CN106053670A - 一种4‑氰基吡啶中3‑氰基吡啶、4‑甲基吡啶的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种4‑氰基吡啶中3‑氰基吡啶、4‑甲基吡啶的高效液相色谱检测方法：（1）制备系统适用性溶液；（2）制备供试品溶液；（3）制备对照溶液；采用高效液相色谱分别对系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液进行检测，检测条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为A为改性缓冲盐20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺到1000ml水中，用磷酸调节PH值至6.0～8.0，B相为有机相采用梯度洗脱；流速0.5～1.5ml/min；柱温为10℃～40℃；检测波长200～300nm；进样体积10µl；本发明检测方法中3‑氰基吡啶、4‑氰基吡啶和4‑甲基吡啶分离度均在2.0以上，理论塔板数高，对称性好，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短，操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，本发明涉及一种高效液相色谱检测方法，一种4-氰基吡啶的中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法。
背景技术
4-氰基吡啶是托吡司他合成的起始原料。4-氰基吡啶的分子式C6H4N2，分子量为104.11，其结构式如下：
本发明的目的为了使4-氰基吡啶的出峰时间与溶剂峰及杂质峰完全分离，改善出峰峰型，进而准确控制4-氰基吡啶的含量，目前很难查询到4-氰基吡啶中3-氰基吡啶和4-甲基吡啶相关高效液相色谱检测方法。
本发明的特点在于克服了4-氰基吡啶极性大，从而导致在高效液相色谱中出峰早，不能很好地和溶剂峰及杂质峰分离，且峰型也不佳，比较难以控制4-氰基吡啶含量的困难。
本发明找到了一种与杂质分离度高，出峰时间适中，分析时间短的检测4-氰基吡啶有关物质的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶的高效液相色谱检测方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明涉及的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶的高效液色谱检测方法，包括以下步骤：
(1)制备系统适用性溶液：取3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含4-氰基吡啶约为0.5mg/ml～1.5mg/ml，含3-氰基吡啶、4-甲基吡啶约为5μg/ml～15μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；
(2)制备供试品溶液：取4-氰基吡啶适量，用有机溶剂稀释制成每1ml 中含4-氰基吡啶约为0.5mg/ml～1.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
(3)制备对照溶液：取供试品溶液适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含4-氰基吡啶约为5μg/ml～15μg/ml的溶液，作为对照溶液。
(4)采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。
(5)设置液相色谱仪的流动相，即A相为改性缓冲盐，B相为有机相，设置液相色谱
仪的梯度洗脱，方法见下表。
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
| 13 | 40 | 60 |
| 16 | 40 | 60 |
| 20 | 90 | 10 |
| 30 | 90 | 10 |
(6)设置液相色谱仪的流速为0.5～1.5mL/min，检测波长200～300nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱温度为10℃～40℃；
(7)取步骤(1)(2)、(3)的样品溶液10μl注入经步骤(4)(5)、(6)设置的液相色谱仪，完成4-氰基吡啶中3-氰基吡啶和4-甲基吡啶检测。
(8)按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶,和4-甲基吡啶的含量。
所述步骤(1)中，系统适用性溶液4-氰基吡啶的浓度为0.5mg/ml～1.5mg/ml，3-氰基吡啶的浓度为5μg/ml～15μg/ml、4-甲基吡啶的浓度为5μg/ml～15μg/ml。
优选的，步骤(1)中，系统适用性溶液4-氰基吡啶的浓度约为0.8mg/ml～1.2mg/ml，3-氰基吡啶、4-甲基吡啶的浓度约为8μg/ml～12μg/ml。
优选的，步骤(1)中，系统适用性溶液4-氰基吡啶的浓度约为1.0mg/ml，3-氰基吡啶、4-甲基吡啶的浓度约为10μg/ml。
所述步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为0.5mg/ml～1.5mg/ml。
优选的，步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为0.8mg/ml～1.2mg/ml。
优选的，步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为1.0mg/ml。
所述步骤(3)中，对照溶液的浓度约为5μg/ml～15μg/ml。
优选的，步骤(3)中，对照溶液的浓度约为8μg/ml～12μg/ml。
优选的，步骤(3)中，对照溶液的浓度约为10μg/ml。
所述步骤(1)、(2)、(3)中的有机溶剂为乙腈。
优选的，步骤(4)中，色谱柱为菲罗门luna C18(4.6*250mm 5μm)柱，规格为4.6*250mm 5μm柱，规格为长度250mm、内径4.6mm、粒径5μm。
所述步骤(5)中，A相为改性缓冲盐，B相为有机相，
优选的，步骤(5)中，改性缓冲盐为20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺，用磷酸调节PH值至6.0～8.0的溶液。
优选的，步骤(5)中，改性缓冲盐为20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺，用磷酸调节PH值至6.6～7.0的溶液。
优选的，步骤(5)中，改性缓冲盐为20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺，用磷酸调节PH值至6.8的溶液。
所述步骤(5)中，B有机相为甲醇或乙腈。
优选的，步骤(5)中，有机相为乙腈。
所述步骤(6)中，流速为0.5～1.5mL/min。
优选的，步骤(6)中，流速为0.8～1.2mL/min。
优选的，步骤(6)中，流速为1.0mL/min。
所述步骤(6)中，检测波长为200～300nm。
优选的，步骤(6)中，检测波长为250～280nm。
优选的，步骤(6)中，检测波长为265nm。
所述步骤(6)中，柱温为10℃～40℃。
优选的，步骤(6)中，柱温为25℃～35℃。
优选的，步骤(6)中，柱温为30℃。
所述步骤(7)中，进样量为10μl。
所述步骤(8)中，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的含量。
本发明4-氰基吡啶中3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的高效液相色谱检测方法，具有以下优点：
(1)本发明在流动相上采取梯度洗脱，可以使3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在16分钟以内，分离度在2.0以上，理论塔板数高，色谱峰的峰形尖锐，同时具有分离度高，分析时间短等优点。
(2)本发明采用乙腈溶解样品，其溶解度大，溶解速度快，可以有效地避免检测过程中析出固体而导致色谱柱以及色谱系统的堵塞，使得检测结果准确可靠，其操作简便。
本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的分离度在2.0以上，理论塔板数高，有效地避免各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点，且符合检测方法的方法验证要求。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本思路的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本思路的前提下，做出的任何形式的修改、替换或变更，均在本发明范围内。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：
图1为实施例1条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图2为实施例2条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图3为实施例3条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图4实施例4条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图5实施例5条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图6实施例6条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图7实施例7条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果图；
图8本发明检测方法3-氰基吡啶的线性关系；
图9本发明检测方法4-甲基吡啶的线性关系。
具体实施方式
本发明中具体实施方式中使用的供试品、设备均为已知产品。
3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶，可以购买获得，例如：阿拉丁公司等生产厂家的市售产品，并经过检测确证其结构。
高效液相色谱仪：Agilent1290液相色谱仪DAD检测器；色谱柱：菲罗门luna C18(4.6*250mm 5μm)。
实施例1
一种4-氰基吡啶的中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法：
(1)制备系统适用性溶液：精密称取3-氰基吡啶、4-甲基吡啶各50mg置50ml量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制成3-氰基吡啶浓度为1mg/ml、4-甲基吡啶浓度为1mg/ml的均质溶液：作为杂质储备液；再精密称取4-氰基吡啶50mg置50ml量瓶中，再加入杂质储备液0.5ml，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制成4-氰基吡啶浓度为1mg/ml、3-氰基吡啶浓度为10μg/ml、4-甲基吡啶浓度为10μg/ml的均质溶液，作为系统适用性溶液；
(2)制备供试品溶液：精密称取4-氰基吡啶50mg置50ml量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制成4-氰基吡啶浓度为1mg/ml，作为供试品溶液；
(3)制备对照溶液：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成4-氰基吡啶浓度为10μg/ml，作为对照溶液。
高效液相色谱的检测条件：
(4)色谱柱：菲罗门luna C18(4.6*250mm 5μm)；
(5)流动相，即A相为20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺，用磷酸调节PH值至6.8的溶
液，B相为乙腈，设置液相色谱仪的梯度洗脱，方法见下表：
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
| 13 | 40 | 60 |
| 16 | 40 | 60 |
| 20 | 90 | 10 |
| 30 | 90 | 10 |
(6)流速：1.0mL/min，检测波长：265nm，柱温：30℃；
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1和表1；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.056％，4-甲基吡啶未检测。
计算公式：
式中：
A杂质：指供试品溶液中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶的峰面积；
A对照主峰：指对照溶液的主峰面积；
表1、实施例1条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.51、16.28，理论塔板数均大于15000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例2
除检测条件中改变流速为0.8ml/min外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2和表2；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.055％，4-甲基吡啶未检测。
表2、实施例2条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 11.448 | 17415 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 12.407 | 17388 | 2.65 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 15.716 | 30822 | 9.00 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.65、9.00，理论塔板数均大于17000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在16分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例3
除检测条件中改变流速为1.2ml/min外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记 录色谱图，见图3和表3；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.055％，4-甲基吡啶未检测。
表3、实施例3条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 7.596 | 13879 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 8.231 | 14439 | 2.38 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 13.163 | 8816 | 11.80 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.38、11.80，理论塔板数均大于8000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例4
除检测条件中改变柱温为25℃外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4和表4；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.053％，4-甲基吡啶未检测。
表4、实施例4条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 9.421 | 15751 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 10.226 | 15808 | 2.57 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 13.969 | 8779 | 8.11 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的 分离度为2.57、8.11，理论塔板数均大于8000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例5
除检测条件中改变柱温为35℃外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5和表5；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.054％，4-甲基吡啶未检测。
表5、实施例5条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 8.822 | 15998 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 9.543 | 15989 | 2.48 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 14.057 | 17802 | 12.46 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.48、12.46，理论塔板数均大于15000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例6
除检测条件中改变A相缓冲盐pH为6.60外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6和表6；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.055％，4-甲基吡啶未检测。
表6、实施例6条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 9.112 | 15361 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 9.873 | 15801 | 2.50 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 14.566 | 24576 | 13.66 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.50、13.66，理论塔板数均大于15000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例7
除检测条件中改变A相缓冲盐pH为7.00外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图7和表7；精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶，4-甲基吡啶含量。3-氰基吡啶的含量为0.056％，4-甲基吡啶未检测。
表7、实施例7条件下3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和4-甲基吡啶的分离效果
| 色谱峰 | 名称 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 1 | 3-氰基吡啶 | 9.114 | 15368 | - |
| 2 | 4-氰基吡啶 | 9.876 | 15889 | 2.50 |
| 3 | 4-甲基吡啶 | 14.636 | 31761 | 14.80 |
结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和、4-甲基吡啶的分离度为2.50、14.80，理论塔板数均大于15000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发 明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的保留时间均在15分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。
综上所述，本发明检测方法3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶的分离度在2.0以上，理论塔板数高，有效地避免各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1
1、定量限与检测限试验
精密称取3-氰基吡啶适量制成1mg/ml的溶液，称取4-甲基吡啶适量制成1mg/ml的溶液，逐级稀释至S/N≈10，作为定量限溶液。稀释至S/N≈3，作为检测限溶液。
精密量取定量限溶液、检测限溶液各10μl，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3-氰基吡啶和的定量限、检测限分别为：
定量限：3-氰基吡啶为3.983ng；4-甲基吡啶为9.996ng。
检测限：3-氰基吡啶为1.328ng；4-甲基吡啶为3.332ng。
试验结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的定量限和检测限低。
取定量限溶液，按照实施例1的检测条件，分别连续进样6次，记录色谱图，结果见表8。
表8、定量限精密度试验结果
试验结果表明，本发明检测方法3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的定量限的精密度好。
2、线性关系
(1)分别取杂质贮备夜(与实施例1相同)适量，加乙腈制成含3-氰基吡啶浓度为1.01μg/ml～20.12μg/ml，4-甲基吡啶为1.00μg/ml～19.99μg/m的线性溶液；
(2)按照实施例1的检测条件对上述线性溶液进行检测，记录色谱图，以3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的浓度相对应的峰面积进行线性回归，3-氰基吡啶的线性方程y＝13.8894x-2.5581，相关系数r＝0.9995，如图8所示；4-甲基吡啶的线性方程y＝4.9808x-0.9281，相关系数r＝1.000，如图9所示。
试验结果表明，本发明检测方法的条件下，3-氰基吡啶和4-甲基吡啶的浓度与峰面积线性回归关系良好。
3、稳定性试验
(1)系统适应性溶液
取浓度为3-氰基吡啶10.26μg/ml、4-氰基吡啶1.054mg/ml、4-甲基吡啶10.68μg/ml的系统适用性溶液，按照实施例1的检测条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取样，精密量取系统适应性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表9。
表9、系统适用性溶液的稳定性试验结果
(2)供试品溶液
取4-氰基吡啶50.54mg，置于50ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为供试品溶液，按照实施例1的检测条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取样，精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶,和4-甲基吡啶的含量，结果见表10。
表10、供试品溶液的稳定性试验结果
试验结果表明，本发明检测方法在4-氰基吡啶检测过程中系统适应性溶液和供试品溶液的稳定性良好。
4、精密度试验
系统适应性溶液进样精密度
取浓度为3-氰基吡啶10.56μg/ml、4-氰基吡啶1.084mg/ml、4-甲基吡啶10.98μg/ml的系统适用性溶液，按照实施例1的检测条件，分别连续进样6次，记录色谱图，结果见表11。
表11、系统适用性溶液的进样精密度试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的进样精密度良好。
5、重复性试验
制备供试品溶液：精密称取6份4-氰基吡啶，每份50mg置50ml量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制备成4-氰基吡啶的浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
制备对照溶液：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制备成4-氰基吡啶的浓度为10μg/ml的溶液，作为对照溶液。
检测：精密量取上述溶液各10μl，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶,和4-甲基吡啶的含量，结果见表12。
表12、重复性试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的重复性好，符合检测方法的验证要求。
本发明检测方法的定量限低、检测限低、线性关系良好、稳定性好、精密度良好，重复性好检测结果准确可靠；同时，具有易操作、省时节能等优点。
Claims (10)
1.一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备系统适用性溶液：取3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、4-甲基吡啶适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含4-氰基吡啶为0.5mg～1.5 mg，含3-氰基吡啶为5µg～15µg，含4-甲基吡啶为5µg～15µg的溶液，作为系统适用性溶液；
（2）制备供试品溶液：取4-氰基吡啶适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含4-氰基吡啶为0.5mg～1.5 mg的溶液，作为供试品溶液；
（3）制备对照溶液：取供试品溶液适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含4-氰基吡啶为5µg～15µg的溶液，作为对照溶液；
（4）采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；
（5）设置液相色谱仪的流动相，即A相为改性缓冲盐，B相为有机相，设置液相色谱仪的梯度洗脱，方法见下表：
（6）设置液相色谱仪的流速为0.5～1.5mL/min，检测波长200～300nm，以及设置液相色谱仪色谱柱的柱温箱温度为10℃～40℃；
（7）取步骤（1）（2）、（3）的样品溶液10µl注入经步骤（4）（5）、（6）设置的液相色谱仪，完成4-氰基吡啶中3-氰基吡啶和4-甲基吡啶检测；
（8）按自身对照法以峰面积计算供试品中3-氰基吡啶,和4-甲基吡啶的含量；
根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（1）系统适应性溶液中4-氰基吡啶浓度为0.8mg/ml～1.2 mg/ml，3-氰基吡啶浓度为8µg/ml～12µg/ml，取用的4-甲基吡啶浓度为8µg/ml～12µg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（2）供试品溶液中4-氰基吡啶浓度为0.8mg/ml～1.2 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（3）对照品溶液中4-氰基吡啶浓度约为8µg/ml～12µg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）、（3）中的有机溶剂为乙腈。
5.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中的色谱柱为菲罗门luna C18（4.6*250mm 5µm）柱，规格为长度250mm、内径4.6mm、粒径5µm。
6.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中的改性缓冲盐为20mmol磷酸二氢钾+2.4ml三乙胺，用磷酸调节PH值至6.0～8.0的溶液。
7.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中的有机相溶剂为甲醇或乙腈。
8.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征是：步骤（6）中的流速为0.8～1.2mL/min。
9.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（6）中的检测波长为250～280nm。
10.根据权利要求1所述的一种4-氰基吡啶中3-氰基吡啶、4-甲基吡啶高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述步骤（6）中的液相色谱仪色谱柱的柱温箱温度为25℃～35℃。
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Denomination of invention: A kind of high-performance liquid chromatography detection method of 3-cyanopyridine and 4-methylpyridine in 4-cyanopyridine Effective date of registration: 20220901 Granted publication date: 20180713 Pledgee: China Construction Bank Corporation Taizhou pharmaceutical high tech Zone sub branch Pledgor: JIANGSU YUEXING PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Registration number: Y2022980014322 |