CN105793701A - 质量分析方法、质量分析装置以及质量分析数据处理程序 - Google Patents

Abstract

本发明的质量分析方法使用质量分析装置(2)，该质量分析装置(2)在隔着使离子分裂的碰撞室(232)的前后具有质量分离部(231)、(234)。在通过对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描来选出与该前体离子对应的产物离子时，基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比的排除范围，从产物离子谱中在除所述排除范围以外的质荷比的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。根据本发明的质量分析方法，能够选出适于测量目标化合物的产物离子。

Description

质量分析方法、质量分析装置以及质量分析数据处理程序

技术领域

本发明涉及用于选出用于通过多重反应监测(MRM＝MultipleReactionMonitoring)测量对试样中的目标化合物进行定性和/或定量的前体离子和产物离子的组合的质量分析方法、质量分析装置以及质量分析数据处理程序。

背景技术

为了进行分子量大的物质的鉴定、其构造分析或者定量等，而广泛使用一种被称为MS/MS分析(串联分析)的方法来作为质量分析的一种方法。作为用于进行MS/MS分析的质量分析装置，存在各种结构的质量分析装置，但从构造比较简单且操作、处理也容易的角度出发，通常使用串联四极型质量分析装置。

在串联四极型质量分析装置中，由离子源生成的源自化合物的离子被导入到前级四极滤质器(习惯上记述为Q1)，筛选出具有特定的质荷比m/z的离子来作为前体离子。该前体离子被导入到内置有四极型(或者四极型以上的多极型)的离子导向器(习惯上记述为q2)的碰撞室。向碰撞室内供给氩等碰撞诱导分解(CID)气体，前体离子在碰撞室内碰撞CID气体而分裂，生成各种产物离子。该产物离子被导入到后级四极滤质器(习惯上记述为Q3)，筛选出具有特定的质荷比m/z的产物离子并使其到达检测器而被检测。

在串联四极型质量分析装置中的MS/MS测量的一个模式中存在MRM测量模式。在MRM测量模式下，使能够通过前级四极滤质器和后级四极滤质器的离子的质荷比分别固定，来测量特定的产物离子相对于特定的前体离子的强度(量)。在这样的MRM测量中，能够通过两级的滤质器来去除源自非测量对象的化合物、夹杂成分的离子、中性粒子，因此能够获得高SN比的离子强度信号。因此，MRM测量特别是在微量成分的定量等中发挥威力。

这样的串联四极型质量分析装置有时也被单独使用，但时常与液相色谱仪(LC)、气相色谱仪(GC)配合使用。例如将串联四极型质量分析装置用作液相色谱仪的检测器的LC/MS/MS经常被用于含有多种化合物的试样、含有夹杂物的试样中的化合物的定量分析等。

在LC/MS/MS(或者GC/MS/MS)中进行MRM测量的情况下，在测量目标试样之前，需要与作为目标的化合物的保持时间相关联地预先将作为目标的前体离子的质荷比和产物离子的质荷比的组合(以下，称为“MRM母子离子对(transitions)”。)设定为测量条件之一。通过对各目标化合物预先设定最佳的MRM母子离子对，能够以高精度且高灵敏度获得源自各目标化合物的离子的信号强度，能够以高精度且高灵敏度进行该化合物的定量。还能够由分析者手动地设定MRM母子离子对，但在手动的情况下花费工夫，而且并不一定能够设定最佳的组合。

因此，以往如下那样设定MRM母子离子对。

首先，分析者仅指定源自作为目标的化合物的前体离子的质荷比。于是，对含有该化合物的已知的试样实施与指定的前体离子有关的产物离子扫描测量，在由此得到的产物离子谱中按信号强度从大到小的顺序选出规定个数的产物离子峰。然后，将由分析者指定的前体离子和对应于所选出的峰的产物离子的组合设为MRM母子离子对。

在上述方法中，即使分析者不知道要作为目标的产物离子的质荷比，也能够搜索适当的产物离子并自动地设定MRM母子离子对。然而，存在以下情况：根据为了使前体离子分裂而施加的碰撞能量(CE)电压的大小等参数的不同，所生成的产物离子的种类不同，仅在某一受限的条件下生成的产物离子表示大的信号强度，因此还存在以下情况：与表示大的信号强度的产物离子相比，信号强度低的产物离子更适于定量。因此，例如还提出了以下方法等：在进行多次产物离子扫描测量而分别获取到的产物离子谱中按出现频率从高到低的顺序选出产物离子(例如专利文献1、2)。

专利文献1：日本特开2013-15485号公报

专利文献2：日本特开2012-104389号公报

发明内容

发明要解决的问题

以外，在进行产物离子扫描而得到的产物离子谱中，按信号强度从大到小的顺序、出现频率从高到低的顺序来选出规定个数的产物离子峰，但在这些方法中，有时没有考虑所选出的产物离子的质荷比而选择了并不一定是对化合物的构造赋予特征的离子的产物离子。如果将这种产物离子设定为MRM母子离子对，则存在以下问题：混淆地检测与目标化合物不同的化合物，从而弄错定性或者在定量中产生误差。

对于不适于选择为产物离子的离子之一，存在前体离子不分裂就被检测为产物离子的离子(即前体离子本身)。如果前体离子是1价的离子，则在不分裂就被检测为产物离子的情况下，前体离子与产物离子的质荷比相同，因此分析者能够识别出作为产物离子并不恰当而再次设定MRM母子离子对。另外，在前体离子是1价的离子的情况下，如果将比前体离子的质荷比小的质荷比的范围设定为产物离子的测量范围，则能够避免选择前体离子本身。

但是，在多价的前体离子分裂而价数减少的产物离子中含有具有比前体离子的质荷比大的质荷比的产物离子，因此不能如上所述那样限定产物离子的质荷比的范围。另外，当价数变化时，质荷比不同，因此存在以下问题：有时分析者未察觉到是实质上与前体离子相同的离子，而设定以该离子为产物离子的MRM母子离子对，弄错定性或者在定量中产生误差。

本发明所要解决的问题在于，提供一种在决定作为用于MRM测量的参数的MRM母子离子对时，能够选出适于目标化合物的定性、定量的产物离子的质量分析方法、装置以及程序。

用于解决问题的方案

为了解决上述问题而完成的本发明的第一方式是一种质量分析方法，使用质量分析装置对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描，由此选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，该质量分析方法的特征在于，

a)基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；

b)在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。

由使用者输入的信息典型的是质荷比的数值，但除此以外，也可以是非选出离子的离子式等能够根据该信息来唯一地决定质荷比的信息。

作为上述基准，能够使用选择质量峰的强度最大的产物离子这样的基准、选择质量峰的出现频率最高的产物离子这样的基准等。

在本发明的第一方式所涉及的方法中，即使是由目标化合物生成的产物离子，也在排除了不是相对于该目标化合物具有特征的离子的、不期望的离子之后选出产物离子。因而，能够选出适于测量目标化合物的产物离子。此外，作为上述不期望的离子，例如能够列举与前体离子相同的离子、从前体离子仅价数发生了变化而得到的离子、同位体离子以及前体离子的脱水离子。

在MRM测量中进行目标化合物的定性时，同时使用两种MRM母子离子对，确认其检测强度的比从而确认是目标化合物。另外，根据试样中含有的夹杂成分的种类存在以下情况：对目标化合物的MRM母子离子对设定的产物离子的质荷比与由夹杂成分生成的产物离子的质荷比是接近的值，因此无法使用该MRM母子离子对。

因而，在上述第一方式所涉及的方法中，

优选选出由使用者指定的数量的满足上述预先决定的基准的产物离子。

另外，为了解决上述问题而完成的本发明的第二方式是一种质量分析装置，在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，通过对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描来选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置的特征在于，具备：

a)非选出离子设定部，其基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；以及

b)产物离子选出部，其在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。

并且，为了解决上述问题而完成的本发明的第三方式是一种质量分析数据处理程序，使用质量分析装置从通过对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描得到的产物离子谱中选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，该质量分析数据处理程序使能够对保存有所述产物离子谱的存储部进行访问的计算机作为以下各部来进行动作：

a)非选出离子设定部，其基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；以及

b)产物离子选出部，其在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。

发明的效果

在本发明所涉及的质量分析方法、质量分析装置以及质量分析数据处理程序中，即使是由目标化合物生成的产物离子，也在排除了不会对该目标化合物赋予特征的不期望的离子之后选出产物离子。因而，能够选出适于测量目标化合物的产物离子。

附图说明

图1是作为本发明所涉及的质量分析装置的一个实施例的液相色谱质量分析装置的主要部分结构图。

图2是说明本发明所涉及的质量分析方法的一个实施例的流程图。

图3是通过本实施例的质量分析方法获取到的产物离子谱。

具体实施方式

以下，参照附图对使用了本发明所涉及的串联四极型质量分析装置的液相色谱质量分析装置的一个实施例进行说明。图1是本实施例的液相色谱质量分析装置的主要部分的结构图。

在本实施例的液相色谱质量分析装置中，液相色谱部1包括：流动相容器10，其贮存有流动相；泵11，其抽吸流动相并以固定流量进行输送；以及注入器12，其将预先准备的规定量的试样注入到流动相中。在本实施例中，在对目标化合物的样品进行流量注入分析之后制定用于分析该目标化合物的MRM方法，因此虽然不使用柱，但在分析实际试样时，使用沿时间方向分离试样中含有的各种化合物的柱13(虚线)。泵11从流动相容器10抽吸流动相并以固定流量进行输送。从注入器12向流动相中导入固定量的样品的试样液，试样液随着流动相的流动而被导入到质量分析装置2。

质量分析装置2是在大致大气压的离子化室20与通过未图示的真空泵进行真空排气的高真空的分析室23之间具备真空度逐级提高的第一中间真空室21和第二中间真空室22的多级差动排气系统的结构。在离子化室20中设置有一边对试样溶液赋予电荷一边进行喷雾的电喷雾离子化用探头(ESI探头)201，离子化室20与后级的第一中间真空室21之间通过细径的加热毛细管202相连通。第一中间真空室21与第二中间真空室22之间被顶部具有小孔的分离器212隔开，在第一中间真空室21和第二中间真空室22中分别设置有用于将离子一边聚集一边向后级输送的离子导向器211、221。在分析室23中，隔着在内部设置有多极离子导向器(q2)233的碰撞室232地设置有根据质荷比来分离离子的前级四极滤质器(Q1)231和同样根据质荷比来分离离子的后级四极滤质器(Q3)234，还设置有离子检测器235。

在MS/MS分析时，向碰撞室232的内部连续地或者间歇性地供给氩、氮等CID气体。电源部24对电喷雾离子化用探头201、离子导向器211、221、233、四极滤质器231、234等分别施加规定的电压。此外，四极滤质器231、234分别在主杆电极的前级具有用于对入口端处的电场的紊乱进行校正的前杆电极，能够对前杆电极施加与主杆电极不同的电压。

在质量分析装置2中，当来自柱13的洗脱液到达ESI探头201时，在该探头201前端，洗脱液一边被赋予电荷一边被雾化。雾化形成的带电液滴由于被赋予的电荷的静电力的作用而一边分裂一边被细微化，在此过程中，溶剂发生气化而生成源自化合物的离子。该离子通过加热毛细管202被送到第一中间真空室21，在离子导向器211中聚集并经由分离器212顶部的小孔被送到第二中间真空室22。然后，源自化合物的离子在离子导向器221中聚集并被送到分析室23，被导入到前级四极滤质器231的长轴方向的空间。此外，作为离子化法，并不限于电喷雾离子化法，也可以使用大气压化学离子化法、大气压光离子化法等。

在质量分析装置2中进行MS/MS分析时，从电源部24对前级四极滤质器231和后级四极滤质器234的各杆电极分别施加规定的电压(高频电压与直流电压相叠加而得到的电压)，向碰撞室232内连续地或者间歇性地供给CID气体。在被送入前级四极滤质器231的各种离子中，仅具有与对前级四极滤质器231的各杆电极施加的电压相应的特定的质荷比的离子通过该滤质器231，作为前体离子被导入到碰撞室232。在碰撞室232内前体离子碰撞CID气体而分解，生成各种产物离子。当所生成的各种产物离子被导入到后级四极滤质器234时，仅具有与对后级四极滤质器234的各杆电极施加的电压相应的特定的质荷比的产物离子通过该滤质器234，到达离子检测器235而被检测。离子检测器235例如是脉冲计数型检测器，将与入射的离子的数量相应的个数的脉冲信号作为检测信号输出到数据处理部4。

数据处理部4具有存储部41，并且作为功能模块具备非选出离子设定部42、产物离子扫描执行部43、产物离子选出部44以及MRM母子离子对决定部45。另外，构成为与分别对液相色谱部1的泵11、注入器12、质量分析装置2的电源部24、CID气体供给部(未图示)等各部的动作进行控制的控制部5之间适当地发送和接收信号。数据处理部4的实体是个人计算机，通过执行预先安装于该计算机的数据处理用软件，能够发挥作为数据处理部4的功能。另外，数据处理部4连接有输入部6、显示部7。

以下，对使用了本实施例的液相色谱质量分析装置的MRM测量条件的决定方法进行说明。图2是决定MRM测量条件时的处理的流程图，图3是使用本实施例的液相色谱质量分析装置进行产物离子扫描而得到的产物离子谱的例子。

首先，分析者将在通过预先进行的目标化合物的MS分析得到的质谱中表现为规定值以上的强度的峰的一个至多个离子设为前体离子，并通过输入部6来输入前体离子的质荷比等信息(步骤S1)。另外，针对各前体离子，输入与非选出离子有关的信息以及产物离子的选出数(步骤S2)。与非选出离子有关的信息典型的是质荷比的数值，但也可以输入离子式。在本实施例中，将前体离子设为质荷比为m/z＝601的一种5价离子，作为非选出离子的信息而输入了质荷比的值(m/z＝601)及其价数(5价)。即，作为非选出离子，设定了前体离子本身。这是为了避免在碰撞室中前体离子不分裂就直接被检测出的情况下将该前体离子决定为MRM母子离子对。另外，将产物离子的选出数设为一个。

前体离子的种类数、产物离子的选出数能够适当地变更。另外，作为非选出离子，除了上述例子以外，还能够适当地设定无法获得对目标化合物赋予特征的信息的离子、例如前体离子的同位体离子、质量不变而只有前体离子的价数发生了变化的离子、以及前体离子的脱水离子等。

当由分析者输入前体离子、与该前体离子有关的非选出离子的信息以及产物离子的选出数时，非选出离子设定部42设定与非选出离子对应的质荷比。例如，在由分析者输入了质荷比的值的情况下，将以该值为中心的±1u的范围(即，能够看作是同一离子的质荷比的范围)设定为排除范围。在与非选出离子相关地输入了分子式的情况下，根据该分子式求出质荷比，将以该值为中心且具有规定的幅度(例如±1u)的范围设定为质荷比的排除范围(步骤S3)。在本实施例中，针对非选出离子的质荷比m/z＝601设定m/z＝602～603这样的排除范围。

另外，非选出离子设定部42根据由分析者输入的质荷比的值和价数将前体离子假定为(M+5H)⁵⁺，并计算该离子不分裂而只有价数变化为1价～4价的离子的质荷比。即，将与(M+H)⁺、(M+2H)²⁺、(M+3H)³⁺以及(M+4H)⁴⁺分别对应的质荷比计算为m/z＝3001、1501、1001、751。然后，将以下范围自动地追加设定为质荷比的排除范围：将处于作为产物离子扫描测量对象的质荷比的范围内(在本实施例中m/z＝50～1200)的值(m/z＝1001、751)分别作为中心且具有规定的幅度的范围(m/z＝750～752、1000～1002)。

当设定质荷比的排除范围时，产物离子扫描执行部43对控制部5输出规定的信号，在预先设定的质荷比的范围(m/z＝50～1200)内执行与最初的前体离子有关的产物离子扫描。关于产物离子扫描，在试样液的洗脱时间段内，在施加于碰撞室的碰撞能量的大小不同的多个条件下执行产物扫描，对在每个条件下的产物扫描中得到的离子的检测强度进行时间平均，由此针对每个条件下的产物扫描获取产物离子谱(步骤S4)。另外，将这些产物离子谱保存到存储部41中，在显示部7的画面上显示所得到的产物离子谱。在本实施例中，在碰撞能量(CE)的大小不同的五个条件(CE：10V、20V、30V、40V、50V)下反复执行产物离子扫描，针对各产物离子扫描事件获取产物离子谱(参照图3)。根据图3的产物离子谱获知：在CE小到10V、20V的条件下，前体离子表现为强峰(m/z＝601)，前体离子在碰撞室232中不分裂就直接被检测出。

当结束产物离子扫描时，产物离子扫描执行部43判定由分析者输入的所有前体离子是否完成了产物离子扫描(步骤S5)。在本实施例中，将产物离子设为一种，但在存在多个前体离子的情况下，依次变更前体离子并执行产物离子扫描，针对所有前体离子获取产物离子谱。

当针对所有前体离子完成产物离子扫描时(步骤S5：“是”)，产物离子选出部44按强度从大到小的顺序从所有产物离子谱中选出与由分析者指定的产物离子的选出数相同数量的质量峰以及得到这些峰的产物离子扫描的实施条件(碰撞能量等)(步骤S6)。其中，由非选出离子设定部42设定的排除范围中存在的质量峰被排除。在图3的例子中，CE为10V、20V的质谱上的m/z＝601的质量峰是位于排除范围的峰，因此无法选出与这些峰对应的离子。

最后，MRM母子离子对决定部45将与该质量峰对应的前体离子和产物离子的组合决定为MRM母子离子对(步骤S7)。另外，制作将该MRM母子离子对与产物离子扫描的实施条件相关联的方法文件。

执行了上述各步骤的结果是，在本实施例中，作为MRM母子离子对而将m/z＝601的前体离子和m/z＝699的产物离子的组合决定为MRM母子离子对，作为MRM测量的实施条件而制作了将CE设为20V的MRM方法。此外，在本实施例中，产物离子的质荷比大于前体离子的质荷比是由于在碰撞室中离子的价数减少。

在得到如图3所示的产物离子谱的情况下，在以往的方法中自动地选出强度最大的质量峰，因此选择了在CE为10V的条件下获取到的产物离子谱上的m/z＝601的峰。但是，如上所述，该峰是与前体离子本身对应的质量峰，作为产物离子无法对目标化合物赋予特征，因此是不恰当的。

另外，如上所述，前体离子的同位体离子、只有前体离子的价数发生了变化的离子以及前体离子的脱水离子等同样也不适合作为产物离子，但在与这样的离子对应的质量峰的强度大的情况下，这样的离子被选出。

另一方面，当使用本实施例的质量分析装置、质量分析方法时，即使假设产物离子谱中的质量峰的强度大也不会选出不期望的产物离子。因而，能够选出适于测量目标化合物的产物离子，决定作为该产物离子及与该产物离子对应的前体离子的组合的MRM母子离子对。

上述实施例是一例，能够按照本发明的宗旨适当地变更。

在上述实施例中，对液相色谱质量分析装置的情况进行了说明，但装置的结构并不限于此，只要是使用质量分析装置的装置结构即可。

另外，在上述实施例中，针对由分析者输入的一个非选出离子设定了一个质荷比的排除范围，但也能够构成为基于由分析者输入的前体离子的信息、非选出离子的信息来设定多个质荷比的排除范围。例如，在分析者输入了前体离子的分子式的情况下，能够将该前体离子的同位体离子、脱水离子等自动地设定为非选出离子。

并且，在上述实施例中，以在仅变更了碰撞能量(CE)的大小的多个条件下执行产物离子扫描的情况为例进行了说明，但除此以外，也能够构成为在适当地变更了例如Q1、Q3的分辨率等条件的条件下执行产物离子扫描，根据由此得到的产物离子谱来决定MRM母子离子对。

附图标记说明

1：液相色谱部；10：流动相容器；11：泵；12：注入器；13：柱；2：质量分析装置；20：离子化室；201：电喷雾离子化用探头；202：加热毛细管；21：第一中间真空室；211：离子导向器；212：分离器；22：第二中间真空室；221：离子导向器；23：分析室；231：前级四极滤质器；232：碰撞室；233：多极离子导向器；234：后级四极滤质器；235：离子检测器；24：电源部；4：数据处理部；41：存储部；42：非选出离子设定部；43：产物离子扫描执行部；44：产物离子选出部；45：MRM母子离子对决定部；5：控制部；6：输入部；7：显示部。

Claims (6)

1.一种质量分析方法，使用质量分析装置对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描，由此选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，该质量分析方法的特征在于，

a)基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；

b)在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。

2.根据权利要求1所述的质量分析方法，其特征在于，

所述质荷比被设定为具有幅度的范围。

3.根据权利要求2所述的质量分析方法，其特征在于，

所述幅度是根据使用者的输入指示来决定的。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的质量分析方法，其特征在于，

选出由使用者输入指示的数量的产物离子。

5.一种质量分析装置，在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，通过对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描来选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置的特征在于，具备：

a)非选出离子设定部，其基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；以及

b)产物离子选出部，其在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。

6.一种质量分析数据处理程序，使用质量分析装置从通过对针对试样设定的前体离子进行产物离子扫描而得到的产物离子谱中选出与该前体离子对应的产物离子，该质量分析装置在隔着使离子分裂的碰撞室的前后具有质量分离部，该质量分析数据处理程序的特征在于，使能够对保存有所述产物离子谱的存储部进行访问的计算机作为以下各部来进行动作：

a)非选出离子设定部，其基于由使用者输入的与非选出离子有关的信息来设定质荷比；以及

b)产物离子选出部，其在通过产物离子扫描得到的产物离子谱中，在除所设定的所述质荷比以外的范围内选出满足预先决定的基准的产物离子。