CN106106187B - 一种建立泰山黄精高频再生体系的方法及培养基 - Google Patents

Abstract

本发明针对当前泰山黄精生产中用种子繁殖困难，常规根茎繁殖易出现病虫害加重和种质退化，而组培主要以根茎顶芽和茎尖为外植体建立快繁体系，外植体来源单一、试验材料消耗量大、繁殖效率低的现状，选择以比较易得的黄精顶芽芽鳞为外植体试材，通过诱导芽鳞分化获得不定根，再对不定根进一步诱导产生同时具有不定根和顶芽的根茎、不定芽团和多种形态的愈伤组织等不同类型的分化体；对这些类型的分化体分别继续培养，均可继续产生新的不定芽团、具顶芽根茎和多种类型愈伤组织，从而建立泰山黄精离体根、茎、叶的高频再生体系；采用同样的培养基也可获得根茎的高频再生体系。利用以上方法获得的根、茎、叶、愈伤组织及根茎之间在不同培养时期可相互转化生长。

Description

一种建立泰山黄精高频再生体系的方法及培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用泰山黄精离体芽鳞为外植体建立泰山黄精高频再生体系的方法及培养基。

背景技术

泰山黄精(polygonatum sibiricum Red.)为百合科黄精属多年生草本植物，别名老虎姜、鸡头参、仙人余粮等。该属植物约有40多种，主要分布在北温带和北亚热带，我国有31种，全国大部分省市均有分布。泰山黄精与滇黄精、多花黄精同被《中国药典》（2010版）确定为正品药用品种，主要以其肉质根状茎入药，药性甘，平；归脾、肺、肾经；具补气养阴，健脾，润肺，益肾的药用功效。泰山黄精也称“鸡头黄精”，主产泰山地区，是著名的泰山四大名药之一，属药用正品黄精。

自古以来，泰山黄精主要作为常用中药方的配药使用，市场需求量并不大，多以采挖野生资源为主。随着对黄精应用研究的不断深入，其用途也日益广泛，除药用保健外，还用以加工成饮料、化妆品及各种菜肴；因其独特的外形，还被作为观赏花卉等园林用途，因此，近年来，市场对黄精的需求量快速增长，供需矛盾日益突出。因目前市场上黄精的来源还主要靠采挖野生资源，这导致了人们对野生资源的过度掠夺性采挖，致使黄精野生资源濒临灭绝，而黄精人工繁育栽植的规模较小，并且面临繁育技术方面的一些问题，如黄精直接用种子繁殖较难且容易出现品种退化问题；生产上一般采用的根茎繁殖方式也存在连续种植后根茎病虫害逐年加重、品质下降的问题，进而影响黄精产品质量和产量。再加上，黄精野生生长环境遭到严重破坏，很难恢复自然种群生长，也更进一步影响了黄精资源的可持续利用和深入发展。为解决黄精供需矛盾，从种源方面改善黄精品质，提高生产繁殖效率，更好地保护生态环境，亟需进行野生黄精人工繁育技术方面的研究。

利用组织培养技术对黄精进行快速繁殖，既有利于对黄精野生资源的保护及高效繁殖又有利于黄精药材的商品化生产。对不同品种黄精进行组织培养技术的研究已有很多报道，但大多集中在多花黄精和鸡头黄精。Zhao等以多花黄精顶芽为外植体建立快繁体系，获得黄精再生植株；徐忠传等筛选出有利于离体多花黄精不定芽增殖的最佳6-BA浓度，并得到可用于生根的再生苗，完善了多花黄精组培技术体系；刘红美等以多花黄精带芽根茎为外植体建立多花黄精组织培养快速繁殖体系；万学峰等以多花黄精的根茎为外植体，初步研究了福建多花黄精快速繁殖技术体系，繁殖系数3.0左右；梁引库进行了黄精脱毒苗繁殖方面的现状阐述，指出黄精脱毒组培苗可有效减轻黄精苗木病虫害发生；李莺等以鸡头黄精的根状茎作为外植体，研究了植物激素对其离体快速繁技术的影响。对泰山黄精的组培快繁技术研究，最早报道的是牟小翎等以泰山野生黄精的根状茎顶芽和茎尖为外植体进行培养，获得黄精组培苗，繁殖系数最高可达4.5左右。

以上关于黄精组织培养的研究虽然都取得了成功，但都局限于以黄精的地下根茎为外植体建立快繁体系，而根茎外植体因长期深埋在泥土中，容易携带各类病菌，不利于彻底消毒，易导致较高的外植体污染率和较低的无菌体建成率；而用根茎顶芽、茎尖做外植体，虽然提高了无菌体成功率，却存在组培材料来源单一，茎尖剥取的无菌操作不好控制，且需大量消耗根茎顶芽，导致无顶芽的黄精根茎当年难以发芽生长的问题。因此，从目前黄精组培的研究现状来看，黄精的组织培养技术研究还存在一定局限性，对黄精不同器官的组培技术探索也很少，黄精组织培养还存在一定的技术空白。

发明内容

本发明针对当前泰山黄精生产中用种子繁殖困难，常规根茎繁殖易出现病虫害加重和种质退化，而组培主要以根茎顶芽和茎尖为外植体建立快繁体系，外植体来源单一、试验材料消耗量大、繁殖效率低的现状，选择以比较易得的黄精顶芽芽鳞为外植体试材，通过诱导芽鳞分化获得不定根，再对不定根进一步诱导产生同时具有不定根和顶芽的根茎、不定芽团和多种形态的愈伤组织等不同类型的分化体；对这些类型的分化体分别继续培养，均可继续产生新的不定芽团、具顶芽根茎和多种类型愈伤组织，从而建立泰山黄精离体根、茎、叶的高频再生体系；采用同样的培养基也可获得根茎的高频再生体系。利用以上方法获得的根、茎、叶、愈伤组织及根茎之间在不同培养时期可相互转化生长。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，包含有如下步骤：

（1）外植体的选择 选择泰山黄精根茎顶芽外层包被的芽鳞作为外植体；

（2）无菌外植体的筛选 将外植体用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒，消毒完后，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基上，每瓶1片，放置在无菌室暗培养；培养3-9 d后挑选并弃除真菌或细菌污染的外植体，将获得的无菌外植体作为试验材料在诱导分化培养基中继续培养；从第7 d开始，外植体开始出现明显生长变化；

（3）外植体再生分化诱导 外植体在诱导分化培养基上培养14 d后，芽鳞基部开始长出白色不定根，随着培养时间延长，不定根表面覆盖白色绒毛，20-30 d后，新生的白色不定根变成条状、片状或束状，并不断伸长至2-4 cm；

（4）离体根茎叶的再生诱导

A、离体根诱导 将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化启动培养基上，继续培养20-30 d后，在根束基部、距新根的根尖生长点1-1.5 cm处均开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化培养基上培养，继续培养30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-23个不同类型的不定芽苗；不定芽苗的类型主要有以下几种：a具有根和顶芽的圆球状根茎；b无根的白色不定芽；c无根，具黄绿色茎叶的小苗；

B、离体叶诱导 从不定根诱导获得的不定芽芽团上，选择生长健壮、绿色、叶片宽度大于0.3 cm的完整叶片，单独剪下平铺在分化启动培养基表面，7 d后叶片开始膨大卷翘，14 d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽；平均每片叶的繁殖系数可达6-15；

C、离体茎诱导 剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中高度0.5 cm以上、至少具有1个节的茎段，直接插入或平铺在分化启动培养基上，14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9-20个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3 cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养；

（5）增殖继代培养

将上一步骤中分化的各种器官类型离体根茎叶诱导产生的不定芽和各种类型的分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，每隔15-20 d继代一次，最后得到泰山黄精高频再生体系。各类型的最高增殖频率可达13，综合增殖效率较仅用根茎繁殖提高2-3倍。

所述步骤1中外植体的具体选择方法为：选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，于10月底11月初地上部分完全枯萎后挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎为试验材料，或于翌年3月早春挖出地下根茎进行适当催芽，并以此为试验材料进行预处理；

选择已初步催芽的生长健壮具饱满顶芽的泰山黄精根茎，先将根茎在流水下冲洗干净表面泥土，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后用流水洗净表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，直接剥取或待顶芽开始膨大，芽鳞开始张开时，用消毒刀片小心剥取顶芽外层包被的白色芽鳞，具体操作为：按从外至内顺序依次剥取3-5层，尽量保持每片芽鳞的完整性。

所述步骤2中的表面消毒方法为：先用70%酒精溶液浸泡30-60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6-10 min。

所述步骤4中将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化培养基上，切取的不定根长度以2-4 cm为最佳。

一组建立泰山黄精高频再生体系所用培养基，由诱导分化培养基、 分化启动培养基、分化继代培养基组成：

所述诱导分化培养基为：MS+BA1.0-2.0 mg/L +2,4-D0.3-0.8 mg/L +蔗糖4-6%；

所述分化启动培养基1为：MS+BA0.1-0.3 mg/L+IBA0.2-0.3 mg/L +蔗糖3-5%；

所述分化继代培基1为：MS+BA2.0-2.5 mg/L +IBA0.5-1.0 mg/L +蔗糖3-5%。

一组建立泰山黄精高频再生体系所用培养基，所述分化启动培养基2还可为：MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%；

所述分化继代培基2还可为： MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05 mg/L +蔗糖3-5%。

上述各阶段采用的基本培养基均为MS培养基，碳源为3-6%的分析纯蔗糖，pH 5.5-6.2。上述各阶段中除使用诱导分化培养基为暗培养外，其他培养条件均相同，培养室温度均为昼温25±2℃ ，夜温20±2℃，光照强度1000-1500 lx，光照时间8-12 h/d。

本发明使泰山黄精外植体有效利用率提高3-4倍，使组培苗繁殖系数达12以上，比已有报道中繁殖效率提高了7.0以上，且用离体根茎叶诱导繁殖的不定芽苗还具有生长速度快和独立成苗能力；各分化类型之间在不同培养时期相互转化生长的形态和时期特征明显。

本发明的技术方法，可重复性高，取材易得，操作简便，繁殖效率高，大大突破了泰山黄精组培中再生材料单一用根茎及顶芽繁殖的瓶颈问题，成功建立泰山黄精根、茎、叶等不同器官的再生体系，填补泰山黄精组培技术体系的空白，可从根本上解决泰山黄精种质退化及常规繁育中周期长、繁殖率低等问题，为满足市场需求、缓解生态压力及工厂化、规范化苗木生产奠定基础。

具体实施方式

实施例1

试验苗为从海拔300 m以上泰山山麓采集的泰山野生黄精根茎繁殖的后代，根茎已在泰山罗汉崖林场试验地驯化栽培2年。生长季节，从试验地选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，于10月底11月初地上部分完全枯萎后挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎为试验材料进行预处理。

先将根茎在流水下冲洗干净表面泥土，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后再用流水冲洗干净表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，剥取顶芽外层包被的白色芽鳞。具体操作为：用消毒刀片和镊子，按从外至内顺序依次剥取3-5层顶芽外层包被的白色芽鳞，尽量保持每片芽鳞的完整性。

将剥取的泰山黄精顶芽芽鳞用无菌水冲洗2-3遍，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6 min，取出后，无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基，诱导分化培养基的成分组成为：MS+BA1.0 mg/L +2,4-D0.3mg/L +蔗糖4%；每瓶1片，放置在无菌培养室暗培养。

经过7-14 d的暗培养，芽鳞片切口处开始长出白色不定根， 20 d后，部分不定根基部连成片或束状，片状根和单独根表面均覆盖白色绒毛。当这样的根长至2-4 cm时，切下接种于分化启动培养基单独培养，分化启动培养基的成分为：MS+BA0.1mg/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%，分化启动培养基进行根的再生分化诱导。离体根在分化启动培养基继续培养20 d后，在根束基部开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化启动培养基上培养，30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-20个不同生长时期的不定芽苗和愈伤组织。这类型产生芽团的根，具有可连续产生2代以上不定芽团的能力。

不定根产生的芽团继续培养30-40 d后，芽苗明显生长，叶片变绿，并长出具2节以上茎段。从不定根诱导获得的不定芽芽团上剪取生长势旺盛、叶片宽度0.3 cm以上的的叶片进行不定芽诱导，接种于分化启动培养基上培养7 d后开始出现体积膨大，叶片卷翘，15d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽，颜色较绿的叶片先长出白色愈伤颗粒，颜色浅绿的叶片大部分直接长出不定芽，平均每片叶的繁殖系数可达10.5。

结合叶片诱导，同时进行茎段不定芽的诱导培养。剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中大于0.5 cm并具有1-2个节的茎段，茎段基部向下直接插入或平铺在分化启动培养基上。14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9-12个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养。

对诱导出的不同类型愈伤组织进行不定芽的诱导。表面光滑的白色圆球形根茎愈伤在分化启动培养基上培养20 d后，表面长出毛刺状白色丛生芽，每个愈伤球可形成5个以上白色新芽，继续培养20 d左右，即可长成无根，具黄绿色叶片的小苗；水滴状具顶芽的圆球茎在芽鳞痕处分化出新的具顶芽的绿色不定芽，根据每个圆球茎体积大小不同可产生1-5个新芽。

对以上诱导产生的不定芽和不同类型分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，分化继代培养基为MS+BA2.0mg/L +IBA0.5mg/L +蔗糖3%，每隔15-20 d继代一次，最高增殖频率可达13，各类型的综合增殖效率较仅用根茎繁殖提高2-3倍。在分化继代培养基MS+BA2.0 mg/L +IBA0.5mg/L +蔗糖3%和分化继代培养基MS+BA0.8 mg/L +IBA0.03 mg/L+蔗糖3%中交替继代，每隔15-20 d继代一次，可获得不同分化类型的分化体，并保持较高的增殖分化率。

实施例2

试验苗为从海拔300 m以上泰山山麓采集的泰山野生黄精根茎繁殖的后代，根茎已在泰山罗汉崖林场试验地驯化栽培2年。生长季节，选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，定株观察，于翌年3月早春挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎，在温室进行适当催芽，具体处理为：选温室内向阳处堆砌深15-25 cm，长30-40cm，宽20-30 cm的沙池，用湿沙填埋基层10-15 cm厚，把选择好的黄精根茎整齐排布在沙层上，然后再覆盖10 cm左右湿沙，适当遮盖保湿，温室内昼夜温差为10℃以上，白天高温25℃左右， 7-14 d后，顶芽明显膨大，顶芽尖部芽鳞明显开裂时，取出沙藏的黄精试验根茎，进行预处理。

先将黄精根茎表面泥沙在流水下冲洗干净，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡10 min，流水冲洗干净表面溶液后，用滤纸吸干表面多余水分，用消毒刀片和镊子剥取顶芽外层包被的白色芽鳞。具体操作为：按从外至内顺序依次剥取3-5层，尽量减少芽鳞的伤口，并保持每片芽鳞的完整性。

将剥取的泰山黄精顶芽芽鳞用无菌水冲洗2-3遍，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡8 min，取出后，无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基，诱导分化培养基的成分为：MS+BA2.0 mg/L +2,4-D0.8 mg/L +蔗糖6%；每瓶1片，放置在无菌培养室暗培养。

经过7-14 d的暗培养，芽鳞片切口处开始长出白色不定根， 25 d后，不定根基部连成片状，且根表面覆盖白色绒毛。当这样的根长至2-4 cm时，切下接种于分化启动培养基进行根的再生分化诱导。分化启动培养基的成分为：MS+BA0.3mg/L +IBA0.3mg/L +蔗糖5%；在分化启动培养基继续培养22 d后，在根束基部开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化启动培养基上培养，40 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-23个不同生长时期的不定芽苗和愈伤组织。这类型产生芽团的根，具有可连续产生2代以上不定芽团的能力。

不定根产生的不定芽芽团继续培养15-20 d后，芽苗明显生长，叶片变绿，并长出具节茎段，剪取生长势旺盛、绿色、叶片宽度0.2-0.5 cm的叶片接种于分化启动培养基进行不定芽诱导。叶片培养7 d后开始出现体积膨大，叶片卷翘，18 d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽，颜色较绿的先长出白色愈伤颗粒，颜色浅绿的叶片大部分直接长出不定芽，平均每片叶的繁殖系数可达11。

结合叶片诱导不定芽，同时进行茎段不定芽诱导培养。剪取高度大于0.5 cm，至少具有1个节的茎段，基部向下直接插入或平铺在分化启动培养基上。18 d后，在茎段剪口处形成白色丛生芽，每段茎段约可产生6-20个不定芽，30 d后逐渐长成直径3 cm左右的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5 cm的小芽团进行继代增殖培养。

对诱导出的不同类型愈伤组织进行不定芽的诱导。表面光滑的白色圆球形根茎愈伤在分化培养基上培养30 d后，表面长出毛刺状白色丛生芽，每个愈伤球可形成6-11个白色新芽，继续培养25 d左右，即可长成无根，具黄绿色叶片的小苗；水滴状具顶芽的圆球茎在芽鳞痕处分化出新的具顶芽的绿色不定芽或继续产生白色具顶芽圆球茎，根据每个圆球茎体积大小不同可产生3-5个新芽。

对以上诱导产生的不定芽和不同类型分化体进行接种于分化继代培养基进行继代增殖培养，分化继代培养基的成分为：MS+BA2.5 mg/L +IBA1.0 mg/L +蔗糖5%，每隔20 d左右转移到新鲜培养基一次，各类型的最高增殖频率可达10以上，综合增殖效率较仅用根茎繁殖提高2-3倍。在MS+BA2.5 mg/L +IBA1.0 mg/L +蔗糖5%和MS+BA1.0 mg/L +IBA0.05mg/L +蔗糖5%中交替继代，每种培养基的培养时间不超过20天，可获得不同分化类型的分化体，并保持较高的增殖分化率。

实施例3

试验苗为从海拔300 m以上泰山山麓采集的泰山野生黄精根茎繁殖的后代，根茎已在泰山罗汉崖林场试验地驯化栽培2年。生长季节，从试验地选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，于10月底11月初地上部分完全枯萎后挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎为试验材料进行预处理。

先将根茎在流水下冲洗干净表面泥土，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后再用流水冲洗干净表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，剥取顶芽外层包被的白色芽鳞。具体操作为：用消毒刀片和镊子，按从外至内顺序依次剥取3-5层顶芽外层包被的白色芽鳞，尽量保持每片芽鳞的完整性。

将剥取的泰山黄精顶芽芽鳞用无菌水冲洗2-3遍，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6 min，取出后，无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基，诱导分化培养基的成分组成为：MS+BA1.5 mg/L +2,4-D0.5mg/L +蔗糖5%；每瓶1片，放置在无菌培养室暗培养。

经过7-14 d的暗培养，芽鳞片切口处开始长出白色不定根， 20 d后，部分不定根基部连成片或束状，片状根和单独根表面均覆盖白色绒毛。当这样的根长至2-4 cm时，切下接种于分化启动培养基单独培养，分化启动培养基的成分为：MS+BA0.2mg/L+IBA0.25 mg/L+蔗糖4%，分化启动培养基进行根的再生分化诱导。离体根在分化启动培养基继续培养20 d后，在根束基部开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化启动培养基上培养，30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-20个不同生长时期的不定芽苗和愈伤组织。这类型产生芽团的根，具有可连续产生2代以上不定芽团的能力。

不定根产生的芽团继续培养30-40 d后，芽苗明显生长，叶片变绿，并长出具2节以上茎段。从不定根诱导获得的不定芽芽团上剪取生长势旺盛、叶片宽度0.3 cm以上的的叶片进行不定芽诱导，接种于分化启动培养基上培养7 d后开始出现体积膨大，叶片卷翘，15d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽，颜色较绿的叶片先长出白色愈伤颗粒，颜色浅绿的叶片大部分直接长出不定芽，平均每片叶的繁殖系数可达10.5。

结合叶片诱导，同时进行茎段不定芽的诱导培养。剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中大于0.5 cm并具有1-2个节的茎段，茎段基部向下直接插入或平铺在分化启动培养基上。14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9-12个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养。

对诱导出的不同类型愈伤组织进行不定芽的诱导。表面光滑的白色圆球形根茎愈伤在分化启动培养基上培养20 d后，表面长出毛刺状白色丛生芽，每个愈伤球可形成5个以上白色新芽，继续培养20 d左右，即可长成无根，具黄绿色叶片的小苗；水滴状具顶芽的圆球茎在芽鳞痕处分化出新的具顶芽的绿色不定芽，根据每个圆球茎体积大小不同可产生1-5个新芽。

对以上诱导产生的不定芽和不同类型分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，分化继代培养基为MS+BA2.2 mg/L +IBA0.8 mg/L +蔗糖4%，每隔15-20 d继代一次，最高增殖频率可达13，各类型的综合增殖效率较仅用根茎繁殖提高2-3倍。在分化继代培养基MS+BA2.2 mg/L +IBA0.8 mg/L +蔗糖4%和分化继代培养基MS+BA0.9 mg/L +IBA0.04mg/L +蔗糖4%中交替继代，每种培养基的培养时间不超过20天，可获得不同分化类型的分化体，并保持较高的增殖分化率。

实施例4

以上从大田试验地挖取的根茎和温室沙藏的根茎，在取完顶芽芽鳞后，剩余的具顶芽生长点的根茎可继续作为外植体材料进行诱导培养。

在流水下将试验根茎表面泥土冲洗干净，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后洗净表面溶液，并用无菌水冲洗2-3遍，吸干表面多余水分，再用酒精棉球擦洗根茎表面，切成0.5-2 cm长的段，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒。先用70%酒精溶液浸泡60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min，取出后，无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于分化启动培养基2，分化启动培养基的成分为：MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%，每瓶一段，放置在无菌室暗培养。

15 d后，根茎顶芽开始萌发，芽鳞痕处出现小米粒状白色新芽，25 d后，顶芽明显伸长，长成绿色具2个节以上的小苗，白色新芽变成直径0.3 cm左右具顶芽圆球茎，30 d后新生圆球茎开始长出粗壮、光滑的白色新根，每个圆球茎可生根1-3条，顶芽叶片也开始展开并长出具结茎段。在上述分化培养基中经3次继代培养后，将所获根茎再转移至分化继代培养基MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05 mg/L +蔗糖3-5%中30-40d，新生圆球茎可继续分化产生白色光滑球状或椭圆形愈伤、具顶芽白色圆球茎等分化类型。随着继代培养时间延长，这类分化体体积继续增大，30 d后约可增至原体积的1倍以上，并出现白色丛生芽和圆球茎的继续增殖分化，丛芽数量依愈伤体积大小约产生3-9个。这样在分化启动培养基和分化继代培养基中按2:1的频次交替继代培养，可保持根茎较稳定的分化频率。

这类型的根茎分化体每隔20-25 d继代一次，每代增殖2-3倍，在MS+BA2.0-5.0mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%和MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05mg/L+蔗糖3-5%中交替继代，可获得不同分化类型的分化体，并保持较高的增殖分化率。

方案一、二、三诱导产生的不定芽具有独立生根能力，新根和叶片诱导产生的新芽可重复进行二次诱导，并可继续产生不定芽芽团。根茎诱导产生的愈伤组织和长出的新根与芽鳞诱导产生的新根具有同样分化不定芽的能力；且，以上方式产生的根茎叶和不同类型的愈伤组织之间，在不同培养时期时期具有相互转换生长分化的能力，且各分化类型相互转化生长的形态和时期特征明显。

Claims (6)

1.一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于包含有如下步骤：

（1）外植体的选择 选择泰山黄精根茎顶芽外层包被的芽鳞作为外植体；

（2）无菌外植体的筛选 将外植体用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒，消毒完后，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基上，每瓶1片，放置在无菌室暗培养；培养3-9 d后挑选并弃除真菌或细菌污染的外植体，将获得的无菌外植体作为试验材料在诱导分化培养基中继续培养；从第7 d开始，外植体开始出现明显生长变化；

（3）外植体再生分化诱导 外植体在诱导分化培养基上培养14 d后，芽鳞基部开始长出白色不定根，随着培养时间延长，不定根表面覆盖白色绒毛，20-30 d后，新生的白色不定根变成条状、片状或束状，并不断伸长至2-4 cm；

（4）离体根茎叶的再生诱导

A、离体根诱导 将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化启动培养基上，继续培养20-30 d后，在根束基部、距新根的根尖生长点1-1.5 cm处均开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化培养基上培养，继续培养30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团有15-23个不同类型的不定芽苗；不定芽苗的类型主要有以下几种：a具有根和顶芽的圆球状根茎；b无根的白色不定芽；c无根，具黄绿色茎叶的小苗；

B、离体叶诱导 从不定根诱导获得的不定芽芽团上，选择生长健壮、绿色、叶片宽度大于0.3 cm的完整叶片，单独剪下平铺在分化启动培养基表面，7 d后叶片开始膨大卷翘，14d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽；

C、离体茎诱导 剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中高度0.5 cm以上、至少具有1个节的茎段，直接插入或平铺在分化启动培养基上，14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段产生9- 20个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3 cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养；

（5）增殖继代培养

将上一步骤中分化的各种器官类型离体根茎叶诱导产生的不定芽和各种类型的分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，每隔15-20 d继代一次，最后得到泰山黄精高频再生体系。

2.根据权利要求1所述的一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于：所述步骤1中外植体的具体选择方法为：选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，于10月底11月初地上部分完全枯萎后挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎为试验材料，或于翌年3月早春挖出地下根茎进行适当催芽，并以此为试验材料进行预处理；

先将根茎在流水下冲洗干净表面泥土，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后用流水洗净表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，直接剥取或待顶芽开始膨大，芽鳞开始张开时，用消毒刀片小心剥取顶芽外层包被的白色芽鳞，具体操作为：按从外至内顺序依次剥取3-5层，尽量保持每片芽鳞的完整性。

3.根据权利要求1所述的一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于：所述步骤2中的表面消毒方法为：先用70%酒精溶液浸泡30-60 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡6-10min。

4.根据权利要求1所述的一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于：所述步骤4中将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化培养基上，切取的不定根长度以2-4 cm为最佳。

5.根据权利要求1所述的一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于：所述建立泰山黄精高频再生体系的方法所用培养基，由诱导分化培养基、 分化启动培养基、分化继代培养基组成：

所述诱导分化培养基为：MS+BA1.0-2.0 mg/L +2,4-D0.3-0.8 mg/L +蔗糖4-6%；

所述分化启动培养基为：MS+BA0.1-0.3 mg/L+IBA0.2-0.3 mg/L +蔗糖3-5%；

所述分化继代培养基为：MS+BA2.0-2.5 mg/L +IBA0.5-1.0 mg/L +蔗糖3-5%。

6.根据权利要求5所述的一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于：所述分化启动培养基还可为：MS+BA2.0-5.0 mg/L +IBA0.05-0.2 mg/L +蔗糖3-6%；

所述分化继代培养基还可为： MS+BA0.8-1.0 mg/L +IBA0.03-0.05 mg/L +蔗糖3-5%。