자체에 미치는 직접적인 효과를 평가하기 위해, 골 세포 상의 가스트린 수용체 존재 및 가스트린이 골 유래 세포에 대하여 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. QPCR, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학법 기법을 사용하여 골에서의 수용체 발현을 확인하였다. 이후, 가스트린의 효과를 3개의 상이한 모델, 1) 마우스 두개관 골아세포; 2) 인간 태아 골아세포 세포주, hFOB 1.19; 3) 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BMMSC)에서 조사하였다.

CCK2 수용체: qRT-PCR을 사용하여, 두개관 골아세포, hFOB 세포주 및 인간 BMMSC에서 CCK2 수용체의 발현을 확인하였다(도 11A). 모든 모델에서 발현이 확인되었고, CQ 값의 범위는 31.2-34였다. 마우스 골 특이 면역염색법에서 면역조직화학법(IHC)을 통해 확인된 가스트린 수용체가 성장판 중 연골 세포에서 확인되었다. 일부 발현은 골아세포 뿐만 아니라, 골내막에서 층을 형성하는 세포에서도 확인되었다(도 11B-C). (죽상동맥경화증 유도성 사지 허혈(골수염의 증거는 없음)에 대한 절단 후에 수집된) 10개의 골수로부터 유래된 인간 피질 골수 샘플에서 표준 PCR 및 웨스턴 블롯 또한 착수하였다. PCR 결과, CCK2 수용체에 상응하는 크기의 밴드가 확인되었다(도 12A). 이를 서열분석하고(생어(Sanger)), 그 결과, CCK2R과 92% 상동성을 보이는 것으로 확인되었다(도 12B). 웨스턴 블롯 결과, 모든 인간 샘플 중에서CCK2 수용체 단백질 발현이 확인되었다(도 12C).

요약: 가스트린 표적은 마우스 두개관 골아세포 세포에서, hFOB에서, 및 BMMSC 세포주에서 뿐만 아니라, 성장판(연골 세포)을 포함하는 골에서 및 인간 골수(골내막 수집물)에서도 확인가능하였으며, 이는 골 내의 다중의 세포 유형이 가스트린에 의해 활성화/조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 가스트린을 함유하는 순환 혈액은 골수를 통해서 삼출되기 때문에, 순환 가스트린의 수준 변경은 CCK2 수용체를 발현하는 임의의 골 유래 세포와 생물학적으로 관련이 있다.

시험관내 가스트린 효과: 가스트린은 공지된 증식성 조절인자인 바, 이에 먼저 가스트린이 증식(BrdU 흡수)에 미치는 효과를 3개의 상이한 세포 모델에서 연구하였다. 가스트린은 3개의 세포 유형 모두에서 증식을 자극하였으며, EC₅₀ = 1-2x10^-11 M(도 13A) 최대 효과는 ~50%(1 nM)였다. 증식에 대해 미치는 상기와 같은 자극성 효과는 선택적 가스트린 길항제인 YF476과의 사전 인큐베이션에 의해서는 억제되지 않았다(도 13B). 상기 화합물은 BMMSC 세포에서 증식을 증강시키는 것으로 보였다. 골아세포 및 BMMSC에 대한 가스트린 활성화의 생물학적 영향을 평가하기 위해, 상기와 같은 가스트린 매개 효과를 통해 골 광물화가 일어나는지 여부를 평가하는 연구를 수행하였다. 형광성 오스테말지의 광물화된 절의 하이드록시아파타이트 부분에의 결합을 측정하였다. 가스트린은 3개의 세포 유형 모두에서 골 광물화를 억제시켰으며, IC₅₀ = 3.2x10^-11 - 1.3x10^-10 M(도 14A)이고, 최대 억제 효과는 ~30-50%(1 nM)였다. 광물화에 대해 미치는 상기와 같은 억제성 효과는 선택적 가스트린 길항제인 YF476과의 사전 인큐베이션에 의해서는 억제되었다(도 14B). 상기 화합물은 마우스 골아세포 두개관 세포에서 광물화를 특이적으로 증강시키는 것으로 보였다.

요약: 가스트린은 골아세포 및 BMMSC의 증식을 자극시키며, 이는 가스트린 길항제에 의해서는 역전되지 않는다. 가스트린 매개 증식은 광물화 손실과 관련이 있으며, 이는 골아세포 표현형의 역전을 나타낸다. GA는 이러한 가스트린 억제성 효과를 역전시켰다. 이러한 결과는 가스트린이 광물화 손실과 함께 골아세포 탈분화를 유발한다는 것을 나타낸다. 길항제는 증식을 감소시키지는 못하지만, 골 표현형은 그대로 유지된다. 이러한 효과는 두개관 골아세포에서 가장 뚜렷하게 나타났다.

가스트린 활성화의 생물학적 영향을 추가로 평가하기 위해, 상기와 같은 가스트린 매개 효과가 골 형태형성 단백질 2(BMP2(bone morphogenetic protein 2) - 골아세포 분화에 관여), RANKL(골아세포 상에서 발현되는 파골세포 활성화 수용체포) 및 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor) - 골수 전구 세포 및 파골세포 활성의 활성인자 조절에 관여)의 발현을 증가시켰는지 여부를 평가하는 연구를 수행하였다.

마우스 두개관 배양물에서, 가스트린(1 nM)은 MSCF-1 유전자 발현을 완전하게 억제시켰을 뿐만 아니라, RANKL 전사(0.8배) 및 ALKP도 억제시켰다(도 15). hFOB에서, 가스트린은 또한 상기 전사체를 억제시켰다. YF476과의 사전 인큐베이션은 상기 효과를 역전시키고, 정상화시켰다. 이들 유전자 중 어느 것도 BMMSC에서는 확인되지 않았지만, ALKP의 경우, 가스트린 효과가 관찰된 반면, BMP2는 어느 세포 유형에서도 확인되지 않았다. 이를 통해 가스트린 효과는 이화 작용성이며, 이 효과를 YF476으로 억제시키면, 골아세포 기능은 정상화될 뿐만 아니라, 동화 작용성 표현형이 유발된다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 데이터는 가스트린이 골아세포 증식 및 분화를 조절할 뿐만 아니라, 전구 세포의 조절에도 관여한다는 것을 나타낸다. 또한, 가스트린은 BMMSC가 증식하도록 영향을 미친다. YF 화합물은 증식을 억제시키지 않고 표현형의 효과를 역전시켰다. 그러므로, 가스트린은 2가지 수준: 골아세포 및 골수 유래 줄기 세포로 골 세포 기능에 직접적으로 영향을 미치고, 가능하게는 연골 세포 거동의 조절을 통해 성장판에서도 영향을 미칠 수 있다.

실시예 4: 가스트린 연구: 양성자 펌프 억제제가 G 세포 기능에 미치는 효과

PPI는 골 흡수 및 골절 위험의 증가와 연루되어 왔는 바, 산 억제(위 pH 상승)의 G 세포 기능 및 가스트린 분비에 대한 역할을 평가하였다. 지속성 고가스트린혈증을 일으키기 위해 식수 중의 비가역성 H2 수용체 길항제인 록스티딘 1 mg/L로 처리된 마우스(마스토미스 - 프라오미스 나타렌시스(Praomys natalensis))의 방 점막으로부터 G 세포를 단리시켰다. 상기 동물은 장기간의 약리학적 방법에 의한 산 분비 억제와 관련된 위산 병태생리의 모델(저산 상태의 병태 생물)로서 광범위하게 연구되어 왔다.

30일 동안 비가역성 위산 억제 처리된 마스토미스(6-9개월)는 상승된 혈장 가스트린 수준(104±23 pg/ml 대 28±13 pg/ml(비처리 동물에서), p<0.05)을 보였다. 이는 낮은 pH-억제된 가스트린 방출의 손실(그 결과 위 pH 수준 상승)을 반영하는 것이다. 그러므로, 상기와 같은 처리로 무산증 및 고가스트린혈증 동물 모델을 얻을 수 있다.

비처리된 동물로부터 단리된 G 세포와 비교하여 무산증(높은 pH 위 -저산 노출 G 세포) 동물로부터 단리된 세포에서는 가스트린 함량, 가스트린 전사체 수준 뿐만 아니라, 기저 가스트린 방출량 모두 유의적으로 상승되었다(p<0.05)(하기 표 2).

표 2를 참조하여, 상승된 위 pH(저산 상태)는 G 세포 가스트린 함량(>2배), 전사(>4배) 및 분비(>8배)를 자극시킨다. 자극성 리간드, 예컨대, GRP 및 칼슘에의 상기 세포의 생리학적 반응은 감소되고 - EC₅₀은 증가된다. 유사하게, 상기 세포는 억제제, 예컨대, 옥트레오티드(OCTR)에 대해 더 적은 감수성을 띠고, IC₅₀은 ~5배 증가된다.

가스트린 방출의 조절인자인 GRP(봄베신) 및 소마토스타틴(OCTR)은 각각 증가된 효능(각각 GRP:EC₅₀: 1.1 pM 대 1 nM) 및 감소된 효능(소마토스타틴 유사체, 옥트레오티드: 28 pM 내지 140 pM)을 보였다(표 2). 추가로, "고가스트린혈증" G 세포는 칼슘 검출시 ~100% 더 적은 감수성을 띠었다(EC₅₀ = 10 mM 대 4 mM(정상가스트린혈증 세포에서)).

상기 데이터는 생체내 위(pH) 환경 증가가 G 세포 기능에 유의적으로 영향을 미친다는 것을 입증한다. (노령 개체 또는 환자에서 PPI 상에 존재하는 것과 같은) 위 pH 증가가 G 세포 Ca² 감지 감도 및 생리학적 조절에 대한 반응을 유의적으로 변경시켰다. 이는 벽 세포 기능의 장기간의 억제 및 산 분비의 감소가 루멘 환경에 대한 방 G 세포 반응을 실질적으로 변경시킨다는 것을 입증하는 것이다.

높은 루멘 pH 조건하에서는 더 많은 가스트린이 생산되는 바, 상기와 같은 관찰 결과는 임상적으로 관련이 있다. 가스트린은 PTH 방출을 자극시키고, 골 세포에 대하여 직접적인 영향을 미치는 바, 이에 고가스트린혈증이 중요하다(도 8, 10, 11 참조).

실시예 5: 산 차단이 골 역학적 성질에 미치는 효과:

마스토미스 고가스트린혈증 모델

마스토미스 모델에서 산 억제가 위, 순환 호르몬, 부갑상선 뿐만 아니라, 골 생리에 미치는 효과를 조사하였다.

상기 동물에서의 골 생물학적 성질에 관해서는 거의 알려진 바가 없다. 한 연구를 통해서 동물 > 9개월 대다수(~80%)에서 추간판의 변성, 및 가동 관절(팔꿈치, 무릎)에서의 중증의 골관절염성 변화가 확인되었다.

실험실 설치류 중에서 단일 근친계 마우스(STR/IN)를 제외한 마스토미스는 골관절염에 걸리기 가장 쉬운 것으로 보인다.

4-6개월된 동물(암컷)을 60일 또는 120일 동안 록스티딘으로 처리하였다. 연령 및 성별이 매칭된, 비처리 동물을 대조군으로서 제공하였다.

순환 호르몬: 호르몬 분석(ELISA)을 통하여 H₂ 수용체 차단의 함수로서 가스트린/PTH 및 에스트라디올 변경을 확인하였다. 구체적으로, 단기간의 가스트린 분비 상승(8주의 록스티딘 처리)은 PTH 분비 상승 및 에스트라디올/에스트로겐 억제와 관련이 있었다(도 16). 보다 장기간의(16주), 만성 고가스트린혈증은 PTH 및 에스트라디올의 억제와 관련이 있었다.

위: ECL 히스타민의 활성화(히스티딘 데카르복실라제- HDC)(도　17A) 및 고가스트린혈증 동안의 G 세포 가스트린(mRNA 수준)의 활성화(도 17B)가 입증되었다. 이는 PTH1R(mRNA 및 단백질 수준)의 활성화, 및 단기간 고가스트린혈증 동안의 위 ERα(mRNA 및 단백질 수준)의 선택적 감소와 관련이 있었지만; 이어서 이는 16주째에 증가하였고, 고가스트린혈증 동안 CaSR(mRNA 및 단백질 수준)의 활성화와 관련이 있었다(도 17A-C).

부갑상선: 면역조직화학법을 사용하여, 마스토미스의 부갑상선 및 갑상선에서의 CCK2 수용체 발현을 입증하였다(도 18). 본 결과를 통해 부갑상선 세포 뿐만 아니라, 갑상선 C 세포, 둘 모두 가스트린 수용체를 발현한다는 것이 확인되었다. 부갑상선에서 CCK2 수용체는 G 세포:PTH 축에 대한 근거가 되며, 그에 의해 (예컨대, PTH의) 부갑상선 분비는 가스트린에 의해 조절될 수 있다.

골 형태학적 성질 및 역학적 성질: 마이크로CT 평가를 사용하여 고가스트린혈증 동물에서 설치류 대퇴골의 골 형태계측 분석법을 개발하였다(도 19). 이를 통해 골 부피는 더 낮고, 밀도 및 인장 강도는 감소되었다는 것이 입증되었다. 본 데이터는 상승된 가스트린 수준이 골 흡수를 자극시켰다는 것을 입증한다.

구조 모델 지수(SMI)를 통해 플레이트/로드 비가 이동하였다는 것이 확인되었고, 이는 대퇴골의 기하학적 구조가 변경되었다는 것을 입증한다. 따라서, 가스트린이 더 많은 로드 유사 형성이 이루어지는 쪽으로 수행되는 재형성을 통해 골 표현형의 변화를 나타내는 SMI를 증가시켰다. 후자의 경우는 골다공증성 여성에서 관찰되는 더 약하고, 더 강직성을 띠는 골 및 골 비외상성과 관련이 있다.

정상적인 마스토미스와 달리, 만성 고가스트린혈증 동물은 하기 특징들: 골단판의 비후화, 골 비외상성(지방세포 형성 증가에 기인하는 비정상적인 골 재구성) 및 비정상적인 면역원성 특징의 확인과 함께 골관절염 표현형을 보였다.

대퇴골로부터 골수를 단리시키고, 파골세포형성에 대하여 평가하였다. 파골세포 및 골아세포, 둘 모두를 난소 적출된 마우스로부터 단리된 세포와 비교하여 비정상적으로 이른 기간에 배양할 수 있다. 이는 고가스트린혈증 모델에서 상기 두 세포 집단의 활성화에 관한 증거가 된다. 이는 CCK2 수용체 유도성 이벤트의 활성화와 일치한다.

난소 적출된 마우스와 비교하여, 고가스트린혈증 마스토미스는 비정상적으로 확장된 형태학적 골 재형성을 보인다. 고가스트린혈증 동물에서 경로 활성화에 관한 qPCR 기반 확인에 의해 비정상적인 골수 표현형이 존재한다는 것을 추가로 확인하였다. 이는 ALOX5 및 PTGS2(염증)의 하향 조절, PPARγ(지방세포 활성화)의 하향 조절, 및 상향 조절된 TNFSR11(RANKL)(골세포 활성)을 포함하였다. PCR 결과, 특히, 골세포 활성의 활성화는 육안으로 관찰된 골수 변경(골단 성장, 골 비외상성)과 일치한다.

골수 표현형을 추가로 평가하고, 골 지방 조직이 활성화되었는지 여부(골 대사 및 완전성의 척도)를 추가로 평가하기 위해, 연령-성별 매칭된 대조군 및 단기간 고가스트린혈증 동물에서 오스뮴 기반 염색 프로토콜을 사용하였다. 처리된 동물에서 흡수의 유의적인 증가가 관찰되었다(도 20). 이는 "노화된" 골/골다공증성 표현형과 일치한다.

이러한 결과를 통해 단기간 고가스트린혈증은 골다공증으로 확인되는 형태학적 외관과 유사한 골 변경과 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이후, 골 조직학적형태계측을 조사하였다. 본 연구에서는 8주 및 16주 처리된 마스토미스에서 골 광물화 감소와 함께, 흡수 강의 증가 뿐만 아니라, TRAP 양성 파골세포 개수의 유의적인 증가(p<0.05)(15±6 p<0.05 및 16±4.5 p<0.05, 대 9±3(대조군에서))가 확인되었다. 유골 봉합선 및 골연화증의 증거 또한 관찰되었다(도 21).

마지막으로, 인스트론 장치를 이용하여 마스토미스에서 골 강도를 조사하였다. 대퇴골에 하중을 부하하여 파괴시켰다(4점 굽힘). 서보유압 시험 장치(인스트론 모델 8874; 인스트론 코포레이션(Instron Corp.: 미국 매사추세츠주 노우드))를 사용하여 0.05 mm/초의 편향률로 시험을 수행하였다.

마지막으로, 인스트론 장치를 이용하여 마스토미스에서 골 강도를 조사하였다. 대퇴골에 하중을 부하하여 파괴시켰다(4점 굽힘). 서보유압 시험 장치(인스트론 모델 8874; 인스트론 코포레이션(미국 매사추세츠주 노우드))를 사용하여 0.05 mm/초의 편향률로 시험을 수행하였다.

강성도 범위는 158-173 N/mm였다. 뼈를 골절시키는 데 필요한 최대 하중의 범위는 32.8-45.7 N/mm였다. 상기 값은 서로 강한 상관관계가 있었다(도 17A, R²=0.86, p<0.003, 선형 회귀 분석).

골 밀도(마이크로CT) 및 골절 힘 비교를 통해 해면질 골(R²=0.54, 22B) 및 피질 골(R²=0.71, 22C), 둘 모두에 대한 상관관계를 확인하였다.

따라서, 인스트론 장치를 사용하여 골 강도를 측정함으로써 고가스트린혈증 동안 비정상적이고, 취약한 골 표현형의 발생과 일치하는 추가 정보를 제공한다. 이러한 기계적 데이터는 고가스트린혈증 모델에서 가스트린 구동 "골다공증성" 표현형의 생물학적 근거가 되는 증거를 뒷받침한다.

요약(도 23, 24): 단기간 고가스트린혈증(8주)은 대퇴골에서 입증가능하고, 측정가능한 골다공증성 변화를 유발한다. 위 방에서, 단기간 고가스트린혈증은 CaSR 발현상의 변화 없이, 활성을 띠는 G 세포(전사체), 증가된 PTH1R 및 에스트로겐 감소 반응(ERα/β 및 AR)과 관련이 있었다. 골 분석 관찰 결과는 인간의 폐경 이후의 상태에서 뚜렷하게 나타나는 것과 유사하다.

고가스트린혈증을 16주까지 연장시켰을 때(만성 모델), 대퇴골에 측정가능한 골다공증성 변화가 일어났고, 이는 방 CaSR 및 ERα 뿐만 아니라, PTH1R 발현 증가와 관련이 있었다(도 17).

순환 가스트린 상승 및 G 세포 상의 PTH1R 발현 증가의 조합은 골다공증성 표현형과 관련된 일치하는 특징이었다.

이러한 결과는 고가스트린혈증 마스토미스가 가스트린이 골 병태생리에 미치는 효과를 평가하는 데 적합한 모델이고, 이는 고가스트린혈증이 골에 대해 미치는 유의적인 골다공증유발성 효과를 입증한다.

실시예 6: 난소 적출된 마스토미스에서 산 차단이 골 역학적 성질에 미치는 효과

난소 적출술은 골 연구를 위한 "폐경 이후의" 표현형을 생성하는 표준 방법이다. 에스트로겐이 G 세포 조절 효과를 보이는 바(도 6 참조), 이어서, 비처리 동물, 난소 적출된 동물 뿐만 아니라, 단기간(8주) 및 장기간(16주) 고가스트린혈증을 앓는 난소 적출된 동물에서 골 표현형에 대한 에스트로겐 손실의 구체적인 역할을 평가하였다. 마스토미스에서 후방 접근법을 이용하여 양측 난소 적출술(OVX) 및 난관결찰술을 수행하였다. 8주 후 동물을 연구하였다.

순환 호르몬: 8주 후, 에스트로겐은 난소 적출술에 의해 감소되었다. 그러나, 혈청 PTH는 ~2배 증가하였다(도 25).

위: 난소 적출술은 크로모그라닌 A(CgA) 및 HDC 전사의 유의적인 증가와 관련이 있었고, 가스트린 발현은 변경되지 않았다(도 26). 이는 위 중의 에스트로겐의 한 효과는 ECL 세포 히스타민 합성을 하향 조절하는 것이라는 것을 입증한다.

난소 적출술은 안드로겐(6배) 및 에스트로겐 수용체(둘 모두 ESRα/β: 4-7배) 뿐만 아니라, CaSR(5배) 및 PTH1R(4배)의 위 점막 전사를 증가시켰다(도 27). 따라서, 에스트로겐을 제거하였을 때, 식이성 칼슘 감지, 및 그에 대한 반응에 관여하는 위 세포 수용체, 즉, CaSR 및 부갑상선 축(PTH1R)에서 검출가능한 변경이 일어났다.

단기간 고가스트린혈증 / OVX 모델: 난소 적출술 모델에서 단기간 고가스트린혈증은 순환 PTH를 증가시켰다(도 25). 위에서, 가스트린 및 HDC 전사체, 둘 모두 산 억제(8주 록스티딘) 및 OVX의 조합에 의해 상승되었다(도 26B-D). OVX 이후에 발생한 수용체, 즉, AR/ESRα/β, CaSR 및 PTH1R의 발현 증가(즉, 도 27)는 고가스트린혈증 동물에서는 확인되지 않았다. 수준은 감소되었고, 더 이상 대조군과 상이하지 않았다(도 28). 이는 약리학적 방법에 의한 산 분비 억제(위 pH 및 가스트린 상승)는 심지어 에스트로겐이 제거된 때에도 칼슘 감지에 관여하는 수용체의 위 발현을 정상화시킨다는 것을 나타낸다.

장기간 고가스트린혈증 / OVX 모델: 16주 고가스트린혈증은 혈장 PTH 수준의 정상화와 관련이 있었다(도 30). 위에서, HDC는 상승하였다(도 26). 16주 처리된 동물에서의 AR/ESRα/, CaSR 및 PTH1R의 수준은 대조군과 상이하지 않았다(도 28). 단기간 모델에서와 같이, 장기간 모델에서 칼슘 감지에 관여하는 수용체의 위 발현은 에스트로겐 제거 동안 정상이었다.

OVX 및 고가스트린혈증 OVX 모델에서의 골 형태학적 성질 및 역학적 성질:

마이크로CT 분석: 해면질 국소형태(topography)는 도 29에 제시되어 있다. 골 측정을 통해 난소 적출술 후에 밀도 및 부피가 ~50% 감소되었다는 것을 확인하였다. 이는 설치류 난소 적출술 모델에서의 이전 보고와 일치한다(도 30A, C). 가스트린 매개 감소는 장기간 고가스트린혈증 동물(80-85% 감소)에서 가장 유의적이었다(p<0.005). 후자의 동물은 또한 피질 밀도도 감소(~5%, p<0.05)를 보였다(도 30B). 피질 골 부피는 모든 OVX 동물에서 감소되었지만(~15%), 단기간 고가스트린혈증 동물에서 가장 유의적이었다(p<0.005, ~30%)(도 30D).

피질 골에 대한 추가 측정을 통해 골내막 및 골막의 유의적인 감소를 확인하였다. OVX는 반경(20%) 및 둘레(18%), 둘 모두를 감소시켰다(도 31A-D). 단기간 고가스트린혈증 동물(반경: 25-30%; 둘레 27%)에서의 감소가 더욱 유의적인 것으로 확인되었다. 이는 OVX 단독 동안 측정된 감소보다 더 적었다(p<0.02). 장기간 고가스트린혈증 동물에서의 측정값은 OVX 단독과 다르지 않았다.

이러한 결과를 통해 상승된 순환 가스트린 수준이 에스트로겐 손실 매개 골 변화를 증폭시킨다는 것을 확인할 수 있다. 단기간 고가스트린혈증의 가장 유의적인 효과는 피질 골 및 골내막/골막의 수준에 그러한 반면, 장기간 고가스트린혈증 효과는 해면질 골에서 두드러졌고, 이를 통해 후자의 것은 또한 골 대사 및 강도의 조절에서도 역할을 한다는 것을 확인하였다. 후자의 것을 평가하기 위해, 강도 시험 연구를 수행하였다.

골 조직학적형태계측: 난소 적출술은 골 광물화 감소와 함께, 흡수 강의 증가 뿐만 아니라, TRAP 양성 파골세포 개수의 유의적인 증가(p<0.05)(26.8±11 대 9±3(대조군에서))와 관련이 있었다(도 32).

골 기계적 강도 시험: 대퇴골의 4점 굽힘 분석 결과, OVX 동물에서 강성도의 증가가 확인되었다(도 33A). OVX는 또한 최대 하중 및 골절 하중, 둘 모두를 감소시켰다(도 33B, C). 이는 에스트로겐 손실 그 자체가 그의 강성도는 증가시키면서(로드/플레이트 변경과 관련된 해면질 효과), 골(피질 효과) 강도를 감소시켰다는 것을 나타낸다. 단기간 고가스트린혈증은 뼈를 골절시키는 데 필요한 운동량을 감소시켰다(도 33D). 이들 파라미터는 약한, 손상된 피질 골과 일치하는 효과를 나타낸다(도 30-31). OVX 생성된 골 강성도는 단기간 고가스트린혈증에 의해 역전되었고, 이는 상기 가스트린 효과가 골 재형성의 활성화 및 흡수 단계로 제한된다는 것을 시사한다. 장기간 고가스트린혈증은 뼈를 골절시키는 데 필요한 하중 및 운동량을 역전시켰다. 그러나, 골 강성도는 상기 동물에서 증가하였는데, 이는 해면질 변경과 일치하였다(도 30). 이는 골 형성의 역전 및 형성 단계를 포함지만, 골이 강직성이고, 이에 따라 약하다는 점에서 비정상적인 것인 골 재형성 표현형과 일치한다.

기계적 강도 평가: pMOI(극 관성 모멘트)는 골의 전반적인 강도(및 강성도)의 척도이며, 이는 하중 파괴(비틀림)와 비례한다. 이는 비정상적인 치유에서 증가된다. 이러한 파라미터를 평가하여 골 강도의 추가의 척도를 제공하였는데, 그 이유는 상기 파라미터가 골 쇠약의 척도를 구체적으로 나타내기 때문이다. OVX는 pMOI를 감소시켰고, 이는 단기간 고가스트린혈증에 의해서 추가로 유의적으로 감소되었다(도 34A). 이를 통해서 난소 적출술이 골을 약화시킨다는 것을 확인하였고, 이는 가스트린 증가가 골 쇠약을 악화시킨다는 것을 입증한다. 장기간 고가스트린혈증은 (대조군과 비교하여) 감소된 pMOI와 관련이 있지만, OVX 단독과 다르지 않았다. 이는 4점 굽힘 데이터(상기 참조)와 일치하며, 단기간(비정상적인 활성화 및 재형성) 및 장기간(비정상적인 역전 및 골 형성) 노출 동안 가스트린의 효과를 강조한다.

골수의 실시간 PCR 분석: 골 재형성과 관련된 5개의 유전자는 OVX에 의해 유의적으로 변경되었다(2개의 감소 및 3개의 상승). 구체적으로, 피질 골수 유래 ALOX5(염증) 및 RUNX2(골아세포 분화)는 유의적으로 감소시켰다(도 35). CXCL12, PPARγ 및 HIF-1α의 발현은 증가되었다. CXCL12는 PTH 매개 골아세포 활성화와 관련이 있고, PPARγ는 지방세포 분화(골 보호 기전)와 관련이 있고, HIF-1α는 저산소증 매개 골 손상(RUNX2 발현을 음성 방식으로 조절, 골막 전구 세포 활성화와 관련)과 관련이 있다. 이는 골아세포 분화 억제 및 파골세포 활성화와 일치한다.

단기간(8주) 고가스트린혈증도, 장기간(16주) 고가스트린혈증도 그 어느 것도 골 재형성에서 OVX 매개 유전자 발현 변경을 유의적으로 변경(증폭 또는 억제)시키지 않았다. 그러나, PTGS2(또는 유도성 COX2)는 가스트린에 의해 유의적으로 감소되었다. 이는 골 손상 반응이며, 보호와 관련된 생물학적 반응과 일치하는 것이다.

요약( 도 36 ): 마스토미스 모델에서의 난소 적출술과 관련된 골(해면질 및 피질) 이상은 피질 유래 골수 세포 수준에서 유전자 발현 및 골 생리의 변경(골아세포 기능 억제)과 관련이 있었다. 이는 HDC 및 칼슘 감지/PTH1R 반응을 비롯한, 위 점막 신경내분비 마커의 증가와 관련이 있었다.

난소 적출술 후 단기간 고가스트린혈증은 골 표현형(해면질 및 피질 밀도 및 부피 감소) 및 골수 유전자 발현 프로파일(예컨대, HIF-1α의 활성화)에 있어서의 난소 적출술 단독인 것과의 유사한 변경과 함께 골을 추가로 약화시켰다. 가스트린 전사 증가는 CaSR/PTH1R 발현의 정상화와 함께, 위에서 가장 유의적인 변경이었다.

장기간 고가스트린혈증으로 약하고, 매우 강직성인 골을 얻었다. 표현형(해면질 및 피질 밀도 및 부피 감소) 뿐만 아니라, 골수 유전자 발현(HIF-1α의 활성화)에 있어서의 난소 적출술 단독인 것과의 유사한 변경이 관찰되었다. 위에서의 가장 유의적인 변경은 CaSR/PTH1R 발현의 정상화와 함께, HDC의 활성화였다.

전반적으로, 골 손실/이상은 세포 골수 활성화의 변경 및 위 점막 신경내분비 세포 전사의 변화와 관련이 있다.

실시예 7: 위 신경내분비 기능 및 골 역학적 성질에 미치는 효과: 유전자

넉아웃 마우스 모델-난소 적출술을 받은 것 및 받지 않은 것

가스트린 및 히스타민의 넉아웃 모델을 사용하는 연구를 통해 골 대사(완전성) 조정에서 히스타민과 가스트린의 관계가 입증되었고, 이는 마스토미스와 다른 종 모델에서 가스트린 및 히스타민의 역할을 평가하였다. 본 연구는 가스트린 매개 히스타민 분비가 골 생물학적 성질(뿐만 아니라, G 세포가 에스트로겐에 의해 조절된다는 본 발명자들의 관찰 결과)에 미치는 효과를 평가하였다. 3가지 넉아웃 조합: HDC 넉아웃 마우스 뿐만 아니라, 가스트린 넉아웃 및 이중 조합(HDC/GAS) 넉아웃 동물이 사용되었다.

순환 호르몬: a) 에스트라디올은 난소 적출술 이후에 3가지 KO 모델 모두에서 유사한 수준(~2 pg/ml)으로 감소되었다(80-90%)(도 37). b) 가스트린은 가스트린 및 이중 KO 마우스, 둘 모두에서 낮았다(10-20 pg/ml); HDC KO 동물에서, 가스트린 수준 GAS 또는 GAS/HDC KO 동물보다 5x 더 높았다. 이러한 수준은 난소 적출술에 의해 영향을 받지 않았고, 정상가스트린혈증 마스토미스와 유사하였다.

PTH 수준은 3가지 KO 모델 모두에서 유사하였지만(도 37), 정상가스트린혈증 마스토미스의 ~50%였다. 난소 적출술은 HDC 및 HDC/GAS KO 동물에서 PTH 수준을 증가시켰으며, 이는 부갑상선 분비에 미치는 에스트로겐의 억제성 효과의 손실과 일치하는 것이었다. 이는 히스타민의 부재는 부갑상선 분비에 어떤 영향도 미치지 않는다는 것을 시사한다. 이에 반해, PTH는 GAS KO 동물에서 난소 적출술 이후에 감소되었다. 마스토미스에서, 8주 고가스트린혈증은 PTH 방출을 증가시켰고, 시험관내 실험을 통해서 가스트린 매개 PTH 방출을 확인하였다. 이는 가스트린이 생리학적 PTH 방출을 위해서는 요구된다는 것을 시사한다. 에스트로겐 및 가스트린, 둘 모두의 손실의 조합은 "낮은" PTH 분비 부갑상선을 초래한다. PTH는 RANK-골아세포(골 흡수)¹⁰²를 통한 파골세포의 활성화와 관련이 있는 바, 이러한 환경하에서 가스트린의 부재는 "보호성"인 것으로 해석될 수 있다.

위: 가스트린 KO 동물에서, OVX는 기저부에서 CCK2 수용체를 유의적으로 상향 조절하였고(3배)(도 38), HDC를 ~10배 증가시켰으며, 이는 에스트로겐이 ECL 세포에 대하여 억제성 효과를 미친다는 것을 나타낸다. 방 G 세포에서, OVX는 CaSR을 60%만큼 하향 조절하였고, 이는 G 세포 칼슘 감지가 에스트로겐에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. HDC KO 동물에서, OVX는 대조군(난소 적출술을 받지 않은 것)과 비교하여, CaSR, PTH1R 및 CCK2를 비롯한 대부분의 표적 유전자를 하향 조절하였다. 가스트린은 또한 유의적으로 하향 조절되었다. 이중 KO 동물에서, CCK2는 난소 적출술에 의해 상향 조절되었다. 상기 데이터는 에스트로겐이 칼슘 감지에 관여하는 전사체의 발현, 및 이로써 칼슘 대사를 조절한다는 것을 나타낸다. 특히, 위의 ECL 및 G 세포는 특히 칼슘 생리학적 성질면에서 에스트로겐 반응성이다.

골 형태학적 성질 및 역학적 성질:

골 마이크로CT: 가스트린 KO 마우스에서, 난소 적출술은 대퇴골 밀도 및 부피에는 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았지만, 골내막 및 골막 두께는 증가시켰다(도 39A). 이는 단기간 및 장기간 고가스트린혈증에서 관찰된 효과(해면질 골 및 피질 골 밀도 및 부피 감소 뿐만 아니라, 골내막 및 골막 측정 - 도 24 참조)와 정반대였다. 이로써, 난소 적출되지 않은 골과 비교하였을 때, 강성을 띠지 않고, 약화된 골을 얻었다. 이는 (낮은 에스트로겐 환경하의) 가스트린 부재가 보호성이고, 상기 동물에서의 낮은 순환 PTH 수준을 반영할 수 있다는 것을 입증한다.

HDC KO 마우스: HDC KO 마우스에서 난소 적출술은 대퇴골 밀도 및 부피에 대해 또는 골내막/골막 두께에 대해 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다. 그러나, 골은 난소 적출되지 않은 골과 비교하였을 때, 강성을 띠었고, 골절시키는 데 더 높은 하중을 필요로 하였으며, 증가된 pMOI(p<0.03)를 보였다(도 39B). 그러므로, 본 발명자들의 연구를 통해서 에스트로겐 및 히스타민 손실의 조합이 골 강도를 증가시킨다는 이전 연구⁹⁹를 확인할 수 있었다.

Gas/ HDC KO 마우스: 가스트린/HDC 이중 KO 마우스에서 난소 적출술은 대퇴골 밀도에 대해 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았지만, 해면질 부피 및 피질 부피는 감소되었다(p<0.03)(도 39C). 골내막/골막 두께에서는 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 그 결과로 난소 적출되지 않은 골과 비교하였을 때, 약화되지 않은 골을 얻었다.

골수 qPCR: 가스트린 KO 동물에서 난소 적출술은 두 유전자, ALOX5 및 CXCL12의 상향 조절과 관련이 있었다(도 40A-B). 이는 각각 PTH를 통해 류코트리엔 합성 및 염증 및 골아세포 활성화에 관여한다. 마스토미스 모델에서, 난소 적출술은 ALOX5를 하향 조절하였지만, CXCL12는 상향 조절하였고, 이 효과는 고가스트린혈증에 의해서 유의적으로 변경되지는 않았다. HDC 및 HDC/GAS KO 동물에서의 난소 적출술은 어떤 유의적인 영향도 없었는데, 이는 히스타민이 상기 두 유전자의 조절에서 어떤 역할도 하지 않는다는 것을 나타낸다.

골수 PCR을 통해서 또한 가스트린 KO 동물에서의 난소 적출술은 HIF-1α 및 IGF1의 상향 조절과 관련이 있었다는 것을 확인하였다(도 40C-D). 이는 앞서 언급한 바와 같이, 각각 골 전구 세포 조절 및 골량 유지에 관여한다.

요약( 도 41 ): 마우스 모델에서 (낮은 에스트로겐 환경하의) 가스트린 손실은 골 생리는 변경시켰지만, 골 강도의 유의적인 차이와는 관련이 없었다. 이에 반해, (마스토미스 모델에서) 단기간 또는 장기간 고가스트린혈증과 함께 난소 적출술을 통해서는 유의적으로 더 약한 골을 얻었다. 그러므로, 가스트린은 골수에 대하여 바람직하지 못한, "항-보호성" 효과를 가지는 것으로 보인다. (낮은 에스트로겐 환경하의) HDC KO 단독은 유의적으로 더 강한(및 더 강직성을 띠는) 골과 관련이 있으며, 이는 가스트린과 같이 히스타민이 골 생리에서 조절 역할을 할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. (HDC KO를 통한) 히스타민의 제거는 상기 효과를 역전시켰고, 따라서, 이는 가스트린 및 히스타민이 협력하여 골 생리를 조절하는 중요한 조절인자라는 주장과 일치한다.

낮은 에스트로겐 환경하에서 가스트린 및 HDC 손실(예컨대, 히스타민 손실)의 조합은 유의적으로 더 약한 골과는 관련이 없었고, 골 역학적 성질은 정상인 것과 다르지 않았다. 이는 (가스트린과 같이) 히스타민이 "골다공증성" 유사 골 표현형을 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, (HDC KO를 통한) 히스타민의 감소(제거)는 에스트로겐 감소에 의해 유발된 골다공증유발성 효과를 역전시켰다.

실시예 8: 원리 증명 연구: 3개의 설치류 모델에서 가스트린 길항제가

난소 적출술 매개 골 표현형에 미치는 효과

골 강도 연구, 형태학적 성질 및 순환 바이오마커에 중점을 두고, 3개의 설치류 모델에서 가스트린 길항제인 YF476이 OVX 매개 골 밀도 손실/골 변경에 미치는 효과를 평가하였다. 2개의 "정상적인" OVX 모델: a) 마우스(계통: CD-1 [스위스 계통] - 찰스 리버(Charles River)) 및 b) 래트(계통: CD IGS[스프라그-돌리(Sprague Dawley) 계통] - 찰스 리버) 뿐만 아니라, 마스토미스(내인적으로 활성화된 가스트린/CCK2 수용체 신호전달) 모델을 조사하였다.

동물은 2개월째에 수술(OVX)을 받았고, 회복될 수 있게 한 후, 경구적으로 산 억제 뿐만 아니라, 가스트린 길항제(GA)인 YF476(단일 주사)에 노출시켰다. 마우스 및 래트, 둘 모두는 PPI, 오메프라졸에 노출시킨 반면, 마스토미스는 H₂ 수용체 길항제인 록스티딘에 노출시켰다. GA 투여는 산 억제 개시 시점에 단일 피하 주사였다. 약동학적으로, 상기 용량 범위는 8주 간의 기간에 걸쳐 15-20 nmol이었다. 투약에 관한 상세한 설명은 하기 표 3에 포함되어 있다.

원리 증명 연구에서의 투약
종	산 억제제	GA
마우스 - CD-1	2 ml/10 g (체중); 21 ㎍/mg/일)	15 ug/동물
래트 - CD	0.8 ml/10 g (체중); 8.5 ㎍/mg/일	50 ug/동물
마스토미스	0.85 ml/10 g (체중); 82.7-91.2 ㎍/mg/일	10 ug/동물

각 동물 모델에 대하여 3개의 군을 포함하였다: a) A군 = 위약/염수 처리(OVX 받지 않음/대조군); b) B군 = OVX+산 억제성 요법(OVX); 및 c) C군 = GA 처리된 난소 적출된 동물(OVX+GA). 연구 종료시(2개월), 본 발명자들은 GA가 골 파라미터(마이크로CT, 골 강도 및 조직학적형태계측 뿐만 아니라, 순환 마커)에서의 OVX 매개 변경을 역전시켰는지 여부를 평가하였다.

모델 1: 마우스 OVX: GA 처리 개시 시점에 동물은 89일(3.0개월)된 것이었고, 연구 종료시에는 146일(4.8개월)된 것이었다. 해면질 골 데이터를 조사한 결과, 난소 적출술은 BV/TV(0.05±0.02 대 0.18±0.04, p<0.05) 및 밀도(37±5 대 173±18, p<0.05)를 유의적으로 감소시켰고, SMI(1.8±1.2 대 1.1±0.4, p<0.05) 및 해면질 간격(0.6±0.18 대 0.28±0.05, p<0.05)을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다(하기 표 4, 도 42). 가스트린 길항제 처리가 해면질 두께 및 간격을 제외한, 상기 난소 적출술 매개 골 변경을 역전시켰으며, 상기 해면질 두께 및 간격은 여전히 증가된 상태로 유지되었다. 이는 해면질 골 밀도의 유의적인 증가와 관련이 있었다(70.7±19, p<0.05 대 OVX).

피질 골 파라미터 분석 결과, 난소 적출술은 골 표면적(11.6±0.9 대 13.4±1.4, p<0.05)을 유의적으로 감소시켰고, 피질 두께(0.2±0.01 대 0.15±0.01, p<0.05)를 유의적으로 증가시켰으며, 이는 피질 밀도의 감소(989±26 대 1153±39, p<0.05)와 관련이 있었다(하기 표 5, 도 43). 가스트린 길항제 처리가 OVX 매개 밀도 감소를 역전시켰다(1025±37, p<0.05 대 OVX).

인스트론 장치를 사용하여 골 강도를 측정한 결과, OVX 매개 골 표현형을 역전시키는 데 있어서의 가스트린 길항체의 유용성을 확인할 수 있었다. 난소 적출술은 골 강도(강성도[246±29 대 294±34], 항복 강성도[221±28 대 271±33], 파괴될 때까지의 골절 하중[37±6 대 56±7])를 유의적으로 감소시켰고(p<0.05), 파괴시키는 데 필요한 총 운동량 및 골[28.3±9.7 대 20.4±2.3, p<0.05]을 유의적으로 증가시켰다. 가스트린 길항제 처리는 골절 하중[43±6]을 제외한 상기의 난소 적출술 매개 골 변경을 정상화시켰고, 상기 골절 하중은 증가되었지만, 여전히 대조군보다는 더 낮은 상태 그대로 유지되었다(하기 표 6, 도 44).

조직학적형태계측 결과, OVX 마우스에서 난소 적출술은 흡수 강의 증가와 함께 골 광물화를 감소시켰고, 그뿐만 아니라, TRAP 양성 파골세포 개수를 유의적으로 증가시켰다(p<0.05)(29±5 대 16±3, p<0.05)는 것이 확인되었다. 가스트린 길항제 처리가 상기 현상을 역전시켰다(도 45).

난소 적출술은 순환 에스트로겐(1.9±0.9 pg/ml 대 5.1±1.9)을 유의적(p<0.05)으로 감소시켰고, PTH(123±74 pg/ml 대 51±32) 및 가스트린(3200±263 pg/ml 대 2437±787) 증가와 관련이 있었다. 길항제 처리가 난소 적출술 매개 가스트린 증가를 역전시켰지만, PTH는 그러하지 않았다(하기 표 7, 도 46). 순환 골 바이오마커 또한 OVX에 의해 변경되었다. 구체적으로, CTx-1(0.60±0.14ng/ml 대 0.29±0.13, p<0.05)과 같이 PINP는 증가되었고(0.19±0.01ng/ml 대 0.1y±0.006, p<0.05), 오스테오칼신은 상승하였다(6.7±2.3ng/ml 대 4.1±1.2, p<0.05). 길항제 처리가 상기 3가지 난소 적출술 매개 변경들 각각을 약화시켰다.

요약 (모델 1): 가스트린 길항제의 단일 주사는 마우스 모델에서 (8주째 조사된) 난소 적출술 매개 골 변화의 역전과 관련이 있었다. 낮은 순환 에스트로겐 및 높은 PTH 수준에도 불구하고 상기 효과는 발생하였고, 이는 동화 작용성 효과와 일치하는 조직학적형태계측 파라미터(광물화, 파골세포 개수) 및 순환 골 바이오마커 발현의 정상화에 의해 예시되었다.

모델 2: 래트 OVX 모델: GA 처리 개시 시점에 동물은 98일(3.2개월)된 것이었고, 연구 종료시에는 163일(5.4개월)된 것이었다. 해면질 골 데이터를 조사한 결과, 난소 적출술이 BV/TV(0.15±0.03 대 0.27±0.07, p<0.05) 및 밀도(159±26 대 287±71, p<0.05)를 유의적으로 감소시켰다는 것인 확인되었다. 해면질 간격(0.58±0.1 대 0.44±0.19, p<0.05) 뿐만 아니라, SMI(1.5±0.2 대 0.6±0.4, p<0.05)는 증가되었다(하기 표 8, 도 47). 가스트린 길항제 처리는 SMI(1.3±0.17)를 제외한, 상기의 난소 적출술 매개 골 변경을 역전시켰고, 상기 SMI는 여전히 증가된 상탤 그대로 유지되었다. 이는 해면질 골 밀도의 유의적인 증가와 관련이 있었다(204±27, p<0.05 대 OVX).

피질 골 파라미터 분석 결과, 난소 적출술은 골 표면적을 유의적으로 감소시켰고(42.7±2.5 대 49.9±3, p<0.05), 피질 두께를 유의적으로 증가시켰으며(0.66±0.03 대 0.61±0.07, p<0.05), 이는 피질 밀도의 감소(1067±22 대 1144±17, p<0.05)와 관련이 있었다(하기 표 9, 도 48). 가스트린 길항제 처리가 OVX 매개의 밀도 감소를 역전시켰다(1098±24, p<0.05 대 OVX).

인스트론 장치를 사용하여 골 강도를 측정한 결과, OVX 매개 골 표현형을 역전시키는 데 있어서의 가스트린 길항체의 유용성을 확인할 수 있었다. 난소 적출술은 골 강도(강성도[495±43 대 578±48], 항복 강성도[445±39 대 526±66], 및 파괴될 때까지의 골절 하중[265±29 대 300±17])를 유의적으로 감소시켰다(p<0.05). 가스트린 길항제 처리가 이러한 난소 적출술 매개 골 변경을 정상화시켰다(하기 표 10, 도 49).

조직학적형태계측 결과, OVX 래트에서 골 광물화 변경과 함께 흡수 강 증가 뿐만 아니라, TRAP 양성 파골세포 개수의 유의적인 증가(p<0.05)(11±3 대 2±2, p<0.05)가 확인되었다. 가스트린 길항제 처리가 상기 현상을 역전시켰다(도 50).

난소 적출술은 순환 에스트로겐(2.1±0.3 pg/ml 대 5.3±2.5)을 유의적(p<0.05)으로 감소시켰고, 가스트린(3200±789 pg/ml 대 954±406) 증가와 관련이 있었다. 길항제 처리가 에스트로겐 또는 가스트린에는 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다(하기 표 11, 도 51). 순환 골 바이오마커는 또한 OVX에 의해 변경되었다. 구체적으로, PINP(0.57±0.18 ng/ml 대 0.35±0.06, p<0.05) 및 오스테오칼신, 둘 모두 상승되었다(1.35±0.9 ng/ml 대 0.43±0.07, p<0.05). 길항제 처리가 상기 난소 적출술 매개 변경들 각각을 약화시켰다.

요약 (모델 2): 가스트린 길항제의 단일 주사는 래트 모델에서 (8주째 조사된) 난소 적출술 매개 골 변화의 역전과 관련이 있었다. 낮은 순환 에스트로겐 및 높은 가스트린 수준에도 불구하고 상기 효과는 발생하였고, 이는 동화 작용성 효과와 일치하는 조직학적형태계측 파라미터(광물화, 파골세포 개수) 및 순환 골 바이오마커 발현의 정상화에 의해 예시되었다.

모델 3: 마스토미스 OVX 모델: GA 처리 개시 시점에 동물은 121일(4.0개월)된 것이었고, 연구 종료시에는 180일(6.0개월)된 것이었다. 난소 적출술은 BV/TV 비(0.06±0.03 대 0.14±0.05, p<0.05), 해면질 개수(1.4±0.3 대 2.0±0.6, p<0.05), 및 골 표면적(8.5±3.7 대 18.5±2.3, p<0.05)를 유의적으로 감소시켰고, SMI(1.1±0.3 대 0.74±0.21, p<0.05) 뿐만 아니라, 해면질 간격(0.82±0.15 대 0.57±0.17, p<0.05)을 유의적으로 증가시켰다(하기 표 12, 도 52). 이는 해면질 골 밀도의 유의적인 감소와 관련이 있었다(60.6±37 대 157±51, p<0.05). 가스트린 길항제 처리가 상기 난소 적출술 매개 골 변경을 역전시켰고, 이는 해면질 골 밀도(187±66)를 정상화시켰다. 상기 약물은 또한 해면질 개수(2.4±0.6, p<0.05 대 대조군) 및 두께(0.08±0.01, p<0.05 대 대조군)의 증가와도 관련이 있었다.

피질 골 파라미터 평가 결과, 난소 적출술은 어떤 피질 골 파라미터에도 유의적인 영향을 미치지 못했다(하기 표 13, 도 53). 가스트린 길항제 처리가 난소 적출된 동물에서는 어떤 영향도 미치지 못했다.

인스트론 장치를 사용하여 골 강도를 측정한 결과, OVX 매개 골 표현형을 역전시키는 데 있어서의 가스트린 길항체의 유용성을 확인할 수 있었다. 난소 적출술은 골 강도(강성도[138±7 대 332±65], 항복 강성도[125±6 대 299±59], 파괴될 때까지의 골절 하중[38±4 대 56±13])를 유의적으로 감소시켰고(p<0.05), 뼈를 파괴시키는 데 필요한 총 운동량[51±7.7 대 34±11.6, p<0.05]을 유의적으로 증가시켰다. 가스트린 길항제 처리는 상기의 난소 적출술 매개 골 변경을 정상화시켰다(하기 표 14, 도 54).

조직학적형태계측 결과, OVX 마스토미스에서 골 광물화 감소와 함께 흡수 강 증가 뿐만 아니라, TRAP 양성 파골세포 개수의 유의적인 증가(p<0.05)(27±11 대 9±3, p<0.05)가 확인되었다. 가스트린 길항제 처리가 상기 현상을 역전시켰다(도 55).

난소 적출술은 순환 에스트로겐(1.9±0.6 pg/ml 대 8.9±2.1)을 유의적(p<0.05)으로 감소시켰고, PTH(523±308 pg/ml 대 290±71) 및 가스트린(7265±3198 pg/ml 대 3705±2015) 증가와 관련이 있었다. 길항제 처리가 난소 적출술 매개의 가스트린(2704±430) 및 PTH(150±37) 증가를 역전시켰다(하기 표 15, 도 56). 순환 골 바이오마커는 또한 OVX에 의해 변경되었다. 구체적으로, CTx-1(0.24±0.17 ng/ml 대 0.03±0.03, p<0.05)과 같이, PINP는 증가되었고(0.16±0.03 ng/ml 대 0.13±0.01, p<0.05), 반면, 오스테오칼신은 상승되었다(1.6±1.1 ng/ml 대 0.4±0.16, p<0.05). 길항제 처리가 상기 3개의 난소 적출술 매개 변경들 각각을 약화시켰다.

요약 (모델 3) : 가스트린 길항제의 단일 주사는 마스토미스 모델에서 (8주째 조사된) 난소 적출술 매개 골 변화의 역전과 관련이 있었다. 낮은 순환 에스트로겐에도 불구하고 상기 효과는 발생하였고, 이는 동화 작용성 효과와 일치하는 조직학적형태계측 파라미터(광물화, 파골세포 개수) 및 순환 골 바이오마커 발현의 정상화에 의해 예시되었다.

요약 (모델 1, 2, 및 3) : 가스트린 길항제의 단일 주사(10-20 ㎍/g(체중))는 3가지 모델 중 3개에서 난소 적출술 매개 골 손실 및 강도를 역전시켜 이는 정상화되거나, 또는 정상화하는 경향을 보였다. 낮은 순환 에스트로겐 및 높은 PTH 수준에도 불구하고 상기 효과는 발생하였고, 이는 사전 골량 신호전달의 변형과 관련이 있었다.

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Claims (16)

1. 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 피험체에게 치료학상 유효량의 가스트린 수용체 표적화제를 1회 이상의 용량으로 투여하여 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함하는, 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제를 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태를 치유하기 위한 치료 기간 동안 투여하는 것인 치료 방법.
3. 제1항에 있어서, 1회 이상의 용량의 가스트린 수용체 표적화제를, 고가스트린혈증 원인과 상관없이, 고가스트린혈증 지속 기간 동안 피험체에게 투여하는 것인 치료 방법.
4. 제1항에 있어서, 고가스트린혈증과 관련된 골 질환 또는 병태가 골다공증을 특징으로 하는 질환 또는 병태인 치료 방법.
5. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제가 선택적 CCK2 수용체 길항제인 치료 방법.
6. 제5항에 있어서, 선택적 CCK2 수용체 길항제가 YF476인 치료 방법.
7. 제1항에 있어서, 피험체가 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성인 치료 방법.
8. 제1항에 있어서, 피험체가 (a) 난소 기능 저하 또는 난소 부전을 갖는 여성이고, (b) 고가스트린혈증을 앓는 것인 치료 방법.
9. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제를 치료학상 유효량의 양성자 펌프 억제제(PPI) 또는 히스타민 2 수용체(H₂R) 길항제와 함께 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 치료 방법.
10. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제의 치료학상 유효량이 10-25 나노몰인 치료 방법.
11. 제8항에 있어서, 고가스트린혈증이 신생물성 고가스트린혈증, 또는 산 억제성 약물요법과 관련된 고가스트린혈증인 치료 방법.
12. 제10항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제의 치료학상 유효량이 피험체 체중 1 kg당 0.2-14 ㎍인 치료 방법.
13. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제를 피험체에게 단회 용량으로 피하 주사에 의해 투여하는 것인 치료 방법.
14. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제를 피험체에게 정맥내 주사에 의해 투여하는 것인 치료 방법.
15. 제1항에 있어서, 가스트린 수용체 표적화제를 20-100 mg 범위의 용량으로 피험체에게 경구 투여하는 것인 치료 방법.
16. 제9항에 있어서, PPI 또는 H₂R 길항제를 피험체에게 경구 투여하는 것인 치료 방법.

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