富硒虫草菌及其培养方法、富硒黄酒及其制备方法
技术领域
本发明涉及富硒技术领域,特别涉及一种富硒虫草菌,以及该富硒虫草菌的培养方法,同时,还涉及由该富硒虫草菌制得的富硒黄酒及制备方法。
背景技术
硒(Se)是人和动物生命活动所必需的微量元素之一,多存在于人体的肝、肾、胰、心、脾、牙釉质和指甲中,硒在自然界中以无机硒和有机硒两种形式存在,无机硒毒性较大,对动植物及微生物细胞有一定的毒害作用,因此通常在食物中补充的硒以有机硒形式存在,目前,有机硒多是利用生物转化的方法获得。
冬虫夏草(Cordyceps sinensis),又名中华虫草,主产于四川、西藏、云南等海拔在4000~5000米的高山草甸土中。现代药理学研究结果证实,青海冬虫夏草中含有虫草酸约7%,碳水化合物约28.9%,脂肪约8.4%,蛋白质约25%,脂肪中82.2%为不饱和脂肪酸,此外还含有虫草多糖、多种氨基酸、核苷及多种碱基、麦角甾醇及其氧化物、甘露醇、硬脂酸、挥发油以及多种矿物质元素。虫草性甘温平,是著名的滋补强壮药,适用于治疗肺气虚和肺肾两虚、改善心肌缺血、扩张支气管、祛痰平喘,另外对中枢神经系统能起镇静、抗惊厥、降温作用,是一味不可多得的珍贵药材。然而,由于虫草药源紧张,价格昂贵,远不能满足国内外市场的需要,近年来,人们采用以天然虫草真菌发酵法获得人工虫草菌,并研究证明,人工虫草菌与天然冬虫夏草具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效,且毒性比天然者小,因此虫草菌及相关产品得到不断发展,如虫草菌发酵制剂、虫草菌发酵酒等。
利用虫草菌发酵液进行硒的生物转化、富集获得富硒虫草菌,对于开发虫草功能性食品、药品具有重要意义,但由于无机硒的毒性,在虫草菌发酵培养过程,无机硒的加量会受到限制,无机硒量超出则会对菌丝体产生抑制或毒害作用,使菌丝生长缓慢或停止,因此限制了菌丝体中有机硒的含量,影响硒的功能性发挥。
发明内容
为解决现有技术中存在的不足,本发明提供了一种富硒虫草菌的培养方法,可以显著提高无机硒的加入量,以获得高有机硒含量的富硒虫草菌。
为实现上述目的,本发明的富硒虫草菌的培养方法,是在虫草菌的发酵培养过程采用两次加入无机硒的方式进行富硒培养,第一次加入无机硒的时间为虫草菌进入对数生长期初期,加入量为140~150μg/mL;第二次加入无机硒的时间为虫草菌处于对数生长期旺盛期,加入量为50~60μg/mL。
本发明通过将无机硒加入到虫草菌的深层液态发酵培养基中,利用虫草菌的高效生物转化作用对微量元素硒进行富集,以获得富含有机硒的虫草菌。根据虫草菌菌丝体在不同生长阶段对硒的耐受性能、吸收性能及转化性能等影响,确定在虫草菌的发酵培养过程采用两次加入无机硒的方式进行富硒培养,其中第一次加入无机硒是在虫草菌进入对数生长期初期,利用此生长阶段的虫草菌菌丝体基本适应了发酵环境,对无机硒具有较强的抗性,以及菌体的富硒能力得到较好驯化的基础上,加入140~150μg/mL的无机硒,使第一次获得较大的富硒量,同时避免无机硒过量造成的毒性影响;继续发酵培养,在虫草菌菌丝体进入对数生长期旺盛期,菌体生长较快,富硒能力较佳,此时第一次加入的无机硒已基本转化、消耗完全,可以继续吸收、转化无机硒,再加入50~60μg/mL的无机硒,使虫草菌进一步富硒,大大促进有机硒的生成,从而获得高有机硒含量的富硒虫草菌。通过本发明的富硒培养方式,可以显著提高富硒量,解决了无机硒的毒性对富硒量的限制瓶颈,进而提高虫草菌的功能性。该富硒培养方法中,无机硒的加入时间与加入量是与虫草菌菌丝体的生长性能相互关联、相互对应的,从而进行高效富硒。
作为对上述方式的限定,所述第一次加入无机硒的时间为发酵培养7~8h,所述第二次加入无机硒的时间为发酵培养48~50h。
明确无机硒加入操作对应的发酵时间,确定更优的富硒培养过程。
作为对上述方式的限定,所述富硒虫草菌的培养方法包括以下步骤:
a、斜面培养虫草菌;
b、培养虫草菌种子液;
c、将虫草菌种子液进行发酵培养,发酵进行到7~8h加入无机硒140~150μg/mL,搅拌均匀后继续发酵培养,进行到48~50h再加入无机硒50~60μg/mL,搅拌均匀后继续发酵到结束,分离得到富硒虫草菌的菌丝体。
作为对上述方式的限定,所述步骤a中斜面培养基为马铃薯琼脂培养基;所述步骤b中种子培养基包括葡萄糖40g/L,蛋白胨10.0~12.0g/L,磷酸二氢钾0.5~0.7g/L,硫酸镁0.5~0.7g/L;所述步骤c中发酵培养基包括葡萄糖53.0~54.0g/L,蛋白胨26.0~27.0g/L,硫酸镁2.0~3.0g/L,磷酸二氢钾0.5~0.7g/L;虫草菌种子液的接种量为每1L发酵培养基接种1.25~1.50mL虫草菌种子液;所述步骤a、b、c中虫草菌的培养温度均为32~35℃。
按常规真菌培养方法,对虫草菌依次进行斜面培养、种子培养和发酵培养,在发酵培养过程中进行富硒,通过两次加硒培养,显著提高富硒量。在虫草菌的培养中,优化各培养阶段的培养基组成,利于虫草菌的生长繁殖、及对硒的生物转化。富硒虫草菌菌丝体的分离可通过常规分离手段实现,其中采用离心机分离操作效果较优,以离心转速3000~5000r/min,离心时间10~15min,重复3次进行分离,得到菌丝体。
同时,本发明还提供了一种富硒虫草菌,由如上所述的富硒虫草菌的培养方法获得,所述富硒虫草菌的菌丝体中硒含量为0.150~0.159mg/g。
通过本发明的培养方法获得的富硒虫草菌中硒含量达到0.150~0.159mg/g,相较于常规有机硒含量0.061~0.094mg/g,得到显著提高。
此外,本发明还提供了一种富硒黄酒的制备方法,包括以下步骤:
(一)、将由如上所述的富硒虫草菌的培养方法获得的富硒虫草菌菌丝体进行细胞壁破碎处理,得到富硒虫草菌菌浆;
(二)、配制复合虫草菌营养液,所述复合虫草菌营养液包括以下重量份组分:富硒虫草菌菌浆5份、枸杞干粉1~2份、大枣干粉2~3份、水1份。
(三)、将熟黍米、复合虫草菌营养液与水混合,接种酒曲,进行糖化发酵,得到富硒黄酒。
黄酒(Chinese rice wine)又称老酒,是以稻米、黍米、玉米、小米、小麦等谷物为主要原料,经蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的酿造酒,酿造中以麦曲或小曲做糖化发酵剂。将本发明的富硒虫草菌,与黄酒相结合,经传统制作工艺,酿造出一款色泽呈橙黄色、清亮透明、有光泽,且香气协调的富硒虫草保健酒,其酒体丰满协调、醇和爽口,具有黄酒和虫草菌的典型香气,同时兼具了虫草菌抗菌、抑制肿瘤细胞生长、降低血压、扩张气管等作用和有机硒的抗肿瘤、提高机体免疫力、具有抗衰老和预防心血管疾病、克山病和骨节病等功效,是一款具有保健功能的新型富硒虫草黄酒。在富硒虫草黄酒的酿造过程,将复合虫草菌营养液与熟黍米混合后进行糖化发酵,一方面利用复合虫草菌营养液有效掩盖虫草菌带来的特殊味道,另一方面通过加入枸杞、大枣得到的复合虫草菌营养液可以增加虫草菌营养与有机硒之间的相须、相配伍的关系,再一方面利用枸杞、大枣还可改善酒的口感和营养价值。由于红枣味甘性温、归脾胃经,有补中益气、养血安神、缓和药性的功能,还能提高体内吞噬细胞系统的吞噬功能,有保护肝脏、增强体力的作用;枸杞性平和,味甘甜,有滋补肝肾,强壮筋骨,养血明目之功效,尤其适宜于中老年人服用,有延年益寿的效果;将大枣和枸杞与富硒虫草菌菌浆复合制成富硒虫草菌营养液,添加到黄酒中以增强黄酒的固本功效。
作为对上述方式的限定,所述步骤(一)中细胞壁破碎处理包括以下步骤:将富硒虫草菌菌丝体以1kg量加入到1L水的比例进行调浆,然后进行生物酶酶解,最后进行超声波细胞破碎;所述生物酶包括纤维素酶和蛋白酶,纤维素酶加入量为0.1~0.2g/L,蛋白酶加入量为0.1~0.2g/L,酶解时间为0.4~0.5h;超声波细胞破碎的频率为20KH,功率为150W,破碎时间为2.0~2.5h。
采用生物酶酶解与超声波细胞破碎相结合的方法对虫草菌菌丝体进行破壁,弥补单一破碎法可能带来的破碎不完全、菌丝细胞内有效成分不能完全释放出来的缺点,以尽量完全获得菌丝体内营养组分。
作为对上述方式的限定,所述步骤(三)中熟黍米、复合虫草菌营养液与水的混合比例为20~25kg:1kg:18~20kg;酒曲接种量为每10kg熟黍米加入1~1.2kg酒曲;糖化发酵温度为30~32℃;糖化发酵至糖分含量降至16.0~18.0g/L,停止发酵。
进一步限定熟黍米与复合虫草菌营养液混合酿酒的酿造条件,获得性能最优的富硒黄酒。
同时,本发明还提供了一种富硒黄酒,由如上所述的富硒黄酒的制备方法制得,所述富硒黄酒的理化指标为酒精度(20℃)/(%Vol)16.0~18.0,氨基酸态氮2.0~3.0g/L,18种氨基酸总含量8900~9500μg/L,有机酸含量28.0~30.0g/L,硒含量10.0~11.0μg/L,虫草酸2.0~3.0mg/L,虫草素0.5~1.0mg/L。
采用本发明的酿造方法获得的富硒黄酒,硒含量及其它功能性有效成分均得到显著提高,从而使该富硒黄酒具有显著的保健功效。
综上所述,采用本发明的技术方案,在虫草菌发酵培养过程采用两次加入无机硒的方式进行虫草菌的富硒培养,通过限定两次加入无机硒的时间和加入量,解决了无机硒的毒性对富硒量的限制瓶颈,显著提高虫草菌的富硒量,以获得富含有机硒的虫草菌。另外,本发明还将富含有机硒的虫草菌与大枣、枸杞复配成复合虫草菌营养液,与熟黍米混合,通过传统的黄酒酿造工艺,酿造出一款色泽呈橙黄色、清亮透明、有光泽,且香气协调的富硒虫草保健酒,其酒体丰满协调、醇和爽口,具有黄酒和虫草菌的典型香气,同时兼具了虫草菌和有机硒的营养、功效,是一款具有保健功能的新型富硒黄酒。
具体实施方式
实施例一
本实施例涉及富硒虫草菌及其培养方法。
实施例1.1
本实施例涉及一种富硒虫草菌的培养,包括以下步骤:
a、斜面培养虫草菌:配制马铃薯琼脂培养基作为虫草菌的斜面培养基,斜面培养基组分为马铃薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L和琼脂20.0g/L;无菌操作下将虫草菌菌种接种到斜面培养基上,在32~35℃下培养48h,然后放入4℃冰箱内保存,得到虫草菌斜面;
b、培养虫草菌种子液:配制种子培养基,组分为葡萄糖40g/L,蛋白胨10.0g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,硫酸镁0.5g/L;无菌操作下取虫草菌斜面以0.5cm3/L的接种量接种到种子培养基内,在32~35℃下静置培养3天,得到虫草菌种子液;
c、将虫草菌种子液进行发酵培养:配制发酵培养基,组分为葡萄糖53.0g/L,蛋白胨26.0g/L,硫酸镁2.0g/L,磷酸二氢钾0.5g/L;无菌操作下将虫草菌种子液接种到发酵培养基中,接种量为每1L发酵培养基接种1.25mL虫草菌种子液,在32~35℃下进行摇床发酵培养,摇床转速为100r/min,当发酵进行到8h时向发酵液加入无机硒140μg/mL,搅拌均匀后继续在32~35℃下发酵,进行到48h时向发酵液再加入无机硒60μg/mL,搅拌均匀后在32~35℃下仍继续发酵,发酵8天结束,得到富硒虫草菌的发酵液,用离心机进行分离,离心机转速3500r/min,每次离心时间15min,用清水清洗后再次离心,重复3次,得到富硒虫草菌菌丝体,测定该富硒虫草菌菌丝体中硒含量为0.150mg/g。
实施例1.2
本实施例涉及一种富硒虫草菌的培养,包括以下步骤:
a、斜面培养虫草菌:配制马铃薯琼脂培养基作为虫草菌的斜面培养基,斜面培养基组分为马铃薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L和琼脂20.0g/L;无菌操作下将虫草菌的菌种接种斜面培养基上,在32~35℃下培养48h,然后放入4℃冰箱内保存,得到虫草菌斜面;
b、培养虫草菌种子液:配制种子培养基,组分为葡萄糖40g/L,蛋白胨12.0g/L,磷酸二氢钾0.7g/L,硫酸镁0.7g/L;无菌操作下取虫草菌斜面以0.5cm3/L的接种量接种到种子培养基内,在32~35℃下静置培养3天,得到虫草菌种子液;
c、将虫草菌种子液进行发酵培养:配制发酵培养基,组分为葡萄糖54.0g/L,蛋白胨27.0g/L,硫酸镁3.0g/L,磷酸二氢钾0.7g/L;无菌操作下将虫草菌种子液接种到发酵培养基中,接种量为每1L发酵培养基接种1.5mL虫草菌种子液,在32~35℃下进行摇床发酵培养,摇床转速为100r/min,当发酵进行到7h时向发酵液加入无机硒150μg/mL,搅拌均匀后继续在32~35℃下发酵,进行到50h时向发酵液再加入无机硒50μg/mL,搅拌均匀后在32~35℃下仍继续发酵,发酵9天结束,得到富硒虫草菌的发酵液,用离心机进行分离,离心机转速5000r/min,每次离心时间10min,用清水清洗后再次离心,重复3次,得到富硒虫草菌菌丝体,测定该富硒虫草菌菌丝体中硒含量为0.159mg/g。
采用本发明富硒虫草菌的培养方法,得到的富硒虫草菌菌丝体中硒含量为0.150~0.159mg/g,富硒虫草菌发酵液中虫草菌菌丝体含量为3.91g/L。
实施例二
本实施例涉及富硒黄酒及其制备方法。
实施例2.1
本实施例涉及一种富硒黄酒的酿造,包括以下步骤:
(一)、将实施例1.1得到的富硒虫草菌菌丝体按1kg菌丝体加入1L水的比例进行调浆,然后加入纤维素酶0.2g/L和蛋白酶0.1g/L进行酶解,酶解时间为0.5h,之后使用超声波细胞粉碎机进行细胞壁破碎处理,超声破碎频率20KH,功率150W,破碎时间2.5h,得到富硒虫草菌菌浆;
(二)、按质量份数取富硒虫草菌菌浆5份、枸杞干粉1份、大枣干粉3份、水1份,混合均匀,配制复合虫草菌营养液;
(三)、取熟黍米、复合虫草菌营养液与水按20kg:1kg:18kg的质量配比混合均匀,接种酒曲,进行糖化发酵,所述酒曲接种量为每10kg熟黍米接种1kg酒曲,发酵温度为30~32℃,待发酵酒中总糖含量降至17g/L时停止发酵,进行压榨、过滤,得到富硒黄酒的发酵原酒,再经陈酿、勾兑、包装,得到富硒黄酒产品。
对富硒黄酒的发酵原酒进行检测,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)16.0g/L,非糖类固形物26.2g/L,总酸(以乳酸计)6.5g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)17.5,氨基酸态氮2.1g/L,同时18种氨基酸总含量为8999μg/L,有机酸含量为28.3g/L,硒含量为10.1μg/L,虫草酸2.2mg/L,虫草素0.5mg/L。
实施例2.2
本实施例涉及一种富硒黄酒的酿造,包括以下步骤:
(一)、将实施例1.2得到的富硒虫草菌菌丝体按1kg菌丝体加入1L水的比例进行调浆,然后加入纤维素酶0.1g/L和蛋白酶0.2g/L进行酶解,酶解时间为0.4h,之后使用超声波细胞粉碎机进行细胞壁破碎处理,超声破碎频率20KH,功率150W,破碎时间2.0h,得到富硒虫草菌菌浆;
(二)、按质量份数取富硒虫草菌菌浆5份、枸杞干粉2份、大枣干粉2份、水1份,混合均匀,配制复合虫草菌营养液;
(三)、取熟黍米、复合虫草菌营养液与水按25kg:1kg:20kg的质量配比混合均匀,接种酒曲,进行糖化发酵,所述酒曲接种量为每10kg熟黍米接种1kg酒曲,发酵温度为30~32℃,待发酵液中总糖含量降至17g/L时停止发酵,进行压榨、过滤,得到富硒黄酒的发酵原酒,再经陈酿、勾兑、包装,得到富硒黄酒产品。
对富硒黄酒的发酵原酒进行检测,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)17.1g/L,非糖类固形物28.2g/L,总酸(以乳酸计)7.0g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)18.5,氨基酸态氮2.5g/L,同时18种氨基酸总含量为9002μg/L,有机酸含量为28.8g/L,硒含量为11.0μg/L,虫草酸2.9mg/L,虫草素0.8mg/L。
采用本发明富硒黄酒的制备方法得到的富硒黄酒,其发酵原酒的各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)16.0~18.0g/L,非糖类固形物26.0~28.0g/L,总酸(以乳酸计)6.0~8.0g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)16.0~18.0,氨基酸态氮2.0~3.0g/L,同时18种氨基酸总含量为8900~9500μg/L,有机酸含量为28.0~30.0g/L,硒含量为10.0~11.0μg/L,虫草酸2.0~3.0mg/L,虫草素0.5~1.0mg/L。
实施例三
本实施例涉及富硒虫草菌培养过程无机硒加入方式对富硒虫草菌及富硒黄酒质量的影响,以及富硒黄酒酿造条件对产品质量的影响。
对比例1
本实施例与实施例1.1大致相同,唯一不同之处在于无机硒的加入方式,采用在虫草菌种子液发酵培养开始时向发酵液加入200μg/L无机硒,得到富硒虫草菌,其菌丝体中硒含量为0.088mg/g;将该富硒虫草菌用于制备富硒黄酒,酿造过程与实施例2.1相同,得到富硒黄酒的发酵原酒,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)16.1g/L,非糖类固形物26.5g/L,总酸(以乳酸计)6.1g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)17.5,氨基酸态氮2.0g/L,同时18种氨基酸总含量为7985μg/L,有机酸含量为28.4g/L,硒含量为4.1μg/L,虫草酸1.5mg/L,虫草素0.2mg/L。
将对比例1与实施例1.1、2.1的结果比较可见,对比例1得到的虫草菌菌丝体的富硒量远远低于实施例1.1,进一步得到的黄酒的有机硒、虫草酸和虫草素等有效物质含量也都显著低于实施例2.1。
对比例2
本实施例与实施例1.1大致相同,唯一不同之处在于无机硒的加入方式,采用在虫草菌种子液发酵培养开始时向发酵液加入60μg/L无机硒,在发酵进行到48h时再次加入140μg/L的无机硒,得到富硒虫草菌,其菌丝体中硒含量为0.112mg/g;将该富硒虫草菌用于制备富硒黄酒,酿造过程与实施例2.1相同,得到富硒黄酒的发酵原酒,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)17.2g/L,非糖类固形物24.3g/L,总酸(以乳酸计)6.1g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)18.1,氨基酸态氮2.1g/L,同时18种氨基酸总含量为8985μg/L,有机酸含量为28.1g/L,硒含量为6.1μg/L,虫草酸1.7mg/L,虫草素0.3mg/L。
将对比例2与对比例1、实施例1.1、2.1的结果比较可见,对比例1得到的虫草菌菌丝体的富硒量虽然较对比例1有所提高,但仍远低于实施例1.1,进一步得到的黄酒的有机硒、虫草酸和虫草素等有效物质含量也都显著低于实施例2.1。
综上所述,富硒过程无机硒的加入方式直接影响富硒效果及后续富硒产品的保健功效,采用本发明的富硒方法,获得的富硒虫草菌能显著提高富硒量,打破目前富硒技术的瓶颈,采用本发明的酿造方法,获得的富硒黄酒不仅具有高富硒量,而且能获得更多的虫草营养物质,显著提高该黄酒的保健功效。
对比例3
本实施例与实施例2.1大致相同,唯一不同之处在于直接将虫草菌菌丝体与熟黍米、水混合后,接种酒曲,糖化发酵,而不是采用复合虫草菌营养液,得到富硒黄酒的发酵原酒,该发酵原酒具有浓重的泥土气味,黄酒香气典型性不足,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)17.8g/L,非糖类固形物23.35g/L,总酸(以乳酸计)6.38g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)17.2,氨基酸态氮1.98g/L,同时18种氨基酸总含量为8256μg/L,有机酸含量为24.52g/L,硒含量为3.25μg/L,虫草酸1.02mg/L,虫草素0.152mg/L。
将对比例3与实施例2.1的结果比较可见,对比例3得到的黄酒具有浓重的泥土气味,其有机硒、虫草酸和虫草素等有效物质含量也都显著低于实施例2.1。
对比例4
本实施例与实施例2.1大致相同,唯一不同之处在于虫草菌菌丝体的细胞壁破碎处理方式,仅采用超声波细胞粉碎机进行细胞壁破碎,超声破碎条件同实施例2.1,得到富硒黄酒的发酵原酒,其各项理化指标为总糖(以葡萄糖计)17.3g/L,非糖类固形物24.2g/L,总酸(以乳酸计)5.8g/L,酒精度(20℃)/(%Vol)17.6,氨基酸态氮1.9g/L,同时18种氨基酸总含量为7986μg/L,有机酸含量为24.4g/L,硒含量为5.1μg/L,虫草酸1.2mg/L,虫草素0.1mg/L。
将对比例4与实施例2.1的结果比较可见,对比例4得到的黄酒的有机硒、虫草酸和虫草素等有效物质含量也都显著低于实施例2.1。
本发明富硒黄酒的制备方法中,使用复合虫草菌营养液与熟黍米发酵,能够有效改善黄酒的品质,采用生物酶与超声破碎的方式相结合进行菌丝体的破壁,能够显著提高黄酒的保健功效。