CN105524844A - 一株降解黄曲霉毒素b1的枝顶孢属菌株及其应用 - Google Patents

一株降解黄曲霉毒素b1的枝顶孢属菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌及其应用，保藏编号为：CGMCC？No.11804，分类命名为：枝顶孢Acremonium？sp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其发酵液液与黄曲霉毒素B1反应5分钟后对黄曲霉毒素B1降解率可以达到74％。本发明的枝顶孢属菌具有高效快速降解黄曲霉毒素的能力，在生物降解饲料等中黄曲霉毒素方面具有很好的应用前景。

Description

一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌株及其应用。
背景技术
全世界每年约有25％的谷物受真菌及真菌毒素污染而不能食用。黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由Aspergillusflavuns、A.nomius、A.parasiticus等多种真菌产生的次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1分布范围最广且化学性质最稳定，具有很强的致癌性、致突变性和致畸性，是国际认可的A类致癌物。因此掌握黄曲霉毒素的防治措施，对保障粮油食品质量安全和确保动物性食品安全尤为重要。
自从1960年发现黄曲霉毒素以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的预防和去毒方法。生物降解黄曲霉毒素是一种行之有效的防毒控毒方法，目前报道可以降解黄曲霉毒素B1的细菌较多，主要有红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)，分支杆菌(Mycobacteriumfluoranthenivoranssp)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasrnaltophilia)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)，施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，肠球菌(Enterococcus)，橙红色粘球菌(Myxococcusfulvus)等。而可以降解黄曲霉毒素B1的真菌相对较少，主要有树状指孢霉(Dactyliumdendroide)，少根根霉(Rhizopusarrhizus)，寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)，从茎点霉(Phomasp.)，白腐菌(Trametesversicolor)等。同时大多数的微生物降解黄曲霉毒素需要较长的处理时间，有的甚至长达168小时。对于乳酸菌，双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50％以下，而且它们的去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。所以高效的降解黄曲霉毒素的微生物菌种具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌株及其应用，该菌具有快速高效降解黄曲霉毒素B1的能力，具有实际应用的前景。
本发明实现目的的技术方案如下：
一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌，保藏编号为：CGMCCNo.11804，分类命名为：枝顶孢Acremoniumsp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌作为饲料防霉剂的应用。
降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌作为生物降解菌剂或生物降解无菌制剂的应用。
本发明的优点和积极效果是：
本发明公开一株枝顶孢属菌(Acremoniumsp.)WCQ6A，其菌种保藏号为CGMCCNo.11804，其发酵液液与黄曲霉毒素B1反应5分钟后对黄曲霉毒素B1降解率可以达到74％。
本发明的枝顶孢属菌具有高效快速降解黄曲霉毒素的能力，在生物降解饲料等中黄曲霉毒素方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明枝顶孢属WCQ6A的菌落形态；其中图1a为菌落正面，图1b为菌落反面；
图2为本发明高效液相色谱法检测枝顶孢属WCQ6A对黄曲霉毒素B1的降解能力a发酵液处理24hb未经发酵液处理的对照组；
图3为本发明不同处理时间对枝顶孢属WCQ6A发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响；
图4为本发明不同pH值对枝顶孢属WCQ6A发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供的枝顶孢属WCQ6A菌株可高效降解黄曲霉毒素B1，5分钟就可降解74％的黄曲霉毒素B1，该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属WCQ6A菌株的筛选方法，其包括内容：从腐败的碱性土壤样本中筛选能够降解香豆素的菌株；二次筛选能够降解黄曲霉毒素B1的菌株，采用初筛培养基(M9+0.1％的香豆素)分离的多株能够在香豆素为唯一碳源和能源的平板上生长的菌株，再用这些菌株分别接种复筛培养基(NB培养基+终浓度为100ug/L的黄曲霉毒素B1)，选择到1株降解黄曲霉毒素B1的菌株，通过形态学，以及ITS核酸序列分析，确定该菌株属于枝顶孢属菌，其保藏编号为：CGMCCNo.11804。其ITS核酸序列为：
TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAAAAAATTGGGGGTTTCACGGCGTGGCCGAGCCGCTCTCCGGTGCGAGGTGTGCTACTACGCAGGGGAGGCTGCGGCGCGACCGCCACTCAATTTGGGGGACAGGGGCCCGGAGGCCGCTGATCCCCAGCACCAGGTCCCCCCCGAAAGGGGGTCCTGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCGGAGTGCCGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGTTTTCGGGCTTTCGCCCCTCAGAGATTCACAATAAAATCAGAGTTTGGTTGTCCCCGGCGGACGCCCGGAGCCCGGAGGCACCGCGCGCTGAGCCCGCCGAGGGAACGATAGGTATGTTCACAATGGGTTGGAGAGCCTAGGGCACTCTGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAA
实施例1
菌株的筛选分离
1、样品采集
2013年9月，在超净工作台中，将采集的碱性土壤样品放在无菌生理盐水中震荡15min制备成菌悬液，按2％的接菌量将菌悬液接种到肉汤培养基中，30℃220rpm富集培养4h。取一定量的发酵液离心，收集菌体，按5％的接菌量转接到50ml初筛的培养基里，30℃220rpm培养7天，按5％的接菌量取培养液2.5ml离心，收集菌体，再次转接到初筛培养基中，一共转接3次。
2、菌株的分离
取300ul有生长迹象的菌悬液涂布初筛固体培养基平板上，30℃条件下培养7d，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株在初筛固体培养基平板划线纯化3代，挑选三代都能稳定生长的菌株的单克隆，再次接种到50ml初筛培养基里，转接3次，选取有明显生长迹象的菌株
3、枝顶孢属WCQ6A的形态特征
枝顶孢属WCQ6A菌株在NA培养基上30℃培养7d后，菌落圆形，直径24-29mm，白色，边缘绒状，背面奶油色至橘黄色。菌落质地絮状，边缘整齐，无特殊气味，命名为WCQ6A，见图1。
4、培养基及培养条件
(1)、初筛培养基KH2PO4，0.25g；MgSO4·7H2O，0.25g；(NH4)2SO4，0.5g；CaCl2·2H2O，0.005g；FeCl3·H2O，0.003g，固体培养基加琼脂20g，水1升，调pH到7.0。分装到锥形瓶，加塞包扎后121℃灭菌20min，稍冷却后加0.1％(W/V)香豆素。30℃，220rpm培养7d。
(2)、肉汤培养基蛋白胨10g；牛肉膏3g；NaCl5g；加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后121℃灭菌20分钟。30℃，220rpm培养4h。
(3)、NB培养基酵母提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖6g，NaCl10g，加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后115℃灭菌20min。按1％的接种量接种在5mlNB培养基的试管里，30℃220rpm培养24h，按5％的接种量接种到100ml培养基中，培养48h。
(4)、NA培养基为NB培养基加20g琼脂，用接种环划线，30℃培养。
实施例2
枝顶孢属WCQ6A菌株对黄曲霉毒素B1的降解能力分析
1、试验方法
(1)黄曲霉毒素B1的配制
将1mg黄曲霉毒素B1溶解在10ml色谱纯甲醇中获得浓度为0.1mg/ml的黄曲霉毒素B1储存液，再取1ml储存液用99ml超纯水稀释成1000ug/L的黄曲霉毒素B1使用液。使用终浓度为100ug/L。
(2)菌种培养
将初筛得到的WCQ6A菌种按1％的接种量接种在5mlNB培养基的试管里，30℃220rpm培养24h，按5％的接种量接种到100mlNB培养基中，培养48h。
(3)枝顶孢属WCQ6A菌株对黄曲霉毒素B1降解能力的检测
取4.5ml发酵液加入50ml棕色青霉素小瓶中，加500ul浓度为1000ug/L的黄曲霉毒素B1(终浓度为100ug/L)，30℃220rpm，分别处理1，2，5，10，20，40和60min，NB培养基作对照。
处理液10000rpm离心5min，取一定体积的上清用超纯水稀释3倍，然后用定性滤纸过滤，使用免疫亲和柱对实验组和对照组样品中的黄曲霉毒素B1进行净化提取(方法参照免疫亲和柱的使用说明书)，提取液在60℃烘箱中烘干。
将烘干的样品衍生化，先加入200ul的正己烷，再加50ul三氟乙酸，激烈震荡30s，40℃衍生5min，加入1.95ml乙腈和水混合物(乙腈：水＝1：9)，激烈震荡30s，静止分层10min，取下层溶液，10000rpm离心5min，然后过0.22um的膜，高效液相色谱检测黄曲霉毒素B1的含量。
高效液相色谱检测条件为：流动相水：甲醇：乙腈＝70：17：17的混合物；流速0.6ml/min；色谱柱C18(250mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；柱温：30℃；进样量25μl。
黄曲霉毒素B1降解率(％)＝(对照组黄曲霉毒素B1含量—实验组黄曲霉毒素B1含量)/对照组黄曲霉毒素B1含量×100。
2、试验结果
实验结果表明，枝顶孢属WCQ6A的发酵液在5min时对黄曲霉毒素B1的降解率为74.42％(图2)，60min时的降解率为75.68％，24h的降解率为78.46％(如图3)。
实施例3
不同pH值对枝顶孢属WCQ6A发酵液降解黄曲霉毒素B1能力的影响
1、试验方法
用2M的HCl将发酵液上清的pH值调到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，把NB培养基调到相应的pH值作为对照，加入黄曲霉毒素B1，30℃下反应20min，检测对黄曲霉毒素B1的降解率。
2、试验结果
在pH为4.0时发酵液上清对黄曲霉毒素B1无降解能力，随着pH值升高，降解率也逐渐升高，在pH值为8.0时，降解率达到最高，为71％(图4)。

Claims (3)

1.一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌，其特征在于：保藏编号为：CGMCCNo.11804，分类命名为：枝顶孢Acremoniumsp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌作为饲料防霉剂的应用。
3.权利要求1所述的降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌作为生物降解菌剂或生物降解无菌制剂的应用。
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