CN105596360A - 一种夏枯草均一多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种夏枯草均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为53％～65％；所述均一多糖的分子量为23.4KDa～41.7KDa；且所述均一多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。本发明还提供了上述夏枯草均一多糖的制备方法和用途。本发明提供的夏枯草均一多糖的多糖含量更高、纯度更高、抗病毒活性更强，且其制备工艺亦适于工业化生产。

Description

一种夏枯草均一多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及中药提取物技术领域，具体涉及一种植物提取组分及其制备方法和用途。
背景技术
中国发明专利申请(201410561972.8)公开了一种夏枯草水提物，所述夏枯草水提物用如下方法制得：将夏枯草果穗加水10～22倍量，加热回流提取2～4次，每次0.5～2h，过滤，滤液过0.45um水膜微滤，收集过0.45um水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45um水膜微滤后的滤液再过截留分子量为3～500KDa的超滤膜，收集未透过超滤膜的药液，浓缩，干燥。该夏枯草水提物具有一定的抗疱疹病毒活性。然而，该专利申请并未涉及其中的多糖分子量、纯度及结构解析方面的研究。
鉴于现有技术的状况，需要寻找多糖含量高、具有更强抗疱疹病毒活性的夏枯草抗病毒多糖组分。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种夏枯草均一多糖及其制备方法和用途。
具体地说，本发明的第一方面是提供了一种夏枯草均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为53％～65％；所述均一多糖的分子量为23.4KDa～41.7KDa；且所述均一多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。
在一优选例中，所述葡萄糖醛酸的含量为12～15％。
在另一优选例中，所述均一多糖用如下方法制得：将夏枯草果穗加水10～22倍量，加热回流提取2～4次，每次0.5～2h，过滤，滤液过0.45um水膜微滤，收集过0.45um水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45um水膜微滤后的滤液再依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液，浓缩，除去游离蛋白5～10次，再经凝胶色谱分离，收集凝胶色谱柱流出的第二种多糖组分，浓缩，干燥。
在另一优选例中，所述超滤膜为XL超滤膜。
在另一优选例中，所述凝胶色谱柱为SephadexG-200葡聚糖凝胶柱。
在另一优选例中，所述均一多糖还含有17～20％硫酸根基团。
本发明的第二方面是提供了一种上述夏枯草均一多糖的制备方法，所述方法包括如下步骤：将夏枯草果穗加水10～22倍量，加热回流提取2～4次，每次0.5～2h，过滤，滤液过0.45um水膜微滤，收集过0.45um水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45um水膜微滤后的滤液再依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液，浓缩，除去游离蛋白5～10次，再经凝胶色谱分离，收集凝胶色谱柱流出的第二种多糖组分，浓缩，干燥。
在一优选例中，所述超滤膜为XL超滤膜。
在另一优选例中，所述凝胶色谱柱为SephadexG-200葡聚糖凝胶柱。
本发明还提供了上述夏枯草均一多糖在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。
与现有的技术相比，本发明提供的夏枯草均一多糖的多糖含量更高、纯度更高、抗疱疹病毒活性更强，且其制备工艺亦适于工业化生产。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1.硫酸-苯酚法测定葡萄糖含量的标准曲线
图2.硫酸-咔唑法测定葡萄糖醛酸含量的标准曲线
图3.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的标准曲线
图4.氯化钡-凝胶法测定硫酸基含量的标准曲线
图5.高效凝胶渗透色谱法测定普鲁兰糖对照品分子量的标准曲线
图6.高效凝胶渗透色谱法测定夏枯草均一多糖的色谱图
图7A-7C.夏枯草均一多糖的单糖组成分析
A：单糖对照品，B：夏枯草均一多糖，C：二者对照叠加图
图8.夏枯草均一多糖的红外光谱图
图9.夏枯草水提物和夏枯草均一多糖IC50(空斑减数法)比较
具体实施方式
本发明人经过长期研究，优化了之前的提取工艺，即将由夏枯草果穗经水提后的微滤液，再用超滤膜超滤，所得超滤液去除游离蛋白后，再经凝胶色谱分离纯化，进而制得了本发明的多糖含量更高且具有更强抗病毒活性的夏枯草均一多糖。本发明的夏枯草均一多糖可用于制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物。
如本发明所使用，“均一多糖”是单糖通过聚合而成的多糖，聚合的糖有特定的结构单元。均一多糖可分为相同单糖形成的聚糖或不同单糖形成的杂多糖。
本发明的夏枯草均一多糖可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的夏枯草均一多糖及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1～99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的夏枯草均一多糖。“可药用载体”不会破坏本发明的夏枯草均一多糖的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的夏枯草均一多糖以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。
本发明的夏枯草均一多糖以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1夏枯草均一多糖PSP-2B的制备及分析
1.制备
【实验材料】
夏枯草，电热套，冷凝管，圆底烧瓶，MilliporeLabscaleTFF超滤系统，Lambda35紫外分光光度计，PerkinElmerSpectrumOne傅立叶变换红外光谱仪，AKTApurifier100系列蛋白纯化仪，Agilent1100系列高效凝胶渗透色谱仪，PolarimeterModel341旋光度仪，WatersHClass超高效液相色谱仪，苯酚，咔唑，硫酸钡，明胶，硫酸，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮等。
【实验方法】
将夏枯草果穗500g，煎煮3次，每次加水20倍量，每次0.5h，水提取液过0.45μm水膜微滤，收集滤液，滤液在50℃减压浓缩，将浓缩的滤液依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液用Sevag法除去游离蛋白质7次，浓缩至饱和，取饱和溶液上样于SephadexG-200葡聚糖凝胶柱(1.6×100cm)，每次上样1ml，流动相为去离子水，流速为0.4ml/min，分管收集，每管5ml，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖，取第二种多糖组分，冷冻干燥，制得。
【实验结果】
每次上样1ml，分管收集，每管5ml，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖，取第二种多糖组分(第31-37管)，浓缩，冷冻干燥，制得具有抗疱疹病毒活性的夏枯草均一多糖PSP-2B(129mg)。
2.结构解析
【实验方法】
(1)对照品溶液的制备
取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含无水葡萄糖0.102mg的溶液，即得。
取无水葡萄糖醛酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含葡萄糖醛酸0.242mg的溶液，即得。
称取硼砂(四硼酸钠5水)4.14g，均匀撒在500ml预冷的浓硫酸中，溶解，静置过夜，即得。
称取咔唑，精密称定，溶于25ml无水乙醇中，制得0.021％的咔唑试剂。
称取牛血清白蛋白(BSA)，精密称定，加水制成每1ml含BSA0.104mg的溶液，即得。
称取考马斯亮蓝G-250适量，精密称定，溶于乙醇中，加磷酸调节pH，再加水定容，制成每1ml含G-250试剂0.101mg的溶液，即得。
称取硫酸钾适量，精密称定，用1M盐酸溶液定容至100ml，制成每1ml含硫酸基浓度为0.3123mg的溶液，即得。
称取氯化钡适量，精密称定，用明胶溶液定容，制成每1ml含氯化钡浓度为5.865mg的溶液，即得。
(2)标准曲线的绘制
分别精密量取葡萄糖对照品溶液0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，置具塞试管中，加水至1.0ml，加入5％苯酚溶液，同时迅速加入浓硫酸5ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，冷却15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外一可见分光光度法(附录VA)，在480nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线(图1)。标准曲线线性范围:0.0306mg/ml-0.0816mg/ml
分别精密量取葡萄糖醛酸对照品溶液0.10ml、0.12ml、0.14ml、0.16ml、0.18ml、0.20ml，置具塞试管中，加水至1.0ml，加入硫酸-咔唑试剂5ml，摇匀，置85℃水浴中加热20分钟，取出后冷至室温，各管加0.2ml咔唑试剂，在室温下保持2h，以相应的试剂为空白，照紫外一可见分光光度法(附录VA)，在530nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线(图2)。标准曲线线性范围:0.0242mg/ml-0.0484mg/ml
分别精密量取牛血清白蛋白对照品溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.5ml、0.6ml，0.7ml，0.8ml，置具塞试管中，加水至1.0ml，向各管加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，在室温下放置5min，以相应的试剂为空白，照紫外一可见分光光度法(附录VA)，在595nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线(图3)。标准曲线线性范围:0.0208mg/ml-0.0832mg/ml
分别精密量取硫酸钾标准溶液0.10ml、0.15ml、0.20ml、0.25ml、0.30ml，置具塞试管中，加1M盐酸溶液至0.5ml，向各管加入5ml，加入三氯乙酸3.5ml及氯化钡-明胶溶液1ml，摇匀，室温静置15min，以相应的试剂为空白，照紫外一可见分光光度法(附录VA)，在360nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线(图4)。标准曲线线性范围:6.25μg/ml-18.74μg/ml
(3)供试品溶液的制备
称取夏枯草均一多糖PSP-2B适量，精密称定，加水定容，制成每1ml含有PSP-2B1.05mg的溶液，摇匀，待用。
(4)分子量测定
采用高效液相色谱法测定均一多糖的分子量，分析柱为ShodexKS804和KS802柱，流动相为0.2MNaCl溶液，流速为0.8ml/min，示差折光检测器
标准曲线的绘制：已知分子量的普鲁兰糖标准品(Mw:708,344,200,107,47,21and0.96kDa)制成5mg/ml的标准溶液，根据7个不同分子量标样的出峰时间不同，以标准多糖重均分子量的对数(LgMw)对洗脱体积作图，绘制标准曲线(图5)
样品的测定：准确称取PSP-2B样品，溶于流动相配制2mg/ml的溶液，离心取上清液进样，记录示差色谱图，根据标准曲线回归方程，计算样品的分子量。
(5)总多糖含量测定
精密量取供试品溶液适量，照标准曲线制备项下的方法1，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的浓度，计算，即得。
(6)糖醛酸的含量测定
精密量取供试品溶液适量，照标准曲线制备项下的方法2，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含糖醛酸的浓度，计算，即得。
(7)蛋白质的含量测定
精密量取供试品溶液适量，照标准曲线制备项下的方法3，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含蛋白质的浓度，计算，即得。
(8)硫酸基的含量测定
精密量取供试品溶液适量，照标准曲线制备项下的方法4，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含硫酸基的浓度，计算，即得。
(9)旋光度的测定
①将待测PSP-2B溶液稀释至0.25mg/ml
②采用钠光源D线(589.3nm)，测定管长度为1dm，测定温度为20℃。
③缓缓注入PSP-2B溶液适量(勿产生气泡)，读取检测读数
④折算为比旋光度
(10)红外光谱分析
采用KBr压片法，PerkinElmerSpectrumOne型红外光谱进行测定。红外光谱仪测定参数如下：背景扫描次数：32次；分辨率：4.0cm-1，检测器：DTGS。
(11)柱前衍生高效液相色谱分析(PMP衍生化方法)
PSP-2B样品经4M三氟乙酸完全酸水解，水解产物40-60℃减压干燥后，再反复加甲醇蒸干，直至除去多余的三氟乙酸。取样品和标准单糖的标准品配制成1mg/ml，取100μl，加入0.5MPMP溶液120μl，0.3M的氢氧化钠溶液100μl，70℃反应1h，冷却至室温后加入100μl浓度为0.3M盐酸溶液中和，二氯甲烷萃取多余的PMP试剂，离心后取上清液，进HPLC检测。
色谱条件为：色谱柱：AcquityUHPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)，流动相：100mM乙酸铵/乙腈(78:22，V/V)，流速：0.2ml/min，检测器：DAD245nm
根据出峰时间和峰面积比可知样品中的单糖组成及摩尔比
【实验结果】
通过HPGPC对纯化后的夏枯草均一多糖PSP-2B的纯度进行了测定(图6)，并测定了其分子量，对PSP-2B的总多糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量以及硫酸基含量进行了测定，结果见表1。
表1夏枯草均一多糖PSP-2B的理化性质分析
单糖组成分析
将各单糖标准品及PSP-2B全水解产物经PMP柱前衍生后，通过HPLC分析，标准品及样品的色谱图如图7所示，PSP-2B中单糖组成主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。其组成摩尔比为0.39:0.19:0.05:0.37:0.32:1.00:4.51。
红外光谱分析
对PSP-2B进行红外光谱分析，其结果如图8所示，3380cm-1左右的强吸收峰为O-H的伸缩振动，2937cm-1左右为C-H的伸缩振动吸收。1423cm-1左右为C-H的变角振动吸收峰，1095cm-1和1047cm-1左右的强吸收峰为C-O-C环内醚的C-O伸缩振动。1257cm-1和896cm-1为硫酸基的特征吸收。
实施例2夏枯草均一多糖B的制备及分析
将夏枯草果穗500g，煎煮3次，每次加水20倍量，每次0.5h，水提取液过0.45μm水膜微滤，收集滤液，滤液在50℃减压浓缩，将浓缩的滤液依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液用Sevag法除去游离蛋白质7次，浓缩至饱和，取饱和溶液上样于SephadexG-200葡聚糖凝胶柱(1.6×100cm)，每次上样1.5ml，流动相为去离子水，流速为0.4ml/min，分管收集，每管5ml，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖，取第二种多糖组分(第32～36管)，浓缩，冷冻干燥，制得具有抗疱疹病毒活性的夏枯草均一多糖B(115mg)。
通过HPGPC对纯化后的夏枯草均一多糖B的纯度进行了测定，并测定了其分子量，对夏枯草均一多糖B的总多糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量以及硫酸基含量进行了测定，结果见表2。
表2夏枯草均一多糖B的理化性质分析
实施例3夏枯草均一多糖C的制备及分析
将夏枯草果穗500g，煎煮3次，每次加水20倍量，每次0.5h，水提取液过0.45μm水膜微滤，收集滤液，滤液在50℃减压浓缩，将浓缩的滤液依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液用Sevag法除去游离蛋白质7次，浓缩至饱和，取饱和溶液上样于SephadexG-200葡聚糖凝胶柱(1.6×100cm)，每次上样2ml，流动相为去离子水，流速为0.4ml/min，分管收集，每管5ml，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖，取第二种多糖组分(第31-38管)，浓缩，冷冻干燥，制得具有抗疱疹病毒活性的夏枯草均一多糖C(131mg)。
通过HPGPC对纯化后的夏枯草均一多糖C的纯度进行了测定，并测定了其分子量，对夏枯草均一多糖C的总多糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量以及硫酸基含量进行了测定，结果见表3。
表3夏枯草均一多糖C的理化性质分析
实施例4夏枯草均一多糖D的制备及分析
将夏枯草果穗500g，煎煮3次，每次加水20倍量，每次0.5h，水提取液过0.45μm水膜微滤，收集滤液，滤液在50℃减压浓缩，将浓缩的滤液依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液用Sevag法除去游离蛋白质7次，浓缩至饱和，取饱和溶液上样于SephadexG-200葡聚糖凝胶柱(1.6×100cm)，每次上样0.5ml，流动相为去离子水，流速为0.4ml/min，分管收集，每管5ml，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖，取第二种多糖组分(第30-35管)，浓缩，冷冻干燥，制得具有抗疱疹病毒活性的夏枯草均一多糖D(118mg)。
通过HPGPC对纯化后的夏枯草均一多糖D的纯度进行了测定，并测定了其分子量，对夏枯草均一多糖D的总多糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量以及硫酸基含量进行了测定，结果见表4。
表4夏枯草均一多糖D的理化性质分析
实施例5验证夏枯草均一多糖的细胞毒性及病毒抑制试验
细胞毒性试验(MTT法)：
【实验材料】
夏枯草均一多糖按实施例1制备。
非洲绿猴肾细胞(vero)购自ATCC公司。细胞于含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
MTT为购自生工生物公司，DMSO购自国药试剂公司，阿昔洛韦购自中国药品生物制品检定所，台盼蓝购自生工生物公司。
【实验方法】
夏枯草均一多糖对vero细胞毒性作用通过MTT法测得。具体步骤如下：
1.样品制备：将夏枯草均一多糖溶解于超纯水中0.22μm过滤得浓度为8mg/ml的溶液。
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，经台盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮密度至2×105细胞/ml。
3.在平底96孔板中，每孔加入100μl细胞，每孔中细胞总数为2×104，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24后成单层细胞。
4.吸去每孔的培养基，每孔不同浓度的样品，使终浓度为1600μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、200μg/ml。每浓度3个复孔，每孔200μl，同时设正常细胞对照组，阳性药物阿昔洛韦对照组(ACV：400μM、200μM、100μM、50μM)、DMSO溶剂组及DMEM溶剂作为背景。
5.将加药的细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72h。
6.每天观察并记录细胞毒性。培养72h后，每孔加入20μl5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中培养4h，加入150μlDMSO。
7.在570/650nm波长下测定吸光度。
8.根据光吸收值计算细胞相对抑制率。计算公式如下：
抑制率＝(细胞组—药物组)/(细胞组—调零组)×100％
9.通过Spss软件计算夏枯草均一多糖对细胞毒性作用的CC50。
【实验结果】
夏枯草均一多糖对vero细胞毒性作用三重复体外试验结果表明：夏枯草均一多糖在1600μg/ml未表现出细胞毒性。
病毒抑制试验(MTT法)：
【实验材料】
夏枯草均一多糖按实施例1制备。
非洲绿猴肾细胞(vero)购自ATCC公司。单纯疱疹Ⅰ型(HSV-1)KOS株购自ATCC公司。细胞于含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
MTT为购自生工生物公司，DMSO购自国药试剂公司，阿昔洛韦购自中国药品生物制品检定所，台盼蓝购自生工生物公司。
【实验方法】
夏枯草均一多糖对vero细胞抗HSV-1抑制作用通过MTT法测得。具体步骤如下：
1.样品制备：将夏枯草水提物及均一多糖分别溶解于超纯水中0.22μm过滤得到浓度为4mg/ml的溶液。
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，经台盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮密度至2×105细胞/ml。
3.在平底96孔板中，每孔加入100μl细胞，每孔中细胞总数为2×104，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24后成单层细胞。
4.吸去每孔的培养基，每孔加入病毒液100TCID50/孔，吸附1h，吸去病毒液，再加入200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml浓度的夏枯草均一多糖样品。每浓度3个复孔，每孔200μl，同时设正常细胞对照组，病毒对照组、阳性药物阿昔洛韦对照组(ACV：4uM、2uM、1uM、0.5uM)及DMSO溶剂组。
5.将加药和病毒的细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72h。
6.每天观察CPE，并记录72h的CPE；在显微镜下观察细胞病变程度(CPE)，以确定夏枯草均一多糖对病毒的抑制作用，记录方式：0％细胞病变为“—”，<25％细胞病变为“+”，25％～50％细胞病变为“++”，50％～75％细胞病变为“+++”，>75％细胞病变为“++++”，以出现“—”的最小浓度为抗病毒活性最佳。
7.培养72h后，每孔加入20μl5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中培养4h，加入150μlDMSO在570/650nm波长下测定吸光度。
8.根据光吸收值计算细胞相对存活率。计算公式如下：
存活率＝(药物组—病毒感染组)/(细胞组—病毒感染组)×100％
9.通过Spss软件计算夏枯草均一多糖对HSV-1抑制作用的IC50。
SI＝CC50/IC50，治疗指数(SI)越大，抗病毒活性越好
【实验结果】
夏枯草均一多糖对HSV-1抑制作用三重复体外试验结果表明：夏枯草均一多糖的抗HSV-1的IC50为84.84μg/ml，
表5-1夏枯草均一多糖CC50和抗HSV-1的IC50(MTT法)
病毒抑制试验(空斑减数法)：
【实验材料】
夏枯草均一多糖按实施例1制备。
非洲绿猴肾细胞(vero)购自ATCC公司。单纯疱疹Ⅰ型(HSV-1)KOS株和单纯疱疹Ⅱ型(HSV-2)strainG购自ATCC公司。细胞于含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
结晶紫为购自生工生物公司，甲醛购自国药试剂公司，阿昔洛韦购自中国药品生物制品检定所，甲基纤维素(MC)购自sigma公司，台盼蓝购自生工生物公司。
【实验方法】
夏枯草均一多糖对vero细胞抗HSV-1和HSV-2抑制作用通过空斑减数法测得。具体步骤如下：
1.样品制备：将夏枯草水提物及均一多糖分别溶解于超纯水中0.22μm过滤得到浓度为4mg/ml的溶液。
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，经台盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮密度至3×105细胞/ml。
3.在平底12孔板中，每孔加入1ml细胞，每孔中细胞总数为3×105，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
4.吸去每孔的培养基，每孔接种病毒原液(HSV-1/HSV-2)104倍稀释液0.4ml(约含100pfu)，于37℃吸附1h，吸弃病毒液，再加入终浓度200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的夏枯草均一多糖样品和终浓度1％MC混匀后至12孔板中。每浓度2个复孔，每孔1ml，同时设正常细胞对照组，病毒对照组、阳性药物阿昔洛韦对照组(ACV：4uM、2uM、1uM、0.5uM)及DMSO溶剂组。
5.将加药和病毒的细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72h。
6.培养72h后，加入3.7％甲醛固定，1％结晶紫染色后，空斑计数，计算抑制率。
空斑抑制率＝(病毒感染组—药物组)/病毒感染组*100％
7.通过Spss软件计算夏枯草均一多糖对HSV-1和HSV-2抑制作用的IC50。
SI＝CC50/IC50，治疗指数(SI)越大，抗病毒活性越好
【实验结果】
夏枯草均一多糖对HSV-1和HSV-2抑制作用三重复体外试验结果表明：夏枯草均一多糖的抗HSV-1的IC50为88.92μg/ml，抗HSV-2的IC50为75.60μg/ml。
表5-2夏枯草均一多糖CC50和抗HSV-1的IC50(空斑减数法)
表5-3夏枯草均一多糖CC50和抗HSV-2的IC50(空斑减数法)
由表5-1/5-2/5-3可见：本发明的夏枯草均一多糖具有较好的抗疱疹病毒活性，可作为活性部位用于制备抗疱疹病毒药物制剂，具有药用前景。
实施例6夏枯草均一多糖和夏枯草水提物的抗疱疹病毒活性比较
【实验材料】
夏枯草均一多糖按实施例1制备。
夏枯草水提物按中国发明专利申请(201410561972.8)的实施例1制备。
非洲绿猴肾细胞(vero)购自ATCC公司。单纯疱疹Ⅰ型(HSV-1)KOS株购自ATCC公司。细胞于含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
结晶紫为购自生工生物公司，甲醛购自国药试剂公司，阿昔洛韦购自中国药品生物制品检定所，甲基纤维素(MC)购自sigma公司，台盼蓝购自生工生物公司。
【实验方法】
夏枯草水提物和夏枯草均一多糖对vero细胞抗HSV-1抑制作用通过空斑减数法测得。具体步骤如下：
1.样品制备：将夏枯草水提物及均一多糖分别溶解于超纯水中0.22μm过滤得到浓度为4mg/ml的溶液。
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，经台盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮密度至3×105细胞/ml。
3.在平底12孔板中，每孔加入1ml细胞，每孔中细胞总数为3×105，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
4.吸去每孔的培养基，每孔接种病毒原液(HSV-1)104倍稀释液0.4ml(约含100pfu)，于37℃吸附1h，吸弃病毒液，再加入终浓度200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的夏枯草水提物或均一多糖，均和终浓度1％MC混匀后至12孔板中。每浓度2个复孔，每孔1ml，同时设正常细胞对照组，病毒对照组、阳性药物阿昔洛韦对照组(ACV：4uM、2uM、1uM、0.5uM)及DMSO溶剂组。
5.将加药和病毒的细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72h。
6.培养72h后，加入3.7％甲醛固定，1％结晶紫染色后，空斑计数，计算抑制率。
空斑抑制率＝(病毒感染组—药物组)/病毒感染组*100％
7.通过Spss软件计算夏枯草均一多糖对HSV-1抑制作用的IC50。通过Spss软件进行统计学差异。
【实验结果】
夏枯草均一多糖对HSV-1抑制作用三重复体外试验结果表明：夏枯草均一多糖的抗HSV-1的IC50为88.92±7.63μg/ml，夏枯草水提物的抗HSV-1的IC50为131.12±9.19μg/ml，均一多糖组IC50明显低于水提物组。
通过Spss软件将两组IC50的三重复数据进行统计学差异比较，经过T-Test检验，P<0.05，两者具有统计学差异意义(图9)。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (10)

1.一种夏枯草均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为53％～65％；所述均一多糖的分子量为23.4KDa～41.7KDa；且所述均一多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。
2.如权利要求1所述的夏枯草均一多糖，其特征在于，所述葡萄糖醛酸的含量为12～15％。
3.如权利要求1所述的夏枯草均一多糖，其特征在于，所述均一多糖用如下方法制得：将夏枯草果穗加水10～22倍量，加热回流提取2～4次，每次0.5～2h，过滤，滤液过0.45um水膜微滤，收集过0.45um水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45um水膜微滤后的滤液再依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液，浓缩，除去游离蛋白5～10次，再经凝胶色谱分离，收集凝胶色谱柱流出的第二种多糖组分，浓缩，干燥。
4.如权利要求3所述的夏枯草均一多糖，其特征在于，所述超滤膜为超滤膜。
5.如权利要求3所述的夏枯草均一多糖，其特征在于，所述凝胶色谱柱为SephadexG-200葡聚糖凝胶柱。
6.如权利要求1所述的夏枯草均一多糖，其特征在于，所述均一多糖还含有17～20％硫酸根基团。
7.一种如权利要求1所述的夏枯草均一多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将夏枯草果穗加水10～22倍量，加热回流提取2～4次，每次0.5～2h，过滤，滤液过0.45um水膜微滤，收集过0.45um水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45um水膜微滤后的滤液再依次过截留分子量为30KDa和100KDa的超滤膜，收集截留分子量大于30KDa且小于100KDa部分的超滤液，浓缩，除去游离蛋白5～10次，再经凝胶色谱分离，收集凝胶色谱柱流出的第二种多糖组分，浓缩，干燥。
8.如权利要求7所述的夏枯草均一多糖的制备方法，其特征在于，所述超滤膜为 超滤膜。
9.如权利要求7所述的夏枯草均一多糖的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为SephadexG-200葡聚糖凝胶柱。
10.如权利要求1～6任一权利要求所述的夏枯草均一多糖在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。
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