CN105879432A - 一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，向料液比为1∶5的治疗银屑病中药制剂水提液中先后加入总体积4％的天然澄清剂B组分和2％的A组分，于60℃水浴，两组分间隔1h，每0.5h搅拌1min，后离心处理，取上清液。本发明采用的澄清除杂方法，不需要任何特殊设备，具有设备投资少、操作工艺简单，克服了传统醇沉除杂法耗醇量大，工艺费时，乙醇回收过程繁琐等缺陷。同时，细胞实验结果表明治疗银屑病中药制剂同未化裁的银屑灵方均有抑制角质形成细胞增殖的作用，药味精简合理，且比化学药物甲氨蝶呤毒性小。

Description

一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法

技术领域

本发明涉及治疗银屑病的中药制剂的澄清除杂工艺，属于医药技术领域。

背景技术

银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性增生性皮肤病，具有反复发作的特点。银屑病病因与发病机制非常复杂，目前无根治的药物。研究显示银屑病能显著增加患者心脑血管等重大疾病的发病率，增加患者的心理负担。中医药在治疗银屑病方面不仅可以有效缓解症状、减少复发率、且毒副作用低、价格适宜、适合长期使用。

银屑灵方是国医大师禤国维教授临床用于治疗银屑病的专用药物(批号：粤Z20080123)，禤老认为银屑病的发生是由于体质不耐，禀赋不足，外邪侵入肌肤腠理，而致气血凝滞，营卫失和，经络阻塞，以致瘀毒遏伏肌表，新血难于充养，燥瘀互结，缠绵难愈。治疗银屑病的中药制剂(银屑灵优化方PSORI-CM01)是发明人以银屑灵方化裁而来，该药由土茯苓、赤芍、肿节风、甘草等7味药材组成，具有活血化瘀、凉血消斑、除湿止痒的功效。近年来发明人通过大量提取生产PSORI-CM01并对其不同剂型进行临床疗效与基础研究，实验结果提示：PSORI-CM01能够抑制角质形成细胞过度增殖(余靖宏，赵瑞芝，卢传坚.银屑灵优化方对银屑病豚鼠及炎性刺激角质形成细胞增殖的影响[J].中华中医药杂志，2013，05：1531-1534.)；降低皮损面积和改善皮损严重程度，临床治疗寻常型银屑病获得良效(LU Chuan-jian，XIANG Yu，XIEXiu-li，etc.A Randomized Controlled Single-Blind Clinical Trial on 84 Outpatientswith Psoriasis Vulgaris by Auricular Therapy Combined with Optimized YinxielingFormula(PSORI-CM01)[J].Chinese Journal of IntegrativeMedicine，2012，03：186-191.)。

目前在中药颗粒剂、片剂和口服液等多种剂型的水提澄清工艺中广泛使用醇沉法，它通过增加提取液中醇的含量令提取液中的淀粉、蛋白质、胶质、鞣质等水溶性杂质溶解度降低，继而以沉淀析出，该方法乙醇消耗大，工艺流程时间长，醇溶解性低的化学成分损失较多。II型ZTC1+1澄清剂在中草药制剂生产工艺中澄清速度快，保留了更多的有效成分，降低了成本，缩短了生产时程，其制剂的稳定性优于水提醇沉法，是中草药制备水提醇沉工艺中乙醇的理想替代品。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗银屑病中药制剂水提液的快速、高效澄清方法，解决传统醇沉除杂方法所存在的耗醇量大、设备投资高，乙醇回收工序复杂，工艺流程时间长等问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：取治疗银屑病的中药制剂常规煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60℃水浴，先加入4％水提液体积的II型ZTC1+1天然澄清剂B组分，1h后加入2％体积的II型ZTC1+1天然澄清剂A组分，期间每半小时搅拌1分钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液；所述的II型ZTC1+1天然澄清剂：它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由A、B两个组分组成，A组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶，配成1％的水溶液使用；B组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1％醋酸配成1％浓度的溶液使用，先加入的B组分起主絮凝作用，另一A组分带有相反电荷，起辅助絮凝作用。

所述的II型ZTC1+1天然澄清剂经过以下配制：

A组分，精密量取1.0g II型ZTC1+1天然澄清剂，加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤；

B组分，精密量取1.0g II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量体积分数为1％的醋酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1％的醋酸溶液配制成100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤。A组分和B组分按1∶2体积配比使用，先加入B组分，后加入A组分。

作为优选的，所述煎煮3次，前2次每次1h，第3次45min，将煎煮液混合，用纱布滤过，加去离子水定容，使治疗银屑病中药制剂水提液的料液比为1∶5。

上述澄清方法适用于提取方法相近或相似的治疗银屑病中药制剂的颗粒剂、片剂或口服液的澄清。

本发明采用的方法不需要任何特殊设备和大量乙醇，只需要加入II型ZTC1+1天然澄清剂，工艺周期短，提高除杂效率，既可降低固形物，同时又保留了有效成分，且安全无毒，不会引入任何杂质，同时传统醇沉法避免了乙醇回收存放等繁琐工序，该方法稳定合理，较醇沉法更利于治疗银屑病的中药制剂大量生产的澄清工艺推广。

说明书附图

图1是绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷和黄杞苷混合对照品330nm波长下色谱图。

图2是芍药苷230nm波长下的色谱图。

图3是治疗银屑病的中药制剂330nm波长下HPLC色谱图。

图4是治疗银屑病的中药制剂230nm波长下HPLC色谱图。

图5是阴性样品330nm波长下的HPLC色谱图。

图6是阴性样品230nm波长下的HPLC色谱图。

具体实施方式

一.试剂的配制

如图1-6所示，本发明一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，取治疗银屑病的中药制剂常规煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60℃水浴，先加入4％水提液体积的II型ZTC1+1天然澄清剂B组分，1h后加入2％体积的A组分，期间每半小时搅拌1分钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液。

其中，II型ZTC1+1天然澄清剂：

A组分，精密量取1.0g II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤。

B组分，精密量取1.0g II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量体积分数为1％的醋酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1％的醋酸溶液配制成100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤。

治疗银屑病的中药制剂水提液的制备：取治疗银屑病的中药制剂组成1剂，加入1L去离子水，加热煎煮3次，前2次每次1小时，第3次45分钟，将煎煮液混合，用纱布滤过，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含1g原药。同时，去离子水稀释至料液比为1∶5，1∶10，1∶15备用。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸、异嗪皮啶、芍药苷、落新妇苷和黄杞苷五种对照品各2mg，分别加1mL甲醇配制质量浓度为2mg/mL的母液，再用甲醇稀释成不同浓度倍数备用。

二.高效液相色谱法测定5种化合物含量

标准曲线绘制：分别精密吸取上述不同浓度的五种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10μL，以测得的响应信号(峰面积)和浓度进行线性回归，得到五种标准品的回归方程。绿原酸Y＝29901 X+5698.6(R²＝0.9992)，进样浓度在1.79～115μg/mL范围内线性良好；芍药苷Y＝17281 X+117236(R²＝0.9997)，进样浓度在5.84～750μg/mL范围内线性良好；异嗪皮啶Y＝25094X+34497(R²＝0.9989)，在0.54～87.5μg/mL浓度范围内线性良好；落新妇苷Y＝5272.8 X+60778(R²＝0.9994)，在7.81～1000μg/mL浓度范围内线性良好；黄杞苷Y＝6986.4 X+37074(R²＝0.9992)，在3.91～500μg/mL浓度范围内线性良好。

系统试用性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试样品，照高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性和Inertsil ODS-3色谱柱，流动相见表1，平衡时间15min，流速0.8mL/min，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm，进样10μL，记录色谱图。

表1 流动相梯度洗脱表

对上述确定的测定方法进行系统试用性试验及有效性评价，其中包括精密度、重复性、稳定性等。

三.澄清工艺考察

采用正交试验设计：以澄清剂加入量、料液比、温度和时间为考察因素，各选取3个水平(表2)，以L9(3⁴)正交表(表3)进行试验，以化合物保留率和固形物去除率计算综合评分，并进行方差分析。

表2 L₉(3⁴)正交试验因素水平表

澄清剂A、B加入顺序：根据说明书，ZTC天然澄清剂主要是根据溶液的性质选择不同的添加顺序，一般中药复方相对于蛋白质等电点(pH＝4.8)为酸性环境，添加顺序为先B后A，B组分用量为A组分2倍。

评价指标：分别选取绿原酸含量保留率(X1)、芍药苷含量保留率(X2)、异嗪皮啶苷含量保留率(X3)、落新妇苷含量保留率(X4)、黄杞苷含量保留率(X5)和固形物去除率(X6)作为评价指标进行综合评分，将化合物保留率权重定为0.7，固形物去除率X6权重定为0.3，即

OD％＝(0.7X1+0.7X2+0.7X3+0.7X4+0.7X5)/5+0.3X6。计算公式如下：化合物保留率＝澄清后提取液化合物的含量/提取液中化合物的含量×100％固形物去除率＝(澄清前固形物含量-澄清后固形物含量)/澄清前固形物含量×100％

实验结果：由正交试验结果(见表2)的方差分析可以看出，澄清剂加入量及提取液料液比对综合评分有显著影响，温度和时间对提取液的澄清效果无统计学意义。实验发现，澄清剂B成分为4％时的治疗银屑病的中药制剂提取液澄效果好，故确定II型ZTC1+1天然澄清剂澄清治疗银屑病的中药制剂提取液的最佳工艺条件为澄清剂加入量B组分为4％，A组分为2％，料液比为1∶5，温度为60℃，反应时间为1h。

表3 L₉(3⁴)正交试验结果

本发明所述治疗银屑病的中药制剂澄清工艺的液相色谱技术检测的质量控制方法，该方法供试品溶液的制备：取治疗银屑病的中药制剂组成1剂，常规水煎提取(前2次，每次1h，第3次45min)将煎煮液混合，用纱布滤过，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含1g原药。

本发明所述治疗银屑病的中药制剂的澄清工艺，高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性试验方法：Inertsil ODS-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流速0.8mL/min，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm，进样10μL。

本发明所述的质量控制方法，由于芍药苷的最大吸收波长为230.2nm，绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷与黄杞苷的最大吸收波长分别为327.4nm，342.9nm，290.4nm和292.8nm，芍药苷在大于290nm处吸收很少，故选择230nm和330nm双波长分别测定芍药苷与绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷的含量。

四.与醇沉澄清法比较：本发明将正交试验筛选的天然澄清剂澄清法和醇沉澄清法进行比较，以绿原酸、芍药苷、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷五种化合物成分保留率和固形物去除率为评价指标(表4)，发现：醇沉法虽然杂质去除率高，但活性成分损失多。本发明采用的方法不需要任何特殊设备和大量乙醇，只需要加入II型ZTC1+1天然澄清剂，用于澄清治疗银屑病的中药制剂水提液，简单合理，工艺周期短，提高除杂效率，既去除杂质固形物，同时又保留了有效成分，且安全无毒，不会引入任何杂质，同时避免水提醇沉法乙醇回收等繁琐工序，该方法稳定合理，易于治疗银屑病的中药制剂大量生产的澄清方法推广。

表4 澄清剂法与醇沉法对药物成分及杂质的比较

五.细胞实验

银屑病皮损以角质细胞的角化过度和角化不全，真皮炎症细胞浸润，毛细血管增生为主要特征。银屑病相关药物主要改变其病理状态而起到治疗疾病的作用。本实验目的以观察治疗银屑病的中药制剂对角质形成细胞(HaCaT)增殖的影响。

1.实验材料与仪器

材料：HaCaT细胞，上海医药工业研究所；银屑灵方组成土茯苓、赤芍、肿节风、甘草等药材，购自康美药业股份有限公司，经广东省中医院黄志海主任中药师鉴定均符合《中华人民共和国药典》(2010版)标准；甲氨蝶吟片(MTX)，上海信谊药厂有限公司；MEM培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲盐(PBS)、脂多糖(LPS)，北京鼎国昌盛生物公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，广州菲博生物公司；青链霉素，广州威佳生物公司。

主要仪器：OLYMPUS(XSZ-H)光学显微镜；LXJ-II型离心机；贺利氏CO2培养箱；TS300倒置显微镜。

2.实验方法

药液制备：银屑灵方与治疗银屑病的中药制剂常规水煎提取(前2次，每次1h，第3次45min)将煎煮液混合，以本发明方法澄清，干燥，真空干燥后取药粉用无血清MEM培养液配制母液，除菌过滤后，再稀释为250、125、62.5、31.25、15.6μg/mL共5个浓度。

细胞给药：HaCaT细胞孵育传代，取对数生长期HaCaT细胞以2.0×10⁴/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL，24h后加人LPS，每孔浓度15μg/mL。阳性对照药物用甲氨蝶呤片，浓度为1μg/mL。随后加入各浓度药物，设空白对照组，银屑灵组，治疗银屑病的中药制剂组，LPS对照组和MTX组。

MTT检测细胞活力：给药48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，孵育4h，弃上清，再加人DMSO，每孔100μL，震荡摇匀10min，用免疫分析仪在570nm波长下检测OD值并计算生长抑制率[生长抑制率(％)＝(1-实验组OD值/空白组OD值)×100％]。

3实验结果

浓度为250、125、62.5μg/mL银屑灵及治疗银屑病的中药制剂对培养48h的HaCaT细胞抑制率为-5.4％～32.7％，各浓度组内有显著差异(P＜0.01)，银屑灵组及治疗银屑病的中药制剂组组间差异无统计学意义。甲氨蝶呤在给药48h后抑制率为63.0％，同银屑灵及治疗银屑病的中药制剂比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。本实验中甲氨蝶呤细胞抑制率高于50％，细胞毒性较大。结论：治疗银屑病的中药制剂同银屑灵均有抑制角质形成细胞增殖的作用，同甲氨蝶呤相比安全剂量范围广且毒性小。

Claims (3)

1.一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，其特征在于：取治疗银屑病的中药制剂常规煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60℃水浴，先加入4％水提液体积的II型ZTC1+1天然澄清剂B组分，1h后加入2％体积的II型ZTC1+1天然澄清剂A组分，期间每半小时搅拌1分钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液；所述的II型ZTC1+1天然澄清剂：它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由A、B两个组分组成，A组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶，配成1％的水溶液使用；B组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1％醋酸配成1％浓度的溶液使用，先加入的B组分起主絮凝作用，另一A组分带有相反电荷，起辅助絮凝作用。

2.根据权利要求1所述的一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，其特征在于：煎煮3次，前2次每次1h，第3次45min，将煎煮液混合，用纱布滤过，加去离子水定容，使治疗银屑病中药制剂水提液的料液比为1∶5。

3.根据权利要求1所述的一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，其特征适用于提取方法相近或相似的治疗银屑病中药制剂的颗粒剂、片剂或口服液的澄清。