CN105663180A - 杨梅果实提取物在制备功能食品或药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种杨梅果实提取物在制备降血脂、治疗非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品和药物中的应用。本发明应用了糖尿病肥胖兼脂肪肝的KK-Ay小鼠以模拟肥胖的非酒精性脂肪肝患者，来观察杨梅果实提取物的功效。通过各项测试结果显示，杨梅果实提取物不仅能够减轻肥胖小鼠的体重、改善其糖脂代谢，而且能治疗糖尿病肥胖小鼠所并发的脂肪肝，说明杨梅果实提取物可用在制备治疗高血脂和非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品和药物中。本发明为拓展杨梅果实的药物应用和食品应用提供了科学依据，尤其为非酒精性脂肪肝患者和高血脂人群的治疗和保健提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属医药领域，特别涉及天然来源的杨梅果实提取物在制备降血脂和治疗非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品和药物中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝(Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是一种以肝细胞脂肪变性和脂质过度积累为特征的疾病，其发生与肥胖、高血脂和2型糖尿病等密切相关。在欧美等西方发达国家，肥胖症患者NAFLD患病率为60-95％,高血脂症患者NAFLD患病率为27-92％，2型糖尿病NAFLD患病率为34-74％,肥胖糖尿病NAFLD患病率几乎达100％。国内对FLD流行病学研究结果表明，上海、广州和香港等发达地区成人NAFLD患病率在15％左右，发病率呈不断上升的趋势。然而，目前除了改变生活方式以外，西医仍无治疗NAFLD的公认方法，根据中医“药食同源”的理念，从植物源食物中寻找能够控制体重、降血脂和治疗脂肪肝的功能食品或保健药物已成为国内外学者研究的热点。
杨梅(MerollarubraSieb.etZucc.)，是杨梅科杨梅属的一种亚热带果树，原产于中国，具有很高的药用和食用价值。其成熟果实因品种不同而呈现黑红色、红色、粉红色和白色等不同色泽。研究表明，杨梅果实提取物具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌止泻、降糖及其他多种保健作用。但对其降血脂和治疗非酒精性脂肪肝的报道极少，尤其是对肥胖2型糖尿病患者的降血脂和治疗非酒精性脂肪肝的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种杨梅果实提取物在制备降血脂的功能食品、保健品或药物中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种杨梅果实提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品或药物中的应用。
本发明应用糖尿病肥胖兼NALFD的KK-Ay小鼠以模拟肥胖的NAFLD患者，同时应用C57BL/6正常小鼠为阴性对照，来观察杨梅果实提取物的功效。
本发明的杨梅果实提取物是乙醇提取物，通过以下步骤制备获得：将杨梅果实冷冻干燥粉末与95％乙醇溶液(含1％甲酸)按料液比为1：20混合，超声波提取30min，过滤，滤渣重复提取2次，将滤液混合后，37℃减压浓缩蒸去乙醇，所得杨梅果实粗提水溶液过C18Sep-pakcartridge(12cc/2g,Waters,Milford,MA,USA),水洗4BV(柱床体积)之后，用100％甲醇洗脱，洗脱液再次37℃减压浓缩后，真空旋转蒸干得杨梅果实提取物粉末，保存于-20℃。
本发明应用糖尿病肥胖兼脂肪肝的KK-Ay小鼠以模拟肥胖的非酒精性脂肪肝患者，来观察杨梅果实提取物的功效。通过各项测试结果显示，杨梅果实提取物不仅能够减轻肥胖小鼠的体重、改善其糖脂代谢，而且能治疗糖尿病肥胖小鼠所并发的脂肪肝，说明杨梅果实提取物可用在制备治疗高血脂和非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品和药物中。本发明为拓展杨梅果实的药物应用和食品应用提供了科学依据，尤其为非酒精性脂肪肝患者和高血脂人群的治疗和保健提供了新途径。
附图说明
图1是以KK-Ay鼠为饲喂对象,‘荸荠种’品种杨梅果实提取物对其体重(A)和摄食量(B)的影响，饲喂5周，每周测定一次体重，摄食量为5周每只小鼠的平均摄食量。C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+BQ200为处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
图2是‘荸荠种’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响，饲喂5周，从第2周开始，每周测定一次。C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+BQ200为处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与KK-Ay+Water组比较。
图3是‘荸荠种’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠血清脂质含量的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+BQ200为处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
图4A是‘荸荠种’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠肝脏重量和肝脏脂质含量(A)的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+BQ200为处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
图4B是‘荸荠种’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠肝脏重量和和肝脏组织形态(B)的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+BQ200为处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
图5是以KK-Ay鼠为饲喂对象,‘水晶’品种杨梅果实提取物对其体重(A)和摄食量(B)的影响，饲喂5周，每周测定一次体重，摄食量为5周每只小鼠的平均摄食量。C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+SJ200为‘水晶’果实提取物处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，**p<0.01，与KK-Ay+Water组比较。
图6是‘水晶’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响，饲喂5周，从第2周开始，每周测定一次。C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+SJ200为‘水晶’果实提取物处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与KK-Ay+Water组比较。
图7是‘水晶’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠血清脂质含量的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+SJ200为‘水晶’果实提取物处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，**p<0.01，与KK-Ay+Water组比较。
图8A是‘水晶’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠肝脏重量和肝脏脂质含量(A)的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+SJ200为‘水晶’果实提取物处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
图8B是‘水晶’品种杨梅果实提取物对KK-Ay小鼠肝脏重量和肝脏组织形态(B)的影响，C57BL/6+Water为背景组；KK-Ay+Water为对照组；KK-Ay+SJ200为‘水晶’果实提取物处理组，剂量为200mg/kgBW。利用t检验进行差异显著性分析，*p<0.05，与KK-Ay+Water组比较。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但下述实施例不是对本发明的限制。
实施例1
杨梅果实提取物的制备：新鲜杨梅果实用液氮冻透后，将果实敲碎，弃果核，将果肉置于真空冷冻干燥仪中干燥72小时，使果肉中的水分完全蒸发。用粉碎机将干燥的果肉磨成粉末，得到杨梅果实冷冻干燥粉。将100g杨梅冷冻干燥粉用95％的乙醇溶液(含1％甲酸)(料液比1:20)超声提取三次，6000rpm离心10分钟,合并三次上清液，在减压旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，溶于ddH2O中，上C18Sep-pakcartridge(12cc/2g,Waters,Milford,MA,USA)，上样流速1mL/min。上样后的SPE柱先用水冲洗4BV以去掉杂质，然后用100％的甲醇洗脱2BV，在旋转蒸发仪上37℃浓缩后，真空冷冻干燥得杨梅果实提取物粉末(0.6-2.7g，得率因品种而异)。
实施例2
KK-Ay小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲喂的专用饲料也购自该公司。所有小鼠在恒温恒湿环境下饲养，提供12小时光照12小时黑暗环境，并饲喂专用饲料1K65(粗脂肪％≧6.0，粗蛋白≧18.0)。背景组5只C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂的大小鼠繁殖饲料M01-F25也购自该公司。所有小鼠适应性饲喂2周后，根据体重和空腹血糖值随机将KK-Ay小鼠分为2组：KK-Ay+水和KK-Ay+‘荸荠种’果实提取物，每组10只小鼠，其中，BQ200为‘荸荠种’果实提取物，剂量为200mg/kgBW。所有小鼠可以自由摄取食物和蒸馏水，处理组通过灌胃的方式进行给药，KK-Ay小鼠+水组灌胃蒸馏水。试验为期5周，每周测定小鼠体重和摄食量(见附图1)，给药第2周至第5周，分别对小鼠尾静脉剪尾取血，用强生OneTouchUltraZSJ843ETT型血糖仪测定空腹血糖值。数据用平均值±标准误表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的空腹血糖测定值见附图2。
实验进行5周后，小鼠禁食12h，称重，随后眼眶静脉取血，颈椎脱臼处死，取肝脏等组织，快速称重，取样，其中一部分组织在4％多聚甲醛溶液中固定24h后，做HE染色，另一部分经液氮速冻后，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。取血后，室温静置凝结后，将血清分离，置于-80℃超低温冰箱保存备用。动物协议得到浙江大学动物伦理委员会的批准(许可证号：SYXK2012-0178)。
利用Cobas8000生化免疫分析系统(Roche)测定小鼠血清脂质包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和甘油三酯(TG)含量，测定结果见附图3。
使用南京建成生物工程研究所的甘油三酯测试试剂盒和总胆固醇测定试剂盒对小鼠肝脏甘油三酯和总胆固醇含量进行测定(见附图4A)。
对小鼠肝组织切片进行H&E染色，观察小鼠肝脏组织形态变化(见附图4B)。
实施例3
KK-Ay小鼠和背景组C57BL/6小鼠来源与饲喂条件同实施例1。所有小鼠适应性饲喂2周后，根据体重和空腹血糖值随机将KK-Ay小鼠分为2组：KK-Ay+水、KK-Ay+‘水晶’果实提取物组，每组10只小鼠，其中，SJ200为‘水晶’果实提取物，剂量为100mg/kgBW。所有小鼠可以自由摄取食物和蒸馏水，处理组通过灌胃的方式进行给药，KK-Ay小鼠+水组灌胃蒸馏水。试验为期5周，每周测定小鼠体重和摄食量(见附图5)，给药第2周至第5周，分别对小鼠尾静脉剪尾取血，用强生OneTouchUltraZSJ843ETT型血糖仪测定空腹血糖值。数据用平均值±标准误表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的空腹血糖测定值见附图6。
实验进行5周后，小鼠禁食12h，称重，随后眼眶静脉取血，颈椎脱臼处死，取肝脏等组织，快速称重，取样，其中一部分组织在4％多聚甲醛溶液中固定24h后，做HE染色，另一部分经液氮速冻后，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。取血后，室温静置凝结后，将血清分离，置于-80℃超低温冰箱保存备用。动物协议得到浙江大学动物伦理委员会的批准(许可证号：SYXK2012-0178)。
利用Cobas8000生化免疫分析系统(Roche)测定小鼠血清脂质包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和甘油三酯(TG)含量，测定结果见附图7。
使用南京建成生物工程研究所的甘油三酯测试试剂盒和总胆固醇测定试剂盒对小鼠肝脏甘油三酯和总胆固醇含量进行测定(见附图8A)。
对小鼠肝组织切片进行H&E染色，观察小鼠肝脏组织形态变化(见附图8B)。
Claims (5)
1.一种杨梅果实提取物在制备降血脂的功能食品、保健品中的应用。
2.一种杨梅果实提取物在制备降血脂的药物中的应用。
3.一种杨梅果实提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝的功能食品、保健品中的应用。
4.一种杨梅果实提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的杨梅果实提取物是乙醇提取物，通过以下步骤实现：杨梅果实冷冻干燥粉末与含1％甲酸的95％乙醇溶液按固液比为1：20混合，经超声波提取30分钟，过滤，滤渣重复提取2次，将滤液混合后，37℃减压浓缩蒸去乙醇，所得杨梅果实粗提水溶液过C18Sep-pakcartridge，水洗4柱床体积之后，用100％甲醇洗脱，洗脱液再次37℃减压浓缩后，真空旋转蒸干得杨梅果实提取物粉末，保存于-20℃。
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