CN100487452C - 治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，所述质量控制方法主要包括性状、检查、鉴别、含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括与α-萘酚的显色反应、以人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品为对照的薄层鉴别；含量测定包括对制剂中人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定；与现有技术相比，本发明质量控制方法准确度高，重现性好，不仅能全面有效地控制治疗肿瘤的注射制剂的质量，确保该制剂的临床疗效，而且所采用的方法相对减少了检验成本。
Description
技术领域：本发明涉及一种治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，属于对药品进行质量控制的技术领域。
背景技术：人类发现肿瘤已有3000年以上的历史。上皮性的恶性肿瘤称为癌，约占所有恶性肿瘤的90％以上。癌症是严重威胁人类健康的一大类疾病，并且患者在不断上升。由本申请人研制的一种治疗肿瘤的药物，它主要由斑蝥、人参、黄芪、刺五加制备而成，该产品具有清热解毒，消瘀散结的作用，在治疗原发性肝癌，肺癌，直肠癌，恶性淋巴瘤，妇科恶性肿瘤等疾病方面取得良好的效果。但是如何有效控制该产品的质量，确保该产品的临床疗效，是本申请人长期以来一直研究的问题。
发明内容：
本发明的目的在于：提供一种治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，该注射制剂包括注射液、冻干粉和大输液，本发明对制剂中主要有效成分人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定以及人参和黄芪的薄层鉴别进行了研究和筛选，所制定的质量控制方法能全面有效地控制产品的质量，从而确保了该制剂的临床疗效。
本发明所述治疗肿瘤的注射制剂是这样构成的：按照重量组份计算：它主要由斑蝥0.5-5、人参20-80、黄芪50-150、刺五加100-200制备而成。
本发明所述注射制剂这样制备：人参切片，用20-85％乙醇加热回流提取1-5次，合并提取液，滤过，回收乙醇，药液备用；药渣与其余斑蝥等三味加水煎煮1-6次，合并煎液，滤过，滤液与人参提取液合并，以石硫法沉淀处理1-3次，所得上清液加乙醇使含醇量达50-99％，静置过夜，取上清液减压回收乙醇至无醇味，再按照常规方法分别制成注射液、大输液或冻干粉制剂。
所述质量控制方法主要包括性状、检查、鉴别、含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括与α-萘酚的显色反应、以人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品为对照的薄层鉴别；含量测定包括对制剂中人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定。
本制剂中人参和黄芪的鉴别方法是以人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品为对照，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10、10℃以下放置的下层溶液为展开剂的薄层鉴别方法。
鉴别方法包括以下项目的部分或全部：
(1)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；加入乙醇搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％ α-萘酚乙醇溶液，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸，在二液面接界处显紫红色环；
(2)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，用水洗涤，再用20-85％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
更具体的鉴别方法包括以下项目的部分或全部：
(1)取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，加乙醇20-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水2-10ml溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％ α-萘酚乙醇溶液2-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.2-2ml，在二液面接界处显紫红色环；
(2)取冻干粉200-400g加注射用水40-60ml使溶解、或取大输液200-400ml浓缩至40-60ml；或取注射液40-60ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水1-10ml溶解，加入预先制备好的内径1～1.5cm、长15cm、填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝的DA-201树脂柱上，用水50-150ml洗涤，再用20-85％甲醇液30-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-3mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3-20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15：0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本制剂中人参皂苷Re的含量测定方法是以人参皂苷Re对照品为对照的分光光度法。
本制剂中斑蝥素的含量测定方法是以斑蝥素对照品为对照，以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液的气相色谱法。
含量测定方法包括：
(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加入2-10％香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，摇匀，置水浴中加热，取出，用水冷却，加入冰醋酸，摇匀，照中国药典分光光度法，测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液，摇匀，再精密加入氯仿，密塞，振摇，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
更具体的含量测定方法包括：
(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1-2mg，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液0.1-1ml、高氯酸0.5-1.5ml，摇匀，置40-80℃水浴中加热10-30分钟，取出，用水冷却0.5-5分钟，加冰醋酸2-10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在300-700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：取冻干粉60-150g加注射用水10-30ml使溶解、或取大输液50-200ml浓缩至10-30ml；或取注射液10-30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1-10g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05-0.1mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液0.5-3ml，摇匀，再精密加入0.5-3ml氯仿，密塞，振摇1-10分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2-15μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
所述质量控制方法包括：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：(1)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；加入乙醇搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％ α-萘酚乙醇溶液，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸，在二液面接界处显紫红色环；
(2)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，用水洗涤，再用20-85％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
检查：
PH值：应为3.0-6.0；
重金属：取冻干粉40-80g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；
热原：分别取冻干粉100-200g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至80-150ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；
其他：本发明的注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；
含量测定：
(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加入2-10％香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，摇匀，置水浴中加热，取出，用水冷却，加入冰醋酸，摇匀，照中国药典分光光度法，测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液，摇匀，再精密加入氯仿，密塞，振摇，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
经研究发现，采用以下质量控制方法将更容易控制本发明制剂的质量，更利于保证本制剂的临床疗效。故所述质量控制方法还可包括：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：(1)取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，加乙醇20-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水2-10ml溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％ α-萘酚乙醇溶液2-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.2-2ml，在二液面接界处显紫红色环；
(2)取冻干粉200-400g加注射用水40-60ml使溶解、或取大输液200-400ml浓缩至40-60ml；或取注射液40-60ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水1-10ml溶解，加入预先制备好的内径1～1.5cm、长15cm、填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝的DA-201树脂柱上，用水50-150ml洗涤，再用20-85％甲醇液30-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-3mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各320μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15：0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
检查：
PH值：应为3.0-6.0；
重金属：取冻干粉40-80g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；
热原：分别取冻干粉100-200g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至80-150ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；
其他：本发明的注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；
含量测定：
(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1-2mg，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液0.1-1ml、高氯酸0.5-1.5ml，摇匀，置40-80℃水浴中加热10-30分钟，取出，用水冷却0.5-5分钟，加冰醋酸2-10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在300-700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：取冻干粉60-150g加注射用水10-30ml使溶解、或取大输液50-200ml浓缩至10-30ml；或取注射液10-30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1-10g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05-0.1mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液0.5-3ml，摇匀，再精密加入0.5-3ml氯仿，密塞，振摇1-10分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2-15μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
本制剂中，人参具有增强免疫力的作用，斑蝥具有抗肿瘤的作用。人参和斑蝥均为该产品中起主要作用的药物，而人参皂苷Re和斑蝥素又分别是人参和斑蝥中的主要有效成分，故本发明应对人参皂苷Re及斑蝥素进行含量测定，方能有效控制该产品的质量，但是如何有效测定该制剂中人参皂苷Re和斑蝥素的含量，是本发明的难点所在。经过研究，我们发现，采用分光光度法，并采用氯仿提取药物，然后再用水饱和的正丁醇提取，加入无水硫酸钠后过大孔吸附树脂的方法制备供试品溶液，可有效测定该制剂中人参皂苷Re的含量；采用气相色谱法，色谱条件与系统适用性试验为：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；用该方法可有效测定制剂中斑蝥素的含量。另外在制备斑蝥素供试品溶液的方法中，我们没有使用K-D浓缩器，减少了检验成本。
本发明还对人参和黄芪进行了薄层鉴别研究，并以人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品为对照，采用水饱和的正丁醇提取，然后过树脂柱的方法提取药物，制备供试品溶液；以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，用该方法鉴别制剂中的人参和黄芪药材，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好。所以用本发明方法可有效控制治疗肿瘤的注射制剂的质量，保证该制剂的临床疗效。
本发明的质量控制方法是经过大量的筛选得到的最佳方案，以下实验研究为本发明的优选过程。
一、人参皂苷Re含量测定方法研究
1、供试品溶液制备方法研究：
方法1：取药物，置分液漏斗中，用氯仿提取，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，摇匀，即得。
方法2：取药物，置蒸发皿中，于水浴上浓缩，加氯仿振摇提取，弃去氯仿，再加水饱和的正丁醇振摇提取3次，合并正丁醇，加氨试液洗1次，弃去碱液，正丁醇溶液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，即得。
| 样品 | 方法1(mg/ml) | 方法2(mg/ml) |
| 1 | 0.254 | 0.231 |
| 2 | 0.243 | 0.229 |
| 3 | 0.261 | 0.235 |
根据试验结果可知，采用方法1制备供试品溶液，人参皂苷Re提取更为完全。
二、斑蝥素含量测定方法研究
1、供试品溶液制备方法研究：
方法1：取药物，置具塞试管中，加入1.8mol/L硫酸溶液，摇匀，再加入氯仿，密塞，振摇3分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得。
方法2：取药物，加入1.8mol/L硫酸溶液，用氯仿提取3次，合并氯仿液，用K-D浓缩器浓缩并定容，即得。
| 样品 | 方法1(mg/ml) | 方法2(mg/ml) |
| 1 | 0.00151 | 0.00154 |
| 2 | 0.00175 | 0.00172 |
| 3 | 0.00208 | 0.00212 |
根据实验结果可知，两种方法所提取的斑蝥素含量无明显差别。但是由于方法2中使用了K-D浓缩器，增加了检验成本。另据本申请人了解，由于K-D浓缩器多用于食品的检测，在药品检测中使用的不多，且国内大多数药物检验所均无K-D浓缩器，故本发明中采用方法1检测本产品中斑蝥素的含量，不仅可以相对减少检验成本，还方便各省药检所对该产品进行检测。
三、人参、黄芪薄层鉴别研究
供试品溶液制备方法一：取药物，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，用水洗涤，再用40％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇溶解，作为供试品溶液；同法制备缺人参、黄芪阴性对照液。
供试品溶液制备方法二：取药物，装入滤纸筒内，置索氏提取器中，加乙醚提取至无色，弃去乙醚液，加甲醇浸泡过夜后再加甲醇提取至无色，用少量甲醇洗涤容器，合并提取液及洗涤液，水浴蒸干，残渣用水微热熔解，用0.1mol/L氢氧化钠饱和的正丁醇提取6次，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解；同法制备缺人参、黄芪阴性对照液。
展开剂选择：分别以氯仿、醋酸乙酯、乙腈、水不同比例的混合溶液；氯仿、醋酸乙酯、甲醇、水不同比例的混合溶液；氯仿、甲醇、水不同比例的混合溶液为展开剂。
结果：采用方法一制备供试品溶液，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15：0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好。最佳展开剂为：氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶8∶3∶4、10℃以下放置的下层溶液。
与现有技术相比，本发明对制剂中主要有效成分人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定以及人参和黄芪的薄层鉴别进行了研究和筛选，所采用的质量控制方法科学合理，准确度高，重现性好，不仅能全面有效地控制治疗肿瘤的注射制剂的质量，确保该制剂的临床疗效，而且所采用的方法相对减少了检验成本。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
本发明的实施例1：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：(1)取冻干粉60g加注射用水10ml使溶解、或取大输液60ml浓缩至10ml；或取注射液10ml；分别取上述药品，加乙醇50ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤2次，将沉淀物用蒸馏水5ml溶解，取1ml置试管中，微热后加入5％ α-萘酚乙醇溶液50滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在二液面接界处显紫红色环；
(2)取冻干粉300g加注射用水50ml使溶解、或取大输液300ml浓缩至30ml；或取注射液50ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水3ml溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱(内径1～1.5cm，长15cm，填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝)上，用水100ml洗涤，再用40％甲醇液50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶8∶3∶4，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105°C加热数分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
检查：
PH值：应为3.8-5.0；
重金属：取冻干粉20g加注射用水2ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；
热原：分别取冻干粉150g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至100ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；
其他：本发明的注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；
含量测定：(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1.6mg，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，用水冷却2分钟，加冰醋酸5ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在544nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：取冻干粉100g加注射用水20ml使溶解、或取大输液120ml浓缩至20ml；或取注射液20ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取3次，每次20ml，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤2次，每次5ml，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠3g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算。该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为10％和5％，1∶1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.01mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取冻干粉60g加注射用水10ml使溶解、或取大输液60ml浓缩至10ml；或取注射液10ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1.8mol/L硫酸溶液1ml，摇匀，再精密加入1ml氯仿，密塞，振摇3分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各4μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
本发明的实施例2：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：取冻干粉30g加注射用水5ml使溶解、或取大输液30ml浓缩至5ml；或取注射液5ml；分别取上述药品，加乙醇20ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1次，将沉淀物用蒸馏水2ml溶解，取0.5ml置试管中，微热后加入2％ α-萘酚乙醇溶液2滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.2ml，在二液面接界处显紫红色环；
检查：
PH值：应为3.0-5.0；
热原：分别取冻干粉100g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至80ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；
含量测定：斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5％和2％，1∶9混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取冻干粉30g加注射用水5ml使溶解、或取大输液30ml浓缩至5ml；或取注射液5ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1mol/L硫酸溶液0.5ml，摇匀，再精密加入0.5ml氯仿，密塞，振摇1分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
本发明的实施例3：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：取冻干粉200g加注射用水40ml使溶解、或取大输液200ml浓缩至40ml；或取注射液40ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水1ml溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱(内径1～1.5cm，长15cm，填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝)上，用水50ml洗涤，再用20％甲醇液30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿：醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝10∶5∶0.5∶10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯200nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1mg，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2％香草醛冰醋酸溶液0.1ml、高氯酸0.5ml，摇匀，置40℃水浴中加热10分钟，取出，用水冷却0.5分钟，加冰醋酸2ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在300nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：取冻干粉60g加注射用水10ml使溶解、或取大输液50ml浓缩至10ml；或取注射液10ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，用40％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml。
本发明的实施例4：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
检查：
重金属：取冻干粉40g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；
其他：本发明的注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；
含量测定：(1)人参皂苷Re
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re2mg，摇匀，即得；
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加10％香草醛冰醋酸溶液1ml、高氯酸1.5ml，摇匀，置80℃水浴中加热30分钟，取出，用水冷却5分钟，加冰醋酸10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
供试品溶液的制备：取冻干粉150g加注射用水30ml使溶解、或取大输液200ml浓缩至30ml；或取注射液30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取5次，每次10ml，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤5次，每次5ml，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取6次，每次30ml，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠10g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，控制流速为0.4ml/min，弃去洗液，用90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；
(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为20％和10％，9∶1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取冻干粉100g加注射用水20ml使溶解、或取大输液100ml浓缩至20ml；或取注射液20ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入3mol/L硫酸溶液3ml，摇匀，再精密加入3ml氯仿，密塞，振摇10分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；
测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各15μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
本发明的实施例5：
性状：
对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；
对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；
对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；
鉴别：(1)取冻干粉100g加注射用水20ml使溶解、或取大输液100ml浓缩至20ml；或取注射液20ml；分别取上述药品，加乙醇100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤5次，将沉淀物用蒸馏水10ml溶解，取3ml置试管中，微热后加入10％ α-萘酚乙醇溶液10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸2ml，在二液面接界处显紫红色环；
(2)取冻干粉400g加注射用水60ml使溶解、或取大输液400ml浓缩至60ml；或取注射液60ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次，每次15ml，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水10ml溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱(内径1～1.5cm，长15cm，填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝)上，用水150ml洗涤，再用85％甲醇液100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含3mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1∶15∶6∶1，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
检查：
PH值：应为3.8-6.0；
重金属：取冻干粉80g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；
热原：分别取冻干粉200g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至150ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；
其他：本发明的注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定。
Claims (4)
- 【权利要求1】一种治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，所述治疗肿瘤的注射制剂是这样构成的，按照重量组份计算，它由斑蝥0.5-5、人参20-80、黄芪50-150、刺五加100-200制备而成；该注射制剂为注射液、冻干粉和大输液，所述质量控制方法为性状、检查、鉴别和含量测定项目；其中鉴别为与α-萘酚的显色反应、以人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品为对照的薄层鉴别；含量测定为对制剂中人参皂苷Re和斑蝥素的含量测定；其特征在于：含量测定方法为：(1)人参皂苷Re对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加入2-10％香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，摇匀，置水浴中加热，取出，用水冷却，加入冰醋酸，摇匀，照中国药典分光光度法，测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；(2)斑蝥素 照中国药典气相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液，摇匀，再精密加入氯仿，密塞，振摇，静置分层，必要时离心，取下层液即得；测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
- 【权利要求2】按照权利要求1所述治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，其特征在于：具体的含量测定方法为：(1)人参皂苷Re对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1-2mg，摇匀，即得；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液0.1-1ml、高氯酸0.5-1.5ml，摇匀，置40-80℃水浴中加热10-30分钟，取出，用水冷却0.5-5分钟，加冰醋酸2-10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在300-700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；供试品溶液的制备：取冻干粉60-150g加注射用水10-30ml使溶解、或取大输液50-200ml浓缩至10-30ml；或取注射液10-30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1-10g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；(2)斑蝥素 照中国药典气相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05-0.1mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液0.5-3ml，摇匀，再精密加入0.5-3ml氯仿，密塞，振摇1-10分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2-15μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
- 【权利要求3】按照权利要求1所述治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，其特征在于：所述质量控制方法为：性状：对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；鉴别：(1)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；加入乙醇搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％α-萘酚乙醇溶液，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸，在二液面接界处显紫红色环；(2)分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，加入预先制备好的DA-201树脂柱上，用水洗涤，再用20-85％甲醇液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；检查：PH值：应为3.0-6.0；重金属：取冻干粉40-80g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；热原：分别取冻干粉100-200g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至80-150ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；其他：注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；含量测定：(1)人参皂苷Re对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加入2-10％香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，摇匀，置水浴中加热，取出，用水冷却，加入冰醋酸，摇匀，照中国药典分光光度法，测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；(2)斑蝥素照中国药典气相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：分别取冻干粉加注射用水溶解、或取大输液浓缩、或直接取注射液；置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液，摇匀，再精密加入氯仿，密塞，振摇，静置分层，必要时离心，取下层液即得；测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/m1；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
- 【权利要求4】按照权利要求3所述治疗肿瘤的注射制剂的质量控制方法，其特征在于：所述质量控制方法为：性状：对于注射液：产品为浅棕色的澄明液体；对于大输液：产品为黄色至浅棕色的澄明液体；对于冻干粉：产品为黄色至浅棕色疏松块状物；鉴别：(1)取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，加乙醇20-100ml，搅匀，滤过，沉淀物用乙醇洗涤1-5次，将沉淀物用蒸馏水2-10ml溶解，取0.5-3ml置试管中，微热后加入2-10％α-萘酚乙醇溶液2-10滴，摇匀，再沿管壁缓缓加入浓硫酸0.2-2ml，在二液面接界处显紫红色环；(2)取冻干粉200-400g加注射用水40-60ml使溶解、或取大输液200-400ml浓缩至40-60ml；或取注射液40-60ml；分别取上述药品，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-5次，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水1-10ml溶解，加入预先制备好的内径1～1.5cm、长15cm、填充12cm的DA-201树脂后，再填充2g中性氧化铝的DA-201树脂柱上，用水50-150ml洗涤，再用20-85％甲醇液30-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re、Rg1、Rb及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-3mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3-20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇或乙腈∶水＝1-10∶5-15∶0.5-6∶1-10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热，置紫外光灯200-500nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；检查：PH值：应为3.0-6.0；重金属：取冻干粉40-80g加注射用水10ml使溶解、或取大输液2ml、或取注射液2ml，置坩埚中，水浴上蒸干，依照中国药典重金属检查法检查，含重金属不得过百万分之五；热原：分别取冻干粉100-200g加注射用水30ml使溶解、或取大输液30ml、或取注射液30ml；用氯化钠注射液或5～10％葡萄糖注射液稀释至80-150ml，按家兔体重1kg注射10ml的剂量，照中国药典热原检查法检查，应符合规定；其他：注射液、冻干粉或大输液应符合中国药典关于注射剂项下的有关规定；含量测定：(1)人参皂苷Re对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇溶解使每1ml中含人参皂苷Re1-2mg，摇匀，即得；标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100μl，分别置10ml具塞试管中，置水浴上挥去溶剂，立即取出，放冷，加2-10％香草醛冰醋酸溶液0.1-1ml、高氯酸0.5-1.5ml，摇匀，置40-80℃水浴中加热10-30分钟，取出，用水冷却0.5-5分钟，加冰醋酸2-10ml，摇匀，照中国药典分光光度法，在300-700nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；供试品溶液的制备：取冻干粉60-150g加注射用水10-30ml使溶解、或取大输液50-200ml浓缩至10-30ml；或取注射液10-30ml；分别精密量取上述药品，置分液漏斗中，用氯仿提取1-5次，合并氯仿提取液，用蒸馏水洗涤1-5次，弃去氯仿液，洗液与上述水层合并，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取1-6次，合并正丁醇提取液，加入无水硫酸钠1-10g，搅拌，放至澄清，将正丁醇液移至蒸发皿中，用正丁醇洗涤无水硫酸钠，洗液并入蒸发皿中，蒸干，用蒸馏水溶解残渣，加到大孔吸附树脂DA-201柱上，待液面接近棉花层后，用蒸馏水100ml洗脱，弃去洗液，用40-90％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置水浴上蒸干，用甲醇溶解残渣，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：精密量取供试品溶液100μl，照标准曲线的制备项下的方法，自“置10ml具塞试管中”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的重量μg，计算；该注射制剂中，注射液中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.15mg/ml；冻干粉中含人参以人参皂苷Re计，不得少于2％；大输液制剂中含人参以人参皂苷Re计，不得少于0.02mg/ml；(2)斑蝥素 照中国药典气相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验：以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶SE-30为固定液，涂布浓度分别为5-20％和2-10％，1-9∶9-1混合装柱；柱温为160±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.05-0.1mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取冻干粉30-100g加注射用水5-20ml使溶解、或取大输液30-100ml浓缩至5-20ml；或取注射液5-20ml；分别取上述药品，置具塞试管中，加入1-3mol/L硫酸溶液0.5-3ml，摇匀，再精密加入0.5-3ml氯仿，密塞，振摇1-10分钟，静置分层，必要时离心，取下层液即得；测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2-15μl，注入气相色谱仪，计算；该注射制剂中，注射液中含斑蝥素为0.0005～0.004mg/ml；冻干粉中含斑蝥素为0.01～0.1％；大输液制剂中含斑蝥素为0.00008～0.0008mg/ml。
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