CN105638459A

CN105638459A - 一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法

Info

Publication number: CN105638459A
Application number: CN201511018971.XA
Authority: CN
Inventors: 阳永学; 杨洁; 祝菊红; 赵志远; 李其友; 张安华; 毕秋荣; 杨皓琼
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2016-06-08

Abstract

本发明公开了一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，它包括如下步骤：步骤1：将铁皮石斛组培种苗接种到壮苗培养基上，在温度为24～26℃、湿度为35～45％、每天光照14～16h的条件下培养，经过25～30d的培养，获得健壮铁皮石斛试管苗；步骤2：将株高3～5cm长的健壮铁皮石斛试管苗，接种到花芽诱导和开花培养基上并在温度为24～26℃、湿度为35～45％的条件下每天光照14～16h，再经过70～90d培养后，可获得开花的试管植株。该方法简便易行，可人为控制开花时间，摆脱季节对其花期的限制，缩短开花周期，为铁皮石斛开花机理的研究及试管花的生产应用奠定基础。

Description

一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地指一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)别称铁皮兰、黑节草，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，因其茎干呈铁绿色，故而得名铁皮石斛。铁皮石斛具有独特的药用价值，含有石斛多糖、石斛碱、石斛酚、石斛胺等，还有特殊的菲类、联苄类抗癌成分，有益胃生津、滋阴清热、免疫调节、延缓衰老等功效。千百年以来，铁皮石斛一直和灵芝、人参、冬虫夏草等被列为上品中药，并被道家养生经典《道臧》誉为“中华九大仙草之首”，属国家2级保护的贵重濒危药材。由于铁皮石斛为附生植物，多生于温凉高湿的岩层峭壁或密林的树杈上，其分布区域有很大的局限性。自然条件下，铁皮石斛开花结实率低，仅为0.31％，且种子极小、无胚乳，需与某些真菌共生才能萌发，自然条件下萌发率极低。此外，铁皮石斛从种子萌发到开花通常需要3～4年的时间，因此，研究铁皮石斛试管开花，对阐明开花调控机理具有重要的意义。第一，通过研究铁皮石斛试管开花，探讨其开花规律和调控机理，进一步建立试管开花授粉受精体系，可以缩短其育种周期。此外，研究铁皮石斛试管开花，为研发其花期不受季节限制，研发具有新颖视觉效果的试管花卉产品提供理论依据。

近年来，关于铁皮石斛的组培快繁及栽培技术已有较多研究，而对于其开花调控的研究报道相对较少。

参考文献(王光远,刘培,许智宏，石斛离体培养中ABA对诱导花芽形成的影响。植物学报,1995,37(5):374-378；王光远,许智宏,蔡德发,等.铁皮石斛的离体开花。中国科学(C辑),1997,27(3):229-234)，记载了对铁皮石斛离体开花的研究，研究人员发现原球茎作为起始材料时形成的植株小，但是花芽时间出现较早，无根小苗次之，完整的小植物形成花芽所需时间最长，成花频率也最低。同一茎段的顶芽比下部芽容易诱导花芽形成，开花频率高。此外，在培养基中加入葡萄糖，花芽形成的时间提早，成花率增加。

参考文献(邹娜，喻苏琴，王春玲，张露，铁皮石斛组织培养及试管开花研究。江苏农业科学，2013,41(12)：42-44)，记载了铁皮石斛试管苗在不同培养基上均能开花，开花率在17.18％-35.37％，指出基本培养基成分可能不是影响铁皮石斛试管开花最主要的因素。

参考文献(赵银河，铁皮石斛试管开花的研究。种子，2013,32(2)：16-23)，发现了不经低温诱导或者其他方法处理，应用植物生长调节剂能促进铁皮石斛开花。植物生长抑制剂PP333能够促进花芽的起始和开花，但最高开花率仅为20.0％。基于上述研究，目前关于铁皮石斛试管开花影响因素及如何提高开花率尚需进一步深入研究。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，该方法简便易行，可人为控制开花时间，摆脱季节对其花期的限制，缩短开花周期，为铁皮石斛开花机理的研究及试管花的生产应用奠定基础。

为实现此目的，本发明所设计的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

步骤1：铁皮石斛试管苗的壮苗培养；

将铁皮石斛组培种苗接种到壮苗培养基上，在温度为24～26℃、湿度为35～45％、每天光照14～16h的条件下培养，经过25～30d的培养，获得健壮铁皮石斛试管苗；

步骤2：铁皮石斛试管苗的花芽诱导和开花培养；

将株高3～5cm长的健壮铁皮石斛试管苗，接种到花芽诱导和开花培养基上并在温度为24～26℃、湿度为35～45％的条件下每天光照14～16h，再经过70～90d培养后，可获得开花的试管植株。

本发明的有益效果：

(1)本发明简便易行，操作方便，可人为控制开花时间，摆脱季节对其花期的限制。

(2)本发明采用健壮试管苗直接诱导花芽和开花，时间仅需70～90d，周期短，成花率高。

(3)本发明诱导的试管花花型大，花器官完整，具有较高观赏价值。

附图说明

图1为铁皮石斛试管苗壮苗培养示意图；

图2为铁皮石斛试管苗花芽诱导示意图；

图3为铁皮石斛试管苗开花培养示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

本发明的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，它包括如下步骤：

步骤1：将铁皮石斛组培种苗接种到壮苗培养基上，在温度为24～26℃、湿度为35～45％、光照强度为2000Lux、每天光照14～16h的条件下培养，经过25～30d的培养，获得健壮铁皮石斛试管苗；

步骤2：将株高3～5cm长的健壮铁皮石斛试管苗，接种到花芽诱导和开花培养基上并在温度为24～26℃、湿度为35～45％、光照强度为3000Lux的条件下每天光照14～16h，再经过70～90d培养后，可获得开花的试管植株。

上述技术方案中，所述壮苗培养基为1/2MS基本培养基和附加不同成份的物质,其中附加成份包括2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.5mg/L的萘乙酸(NAA，α-Naphthaleneaceticacid)、0.5mg/L的赤霉素(GA₃)、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂和0.1g/L的活性炭。所述壮苗培养基内的PH值范围为5.8～6.0。上述6-苄基腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA₃)用0.1mol/L的NaOH或酒精溶解，再用蒸溜水稀释后分别配制成0.5mg/ml的母液，装入容量瓶中，置于冰箱保存。除赤霉素(GA₃)需过滤灭菌外，其它的附加物都在高压灭菌前加入，压力为1.1kg/cm^-2并于121℃时计时20min。

上述技术方案中，所述花芽诱导和开花培养基为MS基本培养基和附加不同成份的物质,其中附加成份包括0.5mg/L的2，4-D、0.5mg/L的NAA、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂和0.1g/L的活性炭。所述花芽诱导和开花培养基的pH值为范围5.8～6.0。

上述pH值通过NaOH调节。

实施例1：不同浓度的激素组合对铁皮石斛试管苗开花诱导的影响

1、试验材料

供试材料为常州世花花卉科技有限公司提供的铁皮石斛组培种苗

2、培养基配制：

MS基本培养基和1/2基本培养基的配制见<<植物组织培养>>(李明浚编译.北京：中国农业出版社，1992)。

2，4-D、6-BA、NAA、活性炭、GA₃均可市售购得。所有培养基均添加琼脂粉7g/L、蔗糖30g/L和0.1g/L活性炭及不同浓度的植物生长调节剂，将配制好的培养基用0.1mol/L的NaOH调pH值至6.0左右，除GA₃外需过滤灭菌外，其他的附加物都在高压灭菌前加入，压力1.1kg/cm^-2并于121℃时计时20min。

3、数据统计与分析

开花率＝开花的株数/接种的外植体总数×100％

实验中，所有数据均采用SAS软件进行方差分析与多重比较分析(LSD法，P＝0.05)；数据为百分数时先经反正弦(y＝arcsinx1/2)转换后，再加以分析和比较。

4、方法

以MS添加0.5mg/LNAA，0.1g/L活性炭为基本培养基，将经过壮苗培养后的铁皮石斛试管苗(图1)接种到各添加不同激素及不同浓度的开花诱导培养基中(表1)，每处理培养基接种10瓶，每瓶4个外植体，在温度为24～26℃、湿度为35～45％，光照强度3000Lux，每天光照14～16h条件下培养，80d后，统计不同开花诱导培养基中试管苗的开花情况，探讨不同浓度的激素组合对铁皮石斛开花诱导的影响。

结果表明，将铁皮石斛的试管苗分别接种到不同培养基上进行开花诱导，70d后可见试管苗的绿色花苞形成(图2)，随后5～7d，花苞逐渐展开开放，花器官完整，萼片为黄绿色，唇瓣为淡绿色，中间有两块紫斑，随后颜色慢慢变淡(图3)。由表2～3可知，不同浓度的激素组合对铁皮石斛试管苗开花诱导效果存在显著性差异，培养基中只添加0.5mg/LNAA，试管苗开花率只有4.44％；添加不同浓度的6-BA、激动素(kinetin，KT)、2,4-D及噻苯隆(Thidiazuron,TDZ)均可以显著提高铁皮石斛试管开花率，其中添加0.5mg/L的2,4-D的试管开花率最高，可达42.22％。在不添加2,4-D的情况下，添加1.0mg/L的TDZ和添加1.0mg/L的KT对试管苗开花影响差异并不显著，说明2,4-D对铁皮石斛试管开花的诱导发挥重要作用，因此，选择MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L作为铁皮石斛试管开花诱导的最佳培养基。

表1不同培养基对铁皮石斛试管苗开花的影响

实施例2：不同光照强度对铁皮石斛试管苗开花诱导的影响

光照强度在植物开花调控中起到重要的作用，为了探讨光照强度对铁皮石斛试管苗开花的影响，将铁皮石斛试管苗接种到MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L培养基中，在光照强度分别为1000、2000、3000、4000Lux下进行培养，每个光照强度处理10瓶，每瓶4个外植体，在温度为24～26℃、湿度为35～45％，每天光照14～16h条件下培养，80d后，统计不同光照强度下的开花情况，探讨不同光照强度对铁皮石斛试管苗开花诱导的影响。

结果如表2所示，铁皮石斛试管苗随着光照强度的增加开花率升高，当光照强度为3000lux时，铁皮石斛试管苗开花率最高，达44.44％，随后，随着光照强度的增加，铁皮石斛的开花率降低。

表2不同光照强度对铁皮石斛试管苗开花的影响

本说明书未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims

1.一种快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

步骤1：将铁皮石斛组培种苗接种到壮苗培养基上，在温度为24～26℃、湿度为35～45％、每天光照14～16h的条件下培养，经过25～30d的培养，获得健壮铁皮石斛试管苗；

步骤2：将株高3～5cm长的健壮铁皮石斛试管苗，接种到花芽诱导和开花培养基上并在温度为24～26℃、湿度为35～45％的条件下每天光照14～16h，再经过70～90d培养后，可获得开花的试管植株。

2.根据权利要求1所述的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于：所述壮苗培养基为1/2MS基本培养基和附加不同成份的物质,其中附加成份包括2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的赤霉素、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂和0.1g/L的活性炭，pH值范围为5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于：所述花芽诱导和开花培养基为MS基本培养基和附加不同成份的物质,其中附加成份包括0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂和0.1g/L的活性炭,pH值范围为5.8～6.0。

4.根据权利要求1所述的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于：所述步骤1中，将铁皮石斛组培种苗接种到壮苗培养基上，在温度为24～26℃、湿度为35～45％、光照强度为2000Lux、每天光照14～16h的条件下培养。

5.根据权利要求1所述的快速诱导铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于：所述步骤2中，将株高3～5cm长的健壮铁皮石斛试管苗，接种到花芽诱导和开花培养基上并在温度为24～26℃、湿度为35～45％、光照强度为3000Lux的条件下每天光照14～16h，再经过70～90d培养后，可获得开花的试管植株。