CN105503993A - 一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 - Google Patents
一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105503993A CN105503993A CN201510906691.6A CN201510906691A CN105503993A CN 105503993 A CN105503993 A CN 105503993A CN 201510906691 A CN201510906691 A CN 201510906691A CN 105503993 A CN105503993 A CN 105503993A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saponin
- nigella damascena
- nigella
- damascena
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000005912 Nigella damascena Species 0.000 title claims abstract description 84
- 235000008750 Nigella damascena Nutrition 0.000 title claims abstract description 82
- SMRPGWBDLOQHOS-UHFFFAOYSA-N 5-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-[[9-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-4,6a,6b,8a,11,11,14b-heptamethyl-14-oxo-2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14a-dodecahydro-1H-picen-3-yl]oxy]oxane-2-carboxylic acid Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(C(O)C2O)C(O)=O)OC2C(C3C(C4C(C5(CCC6(C)C(O)CC(C)(C)CC6C5=CC4=O)C)(C)CC3)(C)CC2)(C)CO)OC(CO)C(O)C1O SMRPGWBDLOQHOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 61
- PPRSVUXPYPBULA-UHFFFAOYSA-N saponin A Natural products CC1(C)CCC2(CCC3(C)C(=CCC4C5(C)CCC(OC6OC(CO)C(O)C(O)C6=O)C(C)(C)C5CCC34C)C2C1)C(=O)O PPRSVUXPYPBULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 61
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims abstract description 20
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001529246 Platymiscium Species 0.000 claims description 6
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 5
- -1 carbon 18 modified silica-gel Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000007670 refining Methods 0.000 abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 6
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 5
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000011024 colonic benign neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 3
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 3
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 244000090896 Nigella sativa Species 0.000 description 2
- 235000016698 Nigella sativa Nutrition 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N Para-Xylene Chemical compound CC1=CC=C(C)C=C1 URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 2
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 240000006409 Acacia auriculiformis Species 0.000 description 1
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010007027 Calculus urinary Diseases 0.000 description 1
- 241000205571 Caulophyllum Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000183278 Nephelium litchi Species 0.000 description 1
- 235000015742 Nephelium litchi Nutrition 0.000 description 1
- 235000007413 Nigella arvensis Nutrition 0.000 description 1
- 241001518085 Nigella glandulifera Species 0.000 description 1
- 244000011358 Patrinia scabiosaefolia Species 0.000 description 1
- 235000009267 Patrinia scabiosaefolia Nutrition 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical group C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical group O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001711 nigella sativa Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000000039 preparative column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 230000026676 system process Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 208000008281 urolithiasis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
- C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种黑种草皂苷A的制备方法，其主要步骤如下：选取黑种草属植物种子，采用乙醇溶液进行提取，并进一步采用大孔树脂进行精制，浓缩，获得黑种草总皂苷浓缩液；所述浓缩液采用加压制备色谱系统，以20-120μm粒径范围的碳十八改性硅胶为填料，40-60％甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的黑种草皂苷A成品。本发明制备产品纯度高，工艺简洁、可操作性强，易于实现产业化放大。本发明所述黑种草皂苷A具有明确抗结肠癌和抗炎作用，因而可应用于具有抗肿瘤和抗炎功能的相关药物或保健食品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑种草皂苷A的制备方法，本发明同时涉及该化合物物在抗肿瘤和抗炎功效方面的应用，属保健食品与生物医药领域。
技术背景
毛茛科黑种草属(Nigella)植物分布在地中海、西亚、中亚、中国新疆等地，黑种草子系维吾尔族(维语斯亚旦)和地中海地区习用药材，具有止咳平喘、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤、保肝、降脂、降糖等多种药理活性，常用于胸闷气足，乳肿，乳汁减少，耳呜，热淋，石淋，闭经等症。黑种草子中含油30-35％，是维族常用的功能食品；此外，黑种草子中还富含黄酮、皂苷、生物碱等生物活性物质。近年来，黑种草子中含有的皂苷类成分具有一定的体外抗肿瘤活性，因而对其研究工作受到关注。
黑种草子现有文献研究侧重于对该类皂苷类成分的分离和鉴定，一般采用醇提、大孔树脂精制、硅胶和反相硅胶多次柱层析纯化等复杂工艺，其分离制备工艺步骤复杂、得率低，主要局限于实验室制备规模。赵军等(中国专利号CN201010250936.1)公开了一种“黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用”，所述工艺主要通过大孔树脂精制获得黑种草子总苷提取物，其中含有50％至80％的皂苷、3％至11％的黄酮。刘玉明等(中国专利申请号CN201310619087.6)公开了“一种从斯亚旦中提取异株五加甲苷的方法”，所述工艺主要通过乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂、萃取后水相经大孔树脂精制获得异株五加甲苷(即黑种草皂苷A)提取物(纯度范围57.5％至70.3％)。
为进一步综合开发利用黑种草属植物资源，发明人对黑种草子中的化学成分进行深入研究，从中分离鉴定了生物碱、皂苷等成分[Lian-liSun，StudyonantitubercularconstituentsfromtheseedsofNigellaGlandulifera.ChemPharmBull，2013，61(8)：873-876]。黑种草皂苷A是其中的主要成分，又名异株五加甲苷，其化学名：常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基]-28-O-[α-L-鼠李糖基(1→4)-β-D-葡糖基-(1→6)-β-D-葡糖苷]。采用优选的大孔树脂精制工艺，制备获得的黑种草总皂苷中，皂苷A含量约为50％[栾明，维药黑种草子中活性成分HE-III的大孔树脂纯化工艺研究，中国药学杂志，2014，49(12)：1014-1017]。
通过深入研究，本发明首次研制出高纯度黑种草皂苷A(含量大于90％)的规模化制备工艺，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种易于实现产业化的高纯度黑种草苷A制备工艺。
本发明提供的黑种草皂苷A的制备方法包括以下步骤：
(1)选取黑种草属植物种子原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤，上大孔树脂进行吸附，依次用水、50-80％乙醇梯度洗脱，收集50-80％乙醇洗脱液，浓缩，获得黑种草总皂苷浓缩液；
(2)由(1)所得黑种草总皂苷浓缩液，采用加压制备色谱系统，以20-120μm粒径范围的碳十八改性硅胶为填料，40-60％甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的黑种草皂苷A成品。
所述工艺步骤(1)中，所述黑种草属植物可选自腺毛黑种草(Nigellaglandulifera)、黑种草(Nigelladamascena)、果黑种草(Nigellasativa)等同属植物中的任意一种。黑种草皂苷A在黄花败酱、异株五加、野木瓜等其它科属植物中也有发现，但其含量在黑种草子中最高。提取溶剂为水、含水乙醇中的任意一种，其中优选60-80％乙醇。所述大孔树脂为苯乙烯系树脂，其中优选弱极性大孔树脂。大孔树脂洗脱优选60-80％乙醇洗脱液。根据需要，大孔树脂乙醇洗脱液经浓缩后，可进一步采用超滤透析和纳滤浓缩工序处理，获得黑种草总皂苷浓缩液。
所述工艺步骤(2)中，所述加压制备色谱系统为低压或中压制备色谱，优选中压制备色谱系统。所述碳十八改性硅胶填料平均粒径范围20-120μm，优选40-80μm。所述流动相优选45-55％甲醇范围；洗脱方式可为等度或梯度洗脱，优选等度洗脱。所述含有黑种草皂苷A的流份采用在线紫外检测，检测波长为200-210nm。
本发明通过系统工艺研究，所完成的黑种草皂苷A制备技术路线有以下特色：(1)采用优选的大孔树脂梯度洗脱工艺，结合超滤透析、纳滤浓缩工序，可有效除去黑种草总皂苷浓缩液中的低分子量黄酮、寡糖等杂质，同时对浓缩液进行过滤澄清，简化了后续纯化工艺负担；(2)创新性应用中压反相柱色谱工序，可通过一步制备柱层析获得高纯度黑种草皂苷A产品，成功实现了纯化工序的自动化和生产可行性。本发明产品纯度高，工艺简洁、可操作性强，易于实现产业化放大。
本发明同时对所述黑种草皂苷A的抗肿瘤和抗炎作用进行了考察。研究结果表明，黑种草皂苷A(80、120mg/kg，i.p.)可显著抑制SW620人结肠癌裸鼠的瘤重；黑种草皂苷A(100、200mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症有显著抑制作用。结果表明所述黑种草皂苷A具有明确的抗结肠癌、抗炎等作用，因而可以应用于具有抗肿瘤和抗炎功能的相关药物或保健食品中。
本发明内容是通过大量实验研究、工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行说明。
附图说明
图1为采用本发明实施例1中提取的步骤(1)黑种草总皂苷样品HPLC色谱图。
图2为采用本发明实施例1中提取的步骤(2)黑种草皂苷A样品HPLC色谱图。
图1和图2中，色谱峰1为黑种草皂苷A。
具体实施方式
本发明所述的黑种草皂苷A是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。
实施例1黑种草皂苷A的制备
黑种草子药材购自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐(批号：NG20121025)，经鉴定为毛莨科植物腺毛黑种草(NigellaglanduliferaFreynetSint)的干燥成熟种子。
采用HPLC测定黑种草皂苷A含量，色谱条件：AgilentTC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；ELSD检测；流动相为乙腈-水(32∶68)等度洗脱20min；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量20μL。大孔树脂制备工艺参考栾明报道进行[中国药学杂志，2014，49(12)：1014-1017]。
(1)取榨油后的黑种草子药材10kg，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1h；合并滤液，减压回收至无醇味，用水稀释至40L，过滤，上AB-8大孔树脂层析柱(柱体积30L/BV)，先用水洗脱6BV，再用70％乙醇洗脱4BV，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至12L，其中4L备用；余下8L浓缩液经60℃真空干燥，得黑种草总皂苷143g，HPLC测定其中黑总草皂苷A含量为53.5％，HPLC色谱图参见附图1。
(2)取黑种草总皂苷浓缩液2L，加入甲醇500ml稀释，过滤，上DaisogelRP-18柱(40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，45％甲醇等度洗脱，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm，HPLC检测合并高纯度黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A28g(含量95.5％)。HPLC色谱图参见附图2。
实施例2黑种草皂苷A的制备
取实施例1(1)所得黑种草总皂苷浓缩液2L，加入甲醇500ml稀释，过滤，上DaisogelRP-18柱(80-120μm，柱体积4L)中压制备色谱，45％→55％甲醇梯度洗脱120min，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm。HPLC检测合并黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A31g(含量91.4％)。
实施例3黑种草皂苷A的制备
(1)取榨油后的黑种草子药材10kg，加15倍量50％乙醇回流提取2次，每次1.5h；合并滤液，减压浓缩至无醇味，用水稀释至40L，过滤，上HPD450大孔树脂层析柱(柱体积30L/BV)，先用水洗脱6BV，再用60％乙醇洗脱4BV，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，用水稀释至50L，先用超滤陶瓷膜(0.05μm孔径)过滤，收集透过液40L，再用纳滤有机膜(截留分子量200Da)过滤，收集黑种草子总皂苷浓缩液5L。测定浓缩液中固含物为62g/L，其中黑种草皂苷A含量为76.7％。
(2)取黑种草子总皂苷浓缩液1L，加甲醇250ml稀释，上DaisogelRP-18柱(40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，55％甲醇等度洗脱，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm，HPLC检测合并黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A42g(含量98.7％)。
实验例1：黑种草皂苷A对SW620肿瘤的抑制作用考察
采用SW620人结肠癌裸鼠模型，考察黑种草皂苷A(NGA)的体内抗肿瘤作用。将接种SW620的裸鼠，随机分为模型组(空白对照)、阳性对照组(环磷酰胺30mg/kg，腹腔注射)、皂苷A剂量组(40、80、120mg/kg，灌胃)，连续给药4周，末次给药24小时后，处死动物，分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤体积、相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组相对肿瘤体积；CRTV：模型组相对肿瘤体积；相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V0，其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积)以及平均抑瘤率，公式如下：I＝(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％。实验结果见表1。
表1黑种草皂苷A对SW620人结肠癌裸鼠的抑制作用(n＝6，)
结果表明：黑种草皂苷A(80、120mg/kg，i.p.)可显著抑制小鼠的瘤重，T/C比范围为51.16％、38.74％，结果表明黑种草皂苷A具有明确抗SW620人结肠癌肿瘤作用。
讨论：本发明曾采用MTT体外实验，测试黑种草皂苷A对A549人肺癌细胞株、Sk-ov-3人卵巢癌细胞株、HepG2人肝癌细胞株、PC3人前列腺癌细胞株、SW620人结肠癌细胞株等5种瘤株的抑制作用。结果表明该化合物在测试浓度(100μM)下对5种瘤株均无抑制作用，相应水解产物“常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基]”均有效(IC50约15-25μM)。结合本次体内试验，本发明首次证实，黑种草皂苷A具有明确抗SW620人结肠癌肿瘤作用，推测可能作为其水解产物前药起效。
实验例2：黑种草皂苷A的抗炎作用考察
选用实施例1黑种草皂苷A进行抗炎实验。取20-25g小鼠80只，雌雄各半，分为皂苷A低/中/高剂量组(50、100、200mg/kg)、吲哚美辛对照组(20mg/kg)和模型组5组，预灌胃给药一周。最后一次灌药2小时后，用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳，半小时后处死小鼠，用直径6mm打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平称重。取下的右耳减去左耳重量为肿胀度，计算对照组和给药组的均值与标准差，t检验比较组间差异显著性。按下式求出肿胀抑制率：
肿胀抑制率(％)＝[1-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]×100％
结果：黑种草皂苷A中/高剂量(100、200mg/kg)组对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症均有抑制作用，肿胀抑制率依次为61.3、76.5(％)。
Claims (9)
1.一种黑种草皂苷A的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取黑种草属植物种子原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤，上大孔树脂进行吸附，依次用水、50-80％乙醇梯度洗脱，收集50-80％乙醇洗脱液，浓缩，获得黑种草总皂苷浓缩液；
(2)由(1)所得黑种草总皂苷浓缩液，采用加压制备色谱系统，以20-120μm粒径范围的碳十八改性硅胶为填料，40-60％甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的黑种草皂苷A成品。
2.根据权利要求1所述黑种草皂苷A的制备方法，特征在于所述步骤(1)中黑种草属植物选自腺毛黑种草、黑种草、果黑种草中的任意一种。
3.根据权利要求1所述黑种草皂苷A的制备方法，特征在于所述步骤(1)中50-80％乙醇洗脱液经浓缩后，采用超滤透析和纳滤浓缩工序处理，获得黑种草总皂苷浓缩液。
4.根据权利要求1所述黑种草皂苷A的制备方法，特征在于所述步骤(2)中所述加压制备色谱系统为中压制备色谱系统。
5.根据权利要求1所述黑种草皂苷A的制备方法，特征在于所述步骤(2)中所述碳十八改性硅胶平均粒径范围40-80μm。
6.根据权利要求1所述黑种草皂苷A的制备方法，特征在于所述步骤(2)中所述流动相为45-55％甲醇，优选等度洗脱。
7.根据权利要求1-6的黑种草皂苷A在制备抗肿瘤药品或保健食品中的应用。
8.根据权利要求7的黑种草皂苷A在制备抗肿瘤药品或保健食品中的应用，特征在于所述肿瘤为结肠癌。
9.根据权利要求1-6的黑种草皂苷A在制备抗炎药品或保健食品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510906691.6A CN105503993A (zh) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | 一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510906691.6A CN105503993A (zh) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | 一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105503993A true CN105503993A (zh) | 2016-04-20 |
Family
ID=55712348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510906691.6A Pending CN105503993A (zh) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | 一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105503993A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109633005A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-16 | 中证检测科技（天津）有限公司 | 抗疲劳保健中总皂苷的检测方法 |
| CN112390833A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-23 | 河南大学 | 一种从Nigella sativa种籽中分离提取糖及糖类衍生物的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103694301A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-04-02 | 天津理工大学 | 一种从斯亚旦中提取异株五加甲苷的方法 |
| CN103948604A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-07-30 | 天津理工大学 | 常春藤皂苷元类化合物作为治疗肝癌药品的应用及其制备 |
-
2015
- 2015-12-07 CN CN201510906691.6A patent/CN105503993A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103694301A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-04-02 | 天津理工大学 | 一种从斯亚旦中提取异株五加甲苷的方法 |
| CN103948604A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-07-30 | 天津理工大学 | 常春藤皂苷元类化合物作为治疗肝癌药品的应用及其制备 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘玉明 等: ""瘤果黑种草子化学成分的研究"", 《中国中药杂志》 * |
| 李静 等: ""瘤果黑种草子中磷脂类成分的研究"", 《中成药》 * |
| 蔡晓翠 等: ""HPLC-ELSD法测定黑种草总皂苷提取物中黑种草皂苷A的含量"", 《中国药房》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109633005A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-16 | 中证检测科技（天津）有限公司 | 抗疲劳保健中总皂苷的检测方法 |
| CN112390833A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-23 | 河南大学 | 一种从Nigella sativa种籽中分离提取糖及糖类衍生物的方法 |
| CN112390833B (zh) * | 2020-11-20 | 2023-05-16 | 河南大学 | 一种从Nigella sativa种籽中分离提取糖及糖类衍生物的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103816296B (zh) | 紫珠总苷提取物及其制备方法和用途 | |
| CN101904968B (zh) | 重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂 | |
| CN105362315A (zh) | 一种东革阿里提取物及其制备方法 | |
| CN102772500B (zh) | 具有抗炎作用的热淋清颗粒原料头花蓼提取物 | |
| CN101824067A (zh) | 玉蕊醇型三萜皂苷类化合物、制备方法及其应用 | |
| CN104130226B (zh) | 一种高含量丹参丹酚酸b的制备方法 | |
| CN105384748A (zh) | 从飞龙掌血中分离纯化茴芹香豆素的方法及应用 | |
| CN102180938A (zh) | 细梗香草皂苷的制备方法 | |
| CN101830875A (zh) | 抗炎化合物线叶旋覆花内酯a及其制备方法和应用 | |
| CN105503993A (zh) | 一种黑种草皂苷a的制备方法及其用途 | |
| CN102070683B (zh) | 同时制备parishin、parishin B、parishin C化学对照品的方法 | |
| CN110464771A (zh) | 一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法 | |
| CN106349304A (zh) | 高纯度荨麻新苷及荨麻木脂素的制备方法 | |
| CN103385913B (zh) | 黄芪提取物及其制备方法和制剂 | |
| CN102772497B (zh) | 热淋清颗粒药材醇提有效部位及其制备方法 | |
| CN104892708B (zh) | 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法 | |
| CN104072456A (zh) | 一种高纯度丹酚酸b的制备方法 | |
| CN104027403B (zh) | 一种远志糖酯有效部位的制备方法 | |
| CN102755450B (zh) | 一种消炎解毒中药组合物的制备方法 | |
| CN102397317A (zh) | 大豆婕妮雌婷生产方法及其在制备类雌激素药或女性保健食品中的应用 | |
| CN107266464A (zh) | 一种泽泻汤提取物及其应用 | |
| CN104083390A (zh) | 6，7-二羟基-5-β-D-吡喃葡萄糖-4`-β-O-D-吡喃葡萄糖黄酮在制备抗炎药物中的用途 | |
| CN102260152A (zh) | 一种姜烯酚提取物的制备方法及其医药用途 | |
| CN105348338A (zh) | 从琼岛染木树中提取分离鸡屎藤苷酸的方法 | |
| CN105646638A (zh) | 长梗冬青苷的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160420 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |