CN105906415A - 一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法，其包括在适合牛樟芝生长的条件下，在液体种子培养基或固体种子培养基中培养牛樟芝，获得液体或固体牛樟芝种子；采用苹果木桩浸泡清洗，装入聚丙烯菌袋封口扎紧灭菌；在无菌环境下打开装有苹果木的菌袋，接入固体或液体牛樟芝种子，封口扎紧；将接种完的菌袋进行暗培养，完成营养生长管理；脱袋培养，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收，完成生殖生长管理。其所用胡萝卜培养基原料包括：胡萝卜沸水煮后过滤的滤液、葡萄糖、琼脂，余量水；其所用液体种子培养基原料包括：固形物含量为5%（W/V）的麦芽汁；栽培培养基为苹果木。本发明操作简单，培养周期相对较短，原料来源广泛，成本低廉。
Description
技术领域：
本发明一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法及其培养基，涉及到在人工培养条件下，以苹果木为原料培养牛樟芝形成子实体的方法，属于食药用菌栽培技术领域。
背景技术：
牛樟芝（Antrodia camphorata）又名牛樟菇、樟窟内菇、红樟芝，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），多孔菌科（Polyporaceae），薄孔菌属 （Antrodia），是一种原产于台湾的珍稀药用菌。牛樟芝原生于中国台湾山区海拔450～2000米之间特有的树龄百年以上的牛樟树（Cinnamomea kanehirai）树干腐朽心材的内壁，是台湾的地道药材，被称为“台湾瑰宝”、“台湾森林中的红宝石”。牛樟树由于过度砍伐，目前在中海拔已难得一见，台湾已立法将牛樟树列为一级国宝保护树种，不得任意砍伐，也因此野生牛樟芝子实体取得更为困难，目前黑市价格往往高达每公斤数十万元台币，因此如何以人工栽培开发出和野生樟芝具有相同成分的子实体或菌丝体，已成为学术界及产业界的热门话题。
牛樟芝含有丰富的活性物质，樟芝中有超过 78 种化合物, 包括三萜类 ( terpenoids) 、苯酸类 (
benzenoids) 、木脂素 ( lignans) 、苯醌及其衍生物 ( benzoquinone derivatives) 、琥珀酸与马来酸及其衍生物 ( uccinic and maleic derivatives) 及多糖体等。近年来樟芝在抗发炎、保肝、抗肝癌、抗肺癌、抗乳癌、抗卵巢癌、抗结肠癌、抗口腔癌、抗氧化、降低系统性红斑狼疮性肾炎及抗血小板凝集等方面的研究皆显示其未来具有高度发展潜力。樟芝也已被证实不具有基因毒性,口服 90 天亚急性毒性试验也未显示其具安全疑虑。
三萜类物质为牛樟芝的主要活性成分之一，且最为特别，高达200种以上，是其他菇菌无法相比的，具有抗癌、保肝等功效。已有30 余种萜类化合物从牛樟芝子实体和菌丝体中得到分离纯化，牛樟芝二萜类化合物、三萜类化合物、苯环衍生物化合物等。 天然产物三萜的药理研究表明三萜具有抗癌，抗炎，抗病毒和保肝等多种活性，牛樟芝对于酒后或宿醉的解酒效果非常显著。近年来已逐渐成为国内外研究和开发的热点。
牛樟芝是只生长在台湾地区的珍稀药用真菌，具有广泛的功能活性，有极高的药用价值，是一种极具开发与发展潜力的药用真菌。牛樟芝人工培养技术虽得到长足发展，但总体来说，其培养技术及产品的开发与应用还处于初中级阶段。
现有技术的固体培养，是将牛樟芝菌种接种在固体琼脂培养基或太空包中培养，培养时间通常为几个月，很难培养成子实体。
现有技术的液体培养可以在较短时间内获得大量的菌丝体和发酵液，能大大的提高产量，可以弥补牛樟芝生长缓慢这个缺点，但是其活性产物的含量较低。
现有技术的椴木栽培法，是将牛樟芝接种在牛樟椴木上，其所获得的牛樟芝成分和野生牛樟芝所含的生理活性物质的种类相近，可以得到质量较高的牛樟芝子实体，但因为其生长极其缓慢、生产周期较长，而且牛樟树为台湾一级保护树种，资源有限，这些都极大的限制了樟芝的产量。牛樟芝分布范围有限，牛樟树生长缓慢，产量低，寻求代替树种以扩大半人工栽培的范围，从而提高产量需要做大量的研究。
发明内容：
本发明的在于克服上述已有技术的不足而提供一种操作简单，原料易得，成本低，环保，节省资源，培养周期相对较短的采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法及其培养基。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：
一种用于采用苹果木栽培牛樟芝子实体的培养基，其特征在于培养基原料包括：胡萝卜20%（W/V），葡萄糖2%（W/V），琼脂1.5%（W/V），余量水，pH自然；其中胡萝卜切成1cm3 大小，沸水煮20min，过滤取滤液使用。
一种用于采用苹果木栽培牛樟芝子实体的液体种子培养基，其特征在于培养基原料包括：固形物含量为5%（W/V）的麦芽汁，pH自然。
一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法，其特征在于其包括如下步骤：
1）、菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，保存于PDA斜面培养基上；
2）、在适合牛樟芝生长的条件下，在液体种子培养基或固体种子培养基中培养牛樟芝，获得液体或固体牛樟芝种子；其中液体牛樟芝种子培养采用液体种子培养基用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶；接入活化的牛樟芝菌种，旋转式摇床，转速120rpm；温度28℃，暗培养10-12天；其中固体牛樟芝种子培养采用胡萝卜培养基，接种斜面牛樟芝菌种后温度28℃，暗培养20天；
3）、牛樟芝栽培培养基的制备：将老龄的苹果木锯成长约30cm的木桩，将锯好的木桩在水中完全浸没浸泡7-10天，取出后清洗，装入聚丙烯菌袋中，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；121℃，灭菌120min；
4）、接种：在超净工作台中，将液体发酵菌种摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将培养基口打开，灼烧瓶口；待菌袋冷却后，打开菌袋，接入固体或液体牛樟芝种子，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；其中每袋接入2-3块固体牛樟芝种子或每袋接入150ml液体牛樟芝种子，保证液体牛樟芝种子从苹果段木的各个面流下；
5）、营养生长管理：将接种完的菌袋置于15℃-30℃℃培养室中进行暗培养30-60天，菌丝在段木表面蔓延覆盖，并深入生长到木质内部；
6）、生殖生长管理：脱袋，放置于湿度80-95%、温度15-25℃℃培养室中进行培养，培养过程中无需光照；脱袋之后培养30天之后，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收。
为了进一步实现本发明的目的，固体牛樟芝种子制备：将上述配制好的胡萝卜培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装250ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃灭菌30min；无菌操作，倒平板，平板凉至室温后，接种试管菌种；每只试管可以接种12块平板；接种后的平板放入28℃培养箱中，暗培养20天，成为固体牛樟芝种子。
为了进一步实现本发明的目的，液体牛樟芝种子制备包括：1）菌种活化：采用上述配制好的胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养15天；将低温保藏的牛樟芝菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，28℃暗培养15天；
2)液体牛樟芝种子制备：将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装150ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的牛樟芝菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度28℃条件下培养10-12天，成为液体牛樟芝种子。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：
1、采用常见的苹果段木作为牛樟芝生长的宿主，做到了创新的理念。通常牛樟芝的段木栽培都是以台湾牛樟木作为宿主，但是由于过度砍伐，目前在中海拔已难得一见，台湾已立法将牛樟树列为一级国宝保护树种，不得任意砍伐，资源有限。本发明应用苹果段木培育的牛樟芝在外观形态和樟芝三萜含量上，都基本和牛樟木为宿主培养的牛樟芝相近。
2、牛樟芝子实体的培养时缩短。一般牛樟木培养的牛樟芝子实体生长期大致为2-3年，而采用本发明培育的牛樟芝子实体的生长期大致为120-180天。
3、选用废旧老龄的苹果木，防止焚烧，遵循环保理念，已用过的苹果段木还可以灭菌处理后重复利用。
4、原料易得，成本低。
具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式做详细说明：
实施例1：以固体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，保存于PDA斜面培养基上。
配制胡萝卜培养基：原料包括：胡萝卜20%（W/V），葡萄糖2%（W/V），琼脂1.5%（W/V），余量水，pH自然；其中胡萝卜切成1cm3 大小，沸水煮20min，过滤取滤液使用。
固体种子制备：将配制好的胡萝卜培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装250ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃灭菌30min。将灭菌的培养皿、接种针、锥形瓶中融化后的培养基、酒精灯放入超净工作台中，然后紫外灯消毒30min，打开通风，酒精棉球将手消毒，点燃酒精灯，开始无菌操作，倒平板，平板凉至室温后，接种试管菌种，每只试管菌种可以接种12块平板；接种后的平板放入28℃培养箱中，暗培养20天，成为固体牛樟芝种子。
牛樟芝栽培培养基的制备：将老龄的苹果木锯成长约30cm的木桩，将锯好的木桩在水中完全浸没浸泡7-10天，取出后清洗，装入聚丙烯菌袋中，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；121℃，灭菌120min。
接种：在超净工作台中，待菌袋冷却后，打开菌袋，每袋接入2-3块固体牛樟芝种子，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧。
营养生长管理：将接种完的菌袋置于30℃培养室中进行暗培养60天，菌丝在苹果段木表面蔓延覆盖，并深入生长到木质内部。
生殖生长管理：脱袋，放置于湿度80%、温度15℃培养室中进行培养，培养过程中无需光照；脱袋之后培养30天之后，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收。
实施例2：以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，保存于PDA斜面培养基上。
配制胡萝卜培养基：原料包括：胡萝卜20%（W/V），葡萄糖2%（W/V），琼脂1.5%（W/V），余量水，pH自然；其中胡萝卜切成1cm3 大小，沸水煮20min，过滤取滤液使用。
配制液体种子培养基：固形物5%（W/V）的麦芽汁，pH自然。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养15天；将低温保藏的牛樟芝菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，28℃暗培养15天。
液体牛樟芝种子制备：将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装150ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的牛樟芝菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度28℃条件下培养10-12天，成为液体牛樟芝种子。
牛樟芝栽培培养基的制备：将老龄的苹果木锯成长约30cm的木桩，将锯好的木桩在水中完全浸没浸泡7-10天，取出后清洗，装入聚丙烯菌袋中，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；121℃，灭菌120min。
接种：在超净工作台中，将液体发酵菌种摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将培养基口打开，灼烧瓶口。待菌袋冷却后，打开菌袋，每袋接入150ml液体牛樟芝种子，保证牛樟芝种子从苹果段木的各个面流下，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧。
营养生长管理：将接种完的菌袋置于24℃培养室中进行暗培养40天，菌丝在段木表面蔓延覆盖，并深入生长到木质内部。
生殖生长管理：脱袋，放置于湿度85%、温度20℃培养室中进行培养，培养过程中无需光照。脱袋之后培养30天之后，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收。
实施例3：以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，保存于PDA斜面培养基上。
配制胡萝卜培养基：原料包括：胡萝卜20%（W/V），葡萄糖2%（W/V），琼脂1.5%（W/V），余量水，pH自然；其中胡萝卜切成1cm3 大小，沸水煮20min，过滤取滤液使用。
配制液体种子培养基：固形物5%（W/V）的麦芽汁，pH自然。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养15天；将低温保藏的牛樟芝菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，28℃暗培养15天。
液体种子制备：将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装150ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的牛樟芝菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度28℃条件下培养10-12天，成为液体牛樟芝种子。
牛樟芝栽培培养基的制备：将老龄的苹果木锯成长约30cm的木桩，将锯好的木桩在水中完全浸没浸泡7-10天，取出后清洗，装入聚丙烯菌袋中，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧。121℃，灭菌120min。
接种：在超净工作台中，将液体发酵菌种摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将培养基口打开，灼烧瓶口。待菌袋冷却后，打开菌袋，每袋接入150ml液体牛樟芝种子，保证液体牛樟芝种子从苹果段木的各个面流下，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧。
营养生长管理：将接种完的菌袋置于15℃培养室中进行暗培养30天，菌丝在段木表面蔓延覆盖，并深入生长到木质内部。
生殖生长管理：脱袋，放置于湿度95%、温度25℃培养室中进行培养，培养过程中无需光照。脱袋之后培养30天之后，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种用于采用苹果木栽培牛樟芝子实体的培养基，其特征在于培养基原料包括：胡萝卜20%（W/V），葡萄糖2%（W/V），琼脂1.5%（W/V），余量水，pH自然；其中胡萝卜切成1cm3 大小，沸水煮20min，过滤取滤液使用。
2.一种用于采用苹果木栽培牛樟芝子实体的液体种子培养基，其特征在于培养基原料包括：固形物含量为5%（W/V）的麦芽汁，pH自然。
3.一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法，其特征在于其包括如下步骤：
1）、菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，保存于PDA斜面培养基上；
2）、在适合牛樟芝生长的条件下，在液体种子培养基或固体种子培养基中培养牛樟芝，获得液体或固体牛樟芝种子；其中液体牛樟芝种子培养采用液体种子培养基用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶；接入活化的牛樟芝菌种，旋转式摇床，转速120rpm；温度28℃，暗培养10-12天；其中固体牛樟芝种子培养采用胡萝卜培养基，接种斜面牛樟芝菌种后温度28℃，暗培养20天；
3）、牛樟芝栽培培养基的制备：将老龄的苹果木锯成长约30cm的木桩，将锯好的木桩在水中完全浸没浸泡7-10天，取出后清洗，装入聚丙烯菌袋中，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；121℃，灭菌120min；
4）、接种：在超净工作台中，将液体发酵菌种摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将培养基口打开，灼烧瓶口；待菌袋冷却后，打开菌袋，接入固体或液体牛樟芝种子，用脱脂棉封口，用棉绳扎紧；其中每袋接入2-3块固体牛樟芝种子或每袋接入150ml液体牛樟芝种子，保证液体牛樟芝种子从苹果段木的各个面流下；
5）、营养生长管理：将接种完的菌袋置于15℃-30℃℃培养室中进行暗培养30-60天，菌丝在段木表面蔓延覆盖，并深入生长到木质内部；
6）、生殖生长管理：脱袋，放置于湿度80-95%、温度15-25℃℃培养室中进行培养，培养过程中无需光照；脱袋之后培养30天之后，牛樟芝子实体长到2cm以上大小，可以进行采收。
4.根据权利要求3所述的一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法，其特征在于所述的固体牛樟芝种子制备包括：将上述配制好的胡萝卜培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装250ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃灭菌30min；无菌操作，倒平板，平板凉至室温后，接种试管菌种；每只试管可以接种12块平板；接种后的平板放入28℃培养箱中，暗培养20天，成为固体牛樟芝种子。
5.根据权利要求3所述的一种采用苹果木栽培牛樟芝子实体的方法，其特征在于所述的液体牛樟芝种子制备：1）菌种活化：采用上述配制好的胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养15天；将低温保藏的牛樟芝菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，28℃暗培养15天；
2）液体牛樟芝种子制备：将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装150ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的牛樟芝菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度28℃条件下培养10-12天，成为液体牛樟芝种子。
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Denomination of invention: The invention relates to a method for cultivating the fruiting body of Ganoderma Lucidum with apple wood and a culture medium thereof Effective date of registration: 20211216 Granted publication date: 20191018 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: LUDONG University Registration number: Y2021980015152 |
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