CN105567571B - 一种白参菌风干子实体菌种分离方法 - Google Patents

一种白参菌风干子实体菌种分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种白参菌风干子实体菌种分离方法，该方法包括如下步骤：1）将自然风干的白参菌子实体用无菌水泡开发胖；2）将步骤1）所得子实体于12℃下培养7‑10天，取菌柄基部长出的白色菌丝；3）将步骤2）所得菌丝放入培养基中培养得到菌落；4）对步骤3）所得菌落进行纯化处理后，再进行复壮处理，即得菌种。本发明解决了利用白参菌新鲜子实体获取菌种所面临的受季节性因素限制、新鲜子实体贮藏成本高、易污染等缺点，实现了可以在全年任何时间进行菌种分离和栽培出菇；本发明大幅提高了白参菌出菇的生物学效率，提升幅度高达35%；利用本发明方法所得菌种进行栽培出菇时，所得菌菇更为整齐、朵更大。

Description

一种白参菌风干子实体菌种分离方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种白参菌风干子实体菌种分离方法。
背景技术
白参菌是裂褶菌的别名，在我国黑龙江、吉林、辽宁、山西、山东、江苏、内蒙古、安徽、浙江、江西、福建、台湾、河北、河南、湖南、广东、广西、海南、甘肃、西藏、四川、贵州和海南等省均有分布。云南省人们采食白参菌历史悠久，并有产品出口。
随着生活水平的不断提高，人们对白参菌的需求日益增加，这使得如何提高白参菌的产量成为重要的研究课题。在该研究课题中，如何解决只能利用新鲜子实体获取菌种而导致白参菌的生产严重受季节所困，是重要的研究方向之一。
将干子实体来进行菌种分离，是解决食用菌生产受季节性所困的方法之一，并已经在紫袍侧耳、猴头和羊肚菌上得到了较好的效果。然而，如何对干子实体进行处理以获得菌种，却没有形成较为确切的方法和理论。
王家季的研究论文《食用菌风干子实体组织分离初探》显示，紫袍侧耳和猴头的风干子实体组织均有再生菌丝的能力，处理组和对照组的生物学效率无差异；菌盖中菌肉组织取材不方便，污染率高，且易引起遗传性状改变；菌柄基部组织菌丝活力差。
基于上述研究结果，中国专利CN104686196A在羊肚菌的干子实体菌株分离工作时，同样利用了菌盖中的组织，并将综合马铃薯培养基替换为麦粒培养基进行培养，获得了一定的效果，但该效果比新鲜子实体实验组的较差。
据发明人所知，目前针对白参菌干子实体菌株分离方面的研究仍为空白，如何处理白参菌子实体来获得菌种，尚未有可靠的方法参考。发明人参考了上述两项研究的方法，根本无法培养得到菌丝，更无法进行菌种的分离。
综上所述，亟待寻求一种适合于白参菌干子实体的菌株分离方法。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种白参菌风干子实体菌种分离方法，该方法包括如下步骤：
1）将自然风干的白参菌子实体用无菌水泡开发胖；
2）将步骤1）所得子实体于12℃下培养7-10天，取菌柄基部长出的白色菌丝；
3）将步骤2）所得菌丝放入培养基中培养得到菌落；
4）对步骤3）所得菌落进行纯化处理后，再进行复壮处理，即得菌种。
由于现有技术尚未涉及到是否能够以及如何利用白参菌干子实体获取白参菌菌种，本发明的发明人尝试参考其它食用菌干子实体获取分离菌种的方法，如《食用菌风干子实体组织分离初探》和中国专利CN104686196A介绍的方法。然而，如本发明的对比实施例所示，发明人发现，利用这些方法，无论取干子实体上的何处部分来进行，均未见白参菌菌丝长出，无法获取菌种。
发明人经过长时间的大量摸索发现，当采取本发明方法时，除了可以成功的获得白参菌菌种之外，更惊喜的是，利用本发明方法得到的菌种在进行栽培出菇实验时，所得的生物学效率比通过新鲜子实体分离得到的菌种（下称对照组）所得的还要高，提高幅度达35%。同时，本发明方法所得菌种在进行栽培出菇时所得菌菇比对照组的更为整齐，朵更大。
也即是说，本发明对现有技术的贡献在于：不仅解决了利用新鲜子实体获取菌种所面临的各种缺点，提供了一种可以在全年任何时候进行菌种分离和栽培出菇的方法；更为重要的是，本发明的方法相比于对照组方法在出菇方面更好，即使不考虑新鲜子实体菌种分离的季节性因素，也显著的提高了白参菌的生产水平和经济效益。
优选的，步骤1）中，浸泡时，水温为室温，时间为3小时。
优选的，步骤2）中的培养方法为：将所得白参菌子实体装入组培瓶中，用无菌水将纱布打湿盖住瓶口，放入人工气候培养箱中遮光培养，湿度保持在 80%-85%，温度设置在12℃培养7-10天。一般而言，白参菌的菌丝在生长阶段，适宜的空气湿度在70-80%。发明人发现当湿度保持在80-85%时，所得结果更好。
优选的，步骤2）中取白色菌丝时的方法为：剪取带有白色菌丝0.5cm～1.0cm长的白参菌菌柄基部，然后移入洁净台中，用长而细的针或铁丝轻轻挑取菌柄基本的白色菌丝。
步骤3）中的培养温度为12℃。当温度为12℃时，能避免杂菌的出现。
优选的，步骤3）中的培养基的成分为：每升培养基中含土豆20 g、蛋白胨2.5 g、大豆蛋白2.5 g、糖20 g、硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂20 g，pH=5.6-5.8。
优选的，步骤4）中的纯化处理方法为：挑取步骤3）所得菌落边缘的菌丝接入PDA培养基中，在25℃下培养7天，得到一次纯化后菌落；再次挑取一次纯化后菌落边缘的菌丝接入PDAP培养基中，于25℃下培养7天，7天后可看到明显的菌落。
优选的，其特征在于，步骤4）中的复壮处理方法为：挑取纯化后菌落边缘的菌丝接入培养基中，于25℃下培养7天，即得到洁白长势旺的菌种；所述培养基的成分为：每升培养基中含土豆20 g、蛋白胨2.5 g、大豆蛋白2.5 g、糖20 g、硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂20 g，pH=5.6-5.8。
本发明的有益效果：
1、解决了利用白参菌新鲜子实体获取菌种所面临的受季节性因素限制、新鲜子实体贮藏成本高、易污染等缺点，实现了可以在全年任何时间进行菌种分离和栽培出菇；
2、风干白参菌子实体可保藏于4℃环境下，一年后仍然可用于菌种分离；
3、大幅提高了白参菌出菇的生物学效率，提升幅度高达35%；
4、利用本发明方法所得菌种进行栽培出菇时，所得菌菇更为整齐、朵更大。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1）将自然风干的白参菌子实体用无菌水泡开发胖，侵泡时间为3小时。
2）然后将泡开的白参菌子实体装入组培瓶中，用无菌水将纱布打湿盖住瓶口，放入人工气候培养箱中遮光培养，湿度保持在 80%-85%，温度设置在12℃，7-10天后方可在白参菌菌柄基部本长出白色茂密的菌丝。
3）剪取带有白色菌丝0.5cm～1.0cm长的白参菌菌柄基部，然后移入洁净台中，用长而细的针或铁丝轻轻挑取菌柄基本的白色菌丝接入准备好的培养基（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8）中，然后放入人工气候培养箱中，温度设置在12℃，7天后可看到明显的菌落。
4）纯化：挑取菌落边缘的菌丝接入PDA培养基中，在25℃下培养7天，7天后可看到明显的菌落，再次挑取菌落边缘的菌丝接入PDAP培养基中，于25℃下培养7天，7天后可看到明显的菌落。
复壮：再次挑取菌落边缘的菌丝接入培养基（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8）中，于25℃下培养7天，即可得到洁白长势旺的菌种。
5）将所得菌种进行出菇实验。
以新鲜子实体组织分离出的菌种为对照组 （1）原种培养
原种培养基配方为:甘蔗渣78%、麦麸20% 、石膏1% 、 蔗糖1% , 料水比为1:1.5，pH5.6-5.8，将料拌好装入650ml的瓶中，高压灭菌，冷却后分别接入，将新鲜子实体组织分离 出的菌种和干子实体组织分离出的菌种接种，新鲜子实体组织分离 出的菌种为对照组，干子实体组织分离出的菌种为处理组，各接种50瓶,在25℃的发菌室中发菌。 （2）栽培出菇
栽培培养基配方为:甘蔗渣80%、麦麸18% 、石膏1% 、 蔗糖1% ,料水比为1:1.5，pH5.6-5.8，将料拌好,装入15x26CM的袋中，每袋装干料300g,高压灭菌，冷却后分别接入对照组和处理组的原种，各接100袋，在25的发菌室中发菌，待菌丝长满后移入出菇房中进行出菇。处理组和对照组的物学效率分别为67.8%和50.2%，处理组的出菇整齐，朵大。
6）用不完的菌种放入4℃环境下保藏。
实施例2
除采用风干并于4℃下保藏一年之后的子实体之外，其余与实施例1一致。所得结果为：成功分离获得菌种，进行栽培出菇实验时，生物学效率为66.3%和50.2%，相较于对照组，出菇整齐、朵大。
对比实施例1
风干的白参菌子实体用75%酒精的消毒30s,在加入0.1%的氯化汞消毒2min,4min,8min,10min,12min,16min,18min,20min然后将其接入培养基（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8），于25℃下培养，处理2min,4min,8min,10min的均全部污染，处理12min,16min的有部分污染，其余的全死亡，处理18min，20min的无污染，但全部死亡。
对比实施例2
无菌条件下，取0.5-1cm2大小的风干的白参菌子实体菌盖和基部组织，分别用无菌水浸泡，完全软化后，放入灭过菌的研钵，加入无菌水1ml，研磨制备组织悬液，分别取组织悬液接种于培养基（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8）和麦粒培养基中 ；在 25℃避光培养 ，三天后全被真菌和细菌污染，此时并未有白参菌丝长出，也无法进行纯化，7天后污染菌盖过整个培养基。
对比实施例3
直剪取白参菌干子实体长1cm的基部，用75%酒精的消毒30s，在加入0.1%的氯化汞消毒11min，在无菌环境下用手术刀切取基部内的组织于培养基中（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8），在 25℃避光培养 ，三天后全被真菌污染，也未见白参菌丝长出。
对比实施例4
直接收集风干白参菌的孢子，于无菌环境下接入培养基中（每升中土豆20g,蛋白胨2.5g,大豆蛋白2.5g，糖20g,硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g,琼脂20g,pH5.6-5.8），在 25℃避光培养，三天后孢子还没萌发，培养基就以被细菌污染，7天后真菌污染盖过培养基。

Claims (4)

1.一种白参菌风干子实体菌种分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）将自然风干的白参菌子实体用无菌水泡开发胖；
2）将步骤1）所得子实体于12℃下培养7-10天，培养方法为： 将所得白参菌子实体装入组培瓶中， 用无菌水将纱布打湿盖住瓶口， 放入人工气候培养箱中遮光培养，湿度保持在80%-85%，温度设置在12℃培养7-10天；取菌柄基部长出的白色菌丝，方法为：剪取带有白色菌丝0 .5cm～1 .0cm长的白参菌菌柄基部，然后移入洁净台中，用长而细的针或铁丝轻轻挑取菌柄基本的白色菌丝；
3）将步骤2）所得菌丝放入培养基中培养得到菌落；培养温度为12℃，培养基的成分为：每升培养基中含土豆20 g、蛋白胨2 .5 g、大豆蛋白2 .5 g、糖20 g、硫酸镁0 .5 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂20 g，pH=5 .6-5 .8；
4）对步骤3）所得菌落进行纯化处理后，再进行复壮处理，即得菌种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，浸泡时，水温为室温，时间为3小时。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中的纯化处理方法为： 挑取步骤3）所得菌落边缘的菌丝接入PDA培养基中， 在25℃下培养7天，得到一次纯化后菌落；再次挑取一次纯化后菌落边缘的菌丝接入PDAP培养基中，于25℃下培养7天，7天后可看到明显的菌落。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中的复壮处理方法为： 挑取纯化后菌落边缘的菌丝接入培养基中，于25℃下培养7天，即得到洁白长势旺的菌种；所述培养基的成分为：每升培养基中含土豆20 g、蛋白胨2 .5 g、大豆蛋白2 .5 g、糖20 g、硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂20 g，pH=5 .6-5 .8。
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