CN106093231B - 橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法 - Google Patents

橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种橘红珠药材的高效液相特征图谱快速鉴别方法。所述方法是：在特殊的色谱柱条件下，将供试品高效液相特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品特征图谱有4个与对照图谱对应的共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74和3.19；各峰相对保留时间在规定值的±5％之内，为检测条件对橘红珠药材进行快速鉴别。该方法科学全面，具有专属性强、稳定性高、重复性好、鉴别快速等优点，尤其适合规模化生产的检测和鉴别。

Description

橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种橘红珠药材的高效液相特征图谱快速鉴别方法。
背景技术
橘红珠，又名橘珠、橘胎，为芸香科植物化州柚(Citrus grandis ‘Tomentosa’)的未成熟幼小果实，收载于《中药大辞典》(下册)，具有止咳、化痰、平喘等功效。橘红珠的活性化学成分主要为黄酮类(如柚皮苷、野漆树苷)、香豆素类(如橙皮内酯水合物、异橙皮内酯)。彭维等(橘红珠质量标准的研究[J].中南药学,2006,04:257-259)采用聚酰胺薄膜层析法鉴别橘红珠中的柚皮苷、野漆树苷；采用硅胶G薄层层析法鉴别其中的橙皮内酯水合物、异橙皮内酯；采用高效液相色谱法测定其中的柚皮苷含量。但鉴于薄层鉴别法受温度、湿度以及载样量等诸多因素影响，存在样品可鉴别的成分数量较少，不能全面反映中药材内在质量；重现性差等缺点。
发明内容
为克服以上缺陷，本发明提供了一种橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法，通过对照图谱对橘红珠药材的真伪及品质优劣进行快速鉴别。
所述鉴别方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备，取橘红珠药材粉末0.5g，精密称定，加甲醇10ml，超声处理30min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备，精密称取柚皮苷对照品10.16mg、野漆树苷对照品10.25mg、橙皮内酯水合物对照品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成每1ml含柚皮苷508μg、野漆树苷16.4μg、橙皮内酯水合物8.36μg、异欧前胡素54.8μg的对照品溶液；
(3)色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以6％醋酸为流动相B；梯度洗脱，洗脱梯度为0-25min内，保持流动相A为30％，流动相B为70％；25-75min内，流动相A由30％到45％，流动相B由70％到55％；在75-110min内，流动相A由45％到100％，流动相B由55％到0％；在110-120min内，100％为流动相A；流速为1ml/min；检测波长为320nm；
(4)对照图谱的建立，按上述供试品溶液、对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的橘红珠样品进行HPLC分析，得到相应特征图谱；将上述特征图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，对照图谱包括柚皮苷、野漆树苷，橙皮内酯水合物和异欧前胡素4个特征峰。
(5)鉴别方法，将供试品特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品特征图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74和3.19；各峰相对保留时间在规定值的±5％之内。
相对于现有技术，本发明可较全面、准确快速鉴别橘红珠药材的真伪及品质优劣。该方法具有专属性强、稳定性高、重复性好等优点，尤其适合规模化生产的检测和鉴别。
附图说明
图1是橘红珠药材的对照特征图谱；
图2是精密度试验结果图谱；
图3是重复性试验结果图谱；
图4是稳定性试验结果图谱；
图5是12批橘红珠样品的特征图谱检测结果图谱；
图6是10批沙田柚样品的特征图谱检测结果图谱；
图7是10批蜜柚样品的特征图谱检测结果图谱；
图8是橘红珠(化州柚)与其混淆品共有模式的比较图谱。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 橘红珠药材特征图谱测定
1实验材料
电子分析天平(BP211D，瑞士Sartorius公司)；超声波清洗器(KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司，超声频率：40KHz，超声功率：150W)；旋转蒸发仪(N-1000，日本东京理化Eyela公司)；超纯水器(Simplicity 185personal，美国Millipore公司)；DionexMultiMate3000型DGLC双三元梯度泵高效液相色谱仪；Dionex P680型高效液相色谱仪；色谱柱：依利特Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm,5μm)、戴安Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm,5μm)、Welth Materials Colume XB-C18(4.6mm×250mm,5μm)。
异欧前胡素、柚皮苷对照品，购自中国药品生物制品检定所；野漆树苷对照品，购自上海同田生物技术有限公司；橙皮内酯水合物对照品为实验室自制，HPLC检测纯度高于98％。甲醇(色谱纯)，超纯水，冰醋酸(分析纯)。
橘红珠药材12批，采集于化州柚的主产区，即广东、广西两省，经鉴定为芸香科植物化州柚(Citrus grandis ‘Tomentosa’)幼果。
2实验方法
2.1对照品溶液的制备
精密称取柚皮苷对照品10.16mg、野漆树苷对照品10.25mg、橙皮内酯水合物对照品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成每1ml含柚皮苷508μg、野漆树苷16.4μg、橙皮内酯水合物8.36μg、异欧前胡素54.8μg的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取橘红珠药材粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.3色谱条件
以甲醇为流动相A，以6％醋酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，检测波长为320nm。
梯度洗脱方式表
3实验结果
3.1方法学考察
(1)精密度试验
取批号为TG-01的橘红珠样品，制成供试品溶液，连续测定6次，并使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度评价，结果见图2、表1。结果表明仪器精密度良好。
表1 精密度相似度评价
(2)重复性试验
取批号为TG-01的橘红珠样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定，并使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度评价，结果见图3、表2。结果表明重复性良好。
表2 重复性相似度评价
(3)稳定性试验
取批号为TG-01的橘红珠样品，制成供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、12、24h后进样测定，并使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度评价，结果见图4、表3。结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
表3 稳定性相似度评价
3.2橘红珠样品检测结果
分别取批号为TG-01、TG-02、TG-03、TG-04、TG-05、TG-06、TG-07、TG-08、TG-09、TG-10、TG-11、TG-12十二批橘红珠样品，分别制成供试品溶液，测定，结果见图5。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，见图1。十二批橘红珠样品与对照色谱图基本一致，有相对应的4个特征峰。其中峰1为柚皮苷，峰2为野漆树苷，峰3为橙皮内酯水合物，峰4为异欧前胡素。以各样品中的柚皮苷为S峰，计算各自特征峰2、3、4的相对保留时间，均在规定值的±5％之内。
实施例2橘红珠混淆品沙田柚、蜜柚的鉴别
1实验样品
沙田柚、蜜柚实验样品各十批，主要采集于广东、广西两省，经鉴定分别为沙田柚(C.grandis cv Shatian)和蜜柚(C.grandis cv Miyou)幼果。
2检测结果
分别取沙田柚、蜜柚样品依法进行测定，结果见图6、图7。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，见图8。沙田柚、蜜柚样品的特征图谱与橘红珠药材的特征图谱不一致：沙田柚仅呈现柚皮苷和橙皮内酯水合物2个特征峰，蜜柚仅呈现柚皮苷一个特征峰。
实施例3、实验方法的考察
1供试品溶液制备方法的考察
分别比较不同提取方法(水浴回流、超声)及不同提取时间(超声20min、超声30min)对检测结果的影响。取批号为TG-01的橘红珠样品粉末(过二号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取25ml续滤液，浓缩至近干，加甲醇定量转移至5ml量瓶中，并加甲醇至刻度，作为供试品溶液1；
另取粉末(过二号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声20min或30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取其续滤液，作为供试品溶液2、供试品溶液3。
按色谱条件分别进样测定，以超声30min与水浴回流1h两种提取方法所得的峰面积计算提取率。结果表明(表4)：超声和水浴回流两种方法提取效率没有明显差异，均可作为供试品溶液的制备方法，超声操作更为方便省时；但是超声处理时间不宜小于30min。
表4 不同提取方法的峰面积对比
2检测波长的选择
检测波长应保证全谱主要色谱峰都有很好响应，应用二极管阵列检测器考察不同波长下色谱图情况，选择检测波长为320nm。
3色谱柱的选择
分别考察依利特Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm,5μm)、戴安Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm,5μm)、Welth Materials Colume XB-C18(4.6mm×250mm,5μm)三根色谱柱分离度、保留时间和理论塔板数，结果表明不同品牌的C18均可用于橘红珠药材特征图谱鉴别(表5)。
表5 色谱柱的比较
4相对保留时间规定值的确定
采用不同色谱柱(依利特Hypersil BDS C18、戴安Acclaim 120 C18、WelchMaterials Column XB-C18)进行考察。以柚皮苷对照品、异欧前胡素对照品为参照，以柚皮苷峰(峰1)为S峰，计算野漆树苷、橙皮内酯水合物的相对保留时间，见表6。
表6 相对保留时间规定值的计算结果
根据不同色谱柱特征峰相对保留时间的平均值，规定特征峰2、3、4的相对保留时间为1.49(峰2)、1.74(峰3)、3.19(峰4)，测定结果应在规定值的±5％之内。

Claims (1)

1.橘红珠药材的HPLC特征图谱快速鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备，取橘红珠药材粉末0.5g，精密称定，加甲醇10ml，超声处理30min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备，精密称取柚皮苷对照品10.16mg、野漆树苷对照品10.25mg、橙皮内酯水合物对照品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成每1ml含柚皮苷508μg、野漆树苷16.4μg、橙皮内酯水合物8.36μg、异欧前胡素54.8μg的对照品溶液；
(3)色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以6％醋酸为流动相B；梯度洗脱，洗脱梯度为0-25min内，保持流动相A为30％，流动相B为70％；25-75min内，流动相A由30％到45％，流动相B由70％到55％；在75-110min内，流动相A由45％到100％，流动相B由55％到0％；在110-120min内，100％为流动相A；流速为1ml/min；检测波长为320nm；
(4)对照图谱的建立，按上述供试品溶液、对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的橘红珠样品进行HPLC分析，得到相应特征图谱；将上述特征图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，对照图谱包括柚皮苷、野漆树苷，橙皮内酯水合物和异欧前胡素4个特征峰;
(5)鉴别方法，将供试品特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品特征图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74和3.19；各峰相对保留时间的偏差在±5％之内。
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