CN105392788A - 用作沉默调节蛋白调节剂的取代的桥连脲类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的取代的桥连脲及相关类似物以及它们的使用方法。该调节沉默调节蛋白的化合物可用于提高细胞寿命，以及治疗和/或预防多种疾病和障碍，包括，例如，与衰老或应激反应有关的疾病或障碍、糖尿病、肥胖症、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝固障碍、炎症、癌症和/或潮红，以及受益于线粒体的活性增加的疾病或障碍。还提供了包含调节沉默调节蛋白的化合物组合另一种治疗剂的组合物。

Description

用作沉默调节蛋白调节剂的取代的桥连脲类似物
背景技术
沉默信息调节剂(SilentInformationRegulator，SIR)基因家族代表存在于范围从古细菌(archaebacteria)至真核生物的生物体的基因组中的高度保守的一组基因。编码的SIR蛋白涉及从基因沉默的调节至DNA修复的各种不同过程。酵母Sir2蛋白属于组蛋白脱乙酰基酶的家族。此家族中完善表征的基因为酿酒酵母SIR2(S.cerevisiaeSIR2)，其涉及含有规定酵母交配型、端粒位置效应及细胞老化的信息的沉默HM基因座。由SIR基因家族成员编码的蛋白显示：在250个氨基酸的核心结构域中有高度序列保守。于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)中的Sir2同系物CobB起到NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依赖性ADP-核糖基转移酶的作用。
Sir2蛋白为使用NAD作为协同底物的第III类脱乙酰基酶。不同于其它脱乙酰基酶，这些中的许多涉及基因沉默，Sir2对第I类及第II类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA))不具敏感性。
通过Sir2进行的乙酰基-赖氨酸的脱乙酰基化与NAD水解作用紧密结合，产生烟酰胺与新的乙酰基-ADP核糖化合物。Sir2的NAD-依赖性脱乙酰基酶活性对于可以将其生物学作用与酵母中的细胞代谢作用结合的这一功能而言是必需的。哺乳动物Sir2同系物具有NAD-依赖性组蛋白脱乙酰基酶活性。
生物化学的研究已显示，Sir2可容易地将组蛋白H3与H4的氨基末端尾部脱乙酰基化，导致形成2’/3’-O-乙酰基-ADP-核糖(OAADPR)与烟酰胺。具有SIR2的额外拷贝的菌株显示rDNA沉默增加且寿命增长30％。还已经表明，秀丽隐杆线虫(C.elegans)SIR2同系物(sir-2.1)及果蝇(D.melanogaster)dSir2基因的额外拷贝会延长那些生物体的寿命。这暗示了针对老化(aging)的SIR2-依赖性调节途径在进化早期出现且已经是相当保守的。现今，认为Sir2基因已经进化为增强生物体的健康与应激反应，以增加其逆境存活(survivingadversity)的机会。
在人中有7种Sir2样基因(SIRT1-SIRT7)，它们共享Sir2的保守催化结构域。SIRT1为具有与Sir2最高程度序列相似性的核蛋白。SIRT1通过脱乙酰化作用调节多种细胞靶点，包括肿瘤抑制基因p53、细胞信号传导因子NF-kB和FOXO转录因子。
SIRT3为SIRT1的同系物，其在原核生物与真核生物中具保守性。SIRT3蛋白通过位于N-末端的独特结构域而靶向至线粒体嵴(cristae)。SIRT3具有NAD+-依赖性蛋白脱乙酰基酶活性，且普遍表达，特别是在代谢活性的组织中。在转移至线粒体后，认为SIRT3被线粒体基质加工肽酶(MPP)裂解成更小的活性形式。
已知70年以上，热量限制(caloricrestriction)增进哺乳动物的健康并延长寿命。酵母寿命(如后生动物的)也通过类似热量限制(例如低葡萄糖)的介入来增长。发现缺乏SIR2基因的酵母与蝇类在热量限制时并不活得更长，这为SIR2基因介导限制性热量饮食的有益健康功效提供了证据。而且，降低酵母葡萄糖-响应性cAMP(腺苷3',5'-单磷酸)-依赖性(PKA)途径活性的突变延长了野生型细胞的寿命，但在突变型sir2菌株中则不会延长，这证明SIR2可能是热量限制途径的关键下游组分。
除了治疗潜力，SIRT1活性的结构和生物物理研究以及经小分子沉默调节蛋白(sirtuin)调节剂的活化将用于推进对沉默调节蛋白的生物学功能的了解、进一步了解沉默调节蛋白活化的作用机理以及帮助研发用于鉴定新的沉默调节蛋白调节剂的试验。
发明内容
本发明提供了新的调节沉默调节蛋白的化合物及其使用方法。
在一方面，本发明提供了下面详细描述的结构式(I)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)和(IV)的调节沉默调节蛋白的化合物。
在另一个方面，本发明提供了使用调节沉默调节蛋白的化合物的方法、或包含调节沉默调节蛋白的化合物的组合物。在一些实施方案中，提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞寿命，治疗和/或预防多种疾病和病症，包括，例如，与衰老或应激反应有关的疾病或障碍，糖尿病，肥胖症，神经变性疾病，化学疗法诱导的神经病，与缺血状况有关的神经病，眼睛疾病和/或病症，心血管疾病，血液凝固病症，炎症，和/或潮红，等等。提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可以用于治疗患者的受益于线粒体活性提高的疾病或障碍，用于增强肌肉性能，用于提高肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或缺血有关的肌肉组织损伤。在其它实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞对应激反应的敏感性，提高细胞凋亡，治疗癌症，刺激食欲，和/或刺激体重增加，等等。如下面进一步所描述，该方法包括向有此需要的受试者给药药学上有效量的调节沉默调节蛋白的化合物。
在一些方面，调节沉默调节蛋白的化合物可以单独给药，或与其它化合物(包括其它调节沉默调节蛋白的化合物或其它治疗剂)组合给药。
附图说明
图1显示化合物1的1H-NMR波谱。
图2显示化合物1的13C-NMR和APTNMR波谱。
图3描绘的是(A)全长SIRT1的HDX-MS，(B)CBS对SIRT1cc活性的影响的酶特征描述，(C)迷你-hSIRT1(ΔN)与迷你-hSIRT1的STAC活化的透视图对比，(D)迷你-hSIRT1(ΔCBS)与迷你-hSIRT1的STAC活化的透视图对比，和(E)迷你-hSIRT1(E230K)与迷你-hSIRT1的STAC活化的透视图对比。
图4显示合成的SIRT1活化剂(1，4-9)、抑制剂(2)和荧光偏振分析探针(3)的化学结构。
图5描绘的是在存在或不存在STAC的情况下迷你-hSIRT1的尺寸排阻色谱(SEC)。
图6描绘的是(A)结合至CSB肽的SIRT1cc的HDX-MS性质的差分扰动(differentialperturbation)，(B)迷你-hSIRT1/1复合物与ySIR2的结构比较，(C)迷你-hSIRT1/1复合物、迷你-hSIRT1/1/2复合物和迷你-hSIRT1/1/Ac-p53-7mer/CarbaNAD四元复合物的N-末端SBD的结构比较。
图7描绘的是使用具有Ac-p53(W5)底物的OAcADPr分析比较野生型和(A)I223A或(B)E230KSIRT1的活化剂量-响应曲线。
图8描绘的是野生型与突变型全长hSIRT1的活化比较。
图9描绘的是(A)迷你-hSIRT1/Ac-p53相互作用的界面。(B)迷你-hSIRT1/carbaNAD相互作用的界面。(C)迷你-hSIRT1/2相互作用的界面。
图10描绘的是(A)FP探针3与SIRT1的结合。(B)4针对SIRT1/3复合物的竞争。
图11描绘的是经全长I223RhSIRT1减弱的STAC结合。
图12描绘的是迷你-hSIRT1(R446A)与迷你-hSIRT1的STAC活化的透视图对比。
发明详述
1.定义
用于本文的下列术语及短语应具有于下文所叙述的含义。除非另行定义，所有于本文中使用的技术与科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
本文中术语“药剂(agent)”用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白或其部分例如肽)、或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制得的提取物。
术语“生物可利用的”当涉及化合物时为本领域所公知的，且所考虑到的涉及化合物形式，其中所给药化合物的量的全部或一部分能够被所给药的受试者或患者吸收、引入或以其它方式在生理学上被利用。
“沉默调节蛋白的生物学活性的部分”是指具有生物活性(例如脱乙酰基化能力)的沉默调节蛋白的一部分(“催化活性”)。沉默调节蛋白的催化活性部分可包含沉默调节蛋白的核心结构域。具有GenBank登录编号NP_036370的SIRT1的催化活性部分，包括NAD+结合结构域与底物结合结构域，例如，可包括但不限于GenBank登录编号NP_036370的氨基酸240-664或240-505，其由GenBank登录编号NM_012238的多核苷酸所编码。因此，此区域有时被称作核心结构域。SIRT1的其它催化活性部分(也有时也被称作核心结构域)包括GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。SIRT1的其他“生物学活性”的部分为GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293或183-225，其包括对于化合物结合位点重要的核心结构域的N-末端结构域。
术语“陪伴动物”是指猫与狗。用于本文的术语“狗”是指犬科家族(Canisfamiliaris)的任一成员，其中有许多不同品种。术语“猫”是指猫科动物，包括驯养猫及猫科猫属(familyFelidae，genusFelis)的其它成员。
“糖尿病”是指高血糖或酮酸中毒，以及因长期高血糖状态或葡萄糖耐受性减低所引起的慢性、一般性代谢异常。“糖尿病”包含该疾病的I与II型(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)两种形式。糖尿病的危险因素包括下列因素：男子腰围超过40英寸或女子腰围超过35英寸，血压为130/85mmHg或以上，甘油三酸酯高于150mg/dl，空腹血糖大于100mg/dl，或男子高密度脂蛋白少于40mg/dl或女子高密度脂蛋白少于50mg/dl。
术语“ED50”是本领域公知的有效量的度量。在一些实施方式中，ED50是指药物产生其最大响应或功效的50％时的剂量，或者在50％的测试受试者或制品(例如分离的组织或细胞)中产生预定响应的剂量。术语“LD50”是本领域公知的致死剂量的度量。在一些实施方式中，LD50是指药物使50％的测试受试者致死的剂量。术语“治疗指数”为本领域所公知的术语，是指药物的治疗指数，定义为LD50/ED50。
术语“高胰岛素血症”是指个体血液中胰岛素水平高于正常值的状态。
术语“胰岛素抵抗”是指这样的一种状态，其中相对于在不具有胰岛素抵抗的受试者中的生物响应而言，正常量胰岛素产生低于正常(subnormal)生物响应的状态。
本文所讨论的“胰岛素抵抗病症”是指由胰岛素抵抗所引起或促成的任何疾病或状况。实例包括：糖尿病、肥胖症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、综合征X、胰岛素抵抗、高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、高脂血症、动脉粥样硬化疾病，包括中风、冠状动脉疾病或心肌梗塞、高血糖症、高胰岛素血症和/或高胰岛素原血症、葡萄糖耐受性不良、延迟胰岛素释放、糖尿病并发症，包括冠心病、心绞痛、充血性心脏衰竭、中风、痴呆的认知功能、视网膜病、周围神经病、肾病、肾小球肾炎、肾小球硬化症、肾病变综合征、高血压性肾硬化、一些类型癌症(如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不调、不育、不定期排卵、多囊卵巢性综合征(PCOS))、脂肪代谢障碍、胆固醇相关病症，例如胆结石、胆囊炎与胆石病，痛风、阻塞性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、骨关节炎，以及骨丢失，例如尤其是骨质疏松症。
术语“家畜动物”是指经驯化的四足动物，其包括那些为肉类与各类副产品而饲养的动物，例如牛类动物，包括牛与牛属(genusBos)的其它成员，猪类动物，包括驯养猪与猪属(genusSus)的其它成员，羊类动物，包括绵羊与其它羊属(genusOvis)的成员、驯养山羊与山羊属(genusCapra)的其它成员；为特定任务例如用做负重畜牲而饲养的经驯化的四足动物，例如马类动物，包括驯养马与马科马属(familyEquidae，genusEquus)的其它成员。
术语“哺乳动物”为本领域已知的，且示例性哺乳动物包括人、灵长类、家畜动物(包括牛类、猪类等)、陪伴动物(例如犬类、猫类等)及啮齿类(例如小鼠与大鼠)。
“肥胖”个体或患有肥胖症的个体，一般指具有的体重指数(BMI)为至少25或以上的个体。肥胖可以与或不与胰岛素抵抗相关。
术语“经肠胃外给药”及“经肠胃外进行给药”为本领域公认的，且指非肠给药与局部给药的给药模式，一般经由注射，且包括但不限定于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内与胸骨内注射及输注给药。
“患者”、“受试者”、“个体”或“宿主”是指人或非人动物。
术语“药学上可接受的载体”为本领域公认的，且是指与携带或运送任何主体组合物或其组分有关的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物料。各种载体就其可与主体组合物或其组分相容的意义而言必须为“可接受的”，且对患者是无害的。可用作药学上可接受载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖与蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉与马铃薯淀粉；(3)纤维素与其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)成粉末的西黄耆胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂与栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、蓖麻油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油与大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇与聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯与月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁与氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；及(21)其它用于医药制剂的无毒性相容物质。
术语“预防”为本领域所公知的，且与涉及在病症(例如局部复发(如疼痛))、疾病(例如癌症)、综合征(例如心力衰竭)或任何其他医学病症使用时，其在本领域中是公知的，包括给药组合物，其与没有接受该组合物的受试者相比，其在受试者中降低了医学病症的症状的频率或延迟了其发作。因此，癌症的预防包括，例如，在接受预防性治疗的患者群中降低了可检测到的癌生长的数量(相对于未治疗的对照人群)，和/或在治疗的人群中延迟了可检测癌生长的出现(与未治疗的对照人群相比)，例如，具有统计学和/或临床显著性的量。感染的预防包括，例如，在治疗的人群中降低了诊断的感染的数量(与未治疗的对照人群相比)，和/或在治疗的人群中延迟了感染症状的发作(与未治疗的对照人群相比)。疼痛的预防包括，例如，在治疗的人群中降低了由该受试者觉察到的疼痛感的程度或者延迟了该感觉(与未治疗的对照人群相比)。
术语“预防性”或“治疗性”治疗为本领域所公知的，且指将药物给药至宿主。如果在不希望病症(例如，宿主动物的疾病或其它不希望状态)临床显现之前进行给药，则该治疗为预防性，即其保护宿主不会发展成该不希望病症，而如果在不希望病症显现之后进行给药，则该治疗为治疗性的(即意在减少、改善或维持现有的不希望病症或由其产生的副作用)。
术语“无热源(pyrogen-free)”在涉及组合物时，是指热源含量不会在已给药该组合物的受试者中导致有害作用(例如，刺激、发热、炎症、腹泻、呼吸窘迫、内毒素性休克等)的组合物。例如，该术语意包括不含或基本上不含诸如脂多糖(LPS)等内毒素的组合物。
细胞的“复制寿命”是指由单个“母细胞”所产生的子细胞数量。另一方面，“时序衰老(chronologicalaging)”或“时序寿命”是指一群不分裂的细胞当被除去养分时仍保持存活的时间长度。“增加细胞寿命”或“延长细胞寿命”当应用于细胞或生物体时，是指增加由一个细胞所产生的子细胞数量；增加细胞或生物体对抗应激及对抗损伤(例如对DNA、蛋白的应激和损伤)的能力；和/或增加细胞或生物体可于特别条件例如应激(如热休克、渗透压力、高能量照射、化学诱导的应激、DNA损伤、不合适的盐水平、不合适的氮水平或不充足的营养物水平)下存活和生存的状态存在较长时间的能力。使用本文中所述的方法，寿命可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％，或20％至70％、30％至60％、40％至60％或以上。
“调节沉默调节蛋白的化合物”是指增加沉默调节蛋白水平，和/或增加沉默调节蛋白的至少一种活性的化合物。在示例性的实施方式中，调节沉默调节蛋白的化合物可使沉默调节蛋白的至少一种生物活性增加至少约10％、25％、50％、75％、100％或以上。沉默调节蛋白的示例性生物活性包括例如组蛋白与p53的脱乙酰基化；延长寿命；增加基因组的稳定性；沉默转录作用；及调控母细胞与子细胞间的经氧化蛋白的分离。
蛋白包括脱乙酰化，例如，乙酰化肽底物。
“沉默调节蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族或优选指sir2家族的成员，其包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)及人SIRT1(GenBank登录编号NM_012238与NP_036370(或AF083106))与SIRT2(GenBank登录编号NM_012237、NM_030593、NP_036369、NP_085096与AF083107)蛋白。其它家族成员包括四种称作“HST基因”(Sir2的同系物)的其它酵母Sir2类基因HST1、HST2、HST3与HST4，及五种其它人同系物hSIRT3、hSIRT4、hSIRT5、hSIRT6与hSIRT7(Brachmann等人，(1995)GenesDev.9：2888及Frye等人(1999)BBRC260：273)。
“SIRT1蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶的Sir2家族的成员。在一些实施方式中，SIRT1蛋白包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)、人SIRT1(GenBank登录编号NM_012238或NP_036370(或AF083106))、小鼠SIRT1(GenBank登录编号NM_019812或NP_062786)及其等同物与片段。在另一个实施方式中，SIRT1蛋白包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT1蛋白包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本发明中的多肽也包括GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685的同源物(直向同源物(orthologs)与侧向同源物(paralogs))、变体或片段。
在此使用的“SIRT2蛋白”、“SIRT3蛋白”、“SIRT4蛋白”、“SIRT5蛋白”、“SIRT6蛋白”和“SIRT7蛋白”指的是其他的哺乳动物(例如人)的沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白(其与SIRT1蛋白同源)，尤其在约275氨基酸保守催化结构域。例如，“SIRT3蛋白”指的是沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族(其与SIRT1蛋白同源)的成员。在一个实施方式中，SIRT3蛋白包括人SIRT3(GenBank登录编号AAH01042、NP_036371或NP_001017524)与小鼠SIRT3(GenBank登录编号NP_071878)蛋白，及其等同物与片段。在一些实施方案中，SIRT4蛋白包括人SIRT4(GenBank登录编号NM_012240或NP_036372)。在一些实施方案中，SIRT5蛋白包括人SIRT5(GenBank登陆编号NM_012241或NP_036373)。在一些实施方案中，SIRT6蛋白包括人SIRT6(GenBank登录编号NM_016539或NP_057623)。在另一个实施方式中，SIRT3蛋白包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT3蛋白包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本发明中的多肽也包括GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878的同源物(直向同源物与侧向同源物)、变体或片段。在一些实施方式中，SIRT3蛋白包括以线粒体基质加工肽酶(MPP)和/或线粒体中间体肽酶(MIP)裂解而产生的SIRT3蛋白片段。
本文中所使用的术语“立体异构体”为本领域所公知的，且指具有任意两个或多个异构体(其具有相同分子组成且仅在空间上它们的原子的三维排列不同)。当在文中用于描述化合物或通式化合物时，立体异构体包括该化合物的任一部分或全部化合物。例如，非对映异构体和对映异构体是立体异构体。
术语“全身性给药”和“全身地给药”为本领域所公知的，且指将主题组合物、治疗剂或其它物质肠内给药或肠胃外给药。
本文中使用的术语“互变异构体”为本领域所公知的，且指由互变异构现象造成可能存在的任一可能的结构式变化，其指的是构造异构形式，其中结构可以以两种或多种构造排列形式存在，尤其是在连接至氧的氢的位置方面。当在文中用于描述化合物或通式化合物时，进一步理解“互变异构体”是容易互相转变的且处于平衡状态。例如，酮式和烯醇式互变异构体以一定的比例存在，这取决于给定条件或设定条件下的平衡位置：
术语“治疗剂”为本领域所公知的，且是指可于受试者内局部或全身性起作用的生物学、生理学或药理学活性物质。该术语也是指欲用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的任何物质，或用于增进动物或人的希望的身体或精神发育和/或状况的物质。
术语“治疗功效”为本领域所公知的，且指动物(特别是哺乳动物，且更特别地为人)中由药理学活性物质产生的有益的局部或全身性功效。术语“治疗上有效量”是指，使物质能以任何治疗的合理效益/风险比应用的，产生某种所希望的局部或全身功效的量。此类物质的治疗上有效量将随欲受治疗的受试者与疾病状况、受试者的体重与年龄、疾病状况的严重度、给药方式等而有所变化，其可由本领域普通技术人员容易地确定。例如，本文所述的一些组合物能以此治疗的合理效益/风险比应用的产生所希望功效的足够量来进行给药。
“治疗”病症或疾病是指治愈以及改善该病症或疾病的至少一种症状。
术语“视力损伤”是指视力减弱，其在进行治疗(例如手术)时往往仅部分可逆或不可逆。特别严重的视力损伤称为“盲”或“视力丧失”，其是指视力完全丧失、视力差于20/200以致无法经由矫正镜片改善，或视野小于20度直径(10度半径)。
2.化合物
在一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防一系列的疾病与病症的新化合物，上述疾病与病症包括例如与老化或应激反应有关的疾病或障碍、糖尿病、肥胖症、神经变性疾病、眼疾病与病症、心血管疾病、血液凝固病症、炎症、癌症和/或潮红(flushing)等。主题化合物，例如增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，也可用于治疗患者中因线粒体活性增加而受益的疾病或障碍，用于增进肌肉机能，用于增加肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或缺血相关的肌肉组织损伤。本文中所公开的化合物可适用于本文中所公开的药物组合物，和/或一种或多种方法。
在一些实施方案中，本发明的化合物由结构式(I)表示：
本发明包括结构式(I)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)和(IV)的任意化合物或上文提及的其他化合物的药物组合物。结构式(I)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)和(IV)的化合物的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明的调节沉默调节蛋白的化合物由结构式(I)表示：
或其盐，其中：
m为1或2；
n为2或3；
p为0至4；
R1选自碳环和杂环，其中R1任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基、-C≡N、-Y、-X-C(＝O)-Y、-X-O-Y、-X-OR4、-X-C(＝O)-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-Y-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-O-Y、-X-NR3R3、＝O、-NH-S(＝O)2-R3、-S(＝O)2-R3、-S-R3、-(C3-C7)环烷基、-C(＝N)-NR3R3、-C(＝N)-NH-X-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-Y、-C(＝O)-NH-X、-NH-X、苯基、-O-苯基、3至6元饱和或不饱和杂环和-O-(5至6元饱和杂环)，其中R1的任意苯基、3至6元饱和或不饱和杂环或-O-5至6元饱和杂环取代基在任意可取代的碳原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-OR4、-X-O-Y、-CF3、-Y、-X–R3R3、-X-NH-C(＝O)-Y-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-O-Y-(5至6元饱和杂环或碳环)、-X-C(＝N)-NR3R3和-S-Y，以及在任意可取代的氮原子处任选地被选自以下的取代基取代：-Y、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-C(＝O)-OR4、-Y-C(＝O)-Y-NR3R3、-Y-NH-C(＝O)-O-Y、-Y-NH-C(＝O)-OR4、-Y-NH2、-C(＝O)-NH-Y或-C(＝O)-3至5元饱和的碳环取代；
R2选自碳环和杂环，其中R2任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基、-C≡N、-Y、-X-OR4、-X-O-Y、-SO2-R3、-X-NR3R3、-NH-S(＝O)2R3、-C(＝O)-NR3R3、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-SO2-Ry、-SO2-NH-Ry、-SO2-NR3R3、3至6元饱和碳环或杂环和苯基，其中R2的任意3至6元饱和杂环取代基在任意碳原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-CF3、-Y、-X-O-Y、-NH-Y和-N(Y)2，并在任意氮原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：-C(＝O)-O-Y、-Y和-C(＝O)-Y，并且当R2为N连接的5至7元饱和或不饱和杂环时，其在任意氮原子处进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：-C(＝O)-O-Y、-Y和-C(＝O)-Y；
各R3独立地选自：氢、-C(＝N)-NH2、-C(＝O)-Y、-Y、-Y-NH-C(＝O)-O-Y、-Y-NH-C(＝O)-OH、-Y-NH-C(＝O)-CF3、-C(＝O)-Y-3至5元饱和杂环、-C(＝O)-O-Y-(3至5元饱和杂环)、-C(＝O)-CF3、-C(＝O)-O-Y、-C(＝O)-OH、-C(＝O)-O-CF3、-S(＝O)2-Y、-S(＝O)2-OH；
两个R3与它们所连接的氮或碳原子一起形成4-至8-元饱和杂环，其任选地包含独立地选自以下的一个额外的杂原子：N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O，其中由两个R3形成的杂环在任意碳原子处任选地被一个或多个OH、卤素、Y、NH2、NH-Y、N(Y)2、O-Y取代，以及在任意可取代的氮原子处任选地被C(＝O)-O-Y、Y或C(＝O)-Y取代；
各R4独立地选自：氢、Y、-CF3、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-Y-C(＝O)-Y或-Y-C(＝O)-O-Y；
R5和R6独立地选自：氢、-OH、-OCF3、-O-Y、-O-C(＝O)-Y、-O-C(＝O)-O-Y、-O-C(＝O)-NH-Y、-O-C(＝O)-N(Y)2、-O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环，其中R5和R6中的仅一个为O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环，且当R5或R6为O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环时，其进一步被卤素、-OH、Y、-O-Y、-OCF3或-O-C(＝O)-Y取代；或
R5和R6可与它们所连接的碳原子一起形成＝O；
R7和R8独立地选自：氢、卤素、-OH、-O-Y和Y；
R9选自氢、卤素、-OH、-OCF3、-O-Y、Y、-O-C(＝O)-Y、-NH-Y和-N(Y)2；
各X为C0-C5直链或支链烷基、烯基或炔基；和
各Y为C1-C5直链或支链烷基、烯基或炔基；
其中任意Y或X任选地被一个或多个-OH、-C1-C4直链或支链烷基、-C1-C4烯基、-C1-C4炔基、-O-(C1-C4烷基)、-O-(C1-C4烯基)、-O-(C1-C4炔基)、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4烯基、-C(＝O)-C1-C4炔基、-C(＝O)-O-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-O-C1-C4烯基、-C(＝O)-O-C1-C4炔基、卤素、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-(C1-C3直链或支链烷基)-NH-(＝NH)-NH2、-NH(烷氧基-取代的C1-C4烷基)、-NH(羟基-取代的C1-C4烷基)、-N(烷氧基-取代的C1-C4烷基)(羟基-取代的C1-C4烷基)、-N(羟基-取代的C1-C4烷基)2或-N(烷氧基-取代的C1-C4烷基)2取代。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于该结构由结构式(IIa)所代表：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于该结构由结构式(IIIa)所代表：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于该结构由结构式(IIb)或(IIIb)所代表：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于该结构由结构式(IV)所代表：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于具有p＝0(即，在C(O)-NH和R1之间无亚甲基)。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于具有p＝1-4(即，在C(O)-NH和R1之间有1-4个亚甲基)。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于具有选自以下的–(CH2)p-R1基团：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R1基团为苯基、饱和或不饱和的5至6元杂环、或稠和双环8-至11-元饱和或不饱和的碳环或杂环。
在具体实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R1为稠和双环8-至11-元饱和或不饱和杂环。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R1基团选自以下任意一个：
在具体实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R1基团选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R2基团选自5至7元饱和碳环或杂环、N连接的杂环和8-至11-元饱和或不饱和杂环。
在具体实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R2基团为N连接的5至7元饱和或不饱和杂环。
在上述一些实施方案中，上述化合物选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R2基团为稠和双环8-至11-元饱和或不饱和杂环。
在上述一些实施方案中，上述化合物选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R2基团选自任意一个：
在具体实施方案中，结构式(I)的化合物或盐的特征在于R2基团选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物或盐选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(IIa)的化合物或盐选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(IIIa)的化合物或盐选自以下任意一个：
在一些实施方案中，结构式(IIb)的化合物或盐选自：
在一些实施方案中，结构式(IIIb)的化合物或盐选自：
在一些实施方案中，结构式(IV)化合物或盐选自以下的任意一个：
本发明化合物，包括新的本发明化合物，也可用于本文所述的药物组合物和方法中。
在任一前述实施方案中，C1-C4烷氧基-取代的基团可包括一个或多个烷氧基取代基，例如一个、两个或三个甲氧基，或甲氧基和乙氧基，例如。示例性的C1-C4烷氧基取代基包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。
在任一前述实施方案中，羟基-取代的基团可包括一个或多个羟基取代基，例如两个或三个羟基基团。
在任一前述实施方案中，“卤素-取代的”基团包括一个卤素取代基至最多至全卤代取代基。示例性的卤素-取代的C1-C4烷基包括CFH2、CClH2、CBrH2、CF2H、CCl2H、CBr2H、CF3、CCl3、CBr3、CH2CH2F、CH2CH2Cl、CH2CH2Br、CH2CHF2、CHFCH3、CHClCH3、CHBrCH3、CF2CHF2、CF2CHCl2、CF2CHBr2、CH(CF3)2和C(CF3)3。全卤代的C1-C4烷基(例如)包括CF3、CCl3、CBr3、CF2CF3、CCl2CF3和CBr2CF3。
在任一前述实施方案中，“碳环”可以指单环碳环实施方案和/或多环碳环实施方案，例如稠合的、桥连的或双环碳环实施方案。本发明的“碳环”基团可进一步指芳香碳环实施方案和/或非芳香碳环实施方案，或在多环实施方案的情况下，具有一个或多个芳香环和/或一个或多个非芳香环两者的碳环。多环碳环实施方案可为双环、稠合环或桥连双环。非限制性的示例性的碳环包括苯基、环己烷、环戊烷或环己烯、金刚烷胺、环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘、金刚烷、十氢化萘、萘、1,2,3,4-四氢萘、降莰烷、十氢化萘、螺戊烷、二甲金刚烷胺(memantine)、吡派立登(biperiden)、金刚乙胺(rimantadine)、樟脑、胆甾醇、4-苯基环己醇、双环[4.2.0]辛烷、二甲金刚烷胺和4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。
在任一前述实施方案中，“杂环”基团可以指单环杂环实施方案和/或多环杂环实施方案，例如稠合的、桥连的或双环杂环实施方案。本发明的“杂环”基团可以进一步指芳香杂环实施方案和/或非芳香杂环实施方案，或在多环实施方案的情况下，具有一个或多个芳香环和/或一个或多个非芳香环两者的杂环。多环杂环实施方案可为双环环、稠合环或桥连环。非限制性的示例性杂环包括吡啶、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、嘧啶、苯并呋喃、吲哚、喹啉、内酯、内酰胺、苯并二氮杂环庚三烯、吲哚、喹啉、嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑、环六亚甲基四胺(hexamine)和乌洛托品(methenamine)。
本发明的一些化合物可以以特定的几何异构或立体异构形式存在。本发明包括所有的此类化合物，包括顺式-和反式-异构体、(R)-和(S)-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物，和它们的其他混合物，如落入本发明范围内的那些。其他的不对称碳原子可存在于取代基(例如烷基)中。所有此类异构体及其混合物均包括于本发明中。
本文中所述的化合物及其盐也可以相应的水合物(例如，半水合物、单水合物、二水合物、三水合物、四水合物)或溶剂合物存在。用于制备溶剂合物和水合物的适宜溶剂通常可由本领域技术人员选择。
该化合物及其盐可以以无定形或结晶(包括共晶体和多晶型)形式存在。
本发明的调节沉默调节蛋白的化合物有利地调节沉默调节蛋白的水平和/或活性，尤其是沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性。
独立地或除了上述性质外，本发明的调节沉默调节蛋白的化合物基本上不具有一个或多个下列活性：抑制PI3-激酶、抑制糖醛还原酶(aldoreductase)、抑制酪氨酸激酶、转活化EGFR酪氨酸激酶、冠状动脉扩张或解痉活性，以有效调节沉默调节蛋白(例如，SIRT1和/或SIRT3蛋白)的脱乙酰化活性的浓度。
“烷基”或“烷烃”是完全饱和的直链的或支链的非芳香烃基。典型地，直链的或支链的烷基具有1至大约20个碳原子，优选具有1至大约10个碳原子，除非另有说明。直链的和支链的烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基和辛基。C1-C4直链的或支链的烷基也称为"低级烷基"。
术语“烯基”(“烯烃”)和“炔基”(“炔烃”)指的是不饱和的脂肪族基团在长度上的同系物，且是对上述的烷基的可行取代，但各自包含至少一个双键或叁键。
术语“芳香碳环”指的是包含至少一个芳香环的芳香性烃环体系。该环可稠合至或连接至其他的芳香碳环上或非芳香碳环上。芳香碳环基团的实例包括碳环芳香基团例如苯基、萘基和蒽基。
“氮杂双环”指的是在环骨架中包含氮原子的双环分子。双环的两个环可以在两个互相键接的原子处稠合，例如吲哚，跨越一系列的原子稠合，例如氮杂双环[2.2.1]庚烷，或在单个原子处连接，例如，螺环。
“双环”或“双环的”指的是二环体系，其中这两个环之间共享一个、两个或三个或多个原子。双环包括稠合双环，其中两个相邻的原子被这两个环各自所共享，例如，十氢化萘、吲哚。双环也包括螺双环，其中两个环共享一个原子，例如，螺[2.2]戊烷、1-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛烷。双环还包括桥连的双环，其中至少三个原子被两个环所共享，例如，降莰烷。
“桥连双环”化合物为双环体系，其中至少三个原子被该体系的两个环均共享，即它们包括连接两个桥头原子的一个或多个原子的至少一个桥。桥连的氮杂双环指的是在至少一个环中包含氮原子的桥连的双环分子。
术语“Boc”是指叔丁基氧基羰基(常用的胺保护基)。
在此使用的术语“碳环”和“碳环的”指的是饱和的或不饱和的环，其中该环的各个原子是碳。术语碳环包括芳香碳环和非芳香碳环两者。非芳香碳环包括环烷烃环(其中所有的碳原子是饱和的)和环烯烃环(其包含至少一个双键)两者。“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环的各个环可选自非芳香和芳香环。碳环包括双环分子，其中一个、两个或三个或多个原子被这两个环所共享。术语“稠合碳环”指的是其中该环的各个环与另一个环共享两个相邻的原子的双环碳环。稠合碳环的各个环可选自非芳香和芳香环。在示例性的实施方案中，芳香环(例如苯基)可以稠合至非芳香或芳香环，例如，环己烷、环戊烷或环己烯。非芳香和芳香双环的任一组合(只要价键允许)包括于碳环的定义中。示例性的“碳环”包括环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性的稠合碳环包括十氢化萘、萘、1,2,3,4-四氢萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可在任一个或多个能够带氢原子的位置被取代。
“环烷基”基团为完全饱和(非芳香)的环状烃基。典型地，环烷基具有3至大约10个碳原子，更典型地3至8个碳原子，除非另有规定。“环烯基”基团为包含一个或多个双键的环状烃基。
“卤素”表示F、Cl、Br或I。
“卤素-取代”或“卤代”表示一个或多个氢被F、Cl、Br或I替换。
术语“杂芳基”或“芳香杂环”包括取代的或未取代的芳香单环结构，优选地5至7-元环，更优选地5至6元环，其中环结构包括至少一个杂原子，优选地1-4个杂原子，更优选地1或2个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有其中至少一个环为杂芳香环(例如)且另一环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳香碳环、杂芳基和/或杂环基的一个或两个环的环体系。杂芳基包括，例如，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶。
本文中使用的术语“杂环”和“杂环的”指的是非芳香或芳香环，其包含一个或多个选自例如N、O、B和S原子，优选N、O或S的杂原子。术语“杂环”包括“芳香杂环”和“非芳香杂环”两者。杂环包括4-7元单环和8-12元双环。杂环包括双环分子，其中一个、两个或三个或多个原子为两个环所共享。双环杂环的各个环可以选自非芳香和芳香环。术语“稠合杂环”指的是双环杂环，其中每个环与其他环共享两个相邻的原子。稠合杂环的各个环可选自非芳香和芳香环。在示例性的实施方案中，芳香环(例如吡啶基)可以稠合至非芳香或芳香环，例如环己烷、环戊烷、吡咯烷、2,3-二氢呋喃或环己烯。“杂环”基团包括，例如，哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、嘧啶、苯并呋喃、吲哚、喹啉、内酯和内酰胺。示例性的“稠合杂环”包括苯并二氮杂环庚三烯、吲哚、喹啉、嘌呤和4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑。“杂环”可在任一个或多个能够带氢原子的位置被取代。
“单环”包括5-7元芳香碳环或杂芳基、3-7元环烷基或环烯基，和5-7元非芳香杂环基。示例性的单环基团包括取代的或未取代的杂环或碳环，例如，噻唑基、唑基、嗪基、噻嗪基、二硫杂环己烷基、二烷基、异唑基、异噻唑基、三唑基、呋喃基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、吡喃基、四唑基、吡唑基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、吡啶基、吡咯基、二氢吡咯基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基、吗啉基、四氢噻吩基、噻吩基、环己基、环戊基、环丙基、环丁基、环庚基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、氮杂环丙烷基和硫吗啉基。
如在此使用的“取代的”指的是用不是氢的原子或分子替换结构中的氢原子。可取代的原子(例如“可取代的氮”)是带有处于至少一种共振形式的氢原子的原子。氢原子可以被取代为另一原子或基团，如CH3或OH基团。例如，哌啶分子中的氮是可取代的(如果该氮原子连接至氢原子)。例如，如果哌啶的氮连接至非氢的原子，则该氮是不可取代的。在任何共振形式不可能带有氢原子的原子是不可取代的。
本发明预计的取代基与变体的组合仅是形成稳定化合物的那些。本文所使用的术语“稳定的”是指化合物具有允许其制备的足够稳定性，且可使该化合物的完整性维持足够时间以用于本文中所详述的目的。
本文中所公开的化合物也包括经部分及完全氘代的变体。在一些实施方案中，氘代的变体可用于动力学研究。本领域普通技术人员可选择所述氘原子存在的部位。
本发明也包括本文所述的化合物的盐类，特别是药学上可接受的盐类。具有足够酸性、足够碱性或该二性的官能团的本发明化合物，可以和许多的无机碱类、及无机与有机酸类中的任一种反应形成盐类。或者，固有带电荷的化合物(例如具有季氮的化合物)可和适当抗衡离子(例如，卤离子如溴离子、氯离子或氟离子，特别是溴离子)形成盐。
一般用于形成酸加成盐的酸类为无机酸类，例如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，及有机酸类，例如对-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、酸式硫酸盐、亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、酞酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
碱加成盐包括衍生自无机碱类，例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等的那些盐。因此此类可用于制备本发明盐类的碱类包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
根据另一实施方案，本发明提供制备前述定义的调节性化合物的方法。这些化合物可使用通用技术合成。有利地，这些化合物可由容易获得的起始物料方便地合成。
用于合成本文所述沉的化合物的合成化学转化作用与方法在本领域中是已知的，且包括，例如描述于R.Larock，ComprehensiveOrganicTransformations(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，第二版，(1991)；L.Fieser与M.Fieser，FieserandFieser’sReagentforOrganicSynthesis(1994)；及L.Paquette编著，EncyclopediaofReagentforOrganicSynthesis(1995)中的那些化学转化作用与方法。
在一个示例性的实施方案中，该治疗性化合物可能穿过细胞的胞质膜。例如，化合物可具有至少约20％、50％、75％、80％、90％或95％的细胞-通透性。
本文所述的化合物也可具有一个或多个下列特性：该化合物可基本上对细胞或受试者无毒性；该化合物可为有机分子或具有2000amu或小于2000amu，1000amu或小于1000amu的小分子；该化合物可于正常大气条件下具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；该化合物于溶液中可具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；该化合物可于溶液中，较白藜芦醇稳定至少约50％、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍；该化合物可促进DNA修复因子Ku70的脱乙酰基化作用；该化合物可促进RelA/p65的脱乙酰基化作用；该化合物可增加一般转换率，及增强细胞对TNF-所诱发细胞凋亡的敏感性。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物在(例如体内)有效调节沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制第I类组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)、和/或第II类HDAC的任何实质能力。例如，在优选的实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物为以下调节沉默调节蛋白的化合物，选择那些具有对活化沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的EC50值，所对应的活性是抑制HDACI和/或HDACII的EC50值的至少5倍，且甚至优选至少10倍、100倍或甚至1000倍的调节沉默调节蛋白的化合物。用于分析HDACI和/或HDACII活性的方法为本领域所熟知，且进行此类分析的试剂盒可市场上购得。参见例如，BioVision，Inc.(MountainView，CA；网址biovision.com)及ThomasScientific(Swedesboro，NJ；网址thomassci.com)。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物不具有调节沉默调节蛋白同系物的任何实质能力。在一些实施方案中，人沉默调节蛋白的活化剂，在(例如活体内)有效活化人沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，可能不具有活化得自低等真核生物，特别是酵母或人病原体的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，调节沉默调节蛋白的化合物可选择具有对于活化人沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3)脱乙酰基酶活性的EC50值，所对应的活性为活化酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的EC50值的至少5倍，且甚至更优选至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在另一实施方案中，得自低等真核生物(特别是酵母或人病原体)的沉默调节蛋白的抑制剂，在(例如活体内)有效抑制得自低等真核生物的沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制得自人的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的抑制性化合物可选择具有对于抑制人沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3)的脱乙酰基酶活性的IC50值，是抑制酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的IC50值的至少5倍，且甚至更优选至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可具有调节一种或多种沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的能力。在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物具有调节SIRT1及SIRT3蛋白的能力。
在其它实施方案中，SIRT1调节剂在(例如活体内)有效调节人SIRT1的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有调节其它沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的任何实质能力。例如，调节沉默调节蛋白的化合物可选择具有对于调节人SIRT1脱乙酰基酶活性的ED50值，所对应的活性为调节一种或多种人SIRT2、SIRT3、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值的至少5倍，且甚至更优选至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一些实施方案中，SIRT1调节剂不具有调节SIRT3蛋白的任何实质能力。
在其它实施方案中，SIRT3调节剂在有效调节人SIRT3的脱乙酰基酶活性的浓度(例如，在体内)不具有任何调节其它沉默调节蛋白蛋白同源物(例如人SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7中的一个或多个)的实质能力。例如，调节沉默调节蛋白的化合物可选择具有对于调节人SIRT3脱乙酰基酶活性的ED50值，所对应的活性为调节一种或多种人SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值的至少5倍，且甚至更优选至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一个实施方案中，SIRT3调节剂不具有调节SIRT1蛋白的任何实质能力。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可具有对于沉默调节蛋白的结合亲和力约10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或以下。调节沉默调节蛋白的化合物可减少(活化剂)或增加(抑制剂)沉默调节蛋白对于其底物或NAD+(或其它辅因子)的表观Km值达至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。在一些实施方案中，Km值使用本文所述的质谱分析测定。优选的活化化合物减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，至较由白藜芦醇在相似浓度下所引起的更大的程度，或减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，相似于由白藜芦醇在较低浓度下所引起的Km值。调节沉默调节蛋白的化合物可增加沉默调节蛋白的Vmax值至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。调节沉默调节蛋白的化合物可具有对于调节SIRT1和/或SIRT3蛋白的脱乙酰基酶活性的ED50值少于约1nM，少于约10nM，少于约100nM，少于约1μM，少于约10μM，少于约100μM，或从约1-10nM，从约10-100nM，从约0.1-1μM，从约1-10μM或从约10-100μM。调节沉默调节蛋白的化合物可调节SIRT1和/或SIRT3蛋白的脱乙酰基酶活性达至少约5、10、20、30、50或100倍，通过细胞分析或以细胞为基础的分析(cellbasedassay)测定。调节沉默调节蛋白的化合物可诱导沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性，相对于相同浓度的白藜芦醇为至少约10％、30％、50％、80％、2倍、5倍、10倍、50倍或100倍。调节沉默调节蛋白的化合物可具有对于调节SIRT5的ED50值，较对于调节SIRT1和/或SIRT3的ED50值的至少约10倍、20倍、30倍、50倍。
3.示例性的用途
在一些方面，本发明提供用于调节沉默调节蛋白的水平和/或活性的方法，及其使用方法。
在一些实施方案中，本发明提供使用调节沉默调节蛋白的化合物的方法，其中调节沉默调节蛋白的化合物活化沉默调节蛋白，例如增加沉默调节蛋白的水平和/或活性。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于各种治疗应用，包括例如增加细胞寿命，及治疗和/或预防许多种疾病与病症，包括例如与老化或应激有关的疾病或障碍、糖尿病、肥胖、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝固病症、炎症、癌症和/或潮红等。该方法包含将药学上有效量的调节沉默调节蛋白的化合物，例如调节沉默调节蛋白的化合物给药于对其有需要的患者。
不希望受限于理论，但相信本发明的活化剂可在沉默调节蛋白内的相同部位(例如，活性位置或影响该活性位置的Km或Vmax的位置)与沉默调节蛋白相互作用。认为此即一些类沉默调节蛋白的活化剂与抑制剂为何能具有实质结构相似性的原因。
在一些实施方案中，本文中所述的调节沉默调节蛋白的化合物可单独使用或与其它化合物组合使用。在一些实施方案中，可将两种或更多种调节沉默调节蛋白的化合物的混合物给药于对其有需要的受试者。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与一种或多种下列化合物一起给药：白藜芦醇、紫铆花素、非瑟素、白皮杉醇(piceatannol)或槲皮素。在一个示例性的实施方案中，将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物与烟酸或烟酰胺核糖苷组合给药。在另一个实施方案中，减少沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与一种或多种下列化合物一起给药：烟酰胺(NAM)、舒拉宁(suranim)；NF023(一种G-蛋白拮抗剂)；NF279(一种嘌呤能受体拮抗剂)；托洛索(Trolox)(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸)；(-)-表没食子儿茶酚(羟基位于位置3,5,7,3',4',5')；(-)-表没食子儿茶酚没食子酸酯(羟基位置5,7,3',4',5'，且没食子酸酯位于位置3)；氯化花青素(3,5,7,3',4'-五羟基氯化黄(flavylium)盐)；氯化翠雀色素(3,5,7,3',4',5'-六羟基氯化黄盐)；杨梅黄酮(大麻双酮；3,5,7,3',4',5'-六羟基黄酮)；3,7,3',4',5'-五羟基黄酮；棉黄素(3,5,7,8,3',4'-六羟基黄酮)、sirtinol；及splitomicin。在另一实施方案中，一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物可与一种或多种用于治疗或预防各种疾病包括例如癌症、糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝固、炎症、潮红、肥胖、老化、应激等的治疗剂一起进行给药。在多种实施方案中，包含调节沉默调节蛋白的化合物的组合疗法可涉及(1)包含一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种治疗剂(例如，一种或多种于本文中所描述的治疗剂)的药物组合物；及(2)一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种治疗剂的共同给药，其中所述调节沉默调节蛋白的化合物与治疗剂尚未配制在同一组合物中(但是可存在于相同试剂盒或包装，例如泡罩包装或其它多隔室包装内；存在于可由使用者自行分开的相连结的、分别密封的容器(例如锡箔小袋)内；或存在于其中该化合物与其它治疗剂处于分开的容器中的试剂盒内)。当使用分开的制剂时，调节沉默调节蛋白的化合物可与另一治疗剂的给药同时、间歇、交错、在其之前、在其之后，或这些方式的组合进行给药。
在一些实施方案中，使用本文所述的化合物以减轻、预防或治疗疾病或障碍的方法，也可包括增加沉默调节蛋白(例如人SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白水平。增加蛋白水平可通过将编码沉默调节蛋白的一个或多个核酸拷贝引入细胞中而完成。例如，可通过将编码沉默调节蛋白的核酸引入哺乳动物细胞中，而增加哺乳动物细胞中沉默调节蛋白的水平，例如通过将编码列示于GenBank登录编号NP_036370中的氨基酸序列的核酸引入，而增加SIRT1的水平，和/或通过将编码列示于GenBank登录编号AAH01042中的氨基酸序列的核酸引入，而增加SIRT3的水平。
经引入细胞中以增加沉默调节蛋白水平的核酸，可编码与沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的序列至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的蛋白。例如，编码该蛋白的核酸可与编码SIRT1(例如GenBank登录编号NM_012238)和/或SIRT3(例如GenBank登录编号BC001042)蛋白的核酸至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。核酸也可为优选于严格杂交条件下与编码野生型沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的核酸杂交的核酸。严格杂交条件可包括在0.2×SSC中于65℃下杂交并且清洗。当使用编码与野生型沉默调节蛋白不同的蛋白(例如其为野生型沉默调节蛋白的片段的蛋白)的核酸时，该蛋白优选是生物学活性的，例如能够进行脱乙酰基化作用。仅需要在细胞中表达沉默调节蛋白具有生物学活性的部分。例如，与具有GenBank登录编号NP_036370的野生型SIRT1不同的蛋白，优选含有其核心结构。该核心结构有时指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸237至932编码，其包含NAD结合以及底物结合结构域。SIRT1的核心结构域也可指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。可根据本领域已知的方法测定蛋白是否保留生物功能，例如脱乙酰基化能力。
在一些实施方案中，使用调节沉默调节蛋白的化合物以减轻、预防或治疗疾病或障碍的方法，也可包括降低沉默调节蛋白(例如人SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白水平。降低沉默调节蛋白水平可根据本领域已知的方法实现。例如，可于细胞中表达靶向沉默调节蛋白的siRNA、反义核酸或核酶。也可使用显性阴性(dominantnegative)的沉默调节蛋白的突变体，例如不能进行脱乙酰基化的突变体。例如，可使用经描述于例如Luo等人(2001)Cell107：137中的SIRT1突变体H363Y。或者，可使用抑制转录作用的试剂。
用于调节沉默调节蛋白水平的方法也包括调节编码沉默调节蛋白的基因转录作用的方法，稳定化/去稳定化相对应mRNA的方法，及本领域已知的其它方法。
老化/应激
在一个方面，本发明提供通过将细胞与本发明的增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物接触，而延长细胞寿命、增加细胞增殖能力、减缓细胞老化、促进细胞存活、延迟细胞衰老、模拟摄热量限制功效、增加细胞对应激的抗性或防止细胞凋亡的方法。在一个示例性的实施方案中，该方法包含将细胞与调节沉默调节蛋白的化合物接触。
本文所述的方法可用于增加细胞、特别是初生细胞(即得自生物体，例如人的细胞)在细胞培养物中可保持存活的时间量。胚胎干细胞(ES)与多潜能细胞(pluripotentcell)及由其分化的细胞，也可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物来处理，以使细胞或其子代在培养物中保持较长的时间。此类细胞也可用于例如在进行离体修饰(exvivomodification)后移植入受试者中。
在一个方面，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物处理要长时间保存的细胞。细胞可存在于悬浮液(例如血细胞、血清、生物学生长培养基等)中，或存在于组织或器官中。例如，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物处理收集自个体的供输血的血液，使血细胞保存较长的时间。此外，用于法医目的血液也可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物进行保存。其它可经处理以延长其寿命或保护其对抗凋亡的细胞，包括供消耗的细胞例如得自非人哺乳动物的细胞(例如肉类)，或植物细胞(例如蔬菜)。
也可在哺乳动物、植物、昆虫或微生物的发育及生长期施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，以例如改变、减缓或加速发育和/或生长过程。
在另一个方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于处理用于供移植或细胞疗法的细胞，包括例如固体组织移植物、器官移植物、细胞悬浮液、干细胞、骨髓细胞等。细胞或组织可为自体移植物、同种异基因移植物(allograft)、同种同基因移植物(syngraft)或异种移植物。可将细胞或组织于给药/植入之前、于给药/植入的同时、和/或于给药/植入受试者之后，以调节沉默调节蛋白的化合物进行处理。可将细胞或组织于从供给者个体取出之前、于从供给者个体取出后离体地(exvivo)、或于植入接受体之后进行处理。例如，可用调节沉默调节蛋白的化合物对供给者或接受体个体进行全身性处理，或用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物对细胞/组织的子集(subset)进行局部性处理。在一些实施方案中，可另外地用另一种用于延长移植物存活的治疗剂，例如免疫抑制剂、细胞因子、血管生成因子等处理细胞或组织或供给者/接受者个体。
在其它的实施方案中，可在体内用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物处理细胞，以增加其寿命或防止细胞凋亡。例如，可通过用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物来处理皮肤或表皮细胞，而保护皮肤以防老化(例如，形成皱纹、丧失弹性等)。在一个示例性的实施方案中，将皮肤与包含增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物的药物组合物或化妆品组合物接触。可根据本文所述方法处理的示例性皮肤疾病或皮肤病症，包括与炎症、晒伤或自然老化相关或由其引起的病症或疾病。例如，组合物可用于预防或治疗接触性皮炎(包括刺激性接触性皮炎与过敏性接触性皮炎)、特应性皮炎(也称作变应性湿疹)、光化性角化病、角质化病症(包括湿疹)、大疱性表皮松解病(包括天疱疮)、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、红斑(包括多形红斑与结节性红斑)、由日晒或其它光源引起的损伤、盘状红斑性狼疮、皮肌炎、银屑病、皮肤癌及自然老化作用。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗创伤和/或烧伤以促进愈合，包括例如第一度、第二度或第三度烧伤和/或热烧伤、化学烧伤或电烧伤。可将制剂局部地给药至皮肤或粘膜组织。
包含一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物的局部制剂，也可用作为预防性(例如化学预防性)组合物。当使用于化学预防性方法中时，在特定个体中出现可见病症之前处理易感染的皮肤。
可将调节沉默调节蛋白的化合物局部或全身性地递送至受试者。在一个实施方案中，通过注射、局部制剂等，将调节沉默调节蛋白的化合物局部地给药至受试者的组织或器官。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防因受试者中细胞衰老所诱发或加重的疾病或障碍；用于减低受试者衰老速度(例如在开始衰老之后)的方法；用于延长受试者寿命的方法；用于治疗或预防与寿命有关的疾病或障碍的方法；用于治疗或预防与细胞增殖能力有关的疾病或障碍的方法；及用于治疗或预防由细胞损伤或死亡所导致的疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，该方法并非通过减低那些缩短受试者寿命的疾病的发生率而起作用。在一些实施方案中，该方法并非通过减低由疾病(例如癌症)所引起的致死率而起作用。
在另一个实施方案中，为了一般性地增加受试者的细胞寿命以及为了保护其细胞对抗应激和/或对抗凋亡的目的，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于受试者。可以相信以本文所述的化合物治疗受试者，类似于使受试者经历毒物刺激作用(hormesis)即，对生物体有益且可延长其寿命的温和应激。
可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于受试者，以预防老化及与老化有关的后果或疾病，例如中风、心脏病、心脏衰竭、关节炎、高血压及阿尔茨海默病。其它可被治疗的病症包括眼疾病，例如与眼睛老化有关的眼病症，例如白内障、青光眼及黄斑变性。也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于受试者，用来治疗与细胞死亡有关的疾病，例如慢性疾病，以保护细胞不死亡的目的。示例性疾病包括那些与神经细胞死亡、神经元功能障碍、或肌肉细胞死亡或功能障碍有关的疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(amniotropiclateralsclerosis)与肌肉营养不良；AIDS；暴发性肝炎；与脑退化相关的疾病，例如克-雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、色素性视网膜炎与小脑变性；脊髓发育不良例如再生障碍性贫血；缺血性疾病例如心肌梗塞与中风；肝病例如酒精性肝炎、乙型肝炎与丙型肝炎；关节疾病例如骨关节炎；动脉粥样硬化；脱发；由UV光引起的皮肤损伤；扁平苔藓；皮肤萎缩；白内障；以及移植物排斥。细胞死亡也可由手术、药物治疗、化学品接触或放射接触所引起。
也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于患有急性疾病，例如器官或组织伤害的受试者，例如患有中风或心肌梗塞的受试者，或罹患脊髓损伤的受试者。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于修复酒精性肝(alcoholic’liver)。
心血管疾病
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗和/或预防心血管疾病的方法，其通过将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于有需要的受试者。
可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物治疗或预防的心血管疾病，包括心肌病或心肌炎，例如特发性心肌病、代谢性心肌病、酒精中毒性心肌病、药物引发的心肌病、缺血性心肌病及高血压性心肌病。也可使用本文所述化合物与方法治疗或预防的疾病为例如主动脉、冠状动脉、颈动脉、脑血管动脉、肾动脉、髂动脉、股动脉及腘动脉(poplitealarteries)等主要血管的粥样硬化病症(大血管疾病)。其它可被治疗或预防的血管疾病包括那些与血小板聚集、视网膜小动脉、肾小球小动脉(glomerulararteriole)、神经滋养血管(vasanervorum)、心小动脉，及眼、肾脏、心脏与中枢及周围神经系统相关的毛细血管床相关的血管疾病。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于增加个体血浆内的HDL水平。
可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物治疗的其它病症包括再狭窄(例如在冠状动脉介入治疗后)，及与高密度及低密度胆固醇异常水平有关的病症。
在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以作为组合疗法的一部分与另一种心血管药剂一起给药。在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以作为组合疗法的一部分与抗心率失常药剂一起给药。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以作为组合疗法的一部分与其它心血管药剂一起给药。
细胞死亡/癌症
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可给药于最近已接受或可能将接受一定剂量辐射或毒素的受试者。在一个实施方案中，接受辐射或毒素的剂量作为工作相关程序或医药程序的一部分，例如作为预防措施(prophylacticmeasure)给药。在一些实施方案中，非故意地接受辐射或毒素的暴露。在这种情况下，优选在暴露后尽快给药所述化合物，以抑制细胞凋亡及后续发展成急性辐射综合征。
调节沉默调节蛋白的化合物还可以用于治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，该增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗和/或预防癌症。能量限制已经与年龄相关疾病(例如癌症)的发病率的降低建立起了联系。相应地，沉默调节蛋白的水平和/或活性的增加可有利地用于治疗和/或预防年龄相关疾病(例如癌症)的发病率。可以利用调节沉默调节蛋白的化合物治疗的示例性的癌症为脑部和肾脏的癌症；激素-依赖的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌和卵巢癌；淋巴瘤和白血病。在与实体肿瘤有关的癌症中，可将调节性化合物直接给药于该肿瘤。血液细胞的癌症(例如白血病)可通过将调节性化合物给药至血流中或骨髓中而进行治疗。也可治疗良性细胞生长例如疣。可被治疗的其它疾病包括自身免疫疾病，例如全身性红斑狼疮、硬皮病及关节炎，其中应将自身免疫细胞去除。也可通过给药调节沉默调节蛋白的化合物治疗与病毒感染(例如疱疹、HIV、腺病毒及HTLV-1)有关的恶性与良性病症。或者，可自受试者获取细胞，经体外处理以去除一些不希望的细胞(例如癌细胞)，并再给药于相同或不同的受试者。
也可将化学治疗剂与本文所述具有抗癌活性的调节性化合物(例如诱发细胞凋亡的化合物、减短寿命的化合物或使细胞对应激敏感的化合物)共同给药。化学治疗剂本身可与本文所述可诱发细胞死亡或减短寿命或增加对应激敏感的调节沉默调节蛋白的化合物，和/或与其它化学治疗剂组合使用。除了常规化学治疗剂之外，本文所述的调节沉默调节蛋白的化合物也可与反义RNA、RNAi，或其它抑制会引起不希望细胞增殖的细胞组分表达的多核苷酸一起使用。
包含调节沉默调节蛋白的化合物与常规化学治疗剂的组合疗法可能优于本领域已知的组合疗法，因为该组合可使常规化学治疗剂在较低剂量下起更大功效。在优选的实施方案中，对于化学治疗剂或常规化学治疗剂的组合的有效剂量(ED50)而言，当与调节沉默调节蛋白的化合物组合使用时，所对应的活性为单独的该化学治疗剂的ED50的至少2倍，且甚至更优选5倍、10倍或甚至25倍。反之，对于此类化学治疗剂或此类化学治疗剂的组合的治疗指数(TI)而言，当与本文所述调节沉默调节蛋白的化合物组合使用时，相较于单独的常规化学治疗方案的TI为至少2倍，且甚至更优选地高5倍、10倍或甚至25倍。
神经元疾病/病症
在一些方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗患有神经变性疾病，及中枢神经系统(CNS)、脊髓或周围神经系统(PNS)的创伤或机械性损伤的患者。神经变性疾病通常涉及人脑部质量与体积的减少，其可能由于脑细胞萎缩和/或死亡所致，这比健康人因老化所引起的人脑部质量与体积的减少更显著。神经变性疾病可在执行长期正常脑功能后，由于特定脑区域的渐进性退化(例如神经细胞功能不足及死亡)而逐渐进展。另一方面，神经变性疾病可快速发作(onset)，例如那些与创伤或毒素相有关的神经变性疾病。脑退化的实际发作可能较临床表达早许多年。神经变性疾病的实例包括(但不限定于)阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS；罗杰里格氏病(LouGehrig’sdisease))、弥散性路易体病(diffuseLewybodydisease)、舞蹈病-棘红细胞增多症、原发性侧索硬化、眼疾病(眼神经炎)、化学疗法诱发的神经病变(例如来自长春新碱、紫杉醇、硼替佐米)、糖尿病诱发的神经病变及佛里德赖希共济失调。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗这些病症及如下文所描述的其它病症。
AD为导致记忆丧失、异常行为、个性改变及思考能力衰退的CNS病症。这些丧失与特定类型的脑细胞死亡、及脑细胞间的连结与其支撑网络(例如神经胶质细胞)损坏有关。最早期症状包括丧失最近的记忆、错误判断及个性改变。PD为导致身体运动不受控制、僵硬、颤抖及运动障碍的CNS病症，与脑部制备多巴胺的区域中的脑细胞死亡关联。ALS(运动神经元疾病)为攻击运动神经元(CNS中将脑与骨骼肌连结的组分)的CNS病症。
HD为另一种引起运动不受控制、智力丧失及情绪失调的神经变性疾病。泰-萨病(Tay-Sachsdisease)与桑德霍夫病(Sandhoffdisease)，是其中GM2神经节苷脂与β-氨基己糖苷酶(hexosaminidase)的相关糖脂类底物累积于神经系统中并引发急性神经变性的糖脂储存疾病(glycolipidstoragediseases)。
已熟知，细胞凋亡在免疫系统的AIDS病变方面起作用。然而，HIV-1也诱发可以用本发明的调节沉默调节蛋白的化合物治疗的神经学疾病。
神经元丧失(neuronalloss)也为朊病毒病(priondiseases)(例如人克-雅病、牛BSE(疯牛病)、绵羊与山羊的瘙痒病及猫的猫类海绵状脑病(FSE))的突出特征。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防由这上述朊病毒病引起的神经元丧失。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防任何涉及轴突病(axonopathy)的疾病或障碍。远端轴突病为一类由周围神经系统(PNS)神经元的某种代谢或毒性错乱所产生的周围神经病。其为神经对代谢或毒性紊乱的最通常响应，而因此可能由代谢性疾病例如糖尿病、肾衰竭、缺乏综合征例如营养不良及酒精中毒，或由毒素或药物的作用所引起。那些患有远端轴突病的患者通常呈现对称性手套-袜样感觉-运动紊乱。在受影响区域也发生深层腱反射及自主神经系统(ANS)功能丧失或缩减。
糖尿病性神经病变为与糖尿病有关的神经病症。可能与糖尿病性神经病变有关的较常见病症包括第三神经麻痹；单一神经病变；多发性单神经炎；糖尿病性肌肉萎缩；疼痛性多神经病；自主神经病；及胸腹神经病。
周围神经病变为用于对周围神经系统的神经损伤的医学术语，其可能是由神经疾病或由全身性疾病的副作用所引起。周围神经病变的主要原因包括癫痫发作、营养缺乏及HIV，虽然糖尿病是最可能的原因。
在一个示例性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防多发性硬化(MS)，包括复发性MS与单症状MS，及其它脱髓鞘病症(demyelinatingcondition)，例如慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)或与其有关的病症。
在又一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于治疗神经创伤，包括由于疾病、损伤(包括手术介入)或环境创伤(例如神经毒素、酒精中毒等)所引起的创伤。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于预防、治疗及缓解各种PNS病症的症状。术语“周围神经病变”涵括广范围的位于脑与脊髓外部的神经(即周围神经)已经受损的病症。周围神经病变也可指周围神经炎，或者如果涉及许多神经时，可使用术语多神经病或多神经炎。
可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物治疗的PNS疾病包括：糖尿病、麻疯、夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Toothdisease)、格-巴二氏综合征(Guillain-Barrésyndrome)和壁神经丛神经病(BrachialPlexusNeuropathy)(颈与第一胸根、神经干、索(cord)及臂神经丛的周围神经组分的疾病)。
在另一个实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防多谷氨酰胺疾病。示例性多谷胺酰胺疾病包括脊髓延髓肌肉萎缩(肯尼迪病)、亨廷顿病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(Dentatorubral-pallidoluysianatrophy)(郝乌河综合征(HawRiversyndrome))、1型脊髓小脑性共济失调、2型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调(马-约病(Machado-Josephdisease))、6型脊髓小脑性共济失调、7型脊髓小脑性共济失调及17型脊髓小脑性共济失调。
在一些实施方案中，本发明提供治疗中枢神经系统细胞以防止因响应于血液流向细胞减低所引起的伤害的方法。通常可被预防的伤害严重度，将大部分取决于血液流向细胞的减低程度及减少的持续时间。在一个实施方案中，可预防凋亡性或坏死细胞死亡。在再一个实施方案中，可预防缺血所介导的伤害，例如细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧血症。在各实施方案中，中枢神经系统细胞可为脊髓细胞或脑细胞。
另一方面包括将调节沉默调节蛋白的化合物给药于受试者，以治疗中枢神经系统缺血性病症。有许多中枢神经系统缺血性病症可由本文所述的调节沉默调节蛋白的化合物治疗。在一个实施方案中，缺血性病症为导致任何类型缺血性中枢神经系统损伤，例如凋亡性或坏死性细胞死亡、细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧的中风。中风可能影响脑部任何区域，或由任何一般已知会导致中风发生的病因所引起。在该实施方案的另一选择中，中风为脑干中风。在本实施方案的另一选择中，中风为小脑中风。在本实施方案的另一选择中，中风为栓塞性中风(embolicstroke)。在本实施方案的另一选择中，中风为出血性中风。在其它实施方案中，中风为血栓性中风。
在另一方面，可给药调节沉默调节蛋白的化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后减少缺血核心的梗塞大小。而且，也可有益地给药调节沉默调节蛋白的化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后，减少缺血性半影或过渡区域的大小。
在一个实施方案中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防神经变性性病症、或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种抗神经变性药物。
血液凝固病症
在其它方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防血液凝固病症(或止血病症)。如可交换地用于本文，术语“止血”、“血液凝固”及“血液凝结”是指控制流血，包括血管收缩与凝结的生理特性。血液凝固协助维持哺乳动物在受伤、炎症、疾病、先天缺陷、功能障碍或其它破坏(disruption)后的循环完整性。而且，血块的形成在受伤的情况中不仅限制出血(止血作用)，也可能在动脉粥样硬化疾病方面，因阻塞重要动脉或静脉而导致严重器官损伤及死亡。因此血栓是在错误时间及地点形成的血液凝块。
于是，本发明提供目的在于抑制血液凝块形成，以预防或治疗血液凝固病症，例如心肌梗塞、中风、因周围动脉疾病的肢体损失或肺栓塞的抗凝结与抗血栓治疗。
本文可交换地使用的术语“调制止血”及“调节止血”包括诱导(例如刺激或增加)止血，也包括抑制(例如减低或减少)止血。
在一方面，本发明提供通过给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，以减低或抑制受试者中止血的方法。本文所公开的组合物或方法可用于治疗或预防血栓形成疾病。本文使用的术语“血栓形成病症”包括以过量或不希望的凝血或止血活性，或凝固性过高的状态为特征的任何病症或疾病。血栓形成疾病包括涉及血小板粘附与血栓形成的疾病或障碍，且可能显示为形成血栓的可能性增加，例如形成血栓数量增加、在低年龄期(earlyage)出现血栓形成、血栓形成的家族性倾向(familialtendencytowardsthrombosis)及在罕见部位(unusualsite)出现血栓形成。
在另一个实施方案中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防血液凝固病症，或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，与一种或多种抗凝结或抗血栓形成药物。
体重控制
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防受试者的体重增加或肥胖。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于例如治疗或预防遗传性肥胖症、饮食性肥胖症、激素相关的肥胖症、与给药药物有关的肥胖症，用于减轻受试者体重或防止受试者体重增加。需要此类治疗的受试者可为其已经肥胖、有可能变成肥胖、过重或有可能变成过重的受试者。可能变成肥胖或过重的受试者，可例如基于家族史、遗传学、饮食、活动程度、药物摄取或其各种不同组合来确定。
在其它的实施方案中，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物给药于患有各种可通过促进受试者的体重减轻而治疗或预防的其它疾病与病症。此类疾病包括例如高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、II型糖尿病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、冠心病、心绞痛、充血性心力衰竭、中风、胆结石、胆囊炎与胆石病、痛风、骨关节炎、阻碍性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、一些类型癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不规则、不孕、不规则排卵)、膀胱控制问题(例如压迫性尿失禁)；尿酸肾石病；精神性病症(例如忧郁、进食障碍病(eatingdisorders)、体象障碍与自尊降低)。最后，患有AIDS的患者会对于AIDS的组合疗法响应，而发展成脂肪营养障碍或胰岛素抵抗。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于在体外或体内抑制脂肪形成或脂肪细胞分化。此类方法可用于治疗或预防肥胖症。
在其它实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减低食欲和/或增加饱食感，因此引起体重减轻或避免体重增加。需要此类治疗的受试者可为已经过重、肥胖的受试者，或有可能变成过重或肥胖的受试者。该方法包含将一定剂量(例如呈丸剂(pill)的形式)每日或每二日或一周一次给药于受试者。该剂量可为“食欲减低剂量”。
在一个示例性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，可以以治疗或预防体重增加或肥胖症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种抗肥胖剂组合给药。
在另一个实施方案中，可给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，以减低由药物引发的体重增加。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，能够与可以刺激食欲或引起体重增加(尤其是由于除了保留水分以外的因素引起的体重增加)的药物通过组合疗法进行给药。
代谢病症/糖尿病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防代谢病症，例如胰岛素抵抗、前期糖尿病、II型糖尿病、和/或其并发症。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物的给药可增加受试者的胰岛素敏感性和/或减低胰岛素水平。需要此类治疗的受试者可为具有胰岛素抵抗或II型糖尿病的其它前驱症状(precursorsymptom)、具有II型糖尿病或有可能发展任何这些病症的受试者。例如，该受试者可为具有胰岛素抵抗，例如具有高胰岛素循环水平和/或相关联病症，例如高血脂症、脂肪生成障碍、高胆固醇血症、葡萄糖耐受不良、高血糖水平、综合征X的其它表征、高血压、动脉粥样硬化及脂肪代谢障碍的受试者。
在一个示例性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可以以治疗或预防代谢病症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种抗糖尿病剂组合给药。
炎性疾病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防与炎症有关的疾病或障碍。可于引发炎症发作前、发作时或发作之后给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物。当预防性使用时，该化合物优选在任何炎症反应或症状之前给药。该化合物的给药可预防或减弱炎症反应或症状。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防变态反应及呼吸病症，包括哮喘、支气管炎、肺纤维化、过敏性鼻炎、氧气毒性、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征及任何慢性闭塞性肺病(COPD)。该化合物可用于治疗肝炎感染，包括乙型肝炎及丙型肝炎。
此外，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗自身免疫疾病，和/或与自身免疫疾病有关的炎症，例如关节炎，包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎，以及器官-组织自身免疫疾病(例如雷诺氏综合征(Raynaud'ssyndrome))、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、口腔粘膜炎、硬皮病、重症肌无力、移植排斥、内毒素休克、脓毒病、银屑病、湿疹、皮炎、多发性硬化、自身免疫甲状腺炎、葡萄膜炎、全身性红斑狼疮、阿狄森病(Addison'sdisease)、自身免疫多腺疾病(也称为自身免疫多腺综合征)及格雷夫斯病。
在一些具体实施方案中，一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可单独使用，或与用于治疗或预防炎症的其它化合物组合使用。
潮红
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减低作为病症的症状的潮红和/或热潮红(hotflash)的发生率或严重性。例如，主题方法(subjectmethod)包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，单独或与其它药剂组合使用，以减低癌症患者的潮红和/或热潮红的发生率或严重性。在其它实施方案中，该方法提供使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物以减低绝经及绝经后妇女的潮红和/或热潮红的发生率或严重性。
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用作减低作为另一种药物疗法的副作用的潮红和/或热潮红(例如，药物诱发的潮红)的发生率或严重度的疗法。在一些实施方案中，用于治疗和/或预防药物诱发的潮红的方法包括将含有至少一种诱发潮红的化合物与至少一种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物的制剂给药于有需要的患者。在其它实施方案中，用于治疗药物所诱发的潮红的方法包括，分别给药一种或多种诱发潮红的化合物与一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物，例如其中调节沉默调节蛋白的化合物与潮红诱发药物未经配制于同一组合物中。当使用分开的制剂时，可将调节沉默调节蛋白的化合物(1)在与潮红诱发药物的给药的同时给药，(2)与潮红诱发药物一起周期性地给药，(3)与潮红诱发药物错开给药，(4)在潮红诱发药物给药之前给药，(5)于潮红诱发剂给药之后给药，及(6)以其各种不同组合进行给药。示例性潮红诱发药物包括例如烟酸、雷洛昔芬(faloxifene)、抗忧郁剂、抗精神病药、化学治疗剂、钙通道阻断剂及抗生素。
在一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减少血管扩张剂或抗血脂药(包括抗胆固醇血症药物与抗脂肪肝药)的潮红副作用。在一个示例性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减少与给药烟酸有关的潮红。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗和/或预防高血脂症并减低潮红副作用的方法。在另一代表性的实施方案中，该方法包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，以减少雷洛昔芬的潮红副作用。在另一代表性的实施方案中，该方法包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，以减少抗忧郁药或抗精神病药的潮红副作用。举例而言，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与5-羟色胺再吸收抑制剂，或5HT2受体拮抗剂共同使用(分开或一起给药)。
在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用作5-羟色胺再吸收抑制剂(SRI)的治疗的一部分以减少潮红。在另一代表性的实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减少化学治疗剂如环磷酰胺及他莫昔芬的潮红副作用。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减少钙通道阻断剂如氨氯地平的潮红副作用。
在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于减少抗生素的潮红副作用。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与左氧氟沙星组合使用。
眼病症
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗视力损伤的方法，该方法通过将治疗剂量的选自本文所公开化合物的沉默调节蛋白的调节剂或其药学上可接受的盐、前药或代谢衍生物给药于患者。
在本发明的一些方面，视力损伤是由于对视神经或中枢神经系统的伤害所引起。在具体的实施方案中，视神经伤害由高眼内压(例如由青光眼引起的高眼内压)所引起。在其它具体的实施方案中，视神经伤害由神经肿胀(其往往与感染或免疫(例如自身免疫)反应(如在视神经炎中)有关)所引起。
在本发明的一些方面，视力损伤由视网膜的伤害所引起。在具体的实施方案中，视网膜的伤害由流向眼睛的血流中的障碍(例如，动脉粥样硬化、血管炎)所引起。在具体的实施方案中，视网膜的伤害是由黄斑破坏(disruptionofmacula)(例如，渗出性或非渗出性黄斑变性)所引起。
示例性视网膜的疾病包括渗出性年龄相关的黄斑变性、非渗出性年龄相关的黄斑变性、视网膜电子假体和RPE移植年龄相关的黄斑变性、急性多病灶板状色素上皮病、急性视网膜坏死、先天性黄斑变性、视网膜分支动脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、癌症关联和相关的自身免疫视网膜病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(centralserouschorioretinopathy)、伊尔斯病(EalesDisease)、黄斑前膜(epimacularmembrane)、点阵变性、巨动脉瘤、糖尿病性黄斑水肿、艾尔温-盖斯黄斑水肿(Irvine-GassMacularEdema)、黄斑裂孔(macularhole)、视网膜下新血管膜、弥散性单侧亚急性视神经视网膜炎、非假晶状体囊样黄斑水肿(nonpseudophakiccystoidmacularedema)、眼假组织胞浆菌病综合征(presumedocularhistoplasmosissyndrome)、渗出性视网膜脱离、手术后视网膜脱离、增殖性视网膜脱离、孔源性视网膜脱离、牵引性(tractional)视网膜脱离、色素性视网膜炎、CMV视网膜炎、成视网膜细胞瘤、早熟性视网膜病、散弹状视网膜病(birdshotretinopathy)、背景性糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病、血红蛋白病性视网膜病、普尔沙视网膜病(PurtscherRetinopathy)、瓦尔萨尔瓦视网膜病(ValsalvaRetinopathy)、青年性视网膜劈裂症(juvenileretinoschisis)、老年性视网膜劈裂症、泰尔松综合征(TersonSyndrome)及白点综合征(whitedotsyndromes)。
其它示例性疾病包括眼细菌感染(例如，结膜炎、角膜炎、结核病、梅毒、淋病)、病毒感染(例如眼单纯疱疹病毒(ocularherpessimplexVirus)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒视网膜炎、人免疫缺陷病毒(HIV))以及继发于HIV或其它HIV-关联及其它免疫缺陷-关联性眼疾病的进行性外部视网膜坏死。此外，眼疾病包括真菌感染(例如念珠菌性脉络膜炎(Candidachoroiditis)、组织胞浆菌病)、原生动物感染(例如弓形体病)及其它例如眼弓蛔虫病与肉样瘤病(sarcoidosis)。
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗以化学治疗药物(例如，神经毒性药物、升高眼内压力的药物例如类固醇)治疗的受试者视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受试者。
本发明的另一方面为用于抑制、减低或治疗在进行手术包括眼或其它于俯卧位(proneposition)的手术，例如脊髓手术时的受试者视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受试者。眼手术包括白内障、虹膜切开术和晶状体置换。
本发明的另一方面为治疗(包括抑制与预防性治疗)年龄相关的眼疾病，包括白内障、干眼症、年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜损害等的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受试者。
本发明的另一方面为预防或治疗由应激、化学伤害或照射所引起的眼睛损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受试者。对眼睛的照射或电磁性损伤可包括由CRT或暴露于阳光或UV所引起的那些损伤。
在一些实施方案中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防眼病症，或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种用于治疗眼病症的治疗剂。
在一些实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于减低眼内压力的疗法结合进行给药。在另一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防青光眼的疗法结合进行给药。在另一实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防视神经炎的疗法结合进行给药。在一些实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防CMV视网膜病的疗法结合进行给药。在另一个实施方案中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防多发性硬化的疗法结合进行给药。
线粒体有关的疾病与病症
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍的方法。该方法包含将治疗上有效量的调节沉默调节蛋白的化合物给药于需要的受试者。线粒体活性增加是指在维持线粒体的总量(例如线粒体的质量)的同时增加线粒体的活性、增加线粒体的数量并因此增加线粒体的活性(例如，通过刺激线粒体的生物生成(biogenesis))，或其组合。在一些实施方案中，因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍，包括与线粒体功能障碍有关的疾病或障碍。
在一些实施方案中，用于治疗因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍的方法可包括确定患有线粒体功能障碍的受试者。用于诊断线粒体功能障碍的方法可包括分子遗传学、病理学和/或生物化学分析。与线粒体功能障碍有关的疾病或障碍包括这样的疾病和病症，其中线粒体的呼吸链活性不足导致哺乳动物中此类疾病或障碍的病理生理学的发展。因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍一般包括例如，由自由基介导的氧化损伤导致的组织变性的疾病、细胞不适当地进行凋亡的疾病，及细胞无法进行凋亡的疾病。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍的方法，该方法包括将一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物与另一种治疗剂(例如可用于治疗线粒体功能障碍的药剂，或可用于减少与涉及线粒体功能障碍的疾病或障碍有关的症状的药剂)组合给药于有需要的受试者。
在示例性的实施方案中，本发明提供用于治疗因线粒体活性增加而获益的疾病或障碍的方法，通过将治疗上有效量的调节沉默调节蛋白的化合物给药于受试者。示例性疾病或障碍包括例如神经肌肉病症(例如佛里德赖希共济失调(Friedreich’sAtaxia)、肌肉营养不良、多发性硬化等)、神经元不稳定性病症(例如癫痫发作、偏头痛等)、发育迟缓、神经变性病症(例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等)、缺血、肾小管性酸中毒、年龄相关的神经变性与认知衰退、化学疗法疲劳、年龄相关或化学疗法诱发的绝经或月经周期或排卵不规则、线粒体性肌病、线粒体损害(例如钙累积、兴奋性中毒、接触一氧化氮、缺氧等)及线粒体失调。
肌肉营养不良指一类涉及肌肉神经组织构造与功能恶化的疾病，其往往导致骨骼肌萎缩及心肌功能障碍，例如杜兴氏肌肉营养不良(Duchennemusculardystrophy)。在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于减低肌肉功能能力的衰退速率，及用于增强患有肌肉营养不良患者肌肉的功能状态。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗线粒体性肌病。线粒体性肌病范围从外眼部肌肉的轻微缓慢进行性衰弱，到严重致命的婴儿期肌病与多系统脑脊髓病(encephalomyopathy)。一些综合征已经确定，它们之间有些重叠。影响肌肉的已确立的综合征包括进行性外眼肌麻痹、卡-塞综合征(Kearns-Sayresyndrome)(具有眼肌麻痹、色素性视网膜病、心脏传导缺陷、小脑共济失调与感觉神经性耳聋)、MELAS综合征(线粒体性脑脊髓病、乳酸性酸中毒与类中风事件(stroke-likeepisodes))、MERFF综合征(肌阵挛型癫痫、不整齐的红纤维(raggedredfibers))、肢带分配衰弱(limb-girdledistributionweakness)及婴儿肌病(良性、重度与致死)。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗患有对线粒体的毒性损害，例如由于钙累积、兴奋性中毒、一氧化氮接触、药物诱导的毒性损害或缺氧引起的毒性损害的患者。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗与线粒体失调(mitochondrialderegulation)有关的疾病或障碍。
肌肉性能
在其它实施方案中，本发明提供用于增强肌肉性能的方法，其通过给药治疗上有效量的调节沉默调节蛋白的化合物。例如，调节沉默调节蛋白的化合物可用于改善身体耐久力(例如，进行身体工作例如运动、体力劳动、运动活动等)、抑制或延迟身体疲劳、增加血液氧水平、增进健康个体的能量、加强工作能力与持久性、减少肌肉疲劳、减低压力、增强心脏与心血管功能、改善性能力、增加肌肉ATP水平和/或减少血液中的乳酸。在一些实施方案中，该方法包括给药一定量的线粒体活性增加、增进线粒体的生物生成和/或增加线粒体质量的调节沉默调节蛋白的化合物。
运动性能是指运动员的肌肉在参与运动活动时所呈现的能力。所增强的运动效能、强度、速度及持久力，是通过肌肉收缩强度的增加、肌肉收缩幅度的增加、在刺激与收缩之间的肌肉反应时间的缩短而进行测量。运动员指以任何程度参与运动，以及寻求能在其机能上达到增进强度、速度与耐久力水平的个人，例如健身者(bodybuilder)、自行车运动员、长跑运动员、短跑运动员等。所增强的运动效能由能克服肌肉疲劳的能力、保持较长时间活力的能力及具有更有效锻炼的能力显示。
在运动员肌肉性能的场所(arena)，期望产生允许在长期的更高耐性程度下进行比赛或训练的状况。
预期本发明的方法也有效于治疗肌肉相关的病理病症，包括急性肌肉减少症(acutesarcopenia)，例如肌肉萎缩和/或与烧伤、卧床、肢体固定术或胸部、腹部和/或整形外科大手术有关的恶病质。
在一些实施方案中，本发明提供包含沉默调节蛋白的调节剂的新型饮食组合物，其制备方法及使用该组合物以改善运动效能的方法。于是，本发明向涉及广泛定义的运动，包括需要耐力的运动与需要重复性肌肉运动的劳动的人们提供具有改善身体耐力和/或抑制身体疲劳的作用的治疗组合物、食品与饮料。此类饮食组合物可另外包含电解质、咖啡因、维生素、碳水化合物等。
其它用途
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防病毒感染(例如流感病毒、疱疹病毒或乳头状瘤病毒感染)或作为抗真菌剂。在一些实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，可以作为组合药物疗法的一部分与另一种用于治疗病毒性疾病的治疗剂一起给药。在另一个实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，可作为组合药物疗法的一部分与另一种抗真菌剂一起给药。
可如本文所述进行治疗的受试者包括真核生物，例如哺乳动物例如人、羊类、牛类、马类、猪类、犬类、猫类、非人灵长类、小鼠及大鼠。可处理的细胞包括真核细胞，例如得自前述受试者的细胞，或植物细胞、酵母细胞及原核细胞例如细菌细胞。例如，可将调节性化合物给药于农场动物，以改善其能更长期承受农场条件的能力。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于增加植物寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在一个实施方案中，将化合物施予植物(例如定期)，或施予真菌。在另一些实施方案中，植物经遗传修饰以产生化合物。在另一个实施方案中，将植物与果实在采收与运送前先以化合物处理，以增加在运送期间对于损伤的抗性。也可将植物种子与本文所述的化合物接触，以例如使其防腐(preserve)。
在其它实施方案中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于调节酵母细胞的寿命。其中希望延长酵母细胞寿命的情况包括其中使用酵母的任何工艺过程，例如啤酒、酸奶与烘焙物品(例如面包)的制备。使用具有延长寿命的酵母，可以使用更少酵母，或使酵母具有活性的时间更长。也可将用于重组制备蛋白的酵母或其它哺乳动物细胞进行如本文所述的处理。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于增加昆虫寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在此实施方案中，化合物将被施用至有用的昆虫，例如蜜蜂及其它涉及植物授粉的昆虫。在一个具体的实施方案中，化合物将被施用至涉及生产蜂蜜的蜜蜂。一般而言，本文所述的化合物可应用至任何生物体，例如具有商业重要性的真核生物。例如，可将本文所述的化合物应用至鱼类(水产养殖)及鸟类(例如鸡与家禽)。
也可使用较高剂量的增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物作为杀虫剂，这是通过干扰发育期间沉默基因的调节以及细胞凋亡的调节进行的。在该实施方案中，可通过本领域已知的方法将该化合物施用至植物，并确保该化合物对于昆虫幼虫(且不是对于植物)为生物可利用的。
至少就生殖与寿命间的联系的观点而言，可施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物，来影响诸如昆虫、动物及微生物等生物体的生殖。
4.分析
在本文中所涵盖的其它方法包括用于鉴定调节沉默调节蛋白的化合物或试剂的筛选方法。所述试剂可为核酸，例如适体(aptamer)。分析可以基于细胞或不含细胞的形式进行。例如，分析可包含在沉默调节蛋白可被已知调节沉默调节蛋白的试剂所调节的条件下，将沉默调节蛋白与测试剂温育(或接触)，并相对于缺乏测试剂，在该测试剂存在下监控或测定沉默调节蛋白的调节水平。沉默调节蛋白的调节水平可通过测定其将底物脱乙酰基化的能力而确定。示例性底物为可购自BIOMOL(PlymouthMeeting，PA)的乙酰化肽类。优选底物包括p53的肽类，例如那些包含乙酰化K382的肽类。尤其优选的底物为FluordeLys-SIRT1(BIOMOL)，即乙酰化肽Arg-His-Lys-Lys。其它底物为得自人组蛋白H3与H4的肽类或乙酰化氨基酸。底物可为荧光的(fluorogenic)。所述沉默调节蛋白可为SIRT1、Sir2、SIRT3或其部分。例如，重组SIRT1可得自BIOMOL。反应可进行约30分钟，并例如以烟酰胺终止。可使用HDAC荧光活性分析/药物发现试剂盒(drugdiscoverykit)(AK-500，BIOMOLResearchLaboratories)测定乙酰化水平。类似的分析经描述于Bitterman等人(2002)J.Biol.Chem.277：45099中。可将分析中的沉默调节蛋白的调节程度，与在一种或多种本文所述化合物(其可作为阳性或阴性对照组)(分开或同时)存在下的沉默调节蛋白的调节程度进行比较。用于分析的沉默调节蛋白可为全长沉默调节蛋白或其部分。因为在本文中已显示活化化合物表现出与SIRT1的N-末端作用，故用于分析的蛋白包括沉默调节蛋白的N-末端部分，例如SIRT1的大致为氨基酸1-176或1-255；Sir2的大致为氨基酸1-174或1-252部分。
在一个实施方案中，筛选试验包括(i)在无测试剂存在下在适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使沉默调节蛋白与测试剂及乙酰化底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化水平，其中在该测试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该测试剂存在下较低则表示：该测试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该测试剂存在下底物的乙酰化程度，相对于无该测试剂存在下较高则表示：该测试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。
在另一实施方案中，该筛选试验可检测沉默调节蛋白介导的NAD依赖性脱乙酰化的2’/3’-O-乙酰基-ADP-核糖产物的形成。该O-乙酰基-ADP-核糖产物以与沉默调节蛋白脱乙酰化反应的脱乙酰化肽产物等摩尔量形成。相应地，该筛选试验可包括(i)在无测试剂存在下在适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使沉默调节蛋白与测试剂及乙酰化底物接触；及(ii)测定O-乙酰基-ADP-核糖形成的量，其中O-乙酰基-ADP-核糖形成在测试剂存在下相对于不存在该测试剂时的量增加表示：该测试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而O-乙酰基-ADP-核糖形成在测试剂存在下相对于不存在该测试剂时的量降低表示：该测试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。
用于鉴定于体内调节(例如刺激)沉默调节蛋白的试剂的方法可包括(i)在第I类与第II类HDAC的抑制剂存在下，在适合沉默调节蛋白在无测试剂存在下将底物脱乙酰化的条件下，使细胞与测试剂及能够进入细胞的底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化程度，其中在该测试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该测试剂存在下较低则表示：该测试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该测试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该测试剂存在下较高则表示：该测试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。优选底物为乙酰化肽，其也优选为荧光的，如本文中进一步描述的。该方法可进一步包含将细胞裂解(lysing)，以测定底物的乙酰化程度。可将底物以范围介于约1μM至约10mM，优选地约10μM至1mM，甚至更优选约100μM至1mM，例如约200μM的浓度加至细胞中。优选底物为乙酰化赖氨酸，例如ε-乙酰基赖氨酸(FluordeLys，FdL)或FluordeLys-SIRT1。第I类与第II类HDAC的优选抑制剂为曲古抑菌素A(trichostatinA)(TSA)，其可以范围介于约0.01μM至100μM，优选约0.1μM至10μM，例如1μM的浓度使用。细胞与测试化合物及底物的温育可进行约10分钟至5小时，优选约1-3小时。因为TSA抑制所有第I类与第II类HDAC，且一些底物例如FluordeLys对于SIRT2为较差的底物，对于SIRT3-7为甚至更差的底物，故此类分析可用于鉴定体内SIRT1的调节剂。
5.药物组合物
本文所述的化合物可以通过常规方法，使用一种或多种生理学上或药学上可接受的载体或赋形剂配制。例如，该化合物及其药学上可接受的盐与溶剂合物可经配制成用于通过例如注射(例如SubQ、IM、IP)、吸入或吹入(通过口或鼻)或口服、口腔、舌下、经皮、鼻、肠胃外或直肠给药的制剂。在一些实施方案中，该化合物可局部地，在标靶细胞存在的部位，即在特定组织、器官或体液(例如血液、脑脊髓液等)中进行给药。
该化合物可配制成用于各种给药方式，包括全身及局部或区域性给药的制剂。技术与制剂一般可见于Remington’sPharmaceuticalSciences，MeadePublishingCo.，Easton，PA。对于肠胃外给药，以注射为优选，包括肌肉内、静脉内、腹膜内及皮下。对于注射，可将所述化合物配制成液态溶液，优选用生理学上相容的缓冲液，例如汉克氏溶液或林格氏溶液。此外可将所述化合物配制成固体形式，并于使用前立即再溶解或悬浮。也可包括冷冻干燥形式。
对于口服给药，药物组合物可采用例如通过常规方法，用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)制备的片剂、锭剂或胶囊的形式。片剂可通过本领域已熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可制成干燥产物，在使用前以水或其它适宜载体配制。此类液体制剂可通过常规方法，用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂类)；乳化剂(例如卵磷脂或金合欢胶)；非水载体(例如扁桃油、酯油类、乙醇或分馏植物油)；及防腐剂(例如对-羟基苯甲酸甲基酯或对-羟基苯甲酸酯丙基酯或山梨酸)制备。如果适当，该制剂也可含有缓冲盐、调味剂、着色剂与甜味剂。用于口服给药的制剂可适宜地配制，以使活性化合物受控的释放。
对于通过吸入(例如肺递送)给药，可方便地将化合物以从经加压包装或喷雾器中使用适宜的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合气体的气溶胶喷雾制剂形式来递送。在经加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供用于递送已计量的量的阀来确定。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊或药筒(cartridge)，其含所述有化合物与适宜粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
该化合物可经配制成用于通过注射，例如通过推注或持续输注的肠胃外给药。用于注射的配制剂可以单位剂量形式提供，例如，以安瓿或多剂量容器(添加防腐剂)提供。组合物可采用诸如在油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前可以用适宜载体，例如灭菌无热源水构成。
该化合物也可配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯类。
除了先前所述的制剂外，化合物也可配制成储存制剂(depotpreparation)。此类储存制剂可通过植入(例如以皮下或肌肉内)，或经由肌肉内注射给药。因此，例如，可将化合物用适宜的聚合或疏水性材料(例如在可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或呈微溶性衍生物，例如呈微溶性盐。受控释放配制剂也包括贴剂。
在一些实施方案中，本文所述的化合物可配制成用于递送至中枢神经系统(CNS)(见综述，Begley，Pharmacology&Therapeutics104：29-45(2004))。用于药物递送至CNS的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输注)；试剂的分子操作(例如包含与药剂组合的转运肽的嵌合融合蛋白的生成，所述转运肽对内皮细胞表面分子具有亲合力，而所述药剂本身不能穿越BBB)，以尝试开发BBB的内源性运送途径之一；设计用于增加试剂的脂溶度的药理策略(例如，将水溶性试剂缀合(conjugation)至脂质或胆固醇载体)；及通过高渗破坏短暂破坏BBB完整性(源自将甘露糖醇溶液输注入颈动脉中或使用生物活性剂例如血管紧张肽)。
脂质体为另一种容易可注射的药物递送系统。于是，在本发明方法中也可将活性化合物以脂质体递送系统的形式给药。脂质体为本领域熟练技术人员已熟知的。脂质体可由各种磷脂例如胆固醇、磷酯酰胆碱类的硬脂胺形成。可用于本发明方法的脂质体包含所有类型脂质体，包括但不限定于小单层囊泡、大单层囊泡及多层囊泡。
另一种制备本文所述的化合物的制剂(尤其是溶液)的方法是通过使用环糊精。环糊精是指α-、β-或γ-环糊精。环糊精详细描述于Pitha等人，U.S专利4,727,064中，其以参考文献引入本文。环糊精为葡萄糖的环状寡聚物；这些化合物与任何药物形成包合复合物(inclusioncomplex)，所述药物的分子能适合于环糊精分子的亲脂搜寻空腔(lipophile-seekingcavity)中。
快速崩解或溶解剂型可用于医药活性剂的快速吸收，尤其是口腔与舌下吸收。快速溶解(fastmelt)剂型对具有吞咽常见的固体剂型例如囊片(caplet)与片剂困难的患者(例如老年人及幼儿患者)有益。此外，快速溶解剂型克服了与例如咀嚼剂型有关的缺点，其中活性剂在患者口中保持的时间长度，在确定味觉掩盖量及患者可能感受到活性剂的喉咙粗砂质感的程度方面起重要作用。
药物组合物(包括化妆品制剂)可包含约0.00001％至100％，例如0.001至10％或0.1％至5％(按重量计)的一种或多种本文所述的化合物。在其他实施方案中，该药物组合物包含：(i)0.05至1000mg的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，和(ii)0.1至2克的一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，将本文所述的化合物混入含有一般适用于局部药物给药的局部给药载体，且包含本领域已知的任何此类物质的局部制剂中。可选择局部给药载体以使组合物呈所希望的形式，例如呈软膏、洗剂、乳膏、微乳剂、凝胶、油、溶液等，且其可由天然存在或合成来源的材料组成。优选所选择的载体不会有害地影响活性剂或局部制剂的其它组分。用于本文的适宜局部给药载体实例包括水、醇类及其它无毒性有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、凡士林、胶冻剂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯、蜡类等。
制剂可为无色无味的软膏、洗剂、乳膏、微乳剂及凝胶。
该化合物可混入一般为半固体制剂的软膏中，其通常以凡士林或其它石油衍生物为基质。所使用的本领域技术人员所了解的具体软膏基质是能够提供最佳药物递送，且优选可提供其它所希望特征以及例如软化性或类似特性的基质。与其它载体或赋形剂一样，软膏基质应为惰性、稳定、无刺激性且非致敏性的。
该化合物可混入洗剂中，其一般为要无摩擦施用于皮肤表面的制剂，且通常为其中固体颗粒(包括活性剂)存在于水或醇类基质中的液态或半液态制剂。洗剂通常为固体的悬浮液，且可包括水包油型的液体油性乳液。
该化合物可混入乳膏中，其一般为粘稠性液体或半固态乳液，为水包油或油包水型。乳剂基质为可水洗，且含有油相、乳化剂与水相。油相一般由凡士林与脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇所组成；水相通常(虽然不必然)在体积上超过油相，且一般含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂如于前述Reminton的文献中所说明的，一般为非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。
该化合物可混入微乳剂中，其一般为两种不相混溶的液体(例如油与水)经由表面活性剂分子的界面膜稳定化的热动力学上稳定、各向同性的澄清的分散体(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology(NewYork：MarcelDekker，1992)，第9卷)。
该化合物可混入凝胶制剂中，其一般为由小的无机粒子组成的悬浮液(二相系统)，或基本上均匀分布于整个载体液体(单相凝胶)中的大的有机分子所组成的半固体系统。虽然凝胶一般使用含水载体液体，也可使用醇类与油类作为载体液体。
在制剂中也可包括其它活性剂，例如其它消炎剂、镇痛剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂及一般存在于防晒制剂中的阳光阻断剂，包括但不限定于邻氨基苯甲酸酯、二苯甲酮(尤其是二苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰基甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、对-氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物，及水杨酸酯(例如水杨酸辛酯)。
在一些局部制剂中，活性剂以该制剂的大约0.25重量％至75重量％，优选地为该制剂的大约0.25重量％至30重量％，更优选地为该制剂的大约0.5重量％至15重量％，且最优选地为该制剂的大约1.0重量％至10重量％的范围存在。
眼疾病可通过例如全身性、局部眼内注射化合物，或通过安插可释放化合物的持续释放装置而治疗或预防。可将化合物在药学上可接受的眼载体中进行递送，以使该化合物能保持与眼表面接触足够的时间以让该化合物穿透角膜与眼睛的内部区域，例如前室、后室、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体(ciliary)、晶状体、脉络膜/视网膜及巩膜。药学上可接受的眼载体可例如为软膏、植物油或包封材料。另一方面，可将本发明化合物直接注射入玻璃体液与房水中。在另一选择中，该化合物可全身性给药(例如通过静脉内输注或注射)用于眼的治疗。
本文所述的化合物可储存于无氧环境中。例如，可将组合物配制于供口服给药的不透气胶囊中，例如购自Pfizer，Inc.的Capsugel中。
可将例如本文中所述的化合物体外处理的细胞，根据用于将移植物给药于患者的方法进行给药，其可伴随例如给药免疫抑制药物例如环孢菌素A。关于药物配制的一般原理，读者可参考CellTherapy：StemCellTransplantation，GeneTherapyandCellularImmunotherapy，G.Morstyn和W.Sheridan编，剑桥大学出版社，1996；及HematopoieticStemCellTherapy，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，ChurchillLivingstone，2000。
化合物的毒性与治疗功效可通过用细胞培养物或实验动物的标准药学方法测定。LD50为对于50％群体致死的剂量。ED50为对于50％群体治疗上有效的剂量。毒性与治疗功效间的剂量比值(LD50/ED50)为治疗指数。优选具有高治疗指数的化合物。虽然可使用具有毒副作用的化合物，但应小心设计将此类化合物靶向至受感染组织位置的递送系统，以使得可以将对于未受感染细胞可能的伤害减至最低，并由此减少副作用。
得自细胞培养试验及动物研究的数据，可用于配制在人中使用的剂量范围。此类化合物的剂量可在其包括具有较小或无毒性的ED50值的循环浓度范围内。该剂量可在此范围内根据所使用的剂型及所利用的给药途径而有所变化。对于任何化合物，可最初由细胞培养试验评估治疗上有效的剂量。可用动物模型调配剂量，以达到包括如在细胞培养中所测定的IC50值(即，达到对症状的一半最大抑制作用的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地测定人的有效剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的浓度。
6.试剂盒
本发明也提供试剂盒，例如用于治疗目的试剂盒，或用于调节细胞寿命或调节细胞凋亡的试剂盒。试剂盒可包括一种或多种例如以预先测量的剂量的本文中所述的化合物。试剂盒可任选地包括用于将细胞与所述化合物接触的装置及使用说明书。该装置包括注射器、支架及其它用于将化合物导入患者(例如患者的血管)中，或将其涂覆于患者皮肤的装置。
在另一个实施方案中，本发明提供一种物质组合物，其包含本发明的化合物与另一种治疗剂(用于组合疗法及组合组合物中的那些相同的治疗剂)，存在于独立的剂型中，但彼此互相关联。本文使用的术语“互相关联”是指，将独立的剂型包装在一起，或者相互依附，从而使得可以容易地明白这些独立的剂型欲被销售，且欲以相同方案的一部分给药。优选将该化合物和其他药剂一起包装于泡罩包装或其它多室包装中，或作为可由使用者自行分开(例如，通过在两个容器间的刻划线处撕开)的连结的、分开密封的容器(例如锡箔小袋等)中。
在另一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含存在于独立的容器中的a)本发明的化合物；及b)另一种治疗剂，例如那些描述于说明书其它部分的治疗剂。
除非另有说明，本发明方法的实施将利用本领域普通技术人员所知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA及免疫学的常规技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：MolecularCloningALaboratorymanual，第2版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编著(ColdSpSpringHarborLaboratoryPress：1989)；DNACloning，第I与II卷(D.N.Glover编著，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编著，1984)；Mullis等人U.S.专利No：4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins编著，1984)；CultureofAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，PracticalGuideToMolecularCloning(1984)；专题论文，MethodsInEnzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Millerh和M.P.Calos编著，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology，卷154和155(Wu等人编著)，ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker编著，AcademicPress，London，伦敦，1987)；HandbookofExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986)；ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
实施例
参考下列实施例，可更容易地理解一般描述的本发明，实施例仅仅用于举例说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并非以任何方式限制本发明。
实施例1.(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基(methano)吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-(2H)-甲酰胺的制备:
步骤1.(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二甲酯的合成：
向装有温度计、回流冷凝器和机械搅拌器的2L烧瓶中加入(100g，0.52mol)的2,6-二氯-3-硝基吡啶、(205g，1.04mol)的(S)-天冬氨酸二甲酯盐酸盐、(174g，2.07mol)的NaHCO3和1L的四氢呋喃。将该反应在40℃搅拌16h，并用HPLC监测2,6-二氯吡啶的消失。反应完成后，将该固体过滤掉并用乙酸乙酯(3x300mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液浓缩至干，并将残余物溶于1L的乙酸乙酯中。将该溶液用200g木炭在室温搅拌2h，并将该木炭过滤掉并用额外的乙酸乙酯(3x200mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，得到粗制产物(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二甲酯(180g)，其为黄色油状物。将这直接用于下一步而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C11H12ClN3O6:317.0；实测值：318.0(M+H)+。
类似的步骤可用于制备(R)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二甲酯，其以(R)-天冬氨酸二甲酯盐酸盐为起始原料。
步骤2.(S)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸甲酯的合成：
向装有温度计、回流冷凝器和机械搅拌器的5L三颈烧瓶中加入粗制的(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二甲酯(180g，0.52mol)、铁粉(146g，2.59mol)、2L的2-丙醇和700mL的水。将该混合物在40℃搅拌，以足以保持内部温度低于70℃的速率加入乙酸(15.5g，0.259mmol)。将该反应在70℃搅拌30min，HPLC指示反应完全。将该混合物冷却至40℃，然后加入Na2CO3(165g，1.55mol)，并将该混合物搅拌1h。将该固体过滤掉，然后将该固体用四氢呋喃(3x500mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，然后将该残余物在1L乙醇中搅拌12小时。将该固体过滤并用冷乙醇洗涤。真空干燥，得到(S)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸甲酯(91g，68％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C10H10ClN3O3:255.0；实测值：256.0(M+H)+。
类似的步骤可用于制备(R)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸甲酯，其以(R)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二甲酯为起始原料。
步骤3.(S)-2-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇的合成：
向装有机械搅拌器、回流冷凝器和氮气进口的5L3颈烧瓶中加入LiAlH4(60g，1.58mol)。将该烧瓶用冰浴冷却，然后加入500mL的四氢呋喃。将该搅拌的混合物冷却至0℃，加入(S)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸甲酯(81g，0.32mol)在2L四氢呋喃中的溶液，同时保持该内部温度低于5℃。加入完成后，将该反应加热回流16h，HPLC监测产物的出现。酯的还原迅速发生，而内酰胺还原需要更长的时间来完成还原。将该反应冷却至5℃，然后加入60mL的水，保持该内部温度低于10℃。加入完成后，将该反应搅拌15min。接下来，加入60mL的15％(w/w)NaOH(水 溶液)，保持该内部温度低于5℃。加入完成后，将该反应搅拌15min。为了完成后处理，加入180mL的水，然后将该混合物在室温搅拌1h。将该固体过滤并用四氢呋喃(3x150mL)洗涤。将该滤液和洗涤液真空浓缩，然后将该固体残余物真空干燥，得到(S)-2-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇(55g，81％)，其为棕色固体。MS(ESI)计算值C9H12ClN3O:213.1；实测值：214.1(M+H)+。
类似的步骤可用于制备(R)-2-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇，其以(R)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸甲酯为起始原料。
步骤4.(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成:
向(S)-2-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇(50g，0.234mol)在500mLCH2Cl2中的溶液中加入三乙胺(95g，0.936mol)。将该混合物在室温搅拌直至均匀，然后将其冷却至0℃。接下来，滴加POCl3(54g，0.351mol)，将该温度保持在0℃5h。停止冷却，并将该反应在室温搅拌2h并用HPLC监测起始醇的消失。反应完成后，加入200mL的1.2MNaHCO3(水溶液)。分离各层，并将水层用CH2Cl2萃取。将合并的CH2Cl2层用1MHCl(水溶液)(4x300mL)萃取，并将合并的HCl层用NaHCO3(饱和)调整至pH＝8。将所得混合物用CH2Cl2(4x300mL)萃取，并将该合并的CH2Cl2层用Na2SO4干燥，过滤，并用50g的木炭处理。将该混合物在室温搅拌3h，用木炭过滤，并将该木炭用额外的200mLCH2Cl2洗涤。将合并的滤液和洗涤溶液浓缩至干。将该固体残余物真空干燥，得到(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(30g，66％)，其为灰白色结晶固体。MS(ESI)计算值C9H10ClN3:195.1；实测值：196.1(M+H)+。
类似的步骤可用于制备(4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其以(R)-2-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇为起始原料。
步骤5.(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.88g，9.6mmol)、(3-三氟甲基苯基)硼酸(2.4g，12.6mmol)、Pd(OAc)2(0.228g，1.02mmol)、2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯(0.972g，2.04mmol)和Cs2CO3(6.6g，20.4mmol)的混合物溶于二噁烷/H2O(50mL，v/v＝9:1)。将该反应混合物加热至90℃过夜。冷却至室温后，将其用EtOAc(120mL)稀释并用水洗涤。水层用EtOAc萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并浓缩。用硅胶色谱纯化(0-100％EtOAc/戊烷梯度)，得到(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其为亮黄色固体(2.26g，77％)。MS(ESI)计算值C16H14F3N3:305.1；实测值：306[M+H]。
使用Pd(OAc)2的类似的偶联步骤可用于制备(4S)-7-(3-取代的苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其使用合适的3-取代的苯基硼酸或硼酸酯。可制备类似的对映异构体，其以(4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯为起始原料。
步骤6.(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(0.100g，0.328mmol)和Et3N(160μL，1.15mmol)在THF(4mL)中的溶液中加入三光气(0.050g，0.164mmol)。在室温搅拌30min后，加入2-吡啶基胺(0.092g，0.983mmol)。将该反应混合物加热至60℃过夜，并将该反应混合物浓缩并将该残余物溶于CH2Cl2(30mL)。将该溶液用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。用硅胶色谱纯化(0-100％EtOAc/戊烷梯度)，得到(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.086g，62％)。MS(ESI)计算值C22H18F3N5O:425.2；实测值：426.2[M+H]。
类似的步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-三氟甲基苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其通过用合适的胺部分替代2-吡啶基胺。可制备类似的对映异构体，其以(4R)-7-(3-三氟甲基苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺为起始原料。同样地，可通过一般步骤制备(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-N-(芳基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺，以(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯和合适的胺部分为起始原料。
实施例2.(4S)-N-苯乙基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
在0℃，向(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(0.100g，0.326mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中加入吡啶(0.0775g，0.980mmol)和氯甲酸苯酯(0.06117g，0.392mmol)。2h后，将该混合物用饱和Na2CO3水溶液淬灭，用CH2Cl2(3x75mL)萃取，用盐水洗涤，用Na2SO3干燥并浓缩。将该残余物用快速硅胶色谱纯化，得到(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯(0.120g，产率84％)。
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯、2-苯基乙胺(0.057g，0.470mmol)和DMAP(0.035g，0.282mmol)的MeCN(3mL)溶液在80℃搅拌过夜。冷却至室温后，将该混合物浓缩并将该残余物用制备型TLC纯化，用CH2Cl2:MeOH(10:1)洗脱，得到(4S)-N-苯乙基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.020g，产率18％)。MS(ESI)计算值C25H23F3N4O:452.18；实测值：453[M+H]。
实施例3.(4S)-N-(3-(3-氨基丙-1-炔-1-基)-5-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-N-(3-(3-氨基丙-1-炔-1-基)-5-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(A，0.050g，0.08mmol)在4NHCl的二噁烷溶液(10mL)中的混悬液在室温搅拌16h。将该混合物减压浓缩并用CH3CN研磨。将该残余物溶于CH3CN:H2O并冻干，得到(4S)-N-(3-(3-氨基丙-1-炔-1-基)-5-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.030g，产率70％)。MS(ESI)计算值C29H23F3N6O2:544.18；实测值：545[M+H]。
实施例4.(4S)-N-甲基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.267g，0.63mmol)溶于二甲基乙酰胺并加入1当量的NaH(0.025g，60％在油中)。将该溶液搅拌5分钟，然后加入MeI(39μL)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后用乙酸乙酯稀释并用盐水(2×)、水(2×)和盐水连续洗涤。将该溶液干燥(Na2SO4)并减压浓缩并上样至硅胶柱(乙酸乙酯:戊烷为洗脱液)。浓缩该纯化的级分，得到纯化的(4S)-N-甲基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。MS(ESI)计算值C23H20F3N5O:439.16；实测值：440.1[M+H]。
实施例5.(4S)-N-(3-氟吡啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将氯甲酸苯酯(1.46g，9.37mmol)滴加至3-氟吡啶-4-胺(1g，8.92mmol)和吡啶(0.95mL，11.16mmol)在THF(10mL)中的冷却溶液中。将该反应在室温搅拌过夜。用制备型TLC纯化，得到(3-氟吡啶-4-基)氨基甲酸苯酯，其为黄色固体。
将(3-氟吡啶-4-基)氨基甲酸苯酯(72mg，0.31mmol)、(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(50mg，0.16mmol)和DMAP(24mg，0.20mmol)在3mL乙腈中的混合物在60℃搅拌过夜。将该混合物直接上样至制备型TLC并使用乙酸乙酯/石油醚＝1:3～1:8作为洗脱液进行纯化，得到(4S)-N-(3-氟吡啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(18mg，25％)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C22H17F4N5O:443.1；实测值：444.1[M+H]。
使用氨基甲酸苯酯的这个一般脲形成步骤可用于制备各种(4S)-7-(芳基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的(4S)-7-(芳基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯替代(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯和用合适的胺部分替代3-氟吡啶-4-胺。可制备对映异构体，其以(4R)-7-(芳基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯为起始原料。
实施例6.(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成:
向二噁烷/H2O(10mL/1mL)中加入(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(500mg，2.56mmol)、(3-氯苯基)硼酸(807mg，5.11mmol)、Pd(dppf)Cl2(212mg，0.26mmol)和Cs2CO3(2.08g，6.4mmol)。将该混合物在90℃搅拌过夜。将该混合物浓缩并用柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)，得到(4S)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(506mg，81％)。MS(ESI)计算值C15H14ClN3:271.1，实测值：272.1[M+H]。
类似的步骤可用于制备(4S)-7-(3-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯或(4S)-7-(3-甲氧基苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其使用合适的硼酸或硼酸酯。可制备对映异构体，其以合适的(4R)-7-(3-取代的苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯为起始原料。通过这种方法，使用合适的起始氯化物还可制备：(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、(9R)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、3-((9R)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苄腈、3-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苄腈、(9S)-2-(5-(甲基磺酰基)吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、(9S)-2-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、N,N-二甲基-3-((9R)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苯胺、N,N-二甲基-3-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苯胺、(9S)-2-(6-甲基吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、(9S)-2-(吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯、(9S)-2-(3-氯苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯。
步骤2.(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将氯甲酸苯酯(6.99mL，55.79mmol)滴加至2-吡啶基胺(5g，53.10mmol)和吡啶(5.65mL，66.41mmol)在THF(50mL)中的冷却溶液中。将该反应在室温搅拌过夜。缓慢加入盐水并将该混合物用乙酸乙酯萃取。分离各层并将有机层用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。然后将有机层用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将该残余物用石油醚洗涤，得到吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(2.1g，18％)。
将吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(66mg,0.30mmol)、(4S)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(40mg，0.15mmol)和DMAP(23mg，0.18mmol)在3mL乙腈中的混合物在65℃搅拌过夜。反应进程用TLC和LC-MS监测。将该混合物直接上样至制备型TLC，使用乙酸乙酯/石油醚＝1:3～1:8作为洗脱液，得到(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(28mg，48％)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C21H18ClN5O:391.1；实测值：392.1[M+H]。
这个使用氨基甲酸苯酯的一般性脲形成步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-氯、-氟或-甲氧基苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用(4S)-7-(3-氯，-氟或-甲氧基苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯和合适的胺部分。可制备对映异构体，其以合适的(4R)-7-(3-取代的苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯为起始原料。同样地，通过这一脲形成步骤可制备(9S)-2-(5-氟-或氯吡啶-3-基)-N-(芳基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺；参见以下实施例的制备，其以(9S)-2-(5-氟-或氯吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯为起始原料。
用于制备(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的类似步骤(上文步骤1和2)可用于制备以下化合物，其以市售可得的硼酸酯为起始原料：
实施例7.(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的制备:
步骤1.(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二甲酯的合成：
使用以下方案制备这一部分。向40.0g(207mmol)的2,6-二氯-3-硝基吡啶、87.7g(414mmol)的L-谷氨酸二甲酯盐酸盐和69.6g(829mmol)的NaHCO3的混合物中加入600mL四氢呋喃。将该混合物在40℃搅拌24h，用HPLC监测2,6-二氯-3-硝基吡啶的消失。反应完成后，将该固体过滤掉并用乙酸乙酯(3x100mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，然后将该残余物通过硅胶柱色谱纯化，用10/1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱，得到60g(87％)该产物，其为黄色固体。MS(ESI)计算值C12H14ClN3O6:331.0；实测值：332.1(M+H)+。
步骤2.(S)-3-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙酸甲酯的合成：
使用以下方案制备这一部分。向20g(60.2mmol)的(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二甲酯和16.8g(301mmol)的铁粉的混合物中加入375mL2-丙醇，然后加入125mL水。向该搅拌的混合物中加入5.5g(90.3mmol)乙酸，然后将该反应回流搅拌1h。将该反应用HPLC监测起始原料的消失。反应完成后，将该固体过滤掉并用2-丙醇(3x50mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液浓缩至干，然后将该残余物真空干燥，得到15g(81％)产物，其为暗黄色固体。这可直接用于下一步而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C11H12ClN3O3:269.0；实测值：270.1。
步骤3.(S)-3-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙-1-醇的合成:
使用以下方案制备这一部分。在氮气下，向17.78g(133.3mmol)的AlCl3在260mL四氢呋喃(THF)中的溶液中以一定速率滴加200mL2MLiAlH4的THF溶液以控制气体的释放。得到铝烷(AlH3)的THF溶液。在单独的烧瓶中，在氮气下制备26.0g(96.4mmol)(S)-3-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙酸甲酯在460mLTHF中的溶液，然后用干冰/丙酮浴冷却。向这个中滴加该铝烷溶液，同时搅拌，持续2h。当滴加完成后，移去该冷却浴，并将该反应温热至室温。1.5h后，LCMS分析显示该反应完成。接下来，将17.6gNaOH在65mL水中的溶液缓慢加入以控制氢气的释放。将该混悬液搅拌18h，然后将该固体过滤掉。将该沉淀物用乙酸乙酯洗涤，然后将该滤液和洗涤液真空浓缩。将该产物用硅胶柱色谱纯化(330g预填充柱)，用CH2Cl2洗脱，然后用0-10％梯度的甲醇/CH2Cl2洗脱，得到15.21g(69％)的橘黄色固体。MS(ESI)计算值C10H14ClN3O:227.1；实测值：228.1。
步骤4.(5R,9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的合成:
向12g(52.7mmol)的(S)-3-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙-1-醇中加入160mL48％(w/w)HBr(水溶液)，然后将该反应在90℃搅拌18h。将该反应用HPLC监测起始醇的消失。反应完成后，将其冷却至室温，然后加入1.2MNaHCO3(水溶液)直至pH＝8。将该混合物用乙酸乙酯(3x100mL)萃取，然后将有机相用盐水(1x100mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用2/1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱，得到6.0g(55％)产物，其为亮黄色固体。MS(ESI)计算值C10H12ClN3:209.1；实测值：210.1。
步骤5.(9S)-2-氯-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯的合成：
将在5mLTHF中的(9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(1.3g，6.19mmol，注意：暗含该5R立体化学)、Boc2O(2.02g，9.28mmol，1.5当量)和DMAP(1.51g，12.38mmol，2.0当量)在60℃搅拌2h。反应进程用TLS和LC/MS监测。加入水(30mL)，并将该混合物用DCM(3x15mL)萃取。将该有机物浓缩并将该残余物用硅胶柱色谱纯化，得到(9S)-2-氯-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯，其为白色固体(1.3g，92％)。MS(ESI)计算值C15H20ClN3O2:309.1。
步骤6.(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯的合成：
向二噁烷/水(10mL/1mL)的脱气混合物中加入(9S)-2-氯-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯(650mg，2.096mmol)、(5-氯吡啶-3-基)硼酸(658mg，4.19mmol)、Pd(dppf)Cl2(171mg，0.209mmol)和Cs2CO3(2.04g，6.29mmol)。将该混合物在110℃搅拌12h，然后浓缩并用柱色谱(PE/EA＝3/1)纯化，得到(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯(600mg，63％)。MS(ESI)计算值C20H23ClN4O2:386.2。
通过相同方法制备(9S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯。
步骤7.(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的合成：
使用以下方案制备这一部分。将(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酸叔丁酯(600mg，1.55mmol)溶于HCl/MeOH(1M，20mL)并将该反应在室温搅拌1.5h，然后真空浓缩。加入水(20mL)和K2CO3(3g)，并将该混合物在室温搅拌2h，然后用DCM(3x15mL)萃取，得到(9S)-2-(5-氯吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(450mg，定量)。MS(ESI)计算值C15H15ClN4:286.1。
通过相同方法制备(9S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯。
这些部分通过上文实施例所述的一般性脲偶联步骤，用于制备脲化合物。
实施例8.(9S)-2-(5-甲基吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的制备：
使用以下方案制备这一部分。向脱气的1，4-二噁烷/H2O(20ml，v/v＝10/1)中加入(9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(600mg，2.87mmol)、5-甲基吡啶-3-基硼酸(1.18g，3.0当量)、PCy3(644mg，0.8当量)和Pd2(dba)3(330mg，0.2当量)。将该混合物在密封管中加热至110℃。在110℃搅拌12小时后，将该黑色混悬液冷却至室温并减压浓缩。将该浓缩物混悬于EtOAc(300ml)中，用水(4x80ml)、盐水(80ml)洗涤，用Na2SO4干燥并减压浓缩。将该浓缩物用柱(DCM/MeOH＝10/1)纯化，得到产物，其为亮褐色固体(756mg，99％)。MS(ESI)计算值C16H18N4:266.1；实测值：267.2[M+H]。
这些条件也可用于制备(9S)-2-(4-甲基吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯和4-(3-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苯基)吗啉，其以合适的硼酸为起始原料。
所得部分通过上述一般性脲偶联步骤用于制备脲化合物。
实施例9.(9S)-N-(哒嗪-3-基)-2-(吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的制备：
这一部分通过在(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺中描述的类似的氨基甲酸酯方案制备，使用氨基甲酸对氯苯酯代替氨基甲酸苯酯。MS(ESI)计算值C20H19N7O:373.2；实测值：374.3[M+H]。
实施例10.(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(6-(2,3-二羟基丙氧基)吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向6-((2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基)吡嗪-2-胺(83mg，0.37mmol)和吡啶(29mg，1.37mmol)在3mLTHF中的混合物中加入三光气(43mg，0.14mmol)。将上述混合物在60℃搅拌2小时。然后将(4S)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(50mg，0.18mmol)加至该反应混合物中并在60℃搅拌过夜。将粗制产物用制备型TLC纯化，得到该脲中间体，其为黄色固体。向这个原料在THF(3mL)中的溶液中加入浓HCl并将该反应在室温搅拌15min。将饱和NaHCO3加入以调节pH至7-8。将该反应混合物用EtOAc萃取并将该有机层用盐水洗涤。用制备型TLC纯化，得到(4S)-7-(3-氯苯基)-N-(6-(2,3-二羟基丙氧基)吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(8.9mg，40％)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C23H23ClN6O4:482.2；实测值：483.1[M+H]。
这个使用三光气的一般性脲形成步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-氯或-氟苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其也使用(4S)-7-(3-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯和合适的胺部分。
实施例11.(9S)-2-(3-氰基苯基)-N-(吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的制备：
在室温，将DIPEA(97μL，0.54mmol)加至3-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苄腈(50mg，0.18mmol)和三光气(27mg，0.10mmol)在THF(12mL)中的混合物中。将该混合物在60℃加热30分钟。加入3-氨基吡啶(102mg，1.09mmol)并将该反应混合物加热回流32h。冷却至室温后加入CH3OH。将该混合物浓缩并用制备型HPLC纯化。将该TFA盐混悬于CH3CN中，加入1NHCl并将该混合物冻干，得到(9S)-2-(3-氰基苯基)-N-(吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(48mg，61％)，其为盐酸盐。MS(ESI)计算值C23H20N6O:396.2；实测值：397.1[M+H]。
实施例12.(9S)-N-(吡啶-2-基)-2-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的制备:
将该吡啶-2-基氨基甲酸4-氯苯酯(325mg，1.31mmol)、(9S)-2-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(70mg，0.22mmol)和DMAP(160mg，1.31mmol)在DMF(3mL)中的混合物在100℃密封管中加热24h。将该混合物冷却至室温，然后分配在EtOAc/H2O(60mL/30mL)之间。将该有机层分离，用H2O，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将粗制产物用制备型TLC纯化(用CH2Cl2/EtOAc/CH3OH洗脱，120:40:2)，得到(9S)-N-(吡啶-2-基)-2-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺，其为褐色固体(80mg，83％)。MS(ESI)计算值C22H19F3N6O:440.2；实测值：441.2[M+H]。
实施例13.(4S)-N-(2-甲基-2H-吲唑-5-基)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成:
向(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]-二氮杂环庚三烯(500mg，2.55mmol)在脱气二噁烷/H2O(14mL，v/v＝10/1)中的溶液中加入2-甲基吡啶-4-硼酸(1.048g，7.65mmol)、PCy3(286mg，1.02mmol)、K3PO4·3H2O(1.698g，6.375mmol)和Pd2(dba)3(234mg，0.255mmol)。将所得混合物在110℃搅拌过夜。将该混合物冷却至室温然后浓缩。将该残余物分配在EtOAc和水(各50mL)之间。将该有机层用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩至干。将该残余物用硅胶色谱(CH2Cl2/THF＝3/2)纯化，得到(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(418mg，82％)，其为亮黄色固体。MS(ESI)计算值C15H16N4:252.1；实测值：253.2[M+H]。
以下中间体是使用上述方案代替合适的硼酸和2-氯吡啶制备的。2-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)苄腈，5-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)烟腈。
步骤2.(4S)-N-(2-甲基-2H-吲唑-5-基)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向氯甲酸苯酯(0.2mL，1.6mmol)和吡啶(0.16mL，1.95mmol)在CH2Cl2(18mL)中的溶液中加入2-甲基-2H-吲唑-5-胺(180mg，1.22mmol)。将该混合物在室温搅拌30min.，然后用饱和NaHCO3溶液(10mL)淬灭。将水相用CH2Cl2(10mL)萃取。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩至干。将该残余物用己烷(5mLx3)洗涤，得到(2-甲基-2H-吲唑-5-基)氨基甲酸苯酯(304mg，93％)。
将(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(90mg，0.36mmol)、(2-甲基-2H-吲唑-5-基)氨基甲酸苯酯(285mg，1.07mmol)和DMAP(130mg，1.07mmol)在THF(3mL)中的混合物在密封管中加热至80℃。在80℃加热36小时后，然后将该混合物冷却至室温并浓缩。将该残余物混悬于EtOAc(60mL)并过滤。将该滤液用水(20mLx3)洗涤，然后用盐水(20mL)洗涤并用Na2SO4干燥并减压浓缩。将该浓缩物用制备型TLC(CH2Cl2/EtOAc/MeOH＝23/1/数滴)纯化，得到(4S)-N-(2-甲基-2H-吲唑-5-基)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(60mg，40％)，其为棕色固体。MS(ESI)计算值C24H23N7O:425.2；实测值：426.3[M+H]。
这个使用氨基甲酸苯酯的一般性脲形成步骤可用于制备各种(4S)-N-(芳基)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用合适的胺部分。
实施例14：(4S)-N-(2,6-二乙基苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备:
在氮气氛下，向2,6-二乙基苯胺(39.1mg，0.262mmol，2.0当量)和吡啶(0.5ml，过量)在无水THF(3mL)中的混合物中加入三光气(54.4mg，0.183mmol)。将该混合物在60℃搅拌2小时并将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(40mg，0.131mmol，1.0当量)加至该反应混合物并再搅拌18小时。将饱和的碳酸氢钠溶液(5ml)和二氯甲烷(10ml)加至该反应混合物中；将有机层用水(10mL)和盐水依次洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。将粗制产物用制备型TLC纯化，使用15:1的乙酸乙酯/CH2Cl2作为洗脱液，得到(4S)-N-(2,6-二乙基苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色固体(5.1mg，8％产率)。MS(ESI)计算值C27H27F3N4O:480.21；实测值：481[M+H]。
这个使用三光气的一般性脲形成步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-三氟甲基苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的胺部分代替2,6-二乙基苯胺。
实施例15.(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-氯-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成:
将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(400mg，2.04mmol)、吡嗪-2-基氨基甲酸苯酯(1.32g，6.13mmol)和DMAP(249mg，2.04mmol)在DMF(8mL)中的混合物在密封的烧瓶中加热至82℃。加热22小时后，然后将该混合物冷却至室温并用EtOAc(100mL)稀释。将该混合物用水(8mLx9)洗涤，然后用盐水洗涤并用Na2SO4干燥并浓缩。将该残余物用柱色谱(CH2Cl2/MeOH＝50/1)纯化，得到(4S)-7-氯-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(600mg，93％)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C14H13ClN6O:316.1。
这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-氯-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的氨基甲酸酯部分代替吡嗪-2-基氨基甲酸苯酯。
步骤2.(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
在氮气气氛下，向(4S)-7-氯-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(40mg，0.126mmol)、2-甲基吡啶-4-硼酸(44mg),和NaHCO3(32mg)在甲苯/EtOH/H2O(1.9mL，v/v/v＝10/6/3)中的混合物中加入PdCl2(PPh3)2(9mg)。将该反应混合物加热回流6小时。加热另一批2-甲基吡啶-4-硼酸(44mg)、NaHCO3(32mg)和PdCl2(PPh3)2(8mg)并将该混合物脱气。回流搅拌过夜后，将该反应混合物冷却至室温并浓缩。将该浓缩物混悬于EtOAc(30mL)和水(5mL)。将该混悬液水溶液用EtOAc(8mL)萃取。将合并的EtOAc相用盐水(10mL)洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。用制备型TLC(CH2Cl2/MeOH＝50/1)纯化，得到(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(18mg，38％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C20H19N7O:373.2；实测值：374.3[M+H]。
使用PdCl2(PPh3)2的这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和(4S)-7-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用合适的(4S)-7-氯-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和合适的硼酸或硼酸酯。
实施例16.(4S)-7-(3-((R)-3-氟吡咯烷-1-基)苯基)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-7-氯-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(40mg，0.126mmol)、(R)-3-氟-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡咯烷(74mg，0.252mmol)、Pd(OAc)2(2mg，0.0126mmol)、2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯(12mg，0.0252mmol)和Cs2CO3(82mg，0.252mmol)在二噁烷/H2O(1.5mL，v/v＝9/1)中的混合物在110℃密封的烧瓶中加热。加热过夜后，将该混合物冷却并过滤以除去不溶物质。将该滤液用EtOAc(30mL)稀释，用H2O(5mLx2)洗涤，用盐水(5mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用制备型TLC(CH2Cl2/EtOAc＝3/1)纯化，得到(4S)-7-(3-((R)-3-氟吡咯烷-1-基)苯基)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(18mg，32％)，其为淡黄色固体。MS(ESI)计算值C24H24FN7O:445.2；实测值：446.3[M+H]。
这个使用Pd(OAc)2的一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-和2-取代的苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和(4S)-7-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用合适的(4S)-7-氯-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和合适的硼酸或硼酸酯。
实施例17.(4S)-7-(3-((S)-2,3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成:
将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(300mg，1.53mmol)、吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(986mg，4.59mmol)和DMAP(188mg，1.53mmol)在DMF(6mL)中的混合物脱气并在密封的烧瓶中加热至80℃。在80℃搅拌过夜后，将该反应混合物冷却至室温并分配至EtOAc/H2O(150mL/50mL)。将有机相用水(20mLх6)，盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥并减压浓缩。然后将该浓缩物用柱纯化(CH2Cl2/EtOAc＝1/1)，得到(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(409mg，84％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C15H14ClN5O:315.1；实测值：316.1[M+H]。
步骤2.(4S)-7-(3-羟基苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺:
将(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(80mg，0.284mmol)、(3-羟基苯基)硼酸(78mg，0.568mmol)、Pd(OAc)2(6mg，0.0384mmol)、2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯(27mg，0.0568mmol)和Cs2CO3(185mg，0.568mmol)在二噁烷/H2O(3mL，v/v＝9/1)中的混合物脱气并在110℃密封管中加热过夜，然后冷却至室温并减压浓缩。将该浓缩物混悬于EtOAc(20mL)，用水(5mLx2)，盐水(5mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。将该残余物用柱(CH2Cl2/EtOAc＝1/1)纯化，得到(4S)-7-(3-羟基苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(65mg，61％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C21H19N5O2:373.2；实测值：374.2[M+H]。
步骤3.(4S)-7-(3-((S)-2,3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-7-(3-羟基苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(90mg，0.241mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入NaH(24mg，0.603mmol)。在室温搅拌30min后，加入(S)-4-(氯甲基)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷(217mg，1.45mmol)并将该混合物在密封的烧瓶加热至85℃，持续32小时。将该混合物冷却至室温并用EtOAc稀释并用水和盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥并浓缩。将该浓缩物溶于CH2Cl2(3mL)并加入在二噁烷(6mL)中的HCl溶液。将由此得到的混合物在室温搅拌4小时。减压除去溶剂并将该浓缩物混悬于饱和NaHCO3(5mL)。将该混合物用CH2Cl2(5mLx3)萃取并将合并的有机相用Na2SO4干燥并浓缩。用制备型TLC纯化，得到(4S)-7-(3-((S)-2,3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(24mg，33％)，其为灰白色粉末。MS(ESI)计算值C24H25N5O4:447.2；实测值：448.3[M+H]。
这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(3-((S)-2,3-二羟基丙氧基)苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用合适的(4S)-7-(3-羟基苯基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
实施例18.(4S)-7-(1-丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-氯-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(999mg，3.26mmol，1.0当量)与DIEA(1.7mL，9.78mmol，3.0当量)合并至二氯甲烷(30mL)并在冰浴上冷却至0℃。然后分若干小批量加入三光气(482mg，1.63mmol，0.5当量)至该搅拌溶液。移除该冰浴并将该反应温热至室温。然后将该反应搅拌过夜。然后分小批缓慢加入吡啶-3-胺(800mg，3.60mmol，1.1当量)，经数分钟。然后将该混合物在室温搅拌2小时。然后将该混合物用水(100mL)处理，用EtOAc(100mL)稀释。分离各相并将有机相用Na2SO4干燥并浓缩。将该残余物用柱色谱纯化，使用15-100％的梯度(EtOAc/戊烷)，得到(4S)-7-氯-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(761mg，产率47％)。MS(ESI)计算值C15H14ClN5O315.1；实测值：315.7[M+H]。
步骤2.(4S)-7-(1-丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺:
使用以下方案制备标题化合物：将(4S)-7-氯-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(100mg，0.32mmol，1.0当量)、1-乙基-1H-吡唑-4-硼酸(151mg，0.64mmol，2.0当量)、Pd(dppf)Cl2(26.7mg，0.06mmol，0.2当量)和Cs2CO3(208mg，0.64mmol，2.0当量)在二噁烷/H2O(5mL)中的混合物在100℃搅拌6h。加入水并将该混合物用EtOAc萃取。将有机物用无水Na2SO4干燥，浓缩并用制备型TLC纯化，得到(4S)-7-(1-丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(37.1mg，产率30％)。MS(ESI)计算值C21H23N7O389.2；实测值：390.3[M+H]。
使用Pd(dppf)Cl2的这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(吡啶-3-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的硼酸或硼酸酯部分代替2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-硼酸。
实施例19：(4S)-7-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.3-(吡啶-2-基)-2H-吡啶并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮的合成：
使用以下方案制备标题化合物：将10.0g吡啶-2-甲酸(81.2mmol，1当量)混悬于250mL甲苯中。加入20.0mL的叠氮磷酸二苯酯(92.6mmol，1.14当量)。滴加13.4mL三乙胺(95.8mmol，1.18当量)。将该反应混合物在室温搅拌30分钟，然后在80℃搅拌2小时。将该反应混合物冷却至室温。将固体过滤并用乙酸乙酯和戊烷洗涤。将该固体在高真空下干燥。得到6.46g(66％产率)棕色固体。MS(ESI)计算值C15H14ClN5O:240.06；实测值：241.31[M+H]。
这个一般性步骤可用于制备3-(吡啶-2-基)-2H-吡啶并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮和3-(吡嗪-2-基)-2H-吡嗪并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮，其通过替代为合适的杂芳基羧酸，该杂芳基羧酸在6元芳环的2位上具有氮杂原子。
步骤2.(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
使用以下方案制备标题化合物：在室温，将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(2.0g，10.2mmol，1.0当量)溶于2-甲基-四氢呋喃(40mL)并用NaH(1.7g，30.6mmol，3.0当量)处理。然后将所得混合物在室温搅拌30分钟。然后加入3-(吡啶-2-基)-2H-吡啶并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮(2.4g，10.2mmol，1.0当量)且然后将该反应装上回流冷凝器并加热至80℃过夜。然后将该反应冷却至室温，置于冰浴，并通过缓慢加入NaHCO3(65mL)淬灭。然后将该粗反应用EtOAc萃取3次(各75mL)并将有机物用无水MgSO4干燥并浓缩。将该反应用柱色谱纯化，使用10-100％梯度的EtOAc/戊烷，得到(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(2.5g，78％)。MS(ESI)计算值C15H14ClN5O:315.09；实测值：316.10[M+H]。
步骤3.(4S)-7-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(79mg，0.250mmols，1.0当量)与Pd2(dba)3(2.3mg，0.006mmols，0.02当量)、K3PO4(80mg，0.380mmols，2当量)、S-Phos(4.8mg，0.012mmol，0.05当量)合并并将该烧瓶用氮气吹扫并密封。然后通过注射器加入正丁醇(1mL)并将该反应加热至100℃，持续3小时。然后将该反应冷却至室温过滤，然后直接用反相色谱纯化，使用5-95％梯度的CH3CN/H2O(0.1％TFA)，得到(4S)-7-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(11mg，10％)。C15H14ClN5O:437.13；实测值：438.17[M+H]。
使用Pd(dppf)Cl2的这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(吡啶-2-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和(4S)-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的硼酸或硼酸酯部分代替2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-硼酸。
实施例20.(4S)-N-(5-氟吡啶-2-基)-7-(2-(3-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-氯-N-(5-氟吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(280mg，1.43mmol)、(5-氟吡啶-2-基)氨基甲酸4-氯苯酯(1.14g，4.29mmol)和DMAP(174mg，1.43mmol)在DMF(7mL)中的混合物在密封的烧瓶中加热至80℃。在80℃搅拌过夜后，将该反应混合物冷却至室温并用EtOAc(100mL)稀释。将有机相用水(50mLx1，10mLх6)洗涤，然后用盐水(50mL)洗涤并用Na2SO4干燥并浓缩。然后将该浓缩物用柱纯化(CH2Cl2/EtOAc＝1/1)，得到(4S)-7-氯-N-(5-氟吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(360mg，75％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C15H13ClFN5O:333.1。
步骤2.(4S)-N-(5-氟吡啶-2-基)-7-(2-(3-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-氯-N-(5-氟吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(50mg，0.149mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2-(3-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)吡啶(102mg，0.298mmol)、PCy3(8mg，0.0298mmol)、Pd2(dba)3(14mg，0.0149mmol)和K3PO4·3H2O(79mg，0.373mmol)在脱气的二噁烷/H2O(2mL，v/v＝9/1)中的混合物在密封的烧瓶中加热至120℃。搅拌过夜后，将该混合物冷却至室温并用EtOAc(60mL)稀释。将该稀溶液用H2O(20mLx1，10mLx5)和盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用制备型TLC(CH2Cl2/EtOAc/MeOH＝3/1/2滴)纯化，得到(4S)-N-(5-氟吡啶-2-基)-7-(2-(3-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)吡啶-4-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(54mg，71％)，其为灰白色固体。MS(ESI)计算值C25H23F4N7O:513.2；实测值：514.3[M+H]。
使用Pd2(dba)3的这个一般性步骤可用于制备各种(4S)-7-(2-(3-取代的-吡咯烷-1-基)吡啶-4-基)-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其使用合适的(4S)-7-氯-N-(芳基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和合适的硼酸或硼酸酯。
实施例21.(4S)-7-(3-氯苯基)-9-甲氧基-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.2,6-二氯-4-甲氧基吡啶的合成：
向2,4,6-三氯吡啶(30g，165mmol)在MeOH中的溶液中缓慢加入甲醇钠(10.7g，197mmol)。将该混合物搅拌过夜并用300ml水淬灭。将该混悬液过滤，用水和石油醚洗涤，得到2,6-二氯-4-甲氧基吡啶，其为白色固体(18g，61％产率)。MS(ESI)计算值C6H5Cl2NO:176.97。
步骤2.2,6-二氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶的合成:
在0℃，向2,6-二氯-4-甲氧基吡啶(18.1g，102mmol)在硫酸(110mL)中的溶液中滴加硝酸(15.6mL)，和然后将该混合物加热至100℃，持续2小时。将该反应混合物倒入冰水中，并将该混悬液过滤并用水洗涤，得到2,6-二氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶，其为白色固体(19.9g，88％产率)。MS(ESI)计算值C6H4Cl2N2O3:221.96。
步骤3.(S)-2-((6-氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二-叔丁酯的合成：
向2,6-二氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶(14.5g，65mmol)和(S)-1,4-二-叔丁氧基-1,4-二氧代丁基-2-铵氯化物(22g，78mmol)在DMF(150mL)中的溶液中加入DIEA(32.3mL)并将该混合物加热至80℃，持续3小时。真空除去DMF并将该残余物溶于乙酸乙酯，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并用快速色谱纯化(10％乙酸乙酯/石油醚)，得到(S)-2-((6-氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二-叔丁酯，其为黄色油状物(4.8g，16％产率)。MS(ESI)计算值C18H26ClN3O7:431.15。
步骤4.(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸叔丁酯的合成：
向(S)-2-((6-氯-4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-基)氨基)丁二酸二-叔丁酯(4.7g，10.9mmol)在AcOH(60ml)中的混合物中加入铁粉(6.107g，109mmol)并将该反应混合物在100℃搅拌2小时。将该反应用1NNaOH淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机物用盐水洗涤并用快速色谱纯化(40％乙酸乙酯/石油醚)，得到(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸叔丁酯，其为黄色油状物(1.87g，52％产率)。MS(ESI)计算值C14H18ClN3O4:327.10。
步骤5.(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇的合成：
向(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙酸叔丁酯(1.7g，5.2mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入BH3-Me2S(5.2mL，10M在Me2S中，52mL)和然后将该反应混合物在50℃加热过夜。一旦冷却至室温，将该反应通过滴加水淬灭，然后加入1NHCl水溶液(10mL)并将该混合物在50℃搅拌2小时。加入饱和的NaHCO3并将该混合物用CH2Cl2萃取并浓缩成油状物。将该油状物用TFA(15mL)的CH2Cl2(15mL)溶液处理2小时并将DCM和TFA在真空下除去。将该残余物溶于MeOH(20mL)并加入Cs2CO3(2g)。将该混合物搅拌1小时，浓缩并用快速色谱纯化(30:1CH2Cl2/MeOH)，得到(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇，其为黄色油状物(997mg，79％产率)。MS(ESI)计算值C10H14ClN3O2:243.08。
步骤6.(4S)-7-氯-9-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
向PPh3(1.003g，3.83mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中加入DDQ(869mg，3.83mmol)，然后加入(S)-2-(6-氯-8-甲氧基-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙醇(620mg，2.55mmol)。将该混合物搅拌30min，浓缩并用快速色谱纯化(33-100％乙酸乙酯/石油醚)，得到(4S)-7-氯-9-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其为黄色固体(413mg，72％产率)。MS(ESI)计算值C10H12ClN3O:225.07。
步骤7.(4S)-7-(3-氯苯基)-9-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
将(4S)-7-氯-9-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(226mg，1.0mmol、(3-氯苯基)硼酸(187mg，1.2mmol)、Cs2CO3(654mg，2.0mmol)和Pd(dppf)Cl2.DCM(40mg，0.05mmol)在10:1二噁烷/水(6mL)溶液中的混合物微波加热(130℃x1h)。将该反应混合物浓缩至干，混悬于CH2Cl2中，用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。将该反应混合物先用硅胶色谱纯化(0-10％梯度的MeOH/CH2Cl2)，并随后用制备型HPLC纯化。将该反应以相同规模重复两次，并将合并的HPLC级分冻干，得到(4S)-9-甲氧基-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(199mg，33％产率)。MS(ESI)计算值C16H16ClN3O:301.10；实测值：302[M+H]。
这个一般性步骤可用于制备(4S)-9-甲氧基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其用(3-(三氟甲基)苯基)硼酸代替(3-氯苯基)硼酸。
步骤8.(4S)-7-(3-氯苯基)-9-甲氧基-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-7-(3-氯苯基)-9-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(60mg，0.2mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入60％NaH在矿物油中的混悬液(24mg，1mmol)。将该混合物加热回流1小时，加入3-(吡嗪-2-基)-2H-吡嗪并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮(73mg，0.3mmol)并将该混合物再加热回流2小时。将该反应混合物冷却至室温，浓缩至干，用饱和NaHCO3稀释,并用CH2Cl2(3x)萃取。将有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩并用制备型HPLC纯化和冻干，得到(4S)-7-(3-氯苯基)-9-甲氧基-N-(吡嗪-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(54mg，64％产率)。MS(ESI)计算值C21H19ClN6O2:422.13；实测值：423[M+H]。
实施例22.(4S)-9-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(191.6mg，0.8995mmol)、(4S)-9-甲氧基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(150mg，0.4477mmol)和DMAP(65.55mg，0.5373mmol)在15ml乙腈中的混合物在60℃搅拌过夜。将该混合物直接上样至制备型TLC并纯化(使用乙酸乙酯作为洗脱液)，得到(4S)-9-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色固体(150mg，产率:74％)。MS(ESI)计算值C23H20F3N5O2:455.2；实测值：456[M+H]。
这个一般性步骤可用于制备(4S)-9-甲氧基-N-(芳基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的氨基甲酸酯部分代替吡啶-2-基氨基甲酸苯酯。
实施例23.(4S)-9-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
在0℃氮气氛下，向(4S)-9-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(50mg，0.1098mmol)在3ml的无水CH2Cl2中的混合物中滴加BBr3(0.5mL，0.5494mmol)。然后将该反应混合物在50℃搅拌过夜。将碳酸氢钠溶液(5mL)和二氯甲烷(10mL)加至该反应混合物并将该有机层用水，盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将粗制产物用制备型TLC纯化，使用(1:20MeOH/CH2Cl2)作为洗脱液，得到(4S)-9-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色固体(18mg，35％产率)。MS(ESI)计算值C22H18F3N5O2:441.1；实测值：442[M+H]。
这个一般性步骤可用于制备((4S)-9-羟基-N-(芳基)-7-(3(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的(4S)-9-甲氧基-N-(芳基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺代替(4S)-9-甲氧基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
实施例24.(4S)-N-(4-((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯(diazirin)-3-基)丙酰胺基)甲基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺盐酸盐(49mg，0.1mmol)、3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(23mg，0.1mmol)和三乙胺(70μL，0.5mmol)在DMF(2mL)中的溶液在室温搅拌1小时。加入水(10mL)和饱和NaHCO3(5mL)，并将该反应混合物用CH2Cl2(3x)萃取并浓缩至干。将粗制产物在硅胶色谱上纯化(0-10％梯度的MeOH/CH2Cl2)，浓缩，用乙醚和戊烷加工，并真空干燥，得到(4S)-N-(4-((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙酰胺基)甲基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色泡沫(39mg，68％产率)。MS(ESI)计算值C29H28F3N7O2:563.23；实测值：564[M+H]。
实施例25：(4S)-N-(3-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂环丙烯-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(46mg，0.15mmol)和三光气(36mg，120mmol)在CH2Cl2(2mL)中的溶液中加入三乙胺(56μL，0.45mmol)。将该反应混合物在40℃搅拌2.5小时并加入溶于CH2Cl2(1mL)中的3-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂环丙烯-3-基)苯胺(40mg，0.2mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2小时。将该有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。将该残余物用快速色谱纯化(先用0-100％梯度的CH2Cl2/戊烷洗脱，然后用0-10％梯度的MeOH/CH2Cl2洗脱)，得到(4S)-N-(3-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂环丙烯-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(40mg，50％产率)。MS(ESI)计算值C25H18F6N6O:532.14；实测值：533[M+H]。
根据BiasottiB.等人，BioorganicandMedicinalChemistry，2003，11，2247-2254制备上述3-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂环丙烯-3-基)苯胺。
这个一般性步骤用于制备各种(3-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂环丙烯-3-基)苯基)脲，其用合适的胺代替(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯。
实施例26.(3R,4R)-7-氯-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的制备：
步骤1.(S)-2-苯甲酰氨基丁二酸二甲酯的合成。
向装有温度计、冷凝器和机械搅拌器的5L三颈烧瓶中加入161g(1.00mol)L-天冬氨酸二甲酯、2500mL二氯甲烷和198g(1.96mol)三乙胺。将该溶液冷却至-5℃，然后滴加156g(1.11mol)苯甲酰氯，保持内部温度在–5℃。将该混合物在-5℃搅拌1h，然后将其过滤。将该沉淀物用额外的二氯甲烷洗涤三次，然后将合并的滤液和洗涤液用饱和K2CO3水溶液萃取。将二氯甲烷层用Na2SO4干燥，然后真空浓缩，得到200g(75％)产物，其为白色固体。MS(ESI)计算值C13H15NO5:265.1。
步骤2.(4S,5S)-2-苯基-4,5-二氢噁唑-4,5-二甲酸二甲酯的合成。
向装有温度计、机械搅拌器和N2进口的10L四颈烧瓶中加入100g(0.377mol)(S)-2-苯甲酰胺基丁二酸二甲酯，然后加入4L无水四氢呋喃。将该混合物搅拌并冷却至0℃。向该溶液中加入770mL(0.77mol)1.0M双(三甲基硅基)氨基锂在四氢呋喃中的溶液，在加入过程中保持内部温度在0℃。将该反应在0℃搅拌30min，然后将其冷却至–78℃。在-78℃，向其中滴加195g(0.77mol)碘在2L四氢呋喃中的溶液。将该反应在-78℃搅拌1h，然后将其通过加入2L饱和的NH4Cl(水溶液)和400g(2.53mol)Na2S2O3淬灭。将该混合物在室温搅拌30min，然后加入2L乙酸乙酯并分离各层。将水相用额外的乙酸乙酯(3x2L)萃取。将合并的乙酸乙酯层用Na2SO4干燥并然后真空浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用20:1(v/v)庚烷:乙酸乙酯洗脱，得到30g(30％)的产物，其为白色固体。MS(ESI)计算值C13H13NO5:263.1。
步骤3.(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸的合成。
向装有回流冷凝器的500mL烧瓶中加入13g(50mmol)(4S,5S)-2-苯基-4,5-二氢噁唑-4,5-二甲酸二甲酯和200mL(2.4mol)12MHCl(水溶液)。将该反应在50℃搅拌16h，然后将溶剂真空除去。将残余物溶于1000mL水，并用乙酸乙酯萃取直至用HPLC监测水层不存在苯甲酸。将该有机层废弃，并将水层真空浓缩，得到8.6g(94％)(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸盐酸盐，其为白色结晶固体。MS(ESI)计算值C4H7NO5:149.0。
步骤4.(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸二甲酯的合成。
向装有回流冷凝器的500mL三颈烧瓶中加入170mL甲醇。将该甲醇冷却至-5℃，然后滴加23.6g(198mmol)SOCl2。加入完成后，加入8.6g(46mmol)(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸HCl盐并将该溶液在室温搅拌16h。将该溶剂真空除去，得到粗制的(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸二甲酯HCl盐，其为黄色油状物，其用于下一步而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C6H11NO5:177.1。
步骤5.(2S,3S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯的合成。
向装有回流冷凝器的500mL圆底烧瓶中加入18g(84.3mmol)(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸二甲酯HCl、29g(150mmol)2,6-二氯-3-硝基吡啶、42.5gNaHCO3(506mmol)和350mLTHF。将该反应在40℃搅拌36h。将该固体过滤掉并用额外的THF(30mLx3)洗涤。将该滤液和洗涤液合并并真空浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用5:1(v/v)-1:1(v/v)梯度的庚烷:乙酸乙酯洗脱，得到22g(63％)2S,3S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯，其为黄色结晶固体。MS(ESI)计算值C11H12ClN3O7:333.0。
这一步骤可用于制备2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯，其用2-氨基-3-羟基丁二酸二甲酯盐酸盐代替(2S,3S)-2-氨基-3-羟基丁二酸二甲酯盐酸盐。
步骤6.(S)-2-((S)-6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-2-羟基乙酸甲酯的合成。
将10gRaneyNi在H2O中的浆液倾倒以除去水，用2-丙醇稀释并再次倾倒，得到湿重为10g的混合物。向500mL烧瓶中加入10g(30mmol)(2S,3S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯、200mL2-丙醇，然后加入10gRaneyNi。将该反应置于真空下并用氮气回充3次，然后将其在1atm.氢气下搅拌3h，或直至用HPLC监测不到残留的起始硝基化合物。将该RaneyNi过滤掉，然后将该滤液放置500mL圆底烧瓶中，并加入5mL(87mmol)冰醋酸。将该烧瓶装上回流冷凝器，然后将该反应在80℃搅拌16h，直至用HPLC监测不到中间体二氨基吡啶的存在。真空除去溶剂。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用5/1(v/v)庚烷/乙酸乙酯洗脱，得到6g(72％)的产物，其为亮黄色固体。MS(ESI)计算值C10H10ClN3O4:271.0。
这一步骤可用于制备2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-2-羟基乙酸甲酯，其用2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯代替(2S,3S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)-3-羟基丁二酸二甲酯。
步骤7.(S)-1-((R)-6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙烷-1,2-二醇的合成。
向装有回流冷凝器和温度计的100mL3-颈圆底烧瓶中加入20mL四氢呋喃，然后加入1.19g(30mmol)LiAlH4。将该搅拌混合物冷却至-5℃，然后滴加0.5g(2mmol)(S)-2-((S)-6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-2-羟基乙酸甲酯在20mL四氢呋喃中的溶液。将该反应在70℃搅拌16h，或直至HPLC监测该反应完成。(内酰胺还原晚于酯还原。)将该反应冷却至–10℃，然后滴加1.2mL水，并将该反应搅拌10min。接下来，滴加1.2mL15％(w/v)NaOH(水溶液)，并将该反应搅拌20min。为了完成过量LiAlH4的淬灭，再滴加3.6mL水，然后将该反应搅拌20min。将该反应过滤，并将该沉淀物用四氢呋喃(3x20mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，得到约1.5g固体。将其用16mL乙酸乙酯稀释并过滤。将该滤液真空浓缩，得到310mg(80％)的产物，其为棕色固体。MS(ESI)计算值C9H12ClN3O2:229.1。
这一步骤可用于制备1-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙烷-1,2-二醇，其用2-((S)-6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-2-羟基乙酸甲酯代替(S)-2-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-2-羟基乙酸甲酯。
步骤8.(1S,4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇的合成。
向装有回流冷凝器的10mL圆底烧瓶中加入250mg(1.1mmol)(S)-1-((R)-6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙烷-1,2-二醇，然后加入5mL48％HBr(水溶液)。将该反应在105℃加热16h，或直至HPLC显示所有起始原料均已被耗尽。将该反应冷却，然后缓慢加入K2CO3(S)直至pH＝8。将溶剂真空除去，然后将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用20/1(v/v)二氯甲烷/甲醇洗脱，得到110mg(47％)的产物，其为白色结晶固体。MS(ESI)计算值C9H10ClN3O:211.1。
这一步骤可用于制备7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇，其用6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙烷-1,2-二醇代替(S)-1-((R)-1-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)乙烷-1,2-二醇。
步骤9.(1S,4R)-7-氯-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成。
向10mL圆底烧瓶中加入1.68g(7.9mmol)(1S,4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇、5mLN,N-二甲基甲酰胺和2.8mL(24mmol)2,6-二甲基吡啶。将该混合物搅拌直至均匀，然后在室温滴加1.5mL(12mmol)三甲基氯硅烷。将该反应在室温搅拌3h，然后将其用100mL二氯甲烷稀释，并用饱和的NaHCO3(水溶液)(1x50mL)萃取，然后用盐水(3x50mL)萃取，并真空浓缩，得到2.04g(91％)的产物，其为白色结晶固体。MS(ESI)计算值C12H18ClN3OSi:283.1。
这一步骤可用于制备7-氯-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其用7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇代替(1S,4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇。
实施例27.(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的制备：
将(3R,4R)-7-氯-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(283mg，1.0mmol)、(3-(三氟甲基)苯基)硼酸(285mg，1.5mmol)、XPhos(24mg，0.05mmol)、Pd(OAc)2(5.6mg，0.025mmol)、Cs2CO3(977mg，3.0mmol)在10:1二噁烷:水(8.8mL)中的混合物脱气并在100℃微波加热25min。将二噁烷层浓缩并用快速色谱纯化(0-7％梯度的MeOH/CH2Cl2)，得到(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯。将该级分浓缩，溶于EtOAc，用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(338mg，85％产率)。MS(ESI)计算值C19H22F3N3OSi:393.15；实测值：394[M+H]。
使用氢化钠的这个一般性偶联步骤可用于制备(3R,4R)-3-羟基-N-芳基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的芳基异氰酸酯或芳基异氰酸酯二聚体代替3-(吡啶-2-基)-2H-吡啶并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮。可制备非立体特异性系列，以7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯为起始原料。
实施例28.(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(215mg，0.55mmol)和60％NaH的矿物油悬浮液(66mg，1.65mmol)在THF(30mL)中的溶液加热回流20min。加入3-(吡啶-2-基)-2H-吡啶并[1,2-a][1,3,5]三嗪-2,4(3H)-二酮(197mg，0.82mmol)并将该反应混合物加热回流2小时。将该反应混合物冷却，浓缩至干，用CH2Cl2稀释。将该有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩至干。将该残余物用制备型HPLC纯化，并将该级分浓缩至干并用乙醚和戊烷的混合物研磨，得到(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐，其为白色固体(132mg，44％产率)。MS(ESI)计算值C22H18F3N5O2:441.14；实测值：442[M+H]。
实施例29.(4R)-3-氧代-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(92mg，0.166mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(105mg，0.25mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1.5小时。加入第二等份的戴斯-马丁高碘烷(105mg，0.25mmol)并将该反应混合物在室温搅拌0.5小时。加入饱和NaHCO3(水溶液)溶液并将该反应混合物用CH2Cl2萃取。将该有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩成白色泡沫。将该残余物用快速色谱纯化(0-100％乙酸乙酯/戊烷)，和然后用制备型HPLC纯化并冻干，得到(4R)-3-氧代-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(62mg，67％产率)。MS(ESI)计算值C22H16F3N5O2:439.13；实测值：440[M+H]。
这个一般性步骤用于制备(4R)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-3-氧代-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用(3R,4R)-3-羟基-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺代替(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
实施例30.(3S,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
在-78℃氮气氛下，向(4R)-3-氧代-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(50mg，0.09mmol)在THF(10mL)中的溶液中滴加1MSuperHydride在THF(0.45mL，0.45mmol)中的溶液。将该反应混合物在-78℃搅拌30min，通过加入EtOAc(5mL)淬灭，温热至室温并浓缩。将该残余物用快速色谱纯化(0-10％梯度的MeOH/CH2Cl2)，得到(3S,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(22mg，55％产率)。MS(ESI)计算值C22H18F3N5O2:441.14；实测值：442[M+H]。
实施例31.乙酸(3S,4R)-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-基酯的制备：
向(3S,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(15mg，0.034mmol)在CH2Cl2中的溶液中加入三乙胺(10μL，0.07mmol)，然后加入DMAP(1mg)和乙酸酐(10μL，0.011mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2小时，浓缩至干并用制备型HPLC纯化。将该级分冻干，得到乙酸(3S,4R)-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-基酯2,2,2-三氟乙酸盐(5.9mg，29％产率)。MS(ESI)计算值C24H20F3N5O3:483.15；实测值：484[M+H]。
这个一般性步骤用于制备乙酸(3R,4R)-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-基酯，其用(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺代替(3S,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
这个一般性步骤用于制备苯甲酸(3R,4R)-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-基酯，其用(3R,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺代替(3S,4R)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，用苯甲酸酐代替乙酸酐。
实施例32.(3R,4R)-3-羟基-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(284mg，0.722mmol)、(3-(噁唑-5-基)苯基)氨基甲酸苯酯(404mg，1.44mmol)和DMAP(44mg，0.36mmol)在CH3CN(20mL)中的溶液在60℃加热(过夜)和然后在80℃加热(2h)。然后向该反应混合物中加入额外量的(3-(噁唑-5-基)苯基)氨基甲酸苯酯(202mg，0.72mmol)和DMAP(88mg，0.72mmol)。将该反应混合物在80℃加热过夜并浓缩至干。将该反应混合物先用柱色谱纯化(0-100％梯度的乙酸乙酯/戊烷)和然后用制备型HPLC纯化并冻干，得到(3R,4R)-3-羟基-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的三氟乙酸盐(161mg，36％)。MS(ESI)计算值C26H20F3N5O3:507.15；实测值：508[M+H]。
实施例33.(3R,4R)-7-(3-氯苯基)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
在-20℃氮气下，将TBSOTf(111mg，0.42mmol)缓慢加至(3R,4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇(90mg，0.28mmol)在2mLCH2Cl2中的溶液中。将该混合物搅拌1h，然后用1NHCl和水洗涤，用无水Na2SO4干燥并蒸发至干。将该残余物用制备型TLC纯化(DCM/EA＝20:1)，得到(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其为黄色固体(90mg，73％产率)，MS(ESI)计算值C15H24ClN3OSi:325.14；
步骤2.(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成。
将(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.08g，3.32mmol)、(3-氯苯基)硼酸(570mg，3.65mmol)、CS2CO3(2.48g，7.63mmol)、Pd(dppf)Cl2(300mg，0.33mmol)在二噁烷/H2O(11mL，10:1)中的混合物在130℃微波反应器中加热2.5h。将该混合物倒入水中，并用EtOAc稀释。有机相用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并蒸发至干。将该残余物用制备型HPLC纯化，得到(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其为亮黄色固体(850mg，63％产率)，MS(ESI)计算值C21H28ClN3OSi:401.17；
这个一般性步骤用于制备(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯。
步骤3.(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(86mg，0.20mmol)，(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(80mg，0.20mmol)和DMAP(24mg，0.20mmol)在5mlMeCN中的混合物在65℃搅拌过夜。将该粗制反应混合物用制备型TLC纯化，用DCM:EA＝20:1洗脱，得到(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(110mg)。MS(ESI)计算值C27H32ClN3O2Si:521.2；
步骤4.(3R,4R)-7-(3-氯苯基)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(110mg，0.21mmol)在10mLTHF和浓HCl(1mL)中的溶液在室温搅拌48h。将该混合物减压浓缩。将该pH用饱和NaHCO3水溶液调节至8。将该混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将该残余物在EtOAc中研磨，得到(3R,4R)-7-(3-氯苯基)-3-羟基-N-(吡啶-2-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(34mg，39％产率)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C21H18ClN5O2:407.1；实测值：408[M+H]。
实施例34.(3R,4R)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3-羟基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备:
步骤1.(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇的合成：
将(3R,4R)-7-氯-3-((三甲基硅基)氧基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1g，3.53mmol)、((3-三氟甲基)苯基)硼酸(1.34g，7.06mmol)、CS2CO3(3.44g，10.6mmol)、Pd(dppf)Cl2(300mg，0.35mmol)在二噁烷/H2O(30mL，10:1)中的混合物在130℃微波反应2.5h。然后将该反应混合物倒入水中，用EtOAc萃取，用水洗涤，然后用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩。将该残余物通过硅胶色谱纯化(PE/EA＝4:1)，得到(3R,4R)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇(600mg，39％产率)。MS(ESI)计算值C16H14F3N3O:321.1；
步骤2.(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
将TBSCl(338mg，2.24mmol)、(3R,4R)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-3-醇(600mg，1.87mmol)、三乙胺(415mg，4.11mmol)和DMAP(22mg，0.20mmol)的混合物搅拌48h。需要额外的TBSCl和TEA来消耗起始原料。将粗制的残余物用柱色谱纯化，得到(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(90mg，73％产率)。MS(ESI)计算值C22H28F3N3OSi:435.20；
步骤3.(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4,5-二甲基噻唑-2-基)氨基甲酸苯酯(25mg，0.10mmol)、(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(30mg，0.05mmol)和DMAP(6mg，0.05mmol)在5mlMeCN中的混合物在65℃搅拌过夜。将该粗制的反应混合物用制备型TLC纯化，得到(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(30mg，定量)。MS(ESI)计算值C28H34F3N5O2SSi:589.22；
步骤4.(3R,4R)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3-羟基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(3R,4R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(30mg，0.051mmol)在THF(2mL)中的溶液中加入TBAF/THF(0.1mL，0.1mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，倒至水中并用EtOAc萃取。将该有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。将该残余物用制备型TLC纯化(EtOAc)，得到(3R,4R)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3-羟基-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色固体(12mg，50％产率)。MS(ESI)计算值C22H20F3N5O2S:475.13；实测值：476[M+H]。
实施例35：(4S)-N-(4-(噁唑-5-基)吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向冷却至0℃的4-(噁唑-5-基)吡啶-2-胺(500mg，3.10mmol)在吡啶(780μL，9.65mmol)和二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入氯甲酸苯酯(466μL，3.72mmol)，持续1.5h。将该反应在0℃搅拌2h。缓慢加入水(15mL)，并加入额外的二氯甲烷。将该有机层分离，用饱和碳酸钠(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用硫酸钠干燥，并将所有溶剂真空除去。将该残余物混悬于5:1石油醚:乙酸乙酯，持续30min，然后将混悬液过滤以得到(4-(噁唑-5-基)吡啶-2-基)氨基甲酸苯酯(547mg，1.94mmol，63％产率)。
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(110mg，0.361mmol)、(4-(噁唑-5-基)吡啶-2-基)氨基甲酸苯酯(203mg，0.722mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(53.0mg，0.434mmol)在乙腈(5mL)中的溶液在60℃搅拌过夜。将该混合物用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(4-(噁唑-5-基)吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(24.3mg，0.0493mmol，14％产率)。MS(ESI)计算值C25H19F3N6O2:492.2；实测值：493.2[M+H]。
实施例36：(4S)-N-(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
步骤1.(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)氨基甲酸苯酯的合成：
将3,5-双(噁唑-5-基)苯胺(100mg，0.44mmol)、氯甲酸苯酯(76mg，0.48mmol)和吡啶(0.20mL)在二氯甲烷(15mL)中的混合物在室温搅拌2h。将该溶剂真空除去，并将剩余物用制备型TLC纯化(1:1石油醚:乙酸乙酯)，得到(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)氨基甲酸苯酯(140mg，0.40mmol，92％产率)。MS(ESI)计算值C19H13N3O4:347.1。
步骤2.(4S)-N-(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(70mg，0.23mmol)、(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)氨基甲酸苯酯(140mg，0.40mmol)和DMAP(56mg，0.46mmol)在乙腈(2mL)中的混合物回流过夜。将溶剂真空除去，将该剩余残余物用制备型TLC纯化(10:1二氯甲烷:甲醇)，得到(4S)-N-(3,5-双(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(13.7mg，0.0245mmol，11％产率)。MS(ESI)计算值C29H21F3N6O3:558.2；实测值：559.0。
实施例37.((1-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的制备：
向三光气(214mg，0.721mmol)在乙腈(5mL)中的溶液中加入((1-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(417mg，1.44mmol)在乙腈(5mL)中的溶液和三乙胺(2mL)。将所得混悬液在室温搅拌10min，然后加入为固体的(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(化合物#；302mg，0.989mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(122mg，1.00mmol)。将该反应在80℃搅拌15min。将该反应冷却至室温，加入甲醇(2mL)，并将该反应倾倒至饱和碳酸氢钠(50mL)，并用二氯甲烷(3x50mL)萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，将溶剂真空除去，并将剩余物用快速色谱纯化(0％-8％甲醇/二氯甲烷)，得到((1-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(579mg，0.933mmol，94％产率)。MS(ESI)计算值C31H31F3N8O3:620.3；实测值：621.0[M+H]。
实施例38.(4S)-N-(3-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将((1-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(160mg，0.258mmol)溶于三氟乙酸(1.6mL)。将该反应在50℃搅拌10min，然后将全部溶剂真空除去，得到(4S)-N-(3-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺三氟乙酸盐(164mg，0.258mmol，100％产率)。MS(ESI)计算值C26H23F3N8O:520.2；实测值：521.0[M+H]。
实施例39：(4S)-N-(6-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
步骤1：(4S)-N-(6-溴吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向三光气(1.81g，6.10mmol)在乙腈(25mL)中的溶液中加入6-溴吡啶-2-胺(2.26g，13.1mmol)在乙腈(25mL)中的溶液。加入三乙胺(8.00mL，57.4mmol)，并将该反应在80℃搅拌30min。加入为固体的(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.04g，3.41mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(410mg，3.36mmol)，并将该反应在80℃搅拌1h。将该反应冷却至室温，倒至水(30mL)中，并用二氯甲烷(2x50mL)萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，并将全部溶剂真空除去。将剩余的残余物用快速色谱纯化(30％-100％乙酸乙酯/戊烷)，得到(4S)-N-(6-溴吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(1.12g，2.22mmol，65％产率)。MS(ESI)计算值C22H17BrF3N5O:503.1；实测值：503.8[M+H]。
步骤2：(4S)-N-(6-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
向微波小瓶中装入(4S)-N-(6-溴吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(46.0mg，0.0912mmol)、四(三苯基膦)钯(4.8mg，0.0042mmol)、氟化铯(180mg，1.18mmol)、1-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(60.0mg，0.288mmol)、DME(1.5mL)和水(150μL)。将该微波小瓶密封，并在100℃微波中加热3h。将有机层分离，并将水层用10:1乙酸乙酯:甲醇(2x2mL)萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，将溶剂真空除去，并将剩余残余物溶于DMSO(4mL)，过滤并将该滤液用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(6-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺三氟乙酸盐(28.4mg，0.0460mmol，50％产率)。MS(ESI)计算值C26H22F3N7O:505.2；实测值：506.0[M+H]。
实施例40：(4S)-N-(3-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向小瓶中装入三光气(75.0mg，0.253mmol)，并将其溶于乙腈(2.5mL)中。加入(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(150mg，0.491mmol)在乙腈(2.5mL)中的溶液，然后加入三乙胺(0.50mL，3.59mmol)。将该反应在室温搅拌4h，并加入为固体的4-(3-氨基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(480mg，1.65mmol)，然后加入DMAP(360mg，2.95mmol)。将该反应在80℃搅拌16h，并将全部溶剂真空除去。将剩余物溶于三氟乙酸(5.0mL)中，并将该溶液在50℃搅拌20min。将过量的三氟乙酸真空除去，将剩余物溶于DMSO，并将所得溶液用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(3-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺三氟乙酸盐(89.1mg，0.140mmol，29％产率)。MS(ESI)计算值C28H29F3N6O:522.2。
实施例41：(4S)-N-(4-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
步骤1.4-(2-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的合成：
在0℃，向4-(2-氨基嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.716mmol)在THF(20mL)中的溶液加入双(三甲基硅基)氨基钠溶液(1.0M在THF中，1.50mL，1.50mmol)。将该反应温热至室温并搅拌30min，并加入(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯(327mg，1.07mmol)在THF(5mL)中的溶液。将该反应在室温搅拌1.5h，然后将该溶剂真空除去并将剩余残余物用制备型TLC纯化(3:1石油醚:乙酸乙酯)，得到4-(2-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(160mg，0.262mmol，37％产率)。MS(ESI)计算值C30H33F3N8O3:610.3。
步骤2.(4S)-N-(4-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将4-(2-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(160mg，0.262mmol)溶于盐酸的乙酸乙酯溶液(2M，10mL)中，并搅拌30min。将全部溶剂真空除去，得到(4S)-N-(4-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(47mg，0.092mmol，35％产率)。MS(ESI)计算值C25H25F3N8O:510.2；实测值：511.0[M+H]。
实施例42：(2-(4-(3-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成:
向小瓶中装入三光气(180mg，0.607mmol)，并将其溶于二氯甲烷(3mL)中。加入(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(320mg，1.00mmol)溶液，并加入N,N-二异丙基乙胺(1.00mL，5.74mmol)。将该反应在室温搅拌25min，和然后加入(2-(4-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(415mg，1.37mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。将该反应在40℃搅拌16h，然后在120℃微波中加热1h。冷却后，将该溶剂真空除去，并将剩余残余物用快速色谱纯化(0％-8％甲醇/二氯甲烷)，得到(2-(4-(3-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(99.0mg，0.153mmol，15％产率)。MS(ESI)计算值C33H35F3N8O3:648.3。
实施例43：(4S)-N-(3-(2-(胍基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(15mg，0.10mmol)和DIEA(17μL，0.10mmol)在DMF(1mL)中的溶液在室温搅拌10min，加入(4S)-N-(3-(2-(氨基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(52mg，0.10mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜和然后用制备型HPLC纯化并冻干，得到(4S)-N-(3-(2-(胍基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺三氟乙酸盐(25.5mg，38％产率)。MS(ESI)计算值C28H25F3N8O2:562.21；实测值：563[M+H]。
这个一般性步骤用于制备其它胍类，其用合适的胺代替(4S)-N-(3-(2-(氨基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
实施例44：(4S)-N-(嘧啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
步骤1.(9S)-2-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的合成：
向20mL微波小瓶中装入磁力搅拌棒、(9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(629mg，3.00mmol)、[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基]氯]烯丙基钯(II)(62.1mg，0.120mmol)、3-三氟甲基哌啶(919mg，6.00mmol)和叔丁醇钾(673mg，6.00mmol)。加入DME(7.0mL)，盖上微波小瓶，并加热至90℃，持续2h。冷却至室温后，加入甲醇(5mL)和硅胶(5g)，并将全部溶剂真空除去。将剩余硅胶浆液上样至40g硅胶柱顶端，并用快速色谱纯化(50％-100％乙酸乙酯/戊烷)，得到(9S)-2-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯2，其为非对映异构体的1:1混合物(713mg，2.18mmol，73％产率)。MS(ESI)计算值C16H21F3N4:326.2。
步骤2.(4S)-N-(嘧啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-7-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(40.0mg，0.128mmol)在乙腈(2mL)和吡啶(1mL)中的溶液中加入为固体的三光气(26.0mg，0.0876mmol)。将所得红色溶液在50℃搅拌1h。然后加入为固体的4-氨基嘧啶(95.0mg，1.00mmol)，并将该反应在70℃搅拌6h。6h后，在氮气流下除去大多数乙腈，并将甲醇(1mL)和DMSO(2mL)加至该反应中。将所得溶液用制备型HPLC纯化，并将所分离出的物质从乙腈/1NHCl水溶液中冻干，得到(4S)-N-(嘧啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺盐酸盐(34.9mg，0.0743mmol，58％产率)。MS(ESI)计算值C20H22F3N7O:433.2。
实施例45：(4S)-7-((S)-3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
步骤1.(3S)-N,N-二甲基-1-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)吡咯烷-3-胺的合成：
向20mL微波小瓶中装入磁力搅拌棒、(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(978mg，5.00mmol)、[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基]氯]烯丙基钯(II)(51.7mg，0.100mmol)、(S)-N,N-二甲基吡咯烷-3-胺(1.14g，10.00mmol)和叔丁醇钾(1.12mg，10.00mmol)。加入DME(10.0mL)，盖好微波小瓶，并加热至100℃，持续4h。冷却至室温后，加入甲醇(20mL)和硅胶(5g)，并将全部溶剂真空除去。将剩余硅胶浆液上样至40g硅胶柱顶端,并用快速色谱纯化(0％-10％甲醇/戊烷)，得到(3S)-N,N-二甲基-1-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)吡咯烷-3-胺(524mg，1.92mmol，38％产率)。MS(ESI)计算值C15H23N5:273.2。
步骤2.(4S)-7-((S)-3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(3S)-N,N-二甲基-1-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)吡咯烷-3-胺(40.0mg，0.146mmol)在乙腈(540μL)和吡啶(150μL)中的溶液中加入三光气(28.9mg，0.0975mmol)在乙腈(310μL)中的溶液。将该反应在50℃搅拌30min，然后加入三乙胺(40μL)。加入为固体的3-氨基吡啶(94mg，1.00mmol)，并将该反应在60℃搅拌16h。16h后，将该反应冷却至室温，加入甲醇(1mL)，并将所得溶液用制备型HPLC纯化。将所分离出的物质从乙腈/1NHCl水溶液中冻干，得到(4S)-7-((S)-3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺盐酸盐(30.6mg，0.0712mmol，49％产率)。MS(ESI)计算值C21H27N7O:393.2。
实施例46：4-((9S)-10-(嘧啶-4-基氨基甲酰基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯的合成：
步骤1.4-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯的合成：
向20mL微波小瓶中装入磁力搅拌棒、(9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(500mg，2.38mmol)、[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基]氯]烯丙基钯(II)(12.4mg，0.0240mmol)、高哌嗪-1-甲酸叔丁酯(953mg，4.76mmol)和叔丁醇钾(534mg，4.76mmol)。加入DME(5.0mL)，将小瓶密封，并在85℃微波中加热4h。冷却至室温后，加入甲醇(20mL)和硅胶(5g)，将全部溶剂真空除去，并将剩余硅胶浆液上样至40g硅胶柱顶部。快速色谱(0％-8％甲醇/二氯甲烷)，得到4-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(550mg，1.48mmol，62％产率)。MS(ESI)计算值C20H31N5O2:373.2；实测值：374.2[M+H]。
步骤2.4-((9S)-10-(嘧啶-4-基氨基甲酰基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯的合成：
将4-((9S)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(500mg，1.34mmol)、嘧啶-4-基-氨基甲酸苯酯(570mg，2.65mmol)、4-二甲基氨基吡啶(190mg，1.56mmol)在乙腈(30mL)中的混合物在60℃搅拌3.5h。将溶剂减压除去，将该残余物溶于二氯甲烷，用水，盐水洗涤，并将有机层用无水Na2SO4干燥。将全部溶剂真空除去，并将剩余残余物通过硅胶色谱纯化，用二氯甲烷:乙酸乙酯(2:1)洗脱，然后通过制备型薄层色谱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到4-((9S)-10-(嘧啶-4-基氨基甲酰基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(363mg，0.734mmol，55％产率)。MS(ESI)计算值C25H34N8O3:494.3；实测值：495.4[M+H]。
实施例47：(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
将4-((9S)-10-(嘧啶-4-基氨基甲酰基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-2-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(400mg，0.808mmol)溶于1MHCl的MeOH溶液(20mL)中，并将该反应混合物在室温搅拌1.5h。将全部溶剂真空除去。加入水(20mL)和碳酸钾(344mg，2.42mmol)，并将该混合物在室温搅拌1h。用二氯甲烷(3x5mL)萃取并将溶剂真空干燥，得到(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(300mg，0.761mmol，94％产率)。MS(ESI)计算值C20H26N8O:394.2。
实施例48：(9S)-2-(4-(甲基磺酰基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
向(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(60.0mg，0.152mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中加入三乙胺(46.1mg，0.457mmol)和甲磺酰氯(18.1mg，0.152mmol)。将该混合物在0℃搅拌1h。将该溶液用水、盐水洗涤，并将有机层用无水Na2SO4干燥。将剩余溶液用制备型薄层色谱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到(9S)-2-(4-(甲基磺酰基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(30.0mg，0.0635mmol，42％产率)。MS(ESI)计算值C21H28N8O3S:472.2。
实施例49：(9S)-2-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
向(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(100mg，0.254mmol)在甲醇(3mL)中的溶液中加入甲醛(37％在水中，20μL)和10％钯/炭(10mg)。将该反应在氢气氛下搅拌1h。将溶剂真空除去，并将剩余残余物用制备型薄层色谱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到(9S)-2-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(22.2mg，0.0543mmol，21％产率)。MS(ESI)计算值C21H28N8O:408.2。
实施例50：(9S)-2-(4-异丙基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
向(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(50.0mg，0.127mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中加入丙酮(12.9mg，0.254mmol)。将该混合物搅拌30min，并加入为固体的氰基硼氢化钠(20.1mg，0.0759mmol)，并将该反应在室温搅拌过夜。将全部溶剂真空除去，并将剩余残余物用制备型薄层色谱纯化(100％乙酸乙酯)，得到(9S)-2-(4-异丙基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(16.8mg，0.0385mmol，30％产率)。MS(ESI)计算值C23H32N8O:436.3。
实施例51：(9S)-N-(嘧啶-4-基)-2-(4-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
向(9S)-2-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-N-(嘧啶-4-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(100mg，0.254mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入碳酸钠(80.7mg，0.761mmol)和三氟甲烷磺酸2,2,2-三氟乙酯(163mg，0.508mmol)。将该反应在室温搅拌过夜，然后用二氯甲烷(10mL)稀释，并用水，盐水洗涤，并用硫酸钠干燥。将全部溶剂真空除去，并将剩余残余物用制备型薄层色谱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到(9S)-N-(嘧啶-4-基)-2-(4-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺(19.5mg，0.0409mmol，16％产率)。MS(ESI)计算值C22H27F3N8O:476.2。
实施例52：(4S)-7-(4-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
步骤1.4-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯的合成：
向(4S)-7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(500mg，2.56mmol)、N-Boc高哌嗪(953mg，4.76mmol)、叔丁醇钾(534mg，4.76mmol)在DME(5mL)中的溶液中加入[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)-4,5-二氢咪唑-2-亚基]氯]烯丙基钯(II)(12.4mg，0.0240mmol)。将该混合物加热至90℃，持续3h。冷却后，加入水，并将该混合物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将剩余残余物用硅胶色谱(5:1戊烷:乙酸乙酯)纯化，得到4-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(610mg，1.70mmol，66％产率)。MS(ESI)计算值C19H29N5O2:359.2。
步骤2.(4S)-7-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
将4-((4S)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-7-基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(610mg，1.70mmol)和HCl的EtOAc溶液(5M，10mL)的混合物在室温搅拌30min。将该溶剂除去，得到(4S)-7-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(418mg，1.61mmol，95％产率)。MS(ESI)计算值C14H21N5:259.2。
步骤3.(4S)-7-(4-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
向(4S)-7-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(418mg，1.61mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙酯(748mg，3.23mmol)和碳酸钾(666mg，4.83mmol)。将该反应在室温搅拌过夜。将该反应用水稀释，用乙酸乙酯(3x10mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将剩余残余物用硅胶色谱(6:1戊烷:乙酸乙酯)纯化，得到(4S)-7-(4-(2,2,2-三氟乙基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(320mg，0.937mmol，58％产率)。MS(ESI)计算值C16H22F3N5:341.2。
实施例53：(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-((R)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-((S)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(120mg，0.241mmol)上样至30x250mm手性OD-H柱。用20:80乙醇:庚烷洗脱，首先洗脱出(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-((R)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(41.3mg，0.0828mmol，34％产率)，[α]D 25＝+32(c，0.09，MeOH)，然后洗脱出(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-((S)-3-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(44.8mg，0.0899mmol，37％产率)[α]D 25＝+18.5(c，0.11，MeOH)。MS(ESI)计算值C25H25F3N6O2:498.2；实测值：499.3[M+H]。
实施例54.(5S)-N-(5-氟吡啶-3-基)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-4,5-二氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯-6(3H)-甲酰胺1,1-二氧化物的制备:
步骤1.(S)-(1-((2,6-二氯吡啶-3-基)磺酰基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯的合成:
向2,6-二氯吡啶-3-磺酰氯(Org.ProcessRes.Dev.2009，13，875-879)(3.40g，13.8mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入(S)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.82g，14.5mmol)，然后加入三乙胺(3.00mL，21.5mmol)。将该反应在室温搅拌30min，然后倒入饱和的碳酸氢钠中，并用二氯甲烷萃取。将该有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并将溶剂真空除去，得到(S)-(1-((2,6-二氯吡啶-3-基)磺酰基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5.47g，13.8mmol，100％产率)。
步骤2.(5S)-8-氯-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物的合成：
向(S)-(1-((2,6-二氯吡啶-3-基)磺酰基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(5.47g，13.8mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液中加入三氟乙酸(10mL)。将该反应在室温搅拌过夜，并将全部溶剂真空除去。将剩余的残余物溶于DMF(30mL)，并加入碳酸钠(10.0g，94.3mmol)。将该反应在90℃搅拌2h。将该反应冷却至室温，倒至冰水中，并将所得溶液过滤，并将该固体用水洗涤。将收集的固体干燥，并用硅胶色谱纯化，得到(5S)-8-氯-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(1.80g，6.93mmol，50％产率)。
步骤3.(5S)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物的合成：
将(5S)-8-氯-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(800mg，3.08mmol)、3-三氟甲基苯硼酸(1.17g，6.16mmol)、碳酸铯(3.00g，9.21mmol)和[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(370mg，0.453mmol)在10:1二噁烷:水(45mL)中的混合物在110℃搅拌过夜。冷却后，将溶剂真空除去，并将该残余物分配在二氯甲烷和水之间。将有机层分离，用水，盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并将溶剂真空除去。将剩余残余物用硅胶色谱纯化，得到(5S)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(1.00g，2.71mmol，88％产率)。
步骤4.(5S)-8-((S)-3-氟吡咯烷-1-基)-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物的合成：
将(S)-3-氟吡咯烷盐酸盐(1.10g，8.76mmol)加至(5S)-8-氯-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(800mg，3.08mmol)和碳酸钠(1.60g，15.1mmol)在DMF(10mL)中的溶液中。将该反应在90℃搅拌6h，然后将其倒至碎冰上，搅拌并过滤。将收集的固体用水洗涤，干燥，并用硅胶色谱纯化，得到(5S)-8-((S)-3-氟吡咯烷-1-基)-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(680mg，2.18mmol，71％产率)。
步骤5.(5S)-N-(5-氟吡啶-3-基)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-4,5-二氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯-6(3H)-甲酰胺1,1-二氧化物的合成：
将(5S)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4,5,6-四氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯1,1-二氧化物(70.0mg，0.190mmol)溶于DMF(3mL)，并加入氢化钠(54mg，60％在油中，1.35mmol)。将该反应在室温搅拌2h，并加入(5-氟吡啶-3-基)氨基甲酸苯酯(176mg，0.768mmol)。将该反应在室温搅拌1h，倒至水中，并用二氯甲烷萃取。将有机层真空浓缩，并将剩余残余物用制备型薄层色谱纯化，得到(5S)-N-(5-氟吡啶-3-基)-8-(3-(三氟甲基)苯基)-4,5-二氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯-6(3H)-甲酰胺1,1-二氧化物(24.0mg，0.0473mmol，25％产率)。MS(ESI)计算值C22H17F4N5O3S:507.1；实测值：508.1(M+H)+。
以下化合物以类似的方式制备：(5S)-N-(5-氟吡啶-3-基)-8-((S)-3-氟吡咯烷-1-基)-4,5-二氢-2,5-亚甲基吡啶并[2,3-g][1,2,6]硫杂二氮杂环辛四烯-6(3H)-甲酰胺1,1-二氧化物。
实施例55.(4S)-N-(3-(4-((6-氨基己酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将((1-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(190mg，0.306mmol)在三氟乙酸(3.0mL)中的溶液在室温搅拌1h，然后将过量的三氟乙酸真空除去。将剩余的残余物溶于DMF(5.0mL)和三乙胺(1.0mL)，并加入6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(250mg，0.761mmol)。将该反应在80℃搅拌30min，然后冷却至65℃并加入4NHCl(4mL)。将该反应在65℃搅拌2h，然后过滤，并将该滤液用制备型HPLC纯化。将分离的物质从乙腈/1NHCl中冻干，得到(4S)-N-(3-(4-((6-氨基己酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺盐酸盐(208mg，0.310mmol，100％产率)。MS(ESI)计算值C32H34F3N9O2:633.3；实测值：634.3(M+H)+。
实施例56.(4S)-N-(3-(4-((6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成:
向(4S)-N-(3-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(44.2mg，0.0850mmol)在乙腈(1.3mL)和三乙胺(0.13mL，0.933mmol)中的溶液中加入生物素酰胺基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(40.9mg，0.090mmol)。将该反应在65℃搅拌2h，然后加入DMF(1mL)，并将所得反应混合物过滤，并将该滤液用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(3-(4-((6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(43.6mg，0.0448mmol，53％产率)。
实施例57.(4S)-N-(3-(4-((3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-N-(3-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(44.2mg，0.0850mmol)在乙腈(1.3mL)和三乙胺(0.13mL，0.933mmol)中的溶液中加入异硫氰酸荧光素异构体I(35.0mg，0.090mmol)。将该反应在65℃搅拌2h，然后加入DMF(1mL)，并将所得反应混合物过滤，并将该滤液用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(3-(4-((3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(51.0mg，0.0498mmol，58％产率)。
实施例58.(4S)-N-(3-(4-((3-((Z)-2-((1-(二氟硼基)-1H-吡咯-2-基)亚甲基)-2H-吡咯-5-基)丙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
向(4S)-N-(3-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(12.2mg，0.0234mmol)在乙腈(0.35mL)和三乙胺(0.035mL，0.251mmol)中的溶液中加入4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(indacene)-3-丙酸、琥珀酰亚胺酯(10mg，0.0257mmol)。将该反应在60℃搅拌30min，然后将该反应混合物用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(3-(4-((3-((Z)-2-((1-(二氟硼基)-1H-吡咯-2-基)亚甲基)-2H-吡咯-5-基)丙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(5.8mg，0.0064mmol，27％产率)。
实施例59.(9S)-N-(4-(乙酰胺基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺的合成：
向(9S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺盐酸盐(108mg，0.214mmol)在吡啶(3.0mL)中的溶液中加入乙酸酐(28.0μL，0.300mmol)。将该反应在室温搅拌4h，并将该反应混合物用制备型HPLC纯化，得到(9S)-N-(4-(乙酰胺基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺三氟乙酸盐(111mg，0.178mmol，83％产率)。MS(ESI)计算值C27H26F3N5O2:509.2；实测值：510.2(M+H)+。
实施例60.(4S)-N-(3-(吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1：3-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的合成：
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(A7，0.150g，0.490mmol)溶于5ml二氯甲烷中并用DIEA(193ul，1.08mmol)处理。将该混合物在室温搅拌30分钟。然后加入3-(3-氨基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.141g，0.539mmol)并将该溶液在室温搅拌过夜。将该反应用5ml二氯甲烷稀释并用10ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤。收集有机物并浓缩至干。用硅胶柱色谱纯化，使用5-100％乙酸乙酯/戊烷洗脱，得到3-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.077g，26％)。MS(ESI)计算值C32H34F3N5O3:593.3，实测值：594[M+H]。
步骤2：(4S)-N-(3-(吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(S)3-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯:(0.077g，0.130mmol)溶于5mL4NHCl的1,4-二噁烷溶液中并在室温氮气下搅拌3小时。然后减压除去全部溶剂并将所得固体真空干燥过夜，得到(4S)-N-(3-(吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.078g，100％)。MS(ESI)计算值C27H26F3N5O:493.21；实测值：494[M+H]。
实施例61.(4S)-N-(3-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-N-(3-(吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(B579，0.029g，0.058mmol)溶于2ml二氯甲烷，然后用DIEA(31ul，0.174mmol)处理。然后加入氯乙酰胺(0.006g，0.064mmol)并将该反应加热至60℃过夜。将该反应然后冷却至室温并用5ml二氯甲烷稀释并用10ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机物浓缩至干并用C18反相色谱纯化，使用5-95％梯度的乙腈/水，其中有0.1％三氟乙酸作为添加剂，得到(4S)-N-(3-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.008g，23％)。MS(ESI)计算值C29H29F3N6O2:550.2；实测值：551[M+H]。
实施例62：(4S)-N-(3-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-N-(3-(吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(B579，0.020g，0.038mmol)溶于1.5ml二氯甲烷中，和然后用DIEA(13ul，0.076mmol)处理。然后加入乙酰氯(0.005g，0.042mmol)并将该反应在室温搅拌过夜。然后将该反应用5ml二氯甲烷稀释并用10ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机物浓缩至干并用C18反相色谱纯化，得到(4S)-N-(3-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.023g，88％)。MS(ESI)计算值C29H28F3N5O2:535.2；实测值：536[M+H]。
这个一般性酰化步骤用于制备(4S)-N-(3-(1-丙酰基吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺和(4S)-N-(3-(1-(环丙烷羰基)吡咯烷-3-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺。
实施例63.((5-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)噁唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯的制备：
将在4mL二氯甲烷中的(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(0.276g，0.902mmol)与DIEA(400uL，2.261mmol)和三光气(0.200g，0.676mmol)合并。然后将该混合物加热至65℃,此时缓慢滴加在4mL二氯甲烷中的((5-(3-氨基苯基)噁唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯(0.321g，0.992mmol)。然后将该混合物在65℃加热5小时。然后将该反应冷却至RT和然后加入10mL二氯甲烷，然后用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤。收集有机层并减压浓缩至干。然后将残余物用硅胶色谱纯化，得到((5-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)噁唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯(0.082g，14％)。MS(ESI)计算值C35H29F3N6O4:654.22；实测值：655[M+H]。
实施例64.(4S)-N-(3-(2-(氨基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备:
将((5-(3-((4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5-甲酰胺基)苯基)噁唑-2-基)甲基)氨基甲酸苄酯(0.040g，0.06mmol)溶于10mL乙酸乙酯中并在真空下脱气三次。然后加入大约5mg钯(10％在degaussa型碳上)并将该反应容器用氮气吹扫，然后装上氢气球。然后开始搅拌并将该混合物在氢气下搅拌2小时。然后将该反应容器抽真空并用氮气吹扫。将该固体通过过滤除去并减压除去溶剂，得到(4S)-N-(3-(2-(氨基甲基)噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(0.032g，100％)，其无需纯化即可使用。MS(ESI)计算值C27H23F3N6O2:520.51；实测值：521[M+H]。
实施例65.(4S)-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备
步骤1.(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯的合成：
在0℃，向(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.5g，4.92mmol)和吡啶(0.74mL，9.84mmol)在DCM(15mL)中的溶液中滴加氯甲酸苯酯(1.1mL，8.85mmol)。将所得混合物在该温度搅拌2h，然后用饱和NaHCO3水溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩，得到粗制的氨基甲酸苯酯(1.8g)，其为褐色油状物，其可用于下一步而无需进一步纯化。
步骤2.(4S)-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
在0℃，向胺(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-胺)(30mg，0.18mmol)在无水THF(5mL)中的溶液中分批加入NaH(18mg，0.75mmol)，将该反应混合物在室温搅拌30min。然后加入(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯(157mg，0.37mmol)并将该混合物搅拌过夜。将所得混合物用MeOH(2mL)淬灭，蒸发器真空浓缩。将该残余物用制备型TLC纯化，得到2-(3-((2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(50mg，产率54.9％)，其为白色固体。
使用(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸苯酯的这个一般性步骤可用于制备各种甲酰胺，其使用合适的芳基-胺代替5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-胺。
实施例66.(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-硫代甲酰胺的制备
步骤1.5-(3-异硫氰酸基苯基)噁唑的合成：
在0℃氩气氛下，向3-(噁唑-5-基)苯胺(160mg，1.0mmol)和TEA(0.4mL，3.0mmol)在无水THF(6mL)中的溶液中滴加硫光气(0.152mL，2.0mmol)在无水THF(1.5mL)中的溶液，持续10min。将该反应混合物在室温搅拌30min，TLC显示3-(噁唑-5-基)苯胺被全部耗尽。用蒸发器减压除去溶剂，将该残余物用水(10mL)和乙酸乙酯(25mL)稀释，将有机层分离。将水相用乙酸乙酯(3x30mL)萃取，将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到5-(3-异硫氰酸基苯基)噁唑，其可用于下一步反应而无需任何进一步的纯化。
步骤2.(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-硫代甲酰胺的合成：
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(244mg，0.8mmol)溶于无水DMF(5mL)中并在0℃氩气氛下分批加入NaH(128mg，60％，3.2mmol)。将该混合物温热至室温并搅拌1h。滴加如上制备的5-(3-异硫氰酸基苯基)噁唑在DMF(3mL)中的溶液并将该反应混合物搅拌在室温过夜。然后将所得混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3x15mL)萃取，用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物用硅胶色谱纯化，使用DCM:MeOH＝10:1，得到标题化合物(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-硫代甲酰胺(186.1mg，产率46％)。
实施例67.(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(S)-2-((5-溴-2-硝基苯基)氨基)丁二酸二甲酯的合成：
将4-溴-2-氟-1-硝基苯(15.0g，68mmol)、(S)-2-氨基丁二酸二甲酯盐酸盐(15g，75mmol)和DIPEA(36mL)在DMSO(127mL)中的混合物在100℃搅拌2h。冷却后，加入水(200mL)并将该混合物用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将该残余物用硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化，得到(S)-2-((5-溴-2-硝基苯基)氨基)丁二酸二甲酯(12.4g，产率51％)
步骤2.(S)-2-(7-溴-3-氧代-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙酸甲酯(SundiaE655-523-23)的合成:
将(S)-2-((5-溴-2-硝基苯基)氨基)丁二酸二甲酯(12.4g，34.4mmol)、Fe(22g，392mmol)和AcOH(1.2mL)在i-PrOH(250mL)和水(50mL)中的混合物回流搅拌2h。冷却后，将该固体过滤并将该滤液浓缩。将该残余物用DCM(300mL)和水(300mL)稀释，将有机层分离，并将水相用DCM(3×300mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将该残余物用硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化，得到(S)-2-(7-溴-3-氧代-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙酸甲酯(8.8g，产率86％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz):δ10.43(s，1H)，6.84(s，1H)，6.75-6.73(m，1H)，6.66-6.63(m，1H)，6.32(s，1H)，4.19-4.16(m，1H)，3.60(s，3H)，2.78-2.72(m，1H)，2.68-2.61(m，1H)。
步骤3.(S)-2-(7-溴-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙醇的合成:
在0℃，向(S)-2-(7-溴-3-氧代-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙酸甲酯(4.4g，14.7mmol)在THF(30mL)中的溶液中滴加BH3Me2S(10M，10mL)，持续15min。将该反应加热回流过夜。冷却后，将该混合物用6NHCl(10mL)淬灭并将所得混合物在50℃搅拌2h。然后将该混合物使用2NNaOH碱化并调整至pH～8。将该混合物用DCM(3x50mL)萃取并将合并的有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将该残余物用硅胶色谱(DCM/MeOH＝20/1)纯化，得到(S)-2-(7-溴-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙醇(2.4g，产率63％)。
步骤4.(4S)-7-溴-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
在室温，将DDQ(2.7g，11.7mmol)加至PPh3(3.0g，11.7mmol)在DCM(100mL)中的溶液中。加入(S)-2-(7-溴-1,2,3,4-四氢喹噁啉-2-基)乙醇(2.0g，7.8mmol)。将该混合物在室温搅拌2h。除去溶剂后，将该残余物用硅胶色谱(DCM/MeOH＝40/1)纯化，得到(4S)-7-溴-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.5g，产率81％)。
步骤5.(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成:
在室温氮气氛下，向(4S)-7-溴-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯(600mg，2.5mmol)、(3-(三氟甲基)苯基)硼酸(950mg，5.0mmol)、Cs2CO3(2.4g，7.5mmol)在二噁烷(60mL)和水(6mL)中的混合物中加入Pd(dppf)Cl2(204mg，0.25mmol)。将该混合物在110℃搅拌过夜。冷却后，将该固体过滤并将该滤液浓缩。将该残余物用DCM(30mL)和水(30mL)稀释，将该有机层分离并将水相用DCM(3×30mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将该残余物用硅胶色谱(DCM/MeOH＝20/1)纯化，得到(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯(700mg，产率95％)。
步骤6.(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯(50mg，0.16mmol)、TEA(0.1mL)和三光气(40mg，0.13mmol)在THF(5mL)中的混合物在60℃搅拌2h。加入3-(噁唑-5-基)苯胺(38mg，0.24mmol)。将该混合物在60℃搅拌过夜。冷却后，将所得混合物浓缩，将该残余物用制备型TLC(DCM/MeOH＝20/1)纯化，得到(4S)-N-(3-(噁唑-5-基)苯基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(26.1mg，产率33％)。
实施例68.(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
将(4S)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯(50mg，0.16mmol)、DMAP(52mg，0.42mmol)和吡啶-2-基氨基甲酸苯酯(89mg，0.42mmol)在CH3CN(2.5mL)中的混合物回流过夜。冷却后，除去溶剂。将该残余物用制备型TLC(DCM/MeOH＝20/1)纯化，得到(4S)-N-(吡啶-2-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基苯并[b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(24.4mg，产率35％)。
实施例69.(4S)-N-(吡啶-3-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.(4S)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
这一部分使用上述一般性的Negishi偶联步骤进行制备，得到(4S)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其为非对映异构体11:1混合物(482mg，36％)。MS(ESI)计算值C16H20F3N3:311.16；实测值：312[M+H]。
步骤2.(4S)-N-(吡啶-3-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
这些化合物使用上述三光气脲偶联步骤进行制备，得到(4S)-N-(吡啶-3-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为非对映异构体9:1混合物(38mg，62％)。MS(ESI)计算值C22H24F3N5O:431.19；实测值：432[M+H]。
实施例70.(4S)-N-(嘧啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
这个非对映异构体混合物使用下列方案制备。将羰基二咪唑(CDI，21mg，0.13mmol)在DCM(1.5mL)中浆化，然后加入4-氨基嘧啶(13mg，0.13mmol)。为了将所有原料放入溶液中，加入二噁烷(0.5mL)。将该混合物在室温氮气氛下搅拌1h。将(4S)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(41mg，0.13mmol)加入DCM(1mL)中，并将该反应搅拌过夜，然后加入更多的CDI(21mg)并将该反应加热回流4h。将该反应用LCMS监测且该中间体(在加入4-氨基嘧啶之前)是主要反应成分。将该反应冷却至室温，浓缩，然后将更多的4-氨基嘧啶(25mg)加入1mLDMSO(为了更好地溶解)中。将该反应温热至60℃过夜，然后在100℃密封管中再加热一晚。加入更多的4-氨基嘧啶(25mg)并将该反应密封并在微波中加热至120℃，持续1h。加入DCM(10mL)，然后加入1NHCl(3mL)。将其用DCM(3x15mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗制产物用硅胶柱色谱纯化(0–10％MeOH/DCM)，然后再用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(嘧啶-4-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(4mg，7％)。MS(ESI)计算值C21H23F3N6O:432.19；实测值：433[M+H]。
实施例71.(4S)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
这个非对映异构体混合物使用如下方案制备。
氨基甲酸酯形成的一般步骤：
将氯甲酸苯酯(2.09g，13.3mmol，1.05当量)滴加至4,5-二甲基噻唑-2-胺(1.63g，12.7mmol，1.0当量)和吡啶(3.01g，38.2mmol，3.0当量)在DCM(16mL)中的冷却溶液中，经1.5h。将该反应继续搅拌冷却2h。缓慢加入水(15mL)，经30min，和然后将该混合物用DCM稀释。分离各层并将有机层用饱和碳酸钠(20mL)水溶液洗涤，然后用盐水(20mL)洗涤。然后将有机层用Na2SO4干燥，然后减压浓缩。将该残余物混悬于EA/PE(1:5)，持续30min，然后过滤，得到(4,5-二甲基噻唑-2-基)氨基甲酸苯酯(1.7g，54％)。
经氨基甲酸酯的脲偶联的一般步骤：
将(4,5-二甲基噻唑-2-基)氨基甲酸苯酯(80mg，0.322mmol，2.0当量)、(4S)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(75mg，0.161mmol，1.0当量)和DMAP(24mg，0.193mmol，1.2当量)在乙腈(4mL)中的混合物在60℃搅拌过夜。使用TLC和LC/MS来监测反应进程。将该混合物用制备型HPLC纯化，得到(4S)-N-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-7-(3-(三氟甲基)环己基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(14.5mg，12％)。MS(ESI)计算值C22H26F3N5OS:465.18；实测值：466[M+H]。
实施例72.N-(哒嗪-3-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备(化合物xx):
步骤1:3-氨基戊-2-烯二酸二乙酯
向250mL3颈烧瓶中装入6.00g(29.7mmol)1,3-丙酮二甲酸二乙酯、4.70g(59.4mmol)碳酸氢铵，和80mL乙醇。将该反应在室温搅拌24h，然后将其真空浓缩。将残余物溶于100mL水中并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1x200mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到5g(87％)的产物，其为无色油状物。将其用于下一步反应而无需进一步纯化。
步骤2：3-氨基戊二酸二乙酯
向250mL3颈烧瓶中装入5.00g(24.8mmol)3-氨基戊-2-烯二酸二乙酯、40mL乙醇、10mL冰醋酸和3.1g(49.6mmol)NaBH3CN。将该反应在室温搅拌2h，然后将该溶剂真空除去。将残余物溶于水并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水(1x200mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩，得到4g(80％)的产物，其为无色油状物。将其用于下一步反应而无需进一步纯化。
步骤3:3-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二乙酯
向250mL3颈烧瓶中装入1.8g(9.8mmol)2,6-二氯-3-硝基吡啶、4.0g(19.7mmol)粗制的3-氨基戊二酸二乙酯、3.2g(39.0mmol)NaHCO3和60mL四氢呋喃。将该反应在40℃搅拌24h，然后将该溶剂真空除去。将该残余物溶于100mL水中，然后用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机相用盐水(1x200mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用20/1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱，得到2.7g(80％)的产物，其为亮黄色固体。
步骤4：3-((3-氨基-6-氯吡啶-2-基)氨基)戊二酸二乙酯
向装有温度计和磁力搅拌棒的250mL3颈烧瓶中装入2.7g(7.5mmol)3-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二乙酯、2.1g(37.5mmol)铁粉、60mL2-丙醇、20mL水和675mg(11.0mmol)乙酸。将该混合物在100C搅拌1h，用HPLC监测起始硝基化合物的消失。反应完成后，将该固体过滤并用2-丙醇(3x50mL)洗涤，然后将合并的滤液和洗涤液真空浓缩。将该残余物溶于100mL水中并用二氯甲烷(3x50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(1x50mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。粗制产物用硅胶柱色谱纯化，用4/1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱，得到1.8g(75％)的产物，其为灰色固体。
步骤5：2-(7-氯-2-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-4-基)乙酸乙酯
向装有温度计和回流冷凝器的100mL3颈烧瓶中装入1.8g(5.4mmol)3-((3-氨基-6-氯吡啶-2-基)氨基)戊二酸二乙酯、20mL甲苯和1.0mL(13.4mmol)三氟乙酸。将该混合物回流搅拌5h，并将该反应用HPLC监测起始原料的消失。反应完成后，将该溶剂真空除去，然后将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用3/1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱，得到1.1g(70％)的产物，其为灰白色固体。
步骤6：2-(7-氯-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-4-基)乙醇
向装有氮气进口、回流冷凝器和温度计的50mL3颈烧瓶中装入1.0g(3.5mmol)2-(7-氯-2-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-4-基)乙酸乙酯、530mg(14.0mmol)LiAlH4和10mL四氢呋喃。将该反应在60℃氮气下搅拌6h，用HPLC监测产物的出现。该酯被快速还原，但该内酰胺需要更长的时间来完成还原。当该反应完成时，将该混合物用冰浴冷却，加入530μL水，同时保持该内部温度低于5℃，然后将该混合物搅拌15min。接下来，加入530μL15％(w/w)NaOH(水溶液)同时保持该内部温度低于5C，然后将该混合物搅拌15min。为了完成后处理，加入1590μL水，然后将该混合物在室温搅拌30min。将该固体过滤，然后将该沉淀物用四氢呋喃(3x50mL)洗涤。将该滤液真空浓缩，然后将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用2/1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到520mg(65％)的产物，其为亮黄色固体。
步骤7：7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯
向50mL3颈烧瓶中装入500mg(2.2mmol)2-(7-氯-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-4-基)乙醇和10mL40％(w/w)HBr(水溶液)。将该混合物回流搅拌18h，然后将其冷却至室温并用饱和NaHCO3(水溶液)中和。将该含水混合物用乙酸乙酯(3x50mL)萃取，然后将合并的有机层用盐水(1x50mL)反萃取，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，用3/1己烷/乙酸乙酯洗脱，得到320mg(70％)的产物，其为灰白色固体。
步骤8.7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
将二噁烷/水混合物(10mL/1mL)脱气并加入7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(250mg，1.196mmol)，然后加入3-(三氟甲基)苯基硼酸(454mg，2.392mmol)、Pd(dppf)Cl2(97mg，0.19mmol)和Cs2CO3(1.16g，3.588mmol)。将该混合物在110℃搅拌12小时，然后浓缩并用柱色谱(PE/EtOAc＝4/1)纯化，得到7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(200mg，48％)。MS(ESI)计算值C17H16F3N3:319.13。
步骤9.N-(哒嗪-3-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
使用以下一般性的脲偶联步骤：
将哒嗪-3-胺的氨基甲酸酯(53.9mg，0.25mmol，2.0当量)、7-(3-(三氟甲基)苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(40mg，0.12mmol，1.0当量)和DMAP(18.4mg，0.15mmol，1.2当量)的乙腈(5mL)溶液在60℃搅拌过夜。反应进程用TLC和LC/MS监测。将该反应混合物直接上样至制备型TLC上，使用100％EtOAc作为洗脱液，得到N-(哒嗪-3-基)-7-(3-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其为白色固体(16.9mg，30.6％)。MS(ESI)计算值C22H19F3N6O:440.16；实测值：440.9[M+H]。
这个一般性脲偶联步骤可用于制备各种7-(3-(三氟甲基)苯基)-、7-(3-氯苯基)-、7-(5-氯吡啶-3-基)-和7-(5-氟吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺，其用合适的胺部分代替哒嗪-3-胺。
实施例73.7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.7-氯-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯的合成:
使用以下方案制备这一部分。将7-氯-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(3.0g，14.31mmol)、(Boc)2O(4.6g，21.05mmol，1.5当量)和DMAP(3.49g，28.62mmol，2.0当量)在THF(5mL)中的混合物在60℃搅拌2h。使用TLC和LC/MS来监测反应进程。加入水(30mL)并将该混合物用DCM(3x15mL)萃取。将该有机物浓缩并将该残余物用柱色谱纯化，得到7-氯-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯，其为白色固体(4.5g，92％)。MS(ESI)计算值C15H20ClN3O2:309.12。
步骤2.7-(3-氯苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(SundiaProp.455)的合成:
使用以下方案制备这一部分。向二噁烷/水(20mL/1mL)的脱气混合物中加入7-氯-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.5g，4.85mmol)、(3-氯苯基)硼酸(1.51g，9.70mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.396g，0.485mmol)和Cs2CO3(4.74g，14.56mmol)。将该混合物在110℃搅拌12h，然后浓缩并用柱色谱(PE/EA＝2/1)纯化，得到7-(3-氯苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.2g，89％)。MS(ESI)计算值C21H24ClN3O2:385.16。
这个一般性偶联步骤可用于制备各种7-(3-取代的苯基或吡啶基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯，其用合适的硼酸或硼酸酯部分代替(3-氯苯基)硼酸。
步骤3.7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(SundiaProp.455)的合成:
使用以下方案制备这一部分。将7-(3-氯苯基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.2g，3.1mmol)溶于HCl/MeOH(1M，20mL)并将该反应混合物在室温搅拌1.5h，然后真空浓缩。加入水(20mL)和K2CO3(3g)。将该混合物在室温搅拌2h，然后用DCM(3x15mL)萃取。将该有机物浓缩，得到7-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(800mg，90％)。MS(ESI)计算值C16H16ClN3:285.10。
步骤4.7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
使用一般性脲偶联步骤制备这个化合物，得到7-(3-氯苯基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(20.4mg，24％)。MS(ESI)计算值C22H20ClN5O:405.14；实测值：406[M+H]。
实施例74.7-(5-氟吡啶-3-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的制备：
步骤1.7-(5-氟吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯的合成：
使用以下方案制备这一部分。向二噁烷/水(30mL/3mL)的脱气混合物中加入7-氯-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.39g，4.5mmol)、(5-氟吡啶-3-基)硼酸(1.27g，9.0mmol)，Pd(dppf)Cl2(0.37g，0.45mmol)和Cs2CO3(4.40g，13.5mmol)。将该混合物在110℃搅拌12h，然后浓缩并用柱色谱(PE/EA＝2/1)纯化，得到7-(5-氟吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.5g，89％)。MS(ESI)计算值C20H23FN4O2:370.18。
步骤2.7-(5-氟吡啶-3-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯的合成：
使用以下方案制备这一部分。将TFA(20mL)加至7-(5-氟吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酸叔丁酯(1.50g)在DCM(20mL)中的溶液中，并将该反应混合物在室温搅拌3h，然后真空浓缩。将该残余物用饱和的NaHCO3溶液碱化并用DCM(3x15mL)萃取。将该有机物浓缩，得到7-(5-氟吡啶-3-基)-2,3,4,5-四氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯(1.2g，100％)。MS(ESI)计算值C15H15FN4:270.13。
步骤3.7-(5-氟吡啶-3-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺的合成：
使用一般性脲偶联步骤制备这个化合物，得到7-(5-氟吡啶-3-基)-N-(吡啶-3-基)-3,4-二氢-1,4-亚乙基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(12.8mg，15％)。MS(ESI)计算值C21H19FN6O:390.16；实测值：391[M+H]。
实施例75.3-溴-5-(噁唑-5-基)苯胺的制备:
步骤1.5-(3-溴-5-硝基苯基)噁唑的合成：
向3-溴-5-硝基苯甲醛(1g，4.34mmol)在DME(10mL)中的溶液中加入K2CO3(1.2g，8.68mmol)，然后加入1-((异氰甲基)磺酰基)-4-甲基苯(891mg，4.56mmol)。将该反应混合物回流搅拌过夜。冷却至室温后，加入EtOAc并将该混合物用H2O洗涤两次，然后用盐水洗涤。将该有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩。用硅胶色谱纯化(0％-100％梯度的EtOAc/戊烷)，得到5-(3-溴-5-硝基苯基)噁唑(762mg，65％)，其为橘色固体。MS(ESI)计算值C9H5BrN2O3:268.0，270.0。
步骤2.3-溴-5-(噁唑-5-基)苯胺的合成：
向5-(3-溴-5-硝基苯基)噁唑(762mg，2.83mmol)在THF(14mL)中的溶液中加入乙酸(13.6mL)，然后加入铁粉(474mg，8.49mmol)。将该反应混合物在60℃搅拌过夜。冷却至室温后，将该混合物倒入饱和Na2CO3溶液(175mL)并用EtOAc(50mLx2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到3-溴-5-(噁唑-5-基)苯胺(697mg)，其为褐色油状物。使用该物质而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C9H7BrN2O:238.0，240.0。
这个一般性的两步步骤(噁唑形成然后硝基还原)可用于制备4-溴-5-(噁唑-5-基)苯胺，其使用4-溴-5-硝基苯甲醛。
实施例76.6-(噁唑-5-基)吡啶-2-胺的制备：
步骤1.6-氨基-N-甲氧基-N-甲基吡啶-2-甲酰胺的合成：
向6-氨基吡啶-2-甲酸(10.0g，72.5mmol)在乙腈(150mL)中的浆液中加入N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(8.52g，87.0mmol)、1-羟基苯并三唑(11.8g，87.0mmol)、N-(3-二甲基氨基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(16.7g，87.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(37.7mL，217mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，并将该溶剂真空除去。将该残余物分配在1NNaOH和乙酸乙酯之间，并将水层用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并将溶剂真空除去。将剩余残余物用快速色谱纯化(乙酸乙酯，含0.1％三乙胺)，得到6-氨基-N-甲氧基-N-甲基吡啶-2-甲酰胺(4.30g，23.7mmol，33％产率)。MS(ESI)计算值C8H11N3O2:181.1。
步骤2.6-(噁唑-5-基)吡啶-2-胺的合成:
将氢化铝锂(1.08g，28.5mmol)加至6-氨基-N-甲氧基-N-甲基吡啶-2-甲酰胺(4.30g，23.7mmol)在THF(30mL)中的溶液中。将该反应在室温搅拌90min。缓慢加入乙酸乙酯(30mL)，将该反应过滤，并收集滤液并将全部溶剂真空除去，得到6-氨基吡啶-2-甲醛，得到其粗品用于下一步。
向上述甲醛在甲醇(20mL)中的溶液中加入对甲基苯磺酰基甲基异腈(13.9g，71.2mmol)和碳酸钾(19.4g，140mmol)。将该反应回流搅拌2h，然后将全部溶剂真空除去。将该残余物分配在乙酸乙酯(150mL)和水(70mL)之间。将该有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并将溶剂真空除去。将剩余残余物用快速色谱纯化(10％甲醇/二氯甲烷)，得到6-(噁唑-5-基)吡啶-2-胺(2.00g，12.4mmol，52％产率，经两步)。MS(ESI)计算值C8H7N3O:161.1。
以下化合物以类似的方式制备：4-(噁唑-5-基)吡啶-2-胺；5-(噁唑-5-基)吡啶-3-胺。
实施例77：3,5-双(噁唑-5-基)苯胺的合成：
步骤1.N1,N3-二甲氧基-N1,N3-二甲基-5-硝基间苯二甲酰胺的合成：
向5-硝基间苯二甲酸(5.00g，23.7mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中加入草酰氯(5.00mL，59.1mmol)，并将该溶液冷却至0℃。滴加DMF(1.0mL)，经30min。将该混合物温热至室温并搅拌4h。将全部溶剂真空除去。
在0℃，向N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(4.6g，47.1mmol)和三乙胺(6.60mL，47.4mmol)在二氯甲烷(80mL)中的混合物中加入上述酰氯在二氯甲烷(20mL)中的溶液。一旦该反应完成，将该反应混合物真空浓缩。将该残余物分配在1N氢氧化钠和乙酸乙酯之间，将有机层分离，并将水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，将该溶剂真空除去，并将该残余物用硅胶色谱(1:1石油醚:乙酸乙酯)纯化，得到N1,N3-二甲氧基-N1,N3-二甲基-5-硝基间苯二甲酰胺(4.00g，13.5mmol，57％产率)。MS(ESI)计算值C12H15N3O6:297.1。
步骤2.5-硝基间苯二甲醛的合成：
在-40℃，将氢化铝锂(2.70g，71.1mmol)加至N1,N3-二甲氧基-N1,N3-二甲基-5-硝基间苯二甲酰胺(5.00g，16.9mmol)在THF(150mL)中的搅拌溶液中。将该反应在-40℃搅拌4h。缓慢加入10％氢氧化钠溶液(2.7mL)，然后加入水(2.7mL)。将所得固体过滤，并将该滤液真空浓缩，得到5-硝基间苯二甲醛(1.37g，7.65mmol，45％产率)。MS(ESI)计算值C8H5NO4:179.0.
步骤3.5,5'-(5-硝基-1,3-亚苯基)双(噁唑)的合成：
将1-异氰甲烷磺酰基-4-甲基-苯(7.40g，37.8mmol)和无水碳酸钾(5.20g，37.8mmol)加至5-硝基间苯二甲醛(1.37g，7.65mmol)在甲醇(100mL)中的溶液中。将该反应在氮气下回流2h。冷却后，将该溶剂真空除去。将该残余物分配在乙酸乙酯(150mL)和水(70mL)之间。分离有机层，并将水层用乙酸乙酯(3x150mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗制的5,5'-(5-硝基-1,3-亚苯基)双(噁唑)(1.70g，6.61mmol，86％产率)。MS(ESI)计算值C12H7N3O4:257.0。
步骤4.3,5-双(噁唑-5-基)苯胺的合成：
将5,5'-(5-硝基-1,3-亚苯基)双(噁唑)(1.70g，6.61mmol)和钯/炭(200mg)在乙酸乙酯(50mL)中的混合物在氢气下搅拌4h。将该固体过滤，并将该滤液真空浓缩。将剩余残余物用硅胶色谱(4:1石油醚:乙酸乙酯)纯化，得到3,5-双(噁唑-5-基)苯胺(1.30g，5.72mmol，87％产率)。MS(ESI)计算值C12H9N3O2:227.1。
实施例78.(2-(4-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的制备：
向20mL微波小瓶中装入(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(551mg，2.50mmol)、叠氮化钠(460mg，7.05mmol)和DMF(5mL)。将该小瓶密封，并在110℃微波中加热12h。将该反应混合物倒入水(8mL)中，并用乙酸乙酯(2x10mL)萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，并将全部溶剂真空除去，得到粗制的(2-叠氮基乙基)氨基甲酸叔丁酯。
将该粗制的(2-叠氮基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于THF(5mL)和三乙胺(1mL)中。加入3-乙炔基苯胺(350mg，2.99mmol)，然后加入碘化亚铜(I)(15.0mg，0.0788mmol)。将该反应在60℃搅拌2h，然后将全部溶剂真空除去，并将剩余残余物用快速色谱纯化(50％-100％乙酸乙酯/戊烷)，得到(2-(4-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(415mg，1.37mmol，55％产率，经2步)。MS(ESI)计算值C15H21N5O2:303.2。
实施例79.((1-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的制备：
向3-叠氮苯胺(Chem.Commun.2004，888)(1.34g，9.99mmol)在THF(9.0mL)和三乙胺(1.0mL)中的溶液中加入丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(1.55g，9.99mmol)和碘化亚铜(I)(40mg，0.210mmol)。将该反应在60℃搅拌1h，然后将全部溶剂真空除去。将剩余残余物用快速色谱纯化(0％-80％乙酸乙酯/戊烷)，得到((1-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物#；1.71g，5.91mmol，59％产率)。MS(ESI)计算值C14H19N5O2:289.1；实测值：290.1[M+H]。
实施例80：((1-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的制备：
向放有3-叠氮苯胺(1.33g，9.92mmol)、丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(1.55g，9.99mmol)和五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)(15.9mg，0.020mmol)的小瓶中加入甲苯(10mL)。将该反应在100℃搅拌72h，然后将该反应冷却至室温。加入二氯甲烷(5mL)以溶剂任意固体，并将剩余溶液用硅胶色谱纯化(50％-80％乙酸乙酯/戊烷)，得到((1-(3-氨基苯基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(970mg，3.35mmol，34％产率)。MS(ESI)计算值C14H19N5O2:289.2。
实施例81：N4,N4-二甲基嘧啶-2,4-二胺的制备：
在密封管中，将4-氯-2-氨基嘧啶(495mg，3.82mmol)溶于二甲胺水溶液(33％)，并将该反应在100℃搅拌过夜。冷却后，将该反应用水稀释，并用二氯甲烷萃取。将该有机层用水和盐水洗涤，并用硫酸钠干燥，并将该溶剂真空除去，得到N4,N4-二甲基嘧啶-2,4-二胺(400mg，2.89mmol，76％产率)。MS(ESI)计算值C6H10N4:138.1。
实施例82:4-(2-氨基嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的制备：
将THF(20mL)加至4-氯-2-氨基嘧啶(500mg，3.87mmol)和N-Boc哌嗪(7.21g，38.7mmol)的混合物中。将该反应在70℃搅拌过夜。冷却后，将该溶剂真空除去并将剩余残余物用硅胶色谱纯化(1:1石油醚:乙酸乙酯)，得到4-(2-氨基嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(650mg，2.33mmol，60％产率)。MS(ESI)计算值C13H21N5O2:279.2。
以下化合物以类似的方式制备：4-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺
实施例83.(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的制备:
步骤1.2-溴-5-硝基苯甲醛的合成：
在0℃，向2-溴苯甲醛(10.0g，53.7mmol)在H2SO4(100mL)中的溶液中分批加入KNO3(5.43g，53.7mmol)，经1h。将该混合物搅拌40min并加入额外的KNO3(0.72g)。将该反应混合物在0℃搅拌3h，然后倒至冰水中。将所得沉淀物通过过滤收集，用水漂洗并从EtOAc/戊烷中重结晶，得到2-溴-5-硝基苯甲醛(11.7g，94％产率)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C7H4BrNO3:228.9。
步骤2.5-(2-溴-5-硝基苯基)噁唑的合成：
将2-溴-5-硝基苯甲醛(1.0g，4.33mmol)、K2CO3(1.79g，12.9mmol)和TosMIC(2.12g，10.8mmmol)在MeOH中的混合物在60℃加热1.5h。将该混合物浓缩。加入水并通过过滤收集固体，用水、MeOH漂洗，然后用石油醚漂洗，得到5-(2-溴-5-硝基苯基)噁唑(750mg，产率65％)，其为灰色固体。MS(ESI)计算值C9H5BrN2O3:228.9。
步骤3.(3-(4-硝基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成：
在氮气下，向5-(2-溴-5-硝基苯基)噁唑(300mg，1.11mmol)在DME(20mL)中的溶液中加入丙-2-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(431mg，2.77mmol)。加入CuI(21mg，0.11mmol)和Pd(dppf)Cl2(78mg，0.11mmol)，然后加入TEA(0.5mL)。将该反应混合物在80℃加热4h，冷却至室温，倒至水中，并用EtOAc(3x50mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化(EtOAc:戊烷＝1:5)，得到(3-(4-硝基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(350mg，产率92％)，其为黄色油状物。MS(ESI)计算值C17H17N3O5:343.1。
步骤4.(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成：
将(3-(4-硝基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(3.8g，11.1mmol)和Fe(4.96g，8.86mmol)在饱和NH4Cl/MeOH水溶液(V/V＝1:3)中的混悬液在60℃加热4.5h。将该混合物冷却至室温，将其通过硅藻土垫并将该滤液浓缩。将该残余物溶于EtOAc，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将粗制残余物用硅胶柱色谱纯化，得到(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(1.51g，产率44％)，其为黄色油状物。MS(ESI)计算值C17H19N3O3:228.9。
以(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯中所描述的类似的方式，从3-溴-5-硝基苯甲醛制备(3-(3-氨基-5-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯。
实施例84.(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙基)氨基甲酸叔丁酯的制备：
将(3-(4-硝基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(3.0g，8.75mmol)和10wt％Pd/C(1.0g)在MeOH(100mL)中的混合物在氢气氛下(50psi)搅拌16h。通过过滤除去催化剂，并将该滤液浓缩。将该残余物用硅胶柱色谱纯化，得到(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(940mg，产率35％)，其为黄色油状物。MS(ESI)计算值C17H23N3O3:228.9。
以(3-(4-氨基-2-(噁唑-5-基)苯基)丙基)氨基甲酸叔丁酯中所述的类似的方式，由(3-(3-硝基-5-(噁唑-5-基)苯基)丙-2-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯制备(3-(3-氨基-5-(噁唑-5-基)苯基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。
实施例85.2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶的制备：
将2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(1g，4.48mmol)、3,3-二氟吡咯烷盐酸盐(1.9g，13.4mmol)和K2CO3(3g，22.4mmol)在NMP(13mL)中的混合物在110℃搅拌过夜。加入第二批3,3-二氟吡咯烷盐酸盐(0.5g)并搅拌过夜。将该混合物过滤，用H2O洗涤，加入2NHCl以调节pH至1。将该混合物用EtOAc洗涤以除去残余的2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶。用K2CO3溶液调节水层至pH13，然后用EtOAc萃取，得到2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(220mg，17％)。MS(ESI)计算值C15H21BF2N2O2:310.2。
这个一般性步骤可用于制备4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2-(3-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)吡啶，其使用3-(三氟甲基)吡咯烷盐酸盐。
实施例86.(S)-2-(3-氟吡咯烷-1-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶的制备：
将2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(200mg)、(S)-3-氟吡咯烷盐酸盐(350mg)和Na2CO3(480mg)在IPA(3.5mL)中的混合物在91℃搅拌17小时。将该混合物过滤并浓缩。加入2NHCl以调节pH至1并用EtOAc萃取。将水层用Na2CO3溶液调节至pH7并将水用甲苯除去。将残余物溶于EtOAc，过滤并浓缩，得到(S)-2-(3-氟吡咯烷-1-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(95mg，36％)。MS(ESI)计算值C15H22BFN2O2:292.2。
这个一般性步骤可用于制备(R)-2-(3-氟吡咯烷-1-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶，其使用(R)-3-氟吡咯烷盐酸盐。
实施例87.3,3-二氟-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡咯烷的制备：
步骤1.1-(3-溴苯基)-3,3-二氟吡咯烷的合成：
将1,3-二溴苯(1g，4.24mmol)、3,3-二氟吡咯烷盐酸盐(669mg，4.66mmol)、Pd2(dba)3(134mg，0.233mmol)、Cs2CO3(3.32g，10.2mmol)和BINAP(264mg，0.424mmol)在甲苯(20mL)中的混合物在氮气氛下加热回流。搅拌过夜后，将该混合物冷却至室温并浓缩。将该浓缩物混悬于EtOAc(50mL)，用水(20mLx3)和盐水(20mL)洗涤，用Na2SO3干燥并浓缩。用柱色谱纯化(己烷/EtOAc＝100/1)，得到1-(3-溴苯基)-3,3-二氟吡咯烷(645mg，>100％)，其为无色油状物。MS(ESI)计算值C10H10BrF2N:261.0。
步骤2.3,3-二氟-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡咯烷的合成：
在氮气氛下，将1-(3-溴苯基)-3,3-二氟吡咯烷(899mg，3.43mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(957mg，3.77mmol)、Pd(dppf)Cl2(75mg，0.103mmol)、KOAc(1g，10.29mmol)在二噁烷(18mL)中的混悬液加热至85℃。搅拌过夜后，将该混悬液冷却至室温并过滤。将该滤液浓缩并用柱色谱纯化(己烷，然后己烷/EtOAc＝100/1)，得到3,3-二氟-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡咯烷(化合物A#；873mg，82％)，其为白色固体。MS(ESI)计算值C16H22BF2NO2:309.2。
这个一般性的两步步骤可用于制备1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)-3-(三氟甲基)吡咯烷，其使用3-(三氟甲基)吡咯烷盐酸盐。
实施例88.2-(3-((2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷的制备：
步骤1.1-烯丙基-3-溴苯的合成：
在氮气氛下，在3颈烧瓶中，将金属Mg(1.78g，73.76mmol)浸渍于无水乙醚(20mL)中。将三分之一体积的1,3-二溴苯(15g，63.58mmol)在无水乙醚(20mL)加至混合物中。加入1,2-二溴乙烷(0.1mL)以起始该反应。回流稳定后，以一定速率滴加剩余量的1,3-二溴苯溶液以维持回流。一旦加入完成，将该混合物回流搅拌1小时。然后滴加烯丙基溴(7.87g，65.12mmol)在无水乙醚(20mL)中的溶液。一旦加入完，将该混悬液回流搅拌1hr。将该反应用饱和NH4Cl(100mL)淬灭并将该混合物分离。将水相用乙醚(20mLx2)萃取。将合并的有机相用水(70mLx2)和盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到1-烯丙基-3-溴苯(146g)，其为无色油状物。使用这个原料而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C9H9Br:196.0。
步骤2.3-(3-溴苯基)丙烷-1,2-二醇的合成：
向1-烯丙基-3-溴苯(A#；1g，5.08mmol)在CH3CN/H2O(20mL，v/v＝4/1)中的溶液加入NMO(1.3g，11.16mmol)和K2OsO4·2H2O(187mg，0.508mmol)。将该混合物在室温搅拌2天。将该CH3CN减压除去并将该浓缩物用EtOAc稀释。将该混合物通过硅藻土过滤并将该滤液浓缩，得到3-(3-溴苯基)丙烷-1,2-二醇(化合物A#)。使用这个原料而无需进一步纯化。MS(ESI)计算值C9H11BrO2:230.0。
步骤3.4-(3-溴苄基)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷的合成：
向3-(3-溴苯基)丙烷-1,2-二醇(A#；1.17g，5.06mmol)在丙酮(25mL)中的溶液中加入2,2-二甲氧基丙烷(1.8mL，15.18mmol)和PTSA(96mg，0.506mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物浓缩并用柱色谱(己烷/EtOAc＝20/1)纯化，得到4-(3-溴苄基)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷(化合物A#；200mg，15％)，其为淡黄色油状物。MS(ESI)计算值C12H15BrO2:270.0。
步骤4.2-(3-((2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷的合成：
将4-(3-溴-苄基)-2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷(A#；800mg，2.95mmol)和双(频哪醇合)二硼(822mg，1.1当量)、Pd(dppf)Cl2(216mg，0.1当量)和KOAc(868mg，3.0当量)在二噁烷(15mL)中的混合物脱气并在氮气下加热至85℃。在85℃搅拌过夜后，将该黑色混悬液冷却至室温并经硅藻土过滤。将该滤液浓缩并用柱色谱(己烷/EtOAc＝40/1)纯化，得到2-(3-((2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(化合物A#；800mg，85％)，其为无色油状物。MS(ESI)计算值C18H27BO4:318.2。
实施例89.(9S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺盐酸盐和2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-5-((6-氧代-6-((4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯甲酸的制备:
试剂和条件：a)NaHCO3，THF，40℃；b)Fe，AcOH，IPA/水，回流；c)AlH3，THF，-78℃至室温；d)48％HBr；e)3-三氟苯基硼酸，Pd(OAc)2，X-Phos，Cs2CO3，二噁烷/水；f)三光气，DIEA，CH2Cl2；g)4NHCl，二噁烷；h)DIEA，6[荧光素-5(6)-甲酰胺基]己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，CH3CN。
步骤1.(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二甲酯的合成。
向2,6-二氯-3-硝基吡啶(40.0g，207mmol)、L-谷氨酸二甲酯盐酸盐(87.7g，414mmol)和NaHCO3(69.6g，829mmol)的混合物中加入四氢呋喃(600mL)。将该混合物在40℃搅拌24h，同时用HPLC监测2,6-二氯-3-硝基吡啶的消失。反应完成后，将该固体过滤并用乙酸乙酯(3x100mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，并将该残余物用硅胶色谱纯化(用10:1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱)，得到(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二甲酯，其为黄色固体(60g，87％)。LRMS(m/z)332.1[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C12H15N3O6Cl，332.0649；实测值，332.0651。
步骤2.(S)-3-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙酸甲酯的合成
向(S)-2-((6-氯-3-硝基吡啶-2-基)氨基)戊二酸二甲酯(20g，60.2mmol)和铁粉(16.8g，301mmol)的混合物中加入2-丙醇(375mL)和水(125mL)。向该搅拌的混合物中加入乙酸(5.5g，90.3mmol)，并将该反应回流搅拌1h，同时用HPLC监测起始原料的消失。反应完成后，将该固体过滤并用2-丙醇(3x50mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液浓缩至干，然后将该残余物真空浓缩，得到(S)-3-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙酸甲酯，其为暗黄色固体，其用于下一步而无需进一步纯化(15g，81％)。LRMS(m/z)270.1[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C11H13N3O3Cl，270.0645；实测值，270.0645。
步骤3.(S)-3-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙-1-醇的合成
在氮气下，向AlCl3(17.78g，133.3mmol)在四氢呋喃(260mL)中的溶液中以一定速率滴加2MLiAlH4的THF溶液(200mL，400mmol)，以控制气体的释放。得到铝烷(AlH3)在THF中的溶液。在单独的烧瓶中，在氮气下制备(S)-3-(6-氯-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙酸甲酯(26.0g，96.4mmol)在THF(460mL)中的溶液，然后用干冰/丙酮浴冷却。向其中滴加铝烷溶液，同时搅拌，经2h。当添加完成后，除去该冷却浴，并将该反应温热至室温。1.5h后，LCMS分析显示将该反应完成，并将NaOH(17.6g)在水(65mL)中的溶液缓慢加入以控制氢气的释放。将该混悬液搅拌18h，之后将该固体通过过滤除去。将该沉淀物用乙酸乙酯洗涤，然后将该滤液和洗涤液真空浓缩。将该产物用硅胶色谱纯化(0-10％梯度的MeOH/CH2Cl2)，得到(S)-3-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙-1-醇，其为橘黄色固体(15.21g，69％)。LRMS(m/z)228.1[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C10H15N3OCl，228.0904；实测值，228.0903。
步骤4.(5R,9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的合成
向(S)-3-(6-氯-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)丙-1-醇(12g，52.7mmol)中加入48％(w/w)HBr(水溶液)(160mL)，并将该反应在90℃搅拌18h，同时用HPLC监测起始醇的消失。反应完成后，将其冷却至室温，然后加入1.2MNaHCO3水溶液，直至达到pH8。将该混合物用乙酸乙酯(3x100mL)萃取，然后将有机相用盐水(1x100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(用2:1(v/v)己烷/乙酸乙酯洗脱)，得到(5R,9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯，其为亮黄色固体(6.0g，55％)。LRMS(m/z)210.1[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C10H13N3Cl，210.0798；实测值，210.0800。
步骤5.(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯的合成
将(9S)-2-氯-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯3.0g，15.4mmol)、(3-(三氟甲基)苯基)硼酸(4.4g，23.1mmol)、乙酸钯(344mg，1.54mmol)、2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯(X-Phos，476mg，3.08mmol)和碳酸铯(15g，46.2mmol)在1,4-二噁烷和水10:1(v/v)混合物(60mL)中的溶液在90℃加热24小时。然后将该反应冷却至室温，并用乙酸乙酯(150mL)稀释。将该混合物用饱和NaHCO3水溶液(200mLx3)洗涤，然后将该有机层干燥(MgSO4)并浓缩至干。将所得残余物用硅胶色谱(10-100％梯度的乙酸乙酯/戊烷)纯化，得到(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯，其为亮黄色固体(3.7g，75％)。LRMS(m/z)320.2[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C17H17N3F3，320.1375；实测值，320.1375。
步骤6.4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基-吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基氨基甲酸叔丁酯的合成
向(9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯(999mg，3.23mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(1.7mL，9.78mmol)并将该反应混合物用冰浴冷却至0℃。然后分四小份加入三光气(482mg，1.63mmol)。除去该冰浴并将该混合物温热至室温。通过以下监测该反应的进程：取出500uL等份并与甲醇合并来测定经中间体氯甲酸酯的形成到氨基甲酸甲酯的转化。如果残留任意起始原料，则加入另一份三光气(200mg)并将该反应混合物在室温搅拌5小时。接下来，分两等分(每份400mg)将4-氨基苄基氨基甲酸叔丁酯(800mg，3.60mmol)加至上述混合物中并将所得混合物在室温搅拌2小时。加入饱和NaHCO3水溶液(30mL)，然后将有机相分离并减压浓缩至干。将该残余物用硅胶色谱纯化(15-100％梯度的乙酸乙酯/戊烷)，得到4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基-氨基甲酸叔丁酯，其为白色固体(761mg，42％)。LRMS(m/z)568.2[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C30H33N5O3F3，568.2536；实测值，568.2538。
步骤7.(9S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺盐酸盐的合成
将4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基氨基甲酸叔丁酯(759mg，1.34mmol)溶于4NHCl(10mL)和1,4-二噁烷中并在室温氮气下搅拌1小时。减压除去溶剂并将所得固体真空干燥过夜，得到(9S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺盐酸盐，其为淡褐色固体(763mg，100％)。LRMS(m/z)468.1[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C25H25N5OF3，468.2011；实测值，468.2010。
步骤8.2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-5-((6-氧代-6-((4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯甲酸的合成
将(9S)-N-(4-(氨基甲基)苯基)-2-(3-(三氟-甲基)苯基)-8,9-二氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10(7H)-甲酰胺盐酸盐(39mg，0.10mmol)溶于乙腈(2mL)和甲醇(0.2mL)中。然后加入N,N-二异丙基乙胺(32μL，0.20mmol)，然后加入6-[荧光素-5(6)-甲酰胺基]己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(50mg，0.085mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后通过反相HPLC(5-95％梯度的乙腈/水，添加有0.1％TFA)将该产物分离，得到2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-5-((6-氧代-6-((4-((9S)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-7,8,9,10-四氢-6H-5,9-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环辛四烯-10-甲酰胺基)苄基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯甲酸，其为棕色固体(26mg，35％)。LRMS(m/z)939.2[M+H]+；HRMS(m/z):[M+H]+计算值C52H46N6O8F3，939.3329；实测值，939.3328。
实施例90.迷你-hSIRT1设计和表征
在全长hSIRT1蛋白上进行质子-氘核交换质谱(HDX-MS)用以鉴定和表征hSIRT1的重要功能性区域。H-D交换的速率高度依赖于所述蛋白的动态性能，其在暴露的溶剂和/或柔性区域发生更快的交换，和在更隐蔽和/或结构上刚性的区域发生更慢的交换(Hamuro，Y.等人(2003)JbiomolTechniques:JBT14，171)。与在hSIRT1(19-747)上的先前研究一致(Hubbard，B.P.等人(2013)Science339，1216)，全长hSIRT1含有三个主要的结构区域：催化核心区域，残基229-516(下文称其为hSIRT1cc)(Jin，L.等人(2009)JBiolChem284，24394和Frye，R.A.(2000)BiochemBiophysResCommun273，793)、该催化核心前190-230的N-末端区域以及该催化核心之后约640-670的C-末端的远端区域。
为了探测在hSIRT1上的STAC结合位点，在存在或不存在STAC1的情况下进行HDX-MS。添加1降低在hSIRT1的N-末端区域残基190-230附近的H-D交换速率，意味着这个区域参与STAC的结合。此外，15N-标记的hSIRT1(180-230)的1H和15NHSQC波谱分散良好，意味着其形成自主折叠区域。将1加至15N-标记的hSIRT1(180-230)导致显著的化学位移扰动并进一步支持了1与这一区域的直接相互作用，以下称其为STAC-结合区域(SBD)。将1加至存在p53-衍生的肽底物(Ac-p53(W5))的hSIRT1中(Dai，H.等人(2010)JBiolChem285，32695)导致在该催化核心的SBD附近以及推测的底物结合位点(残基417-424)处H-D交换速率的扰动，这意味着结合在N-末端区域的STAC和结合在hSIRT1催化核心的底物连结。这与之前观测到的STAC提高底物与hSIRT1的结合从而提高hSIRT1的催化效率一致(Milne，J.C.等人(2007)Nature450，712)。
与SBD不同，将由HDX-MS鉴定的C-末端结构元素(641-665)从该催化核心分离出约150个残基并预测含有多个β链，在本文表示为C-末端β-链/片层(CBS)，类似于之前报道的鼠SIRT1活性必需(EssentialforSIRT1Activity,ESA)肽(19)。使用之前报道的脱乙酰分析条件，hSIRT1cc仅显示出全长酶的八分之一活性(Dai，H.等人(2010)JBiolChem285，32695)。所述CBS肽将hSIRT1cc的催化活性反向恢复至全长hSIRT1的80％，EC50＝59nM，这与以前的观察一致(Kang，H.等人(2011)MolCell44，203和Marmorstein，R.等人(2012)JBiolChem287，2468)。我们还设计了仅涵盖β-链区域(642-658)的最小CBS片段，其表现与亲代CBS肽类似。动力学表征表明，CBS肽通过将肽底物和hSIRT1cc的NAD+的KM值降低至1/4-1/5来恢复活性(参见表1)。
表1.存在或不存在CBS肽情况下的hSIRT1催化核心的稳态动力学。a
a数据来自于PNC1/GDH分析。
bNAD+浓度固定在1mM。
cAc-p53(W)浓度固定在500μM。
综上，上述数据表明最小官能化hSIRT1的三部分结构包括1)构成基本催化机构的中央核心，2)N-末端SBD，其介导STAC的结合和活化，和3)C-末端CBS肽，其稳定所述催化核心，导致更有效的脱乙酰基酶活性。基于此，我们设计了hSIRT1构建体，其包括全部三种共价结合的最小结构元素，我们称其为迷你-hSIRT1。该构建体跨越183-505或183-516，其通过柔性的聚-甘氨酸/丝氨酸连接基(GS、(GGGS)2或(GGGS)3)连接至所述CBS肽(Sauer，R.T.和Robinson，C.R.(1998)ProceedingsofNatAcademyofSciencesofUSA95，5929)。迷你-hSIRT1构建体和全长酶的所述KM和kcat值具有可比性，如同对于非竞争性hSIRT1抑制剂EX-527或烟酰胺(NAM)的IC50值，证实了迷你-hSIRT1的功能保真度(参见表2)。此外，针对跨越广泛化学型的STAC介导的活化，在迷你-hSIRT1和全长酶之间存在极好的相关性。除去SBD完全破坏了STAC介导的迷你-hSIRT1的活化，证明了这个区域对活化是极其重要的。相反，缺少CBS的迷你-hSIRT1保留了显著水平的STAC活化，证明所述CBS提高STAC介导的活化但不是必须的。最终，所述E230K突变还减弱在迷你-hSIRT1上STAC介导的活化以及在全长酶上STAC介导的活化(Hubbard，B.P.等人(2013)Science339，1216)。总之，这些观察结果表明，在一半分子大小的情况下，迷你-hSIRT1是全功能性的且是全长hSIRT1的活性替代物。
表2.迷你-hSIRT1构建体的稳态动力学。a
a数据来自于PNC1/GDH分析。
bNAD+浓度固定在2mM。
cAc-p53(W)浓度固定在400μM。
d来自(1)的值
实施例91.迷你-hSIRT1/STAC复合物的结构
尽管所述hSIRT1催化核心的x射线晶体结构已经被报道(Zhao，X.等人(2013)JMedChem56，963)，但是并不知道该全长酶的结构。全长hSIRT1的结构始终具有挑战，部分是由于延长的N-和C-末端区域的构象灵活性。所述迷你-hSIRT1构建体为我们提供了结晶该全长酶的等功能替代物的机会。我们成功地用在HDX-MS实验中所用的STAC1结晶了迷你-hSIRT1(183-505-(GGGS)2-CBS)，并通过在使用基于SIRT3的同系物模型的研究模型的分子置换来确定该复合物(迷你-hSIRT1/1)的结构(Jin，L.等人(2009)JBiolchem284，24394)。迷你-hSIRT1是由催化核心、N-末端三螺旋束SBD和C-末端β-发夹结构CBS组成，所述催化核心采用所有沉默调节蛋白共有的罗斯曼折叠(Rossmann-fold)大叶和锌结合小叶。有趣的是，在晶格中观察到了与结晶学对称性相关的迷你-hSIRT1的STAC介导的二聚体。尺寸排阻色谱(SEC)证实，迷你-hSIRT1在存在STAC1时在溶液中形成二聚体。但是，对于相同化学型的类似的STAC7却没有观察到迷你-hSIRT1二聚体的形成。鉴于这一观察以及用于结晶的STAC浓度比在生物化学分析测量活化中所用的浓度高得多这一事实，这样子看来，在该晶体结构中观察到的二聚化不是STAC活化hSIRT1所必需的。
所述CBS介导了具有该催化区域的六链β片层罗斯曼折叠小叶的β-增大，这与在CBS结合后的hSIRT1cc扰动的HDX-MS结果一致。所述CBS-介导的β-增大表现出稳定了hSIRT1催化核心的活性位点，其恢复了乙酰化肽和NAD+底物所观察到的KM值。所述N-末端SBD与在该SBD内结合至螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，H2-T-H3)基元的1形成独立折叠的三螺旋束，这与HDX-MS、NMR和酶动力学的结果一致。主要的迷你-hSIRT1/1结合位点是具有偏心的、更深疏水口袋的相对浅的疏水表面，该位点被1的CF3基团占据。这与观察到的跨多个STAC化学型出现的构效关系(SAR)一致，表明需要由分子内氢键维持该核心支架的整体平整度(Vu，等人(2009)JMedChem，52，1275)。就区域构型而言，在迷你-hSIRT1结构和酵母Sir2结构之间观察到显著的相似性，即二者均具有N-末端螺旋束以及典型的罗斯曼折叠大叶外的β-发夹结构的C-末端β-增大(Hsu，H.C.等人(2013)Genes&Dev27，64)。但是，酵母Sir2不包含在hSIRT1上观察到的150个氨基酸插入并显示为酵母中的天然“迷你-SIRT1”。Sir2上的N-末端区域表现出对另一酵母蛋白Sir4的别构活化的重要性(Hsu，H.C.等人(2013)Genes&Dev27，64)。尽管所述Sir2的N-末端区域的结构与hSIRT1SBD不同，但是这二者均表现出在所述催化核心的别构活化中具有功能性保守的作用。
实施例92.STAC结合口袋的位点定向突变
我们使用全长hSIRT1的位点定向突变(site-directedmutagenesis)来确认迷你-hSIRT1结构进行鉴定的所述SBD的关键残基。产生全长hSIRT1的以下点突变来探测三类残基：a)显示出与活化剂直接相互作用的残基(T219A、I223A、N226A和I227A)，b)偶联调节剂Glu230(Hubbard，B.P.等人(2013)Science339，1216)(E230K、E230A和E230Q)，和c)在活化剂结合中没有明显作用的SBD残基(Q222A和V224A)。没有一个所述突变体显著削弱使用所述Ac-p53(W5)底物的基础催化活性，或影响EX-527、TFA-p53肽(Ac-RHK-KTFA-L-Nle-F-NH2)或烟酰胺(NAM)的抑制(参见表4和5)。
该突变对活性的总的影响是通过以下评估的：使用在25μM固定浓度测试的结构不同的246个STAC来比较野生型和突变的全长SIRT1的折叠活化。此外，我们通过使用一组5个化合物(STAC1，6-9)分别监测它们的EC50和最大活化值的改变来研究该突变对STAC结合和活化的影响。T219A、I223A和I227A均表现出广泛的活性削弱，与野生型hSIRT1相比EC50增加，这意味着受损的活性剂结合与结构相关(参见表6)。有趣的是，I223A是最依赖于化合物的突变体，其STAC介导的活化由衰减到提高。显示活性提高的STAC富集了含邻位-CF3取代的苯环的结构。在该晶体结构中，Ile223位于该活化剂的正下方并内衬1的间位-CF3插入的口袋。相比于间位取代，Ile223到Ala突变产生的空腔预期会更好地适应邻位取代。这一发现进一步证实了控制STAC结合的关键的分子相互作用并指出改变STAC与SBD间相互作用的策略。
表4.野生型和突变型全长hSIRT1的稳态底物动力学。
a数据来自于PNC1/GDH分析。
b数据来自于OAcADPr分析。
c来自(1)的值
表5.野生型和突变型全长hSIRT1的抑制。
a数据来自于OAcADPr分析，其使用Ac-p53(W5)底物。
bTFA-p53肽序列：Ac-RHKK(TFA)L-Nle-F-NH2。
表6.用于全长hSIRT1活化或抑制分析的底物浓度。
Asn226表现在其甲酰胺氮和蛋白表面上的1的羰基氧之间形成氢键。但是，相比于野生型而言，N226A的活化仅为最低限度的削弱。来自这个氢键的小贡献可能是由于其溶剂暴露高。
最近已经报道，Glu230到Lys或Ala的突变广泛削弱STAC的活化，尽管其发生机理尚不明确(Hubbard，B.P.等人(2013)Science339，1216)。我们测试了E230K、E230A和E230Q全长hSIRT1蛋白的活化。在全部这三种Glu230突变体中，最大活化被减弱而没有改变EC50(参见表7和8)，表明了Glu230在hSIRT1的活性构象的形成或稳定中的作用。E230Q的活化也广泛地被减弱，意味着Glu230的负电荷对稳定hSIRT1的活性构象是至关重要的并且Glu230可能与活性构象的正电荷残基相互作用。
表7.hSIRT1突变对活化剂EC50值的影响。
a改变倍数＝(突变体EC50/野生型EC50)
EC50值是由使用方程式1的活化剂量-响应曲线确定的。活化是使用Ac-p53(W5)底物的OAcADPr分析测量的。
表8.hSIRT1突变对STAC的最大活化的影响。
a改变倍数＝(野生型RVmax-1)/(突变体RVmax-1)
最大活化值(RVmax)是由使用方程式1的活化剂量-响应曲线确定的。活化是使用Ac-p53(W5)底物的OAcADPr分析测量的。
与上述突变体不同，Q222A和V224A呈现出正常的活化，这与在迷你-hSIRT1/1结构中它们的位置远离STAC相一致。重要的是，由全长hSIRT1得到的全部这些数据与所预期的迷你-SIRT1晶体结构一致，进一步验证这些结构的生化意义。
尽管上述突变的广泛影响，但是没有一个完全破坏了hSIRT1的活化，如去除SBD所见那样。由于Ile223位于结合的STAC正下方且I223A的活化是高度依赖化合物的，因此我们推测I223RhSIRT1将构成迄今为止最高度活化受损的全长酶。将Ile替代为Arg引入体积和电荷到该疏水STAC结合位点，这预期会破坏化合物基于结构的结合。I223R并不会改变与Ac-p53(W5)或FOXO-3a底物肽的基础催化活性，也不会改变EX-527、TFA-p53肽或NAM的抑制(参见表4、5和9)。但是，全部246个活化剂对这两种底物的活化完全丧失。
表9.具有FOXO-3a21-mer的全长hSIRT1的稳态动力学a。
a数据来自于PNC1/GDH分析。
实施例93.STAC和底物结合之间的变构连结
我们研究了STAC活化hSIRT1的机理。为了这个目的，我们确定了迷你-hSIRT1、1、衍生自p53的7个氨基酸肽底物(Ac-p53)和不可水解的NAD+类似物carbaNAD的四元复合物的结构以及与占据肽和NAD+结合位点的新的活性位点定向抑制剂2复合的迷你-hSIRT1/1的结构。在该四元复合结构中，所述Ac-p53肽和carbaNAD结合至大叶和小叶之间的活性位点裂缝。Ac-p53采用了延伸的构象，主链酰胺基团与小叶的残基Gly415和Glu416以及大叶的残基Lys444和Arg446形成氢键。肽+1位的酰胺与Arg446的酰胺之间的氢键为疏水+1残基提供侧链间潜在的相互作用，所述残基可对STAC介导的hSIRT1激活而言非常重要(Dai，H.等人(2010)JBiolChem285，32695)。所述乙酰基赖氨酸侧链插入到Phe414、Leu418和Val445内衬的疏水腔。乙酰基被夹在His363和Phe297之间，该乙酰基赖氨酸的ε-N与Val412的羰基氧发生氢键合，这维持了该乙酰基赖氨酸侧链的定向和延伸构象。CarbaNAD还与hSIRT1多点接触，其中大多数与在hSIRT1催化核心/NAD/EX-527类似物的三元复合物(Zhao，X.等人(2013)JMedChem56，963)中观察到的那些类似。注意到一些不同，例如烟酰胺环的酰胺基团与C口袋中的Ile347和Asp348形成氢键。此外，该烟酰胺侧的呋喃核糖的2’和3’羟基与乙酰基-赖氨酸的羰基氧原子形成氢键，这有助于使NAD的C-1′原子朝向肽N-ε-乙酰基随后的亲核攻击。抑制剂2占据乙酰基-赖氨酸结合位点和迷你-hSIRT1的烟酰胺结合C口袋，类似于最近报道的SIRT3/2复合物的结构。与SIRT3类似，底物或活性位点抑制剂的结合导致区域闭合，使得大小叶聚集(Szczepankiewicz，B.G.等人(2012)JOrgchem77，7319和Jin，L.等人JBiolChem(2009)284，24394)。活性位点占据后更显著的构象变化是N-末端区域向上移动，这看起来是铰接在Arg234周围并将所述SBD更靠近该活性位点，从而提供了通过协同作用将STAC结合和底物结合位点变构连结的潜在机理。该铰链残基，Arg234，位于多元连接基(残基233-238)内并通过Arg234的胍基与Asp475的甲酸酯基之间形成的盐桥将该N-末端SBD锚定至该催化核心并氢键合至His473和Val459的羰基。SBD在这三种结构中的比较表明，该区域是相对刚性的，其中重叠的STAC-结合的螺旋-转角-螺旋(H2-T-H3)基元仅具有微微倾斜于该迷你-hSIRT1/1/2复合物结构的第一螺旋。我们评估了在该SBD和锚定Arg234之间的短连接基(230-233)是否对通过将Pro231和Pro232突变成Gly来调节该连接基的刚性的变构连结非常重要。事实上，P231G/P232G呈现出迷你-hSIRT1明显减弱的STAC活化，支持了这个短连接基调节该SBD的运动以及STAC结合和底物结合而产生的连结的重要性。
HDX-MS数据表明，相比于野生型hSIRT1，STAC与E230K突变体的结合不再围绕E230K/1/Ac-p53(W5)复合物的肽结合位点提供保护。这意味着该E230K突变可能危害到STAC和底物结合位点之间的连结。为了进一步研究，研发了荧光偏振(FP)分析用以测量STAC与hSIRT1的结合并研究底物的存在下的连结效应。将以Kd0.3μM结合至全长hSIRT1的荧光素连接的STAC(3)用作FP探针并被其母体化合物4有效地竞争掉。对于I223RhSIRT1，3的结合被严重削弱，证实在该迷你-hSIRT1/1结构中所示的这个残基在直接参与该全长酶的STAC结合中的作用。在存在或不存在Ac-p53(W5)底物的情况下，在FP测试中测定STAC(例如5)，其中在存在Ac-p53(W5)的情况下展现出提高的结合亲和力(Ki)，这与降低KM的活化机理一致。尽管该E230K突变体相比于野生型而言显示出对绝大多数STAC极其相近的结合亲和力，但是Ac-p53(W5)对这一结合的增强并不存在或被严重削弱。所述HDX-MS和活化数据一同证明Glu230并不直接参与STAC结合，反而是介导STAC和底物结合的连结以促进活化的关键残基。这还通过用化合物1和2确定E230K迷你-hSIRT1蛋白的结构来进一步证实。该整体结构类似于野生型迷你-hSIRT1/1/2三元复合物的结构，证明Glu230并不直接参与STAC结合，而很可能在变构连结过程中扮演一种动态的角色。此外，用E230K迷你-hSIRT1/STAC结构观察结晶二聚体，其与该野生型蛋白结构所观察到的类似，进一步证明STAC对hSIRT1的生物化学活化可能不需要二聚化。
为了评估乙酰基底物上的疏水部分对STAC介导的SIRT1活化的基本需求(Dai，H.等人(2010)JBiolChem285，32695)，我们基于Arg446与+1位非常靠近，将与可能的+1位Trp相互作用的残基Arg446突变成Ala。正如所预期的，R446AhSIRT1对Ac-p53(W5)具有升高的KM值(参见表2)。但是，其也显示了减弱的活化，类似于E230K/A突变体所观察到的。基于这种观察，即Arg446的阳离子性质和活性位点和STAC-结合位点间的连结，我们制作了该迷你-hSIRT1R446E/E230K双重突变体，用于测试Arg446是否是E230的可能的静电配体，使用具有E230K和R446E的迷你-hSIRT1作为对照。而无论E230K还是R446E导致了迷你-hSIRT1的STAC活化显著削弱，所述R446E/E230K双重突变体相比于E230K或R446E，部分恢复STAC介导的迷你-hSIRT1的活化。这些数据支持了在活化构象中的Glu230和Arg446之间存在盐桥且与SBD所预期的运动以与活化状态的催化核心相互作用相一致。
本文中我们讨论的全部迷你-hSIRT1构建体概括了全长hSIRT1的三种重要特征：1)稳态酶动力学和抑制，2)跨越多个化学型的STAC活化模式，3)和由E230K造成的STAC活化减弱。然后我们使用该迷你-hSIRT1构建体，得到首次报道的具有结合的STAC的全功能型hSIRT1的结构。该生物化学和结构表征揭示了CBS和催化核心之间的hSIRT1分子内相互作用，这对于hSIRT1的基础脱乙酰活性而言是必需的。更重要的是，该迷你-hSIRT1/STAC复合物的结构揭示了该STAC结合位点的详细结构，为将来基于结构的药物设计提供了重要信息。结合有不同配体的hSIRT1结构的比较表明，尽管该SBD的确切位置可能受到晶体堆积的影响，但是所述N-末端SBD沿构象反应坐标向上运动。STAC活化的潜在机理可由此推断，即SBD的向上运动与该催化核心的区域闭合的协同作用使连结该STAC结合和底物结合。使用FP的生物物理表征和使用全长hSIRT1的定向诱变与支持这一STAC结合和活化模型的迷你-hSIRT1/STAC复合物的结构观察完全一致。据我们所知，本文所报道的迷你-hSIRT1/STAC复合物的结构代表了合成性变构活化剂结合至除葡糖激酶之外的酶的第二个例子(Grimsby，J.等人(2005)Science301，370)。总而言之，本文给出的结果提供明确可见且功能性的证据证明了hSIRT1经小分子与肽底物的直接别构活化，并为进一步阐明hSIRT1被STAC活化且也有可能被hSIRT1的内源性调节剂活化的机理提供了基础。
实施例94.蛋白克隆、表达和纯化
将迷你-hSIRT1构建体克隆到修饰的pET21b载体(Novagen)。该蛋白表达于大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene)，其作为N-末端融合至具有整合的TEV蛋白酶位点的六组氨酸亲和标记物。将单菌落接种到含100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，在37℃，以250rpm直至该A600达到0.3。然后将该培养基转移至16℃，以250rpm直至该A600达到0.6。加入异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，使最终浓度为0.2mM，且持续在16℃，以250rpm表达过夜。通过离心收集细胞，并将该片状沉淀物再悬浮于裂解缓冲液中(25mMHEPES，pH7.5，200mMNaCl，5％甘油，和5mM2-巯基乙醇)并超声破碎该细胞。通过在4℃以10,000xg离心40分钟从细胞碎片中分离上清液并上样至Ni-NTA柱(Qiagen)，该柱用含25mMHEPES，pH7.5，200mMNaCl，5％甘油，5mM2-巯基乙醇和20mM咪唑的缓冲液平衡。将该柱用5倍柱体积的含25mMHEPES，pH7.5，200mMNaCl，5％甘油，5mM2-巯基乙醇和50mM咪唑的缓冲液洗涤，并用含25mMHEPES，pH7.5，200mMNaCl，5％甘油，5mM2-巯基乙醇，和250mM咪唑的缓冲液洗脱。将洗脱的蛋白在裂解缓冲液中透析并用TEV蛋白酶(Invitrogen)消化以除去该N-末端His标记，在4℃过夜。将该蛋白上样至用裂解缓冲液平衡的第二Ni-NTA柱。将该未标记的蛋白用含25mMHEPES，pH7.5，200mMNaCl，5％甘油，5mM2-巯基乙醇和5mM咪唑的缓冲液洗脱。将该纯化蛋白用含20mMTris-HCl，pH8.0，250mMNaCl，5％甘油和10mMDTT的透析缓冲液透析并浓缩。将该蛋白进一步用S200柱(GEHealthcare)纯化至95％纯度，用经CoomassieBrilliantBlueR-250染色的SDS-PAGE分析进行评估并在透析缓冲液中浓缩至10–15mg/ml。
将人hsirt1180-230克隆至修饰的pET21b载体(Novagen)的BamHI和XhoI之间，其在T7-lacO促进剂的控制下发生表达。该蛋白表达于大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene)，其作为N-末端融合至具有整合的TEV蛋白酶位点的六组氨酸亲和标记物。将单菌落接种到含100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，在37℃，以250rpm过夜。然后将20mlLB培养基接种到含有15NH4Cl的1LM9培养基中并在37℃，定轨振荡器上(200rpm)进行培养直至OD600约为0.8。然后将该培养基转移至16℃，以250rpm直至该A600达到1.0。加入异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷，使最终浓度为0.3mM，且持续在16℃，以250rpm表达过夜。通过离心收集细胞，并将该片状沉淀物再悬浮于裂解缓冲液中(50mMHepes，200mMNaCl，5％甘油，5mMβ-ME，pH7.5)并超声以打开该细胞。通过在4℃以10,000xg离心40分钟从细胞碎片中分离上清液并上样至Ni-NTA柱(Qiagen)，该柱用含50mMHepes，200mMNaCl，5％甘油，5mMβ-ME，pH7.5的缓冲液平衡。将该柱用20倍柱体积的含50mMHepes，200mMNaCl，5％甘油，5mMB-ME和20mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗涤，并用含50mMHepes，200mMNaCl，5％甘油，5mMβ-ME和250mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱。将洗脱的蛋白在裂解缓冲液中透析并用TEV蛋白酶(Invitrogen)消化以除去该N-末端His标记，在4℃过夜。将该蛋白上样至用裂解缓冲液平衡的第二Ni-NTA柱。将该未标记的蛋白用含50mMHepes，200mMNaCl，5％甘油，5mMβ-ME和10mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱。将该纯化蛋白浓缩并进一步用S200柱(GEHealthcare)纯化至95％纯度，用经CoomassieBrilliantBlueR-250染色的SDS-PAGE分析进行评估并在50mMHEPES，50mMNaCl，0.5mMTCEP，pH6.5中浓缩至10mg/ml。
实施例95.全长SIRT1的制备
表达全长人SIRT1(hSIRT1)蛋白使之带有C-末端His6标记物并如Hubbard.等人(2013)Science339，1216中所述进行纯化，除了Q222A和I223RSIRT1，这二者是用(GELifesciences)进行纯化。在冰上将各细胞糊再混悬于含1,000UBenzonase核酸酶(SigmaAldrich)的缓冲液A(50mMTris-HClpH7.5，250mMNaCl，25mM咪唑和0.1mMTCEP)，其补充有完整无EDTA的蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche)。细胞经脉冲超声破碎，在40W以50％开启和50％停止总共进行12分钟。通过离心除去不溶性的碎片。将澄清的上清液直接上样至1mLHisTrapFFCrude柱(GELifesciences)。用缓冲液A洗涤后，将SIRT1用缓冲液B(50mMTris-HClpH7.5，250mMNaCl，500mM咪唑和0.1mMTCEP)洗脱。将该蛋白进一步用尺寸排阻色谱在缓冲液C(50mMTris-HClpH7.5，300mMNaCl，0.1mMTCEP)中进行纯化，其使用Hi-loadSuperdex20016/60柱(GELifesciences)。酶浓度用使用BSA作为标准品的Bradford分析进行确定。最终蛋白纯度用胶体光密度测定法进行评估。蛋白通过LC/MS确定。所有蛋白均大于90％纯度，除了V224A和T219A(80％)和E230A(85％)。
实施例96.SIRT1脱乙酰基反应
SIRT1脱乙酰基反应是在25℃反应缓冲液(50mMHEPES-NaOH，pH7.5，150mMNaCl，1mMDTT和1％DMSO)中进行，使用持续性PNC1/GDH偶联分析监测烟酰胺的产生(Smith，B.C.等人(2009)AnalBiochem394，101)或用质谱监测O-乙酰基ADP核糖(OAcADPr)的产生(Hubbard.等人(2013)Science339，1216)。所使用的最终浓度的PNC1/GDH偶联系统成分为20单元/mL牛GDH(Sigma-Aldrich)、1uM酵母PNC1、3.4mMα-酮戊二酸和220μMNADH或NADPH。使用6.22mM-1cm-1消光系数和0.81cm光路长度在340nm处转变吸光度，得到所用150uL反应的产物浓度。监测OAcADPr产生的分析是在含0.05％BSA的反应缓冲液中进行且通过用终止溶液淬灭该脱乙酰反应取时间点，所述终止溶液提供1％甲酸和5mM烟酰胺的最终浓度。淬灭的反应用1:1乙腈:甲醇稀释5倍并以5,000xg旋转10分钟用于沉淀蛋白，之后将其用AgilentRapidFire200High-Throughput质谱系统(Agilent，Wakefield，MA)分析，该质谱系统偶联至装有电喷雾离子源的ABSciexAPI4000质谱仪。从Biopeptide,Inc.得到基于p53的Ac-p53(W5)(Ac-RHKKAcW-NH2)和FOXO-3a21-mer(Ac-SADDSPSQLSKAcWPGSPTSRSS-NH2)肽。除非另外提及，否则脱乙酰分析使用该Ac-p53(W5)底物。
底物KM测定是通过在固定饱和浓度的第二底物的情况下，改变一个底物浓度进行的。SIRT1活化和抑制分析是在25℃，在含0.05％BSA的反应缓冲液中进行并使用OAcADPr分析进行分析。在加入底物前，对酶和化合物进行20分钟预培养。对于全长hSIRT1的活化筛选，结构不同组的246个化合物一式两份进行测定，各最终浓度25μM。为了对KM-调节的活性剂敏感，使用它们KM值的大约十分之一的底物浓度(参见表5)。测定5个化合物的剂量依赖性且该活化倍数数据用方程式1描述。
v x v o = b + RV m a x - b 1 + EC 50 [ X ] o (方程式1)
其中vx/v0是存在(vx)与不存在(v0)活化剂(X)的反应速率的比例，RVmax是在无穷大的活化剂浓度下的相对速率，EC50是产生二分之一的RVmax所需活化剂的浓度和b是vx/v0的最小值。
表5.野生型和突变体全长hSIRT1的抑制
a数据来自于OAcADPr分析，其使用Ac-p53(W5)底物。
bTFA-p53肽序列：Ac-RHKK(TFA)L-Nle-F-NH2。
实施例97.蛋白结晶、数据收集和结构测定
迷你-hSIRT1/1二元复合物的结晶通过在18℃的悬滴蒸汽扩散法得到。该液滴由1μl蛋白/化合物混合物和0.2M氯化镁、0.1MTrispH8.5和16％w/vPEG4000的1μl结晶缓冲液组成。迷你-hSIRT1/1/2的结晶通过在18℃的悬滴蒸汽扩散法得到。该液滴由1μl蛋白/化合物混合物和0.55M氯化钠、0.1MMESpH6.5和20％w/vPEG4000的1μl结晶缓冲液组成。迷你-hSIRT1/1/p53-7mer/carbaNAD复合物的结晶通过在18℃的悬滴蒸汽扩散法得到。该液滴由1μl蛋白/底物混合物和5％v/vTacsimate，pH.00.1MHEPESpH7.0和10％w/vPEG5000MME的1ul结晶缓冲液组成。迷你-hSIRT1(E230K)/1/2的结晶通过在18℃的悬滴蒸汽扩散法得到。该液滴由1μl蛋白/化合物混合物和0.2M硫酸锂、0.1MBis-TrispH6.5、29％w/vPEG3350的1μl结晶缓冲液组成。
将该晶体冷冻保护在含20％甘油的母液中，然后在液氮中快速冷冻。衍射数据在SSRFBL17U1、APS21-ID-D或APS21-ID-G光束线收集并使用Xia2程序处理(Winter，G.(2010)JApplCrystallogr43，186)。分子置换软件相位仪(McCoy，A.J.等人(2007)JApplCrystallogr40，658)被用于解析基于SIRT3的同源模型(PDB号:3GLU)的含有残基242-494的研究模型的结构。反复的结构精修和模型建立是在CCP4程序((1994)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr50，760)和Coot等(2004)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60，2126的Refmac5(Murshudov，A.A.等人(1997)ActaCrystallogrDBiolCrystallogr53，240)之间进行。有关衍射数据、精修和结构数据的详细信息在表3中列出。
表3.数据处理和精修统计
*括号中的值是针对最高分辨壳(highest-resolutionshell)
实施例98.核磁共振(NMR)波谱
该1H,15NHSQCNMR实验均在25℃在配有冷冻探头的BrukerAVANCEIII600MHzNMR波谱仪上进行，使用含有大约200μM15N-标记的SIRT1(180-230)(存在或不存在400μM1)的样品。所有NMR数据用NMRPipe处理(Delaglio，F.等人(1995)JBiomolNMR6，277)并用NMRView分析(Johnson，等人(1994)JBiomolNMR4，603)。
实施例99.尺寸排阻色谱(SEC)分析
所述分析使用Superdex7510/300GL柱(GEhealthcare)进行，进样100μL存在或不存在100μMSTAC的含有10μM迷你-hSIRT1，溶于50mMHEPES-NaOH，pH7.5，150mMNaCl和0.5mMTCEP的样品。将该结合反应在室温培养1h，然后进样该柱。
实施例100.荧光偏振(FP)分析
FP实验在25℃在20μL分析缓冲液(50mMHEPES-NaOH，pH7.5，150mMNaCl和1mMDTT)中进行。将该384孔板在激发和发射波长(分别为502nm和533nm)的PHERAstarFS上进行读数。为了探针的结合，将增加浓度的SIRT1加至10nM探针3。该结合等温线用方程式2描述。对于竞争性结合模式，将增加浓度的竞争剂添加至10nM3和0.3μMSIRT1野生型或E230K突变体的混合物中，其存在或不存在15μM的Ac-p53(W5)。该竞争性数据用方程式3描述。IC50向Ki的转化用方程式4描述，其中Kd是3与SIRT1的结合亲和力，F0是结合的探针的比例B/(B+F)和L0是探针3的浓度。
y = x ( B - A ) x + K d + N x + A (方程式2)
y = 1 1 + x IC 50 (方程式3)
K i = IC 50 1 1 - F 0 + L 0 ( 2 - F 0 ) 2 K d - K d F 0 2 - F 0 (方程式4)
实施例101.氢-氘交换质谱(HDX-MS)
SIRT1的交换实验。
在胃蛋白酶消化、脱盐、HPLC分离和MS分析之后的H/D-交换反应是使用完全自动化的系统进行的，其在其他地方进行描述(Hamuro，Y.等人(2003)JBiomolTechniques:JBT14，171)。特别是对于这组实验，该交换中反应是通过以下起始的：将20μLSIRT1储备溶液(0.77mg/mLSIRT1，±3.88mMAc-p53(W5)，±192μM配体，在1.9％DMSO中)和20μL100mM磷酸盐混合，pH在D2O中读取为7.0。将该50％D2O混合物在0℃培养15、50、150、500、1,500或5,000s。对于SIRT1(229-516)，该交换中反应是通过以下起始的：将4μLSIRT1储备溶液(1.36mg/mLSIRT1(229-516)，±1.67mMTrp-25mer)和36μL200mM磷酸盐混合，pH在D2O中读取为7.0。将该90％D2O混合物在0℃培养15、50、150、500、1,500或5,000s。加入20μL1.6M盐酸胍(GuHCl)，0.8％甲酸，pH2.3，分析前立即淬灭该交换中反应。
实施例102.标准HDX样品的一般蛋白加工
根据制造商的说明，将该淬灭的溶液用0.05％TFA水溶液(200μL/min)通过胃蛋白酶柱(104μL柱床体积)，持续2min，所述胃蛋白酶柱填充有固定在Poros20AL介质(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)上的猪胃蛋白酶(Sigma，StLouis，MO)。将被消化的片段暂时收集到反相捕获柱(4μL柱床体积)并脱盐。然后将该肽片段从该捕获柱上洗脱并用C18柱(BioBacis-18；ThermoScientific，SanJose，CA)分离，其使用13％溶剂B至40％溶剂B的线性梯度，经23min(溶剂A，0.05％TFA在水中；溶剂B，95％乙腈，5％缓冲液A；流速10μL/min)。质谱分析使用LTQOrbiTrapXL质谱仪(ThermoFisherScientific，SanJose，CA)进行，其中毛细管温度在200℃。
实施例103.SIRT1的消化/分离的优化以及非氘代实验
在H/D-交换实验之前，在非氘代条件下用具有高分辨率的胃蛋白片段将消化和分离条件进行优化以得到高序列覆盖的SIRT1。在该步骤中，通过加入20μL各种酸性缓冲液将20μL0.77mg/mL(9.2μM)SIRT1和20μLH2O的混合物淬灭。对于SIRT1(229-516)，通过加入20μL各种酸性缓冲液将4μLSIRT1储备溶液(1.36mg/mLSIRT1(229-516)，±1.67mMTrp-25mer)和36μLH2O的混合物淬灭。将该淬灭的混合物解析前述一般蛋白加工。将该非氘代的胃蛋白片段用ProteomeDiscoverer1.1中的Sequest(ThermoFisherScientific，SanJose，CA)确定。
实施例104.SIRT1的全氘代实验
该全氘化样品是通过以下制备：将45μL0.77mg/mL(9.2μM)SIRT1的混合物用45μL100mMTCEP在D2O中，在pH2.5，60℃培养3h。对于SIRT1(229-516)，该全氘化样品是通过以下制备：将9μL1.36mg/mL(41.7μM)SIRT1(229-516)的混合物用81μL100mMTCEP在D2O中，在pH2.5，60℃培养3h。培养后，将该样品保持在0℃，然后同样地淬灭成交换中溶液并进行一般蛋白加工。
实施例105.交换中反应之后各肽的氘代水平的确定。
肽同位素外壳(isotopicenvelopes)的质心(centroid)使用与SierraAnalytics(Modesto，CA)合作研发的内部程序进行测定。在蛋白加工步骤过程中的交换后的修正采用以下标准方程式5(Zhang，Z.等人(1993)ProteinScience2，522)：
(方程式5)
其中m(P)、m(N)和m(F)分别是部分氘代(交换中)肽、非氘代肽和全氘代肽的质心值。
实施例106.生物学活性
基于质谱的分析用于鉴定SIRT1活性的调节剂。该基于TAMRA的分析使用具有如下所示的20个氨基酸的肽：
Ac-EE-K(生物素)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG–K(5TMR)-EE-NH2(SEQIDNO:1)
其中K(Ac)是乙酰化的赖氨酸残基，Nle是正亮氨酸。该肽在C-末端用荧光团5TMR(激发540nm/发射580nm)标记。该肽底物的序列基于具有几处修饰的p53。另外，用正亮氨酸代替天然存在于序列中的甲硫氨酸残基，因为甲硫氨酸在合成和纯化期间对氧化敏感。基于Trp的分析使用具有如下所示的氨基酸的肽：
Ac-R-H-K-K(Ac)-W-NH2(SEQIDNO:2)
该基于TAMRA的质谱分析如下进行：在25℃，在反应缓冲液(50mMTris-乙酸盐，pH8，137mMNaCl，2.7mMKCl，1mMMgCl2，5mMDTT，0.05％BSA)中，将0.5μM肽底物和120μMβNAD+与10nMSIRT1温育25分钟。SIRT1蛋白如下得到：将SirT1基因克隆到含有T7-启动子的载体中，然后将其在BL21(DE3)细菌细胞中转化并表达。将测试化合物以各种浓度添加到该反应混合物中，监测得到的反应。与SIRT1温育25分钟后，添加10μL的10％甲酸以终止反应。将得到的反应密封，并冷冻用于之后的质谱分析。测定由沉默调节蛋白介导的NAD-依赖性脱乙酰化反应形成的脱乙酰化的底物肽的量(或者，生成的O-乙酰基-ADP-核糖(OAADPR)的量)，可以精确测量相对SIRT1活性(各种浓度的测试化合物存在下对比缺少测试化合物的对照反应)。
Trp质谱分析进行如下：在25℃，在反应缓冲液(50mMHEPESpH7.5、1500mMNaCl、1mMDTT、0.05％BSA)中，将0.5μM肽底物和120μMβNAD+与10nMSIRT1温育25分钟。SIRT1蛋白如下得到：将SirT1基因克隆到含有T7-启动子的载体中，然后在BL21(DE3)细菌细胞中表达，并纯化，如下面进一步详述的。将测试化合物以各种浓度添加到该反应混合物中，监测得到的反应。与SIRT1温育25分钟后，添加10μL的10％甲酸以终止反应。将得到的反应密封，并冷冻用于之后的质谱分析。然后通过测定由NAD-依赖性沉默调节蛋白脱乙酰化反应形成的O-乙酰基-ADP-核糖(OAADPR)的量(或者，生成的脱乙酰化Trp肽的量)，测量相对SIRT1活性(各种浓度的测试化合物存在下对比缺少测试化合物的对照反应)。测试试剂通过SIRT1活化脱乙酰化的程度表达为EC1.5(即，增加SIRT1活性50％需要的化合物的浓度，相对于缺少测试化合物的对照)，和最大活化百分数(即，对于测试化合物得到的相对于对照(100％)的最大活性)。
在反应开始时，通过加入1μL的500mM烟酰胺作为阴性对照(例如，允许测定最大沉默调节蛋白抑制)来进行沉默调节蛋白活性抑制的对照。沉默调节蛋白活性的活化的对照是如下进行的：使用10nM沉默调节蛋白，用1μLDMSO代替化合物，在分析的线性范围内，在给定时间点测定底物的脱乙酰化量。该时间点与试验化合物所使用的时间点相同，并且在线性范围内，端点代表速度变化。
对于上述分析，SIRT1蛋白表达并纯化如下。将SirT1基因克隆到含有T7-启动子的载体中，并转化到BL21(DE3)中。在18℃，通过用1mMIPTG(作为N-末端His-标记融合蛋白)诱导来表达该蛋白过夜，并在30,000xg下收获。在裂解缓冲液(50mMTris-HCl，2mMTris[2-羧乙基]膦(TCEP)，10μMZnCl2，200mMNaCl)中，用溶菌酶将细胞裂解，并进一步用超声处理10分钟，以便完全裂解。用Ni-NTA柱(Amersham)纯化蛋白，并合并含有纯蛋白的级分，浓缩，使其经过用分级柱(SephadexS20026/60global)。收集含有可溶性蛋白的峰，并通过离子交换柱(MonoQ)。梯度洗脱(200mM-500mMNaCl)得到纯蛋白。将该蛋白浓缩，并用渗析缓冲液(20mMTris-HCl，2mMTCEP)进行渗析过夜。将蛋白等分，并在-80℃冷冻，直到进一步使用为止。
使用上述分析，鉴定活化SIRT1的式(I)的调节沉默调节蛋白的化合物，如下表1所示。EC1.5值代表导致SIRT1的150％活化的试验化合物的浓度。式(I)的活化化合物的EC1.5值由A(EC1.5<1μM)、B(EC1.5：1-25μM)、C(EC1.5>25μM)代表。最大活化倍数百分数由A(活化倍数≥150％)或B(活化倍数<150％)代表。“NT”表示未测试；“ND”表示测不到。表中编号的化合物从化合物编号10开始，和括号编号(#)对应的是图4的STAC编号系统和实施例90-106(即，化合物编号68也是STAC1，因此将其表示为68(1)，还有STAC：546(3)、444(4)、314(5)、816(7)、76(8)和81(9))。
表1.式(I)化合物。
在一些实施方案中，所述化合物为化合物编号1，3，4，5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，23，25，27，28，29，30，31，32，33，34，36，38，39，40，41，42，45，46，47，48，49，53，54，56，57，59，61，63，66，68，75，76，80，81，83，86，87，90，93，95，99，101，102，107，110，118，119，120，121，122，128，129，130，133，135，136，138，139，140，141，142，145，150，151，153，156，159，160，161，162，163，164，165，166，168，170，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，184，189，191，194，197，207，212，214，216，218，220，222，223，230，233，235，239，250，254，260，261，264，268，271，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，285，286，288，289，290，292，293，295，299，314，316，322，324，325，329，330，332，333，335，341，344，347，348，350，351，352，353，354，356，359，360，361，365，366，367，369，373，375，376，377，378，379，380，383，385，387，388，389，391，392，393，394，396，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，415，417，419，421，422，423，425，427，428，430，431，435，452，459，461，463，470，472，473，474，475，480，481，483，485，491，492，496，497，498，499，500，502，503，504，505，506，507，509，515，517，519，523，526，527，530，538，540，541，542，556，557，559，562，563，574，575，580，581，583，588，589，590，591，592，593，594，595，596，601，604，605，606，607，611，617，623，625，626，629，630，635，636，637，638，639，640，642，643，645，646，647，648，651，652，653，654，655，656，657，658，659，660，663，665，666，667，668，670，671，672，676，683，692，693，694，698，703，706，708，709，710，714，717，718，719，720，721，722，723，724，725，727，730，731，733，736，737，739，740，741，742，743，746，747，748，749，750，751，752，753，754，756，757，758，760，763，765，766，767，770，776，777，780，788，790，792，797，798，799，801，803，804，806和808中的任一个。
实施例107
(4S)-N-(吡啶-3-基)-7-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3，4-二氢-1，4-亚甲基吡啶并[2，3-b][1，4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺
在20℃，向((4S)-7-氯-N-(吡啶-2-基)-3，4-二氢-1，4-亚甲基吡啶并[2，3-b][1，4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(700mg，2.217mmol)、4-(三氟甲基)哌啶(679mg，4.43mmol)在1,4-二噁烷(20mL)中的脱气溶液中按顺序加入二环己基(2',4',6'-三异丙基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(423mg，0.887mmol)、碳酸钾(919mg，6.65mmol)和乙酸钯(II)(100mg，0.443mmol)并将该反应混合物在90℃密封管中搅拌16小时。将该反应混合物倒至冰水(70mL)中并用乙酸乙酯(150mL)萃取。将有机物分离并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗制产物。将该粗制产物加入到硅胶柱上并用1％-2％甲醇/二氯甲烷洗脱。收集级分，得到500mg，将其再用GRACE反相HPLC纯化，得到(4S)-N-(吡啶-3-基)-7-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-3,4-二氢-1,4-亚甲基吡啶并[2,3-b][1,4]二氮杂环庚三烯-5(2H)-甲酰胺(320mg，0.710mmol，32％)。MS(ESI)计算值C21H23F3N6O:433.2。
等同方案
本发明提供了调节沉默调节蛋白的化合物及其使用方法等。尽管已经讨论了主题发明的具体实施方案，但上述说明书是说明性的，不是限制性的。在审阅该说明书后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考权利要求书，以及其等同方案的整个范围，和说明书以及此类变化来确定。
参考文献的引入
本文提到的所有出版物和专利(包括下面列出的那些条目)以它们的整体引入到本文中作为参考，如同每个单一的出版物或专利是具体地和单独地注明被引入作为参考那样。在出现矛盾的情况下，以本申请(包括本文任何定义)为准。
还以整体引入作为参考的是任何多核苷酸和多肽序列，参考与公共数据库的目录相互关联的登录号，例如，由TheInstituteforGenomicResearch(TIGR)(www.tigr.org)和/或theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)保存的那些登录号。

Claims (28)

1.式(I)化合物
或其盐其中：
m为1或2；
n为2或3；
p为0至4；
R1选自碳环和杂环，其中R1任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基、-C≡N、-Y、-X-C(＝O)-Y、-X-O-Y、-X-OR4、-X-C(＝O)-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-Y-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-O-Y、-X-NR3R3、＝O、-NH-S(＝O)2-R3、-S(＝O)2-R3、-S-R3、-(C3-C7)环烷基、-C(＝N)-NR3R3、-C(＝N)-NH-X-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-Y、-C(＝O)-NH-X、-NH-X、苯基、-O-苯基、3至6元饱和或不饱和杂环和-O-(5至6元饱和杂环)，其中R1的任意苯基、3至6元饱和或不饱和杂环或-O-5至6元饱和杂环取代基在任意可取代的碳原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-OR4、-X-O-Y、-CF3、-Y、-X–R3R3、-X-NH-C(＝O)-Y-NR3R3、-X-NH-C(＝O)-O-Y-(5至6元饱和杂环或碳环)、-X-C(＝N)-NR3R3和-S-Y以及在任意可取代的氮原子处任选地被以下的取代基取代：-Y、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-C(＝O)-OR4、-Y-C(＝O)-Y-NR3R3、-Y-NH-C(＝O)-O-Y、-Y-NH-C(＝O)-OR4、-Y-NH2、-C(＝O)-NH-Y或-C(＝O)-3至5元饱和的碳环；
R2选自碳环和杂环，其中R2任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-C4烷基、氟取代的C1-C4烷基、-C≡N、-Y、-X-OR4、-X-O-Y、-SO2-R3、-X-NR3R3、-NH-S(＝O)2R3、-C(＝O)-NR3R3、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-SO2-Ry、-SO2-NH-Ry、-SO2-NR3R3、3至6元饱和的碳环或杂环和苯基，其中R2的任意3至6元饱和杂环取代基在任意碳原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-CF3、-Y、-X-O-Y、-NH-Y和-N(Y)2，且在任意氮原子处任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：-C(＝O)-O-Y、-Y和-C(＝O)-Y，和当R2为N连接的5至7元饱和或不饱和杂环时，其在任意氮原子处进一步被一个或多个选自以下的取代基取代：-C(＝O)-O-Y、-Y和-C(＝O)-Y；
各R3独立地选自：氢、-C(＝N)-NH2、-C(＝O)-Y、-Y、-Y-NH-C(＝O)-O-Y、-Y-NH-C(＝O)-OH、-Y-NH-C(＝O)-CF3、-C(＝O)-Y-3至5元饱和杂环、-C(＝O)-O-Y-(3至5元饱和杂环)、-C(＝O)-CF3、-C(＝O)-O-Y、-C(＝O)-OH、-C(＝O)-O-CF3、-S(＝O)2-Y、-S(＝O)2-OH；
两个R3与它们所连接的氮或碳原子一起形成4-至8-元饱和杂环，其任选地包含独立地选自以下的一个额外的杂原子：N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O，其中由两个R3形成的杂环在任意碳原子处任选地被一个或多个OH、卤素、Y、NH2、NH-Y、N(Y)2、O-Y取代，以及在任意可取代的氮原子处任选地被C(＝O)-O-Y、Y或C(＝O)-Y取代；
各R4独立地选自：氢、Y、-CF3、-C(＝O)-Y、-C(＝O)-O-Y、-Y-C(＝O)-Y或-Y-C(＝O)-O-Y；
R5和R6独立地选自：氢、-OH、-OCF3、-O-Y、-O-C(＝O)-Y、-O-C(＝O)-O-Y、-O-C(＝O)-NH-Y、-O-C(＝O)-N(Y)2、-O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环，其中R5和R6中的仅一个为O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环，且当R5或R6为O-C(＝O)-5至6元饱和或不饱和杂环或碳环时，其进一步被卤素、-OH、Y、-O-Y、-OCF3或-O-C(＝O)-Y取代；或
R5和R6可与它们所连接的碳原子一起形成＝O；
R7和R8独立地选自：氢、卤素、-OH、-O-Y和Y；
R9选自氢、卤素、-OH、-OCF3、-O-Y、Y、-O-C(＝O)-Y、-NH-Y和-N(Y)2；
各X为C0-C5直链或支链烷基、烯基或炔基；和
各Y为C1-C5直链或支链烷基、烯基或炔基；
其中任意Y或X任选地被一个或多个-OH、-C1-C4直链或支链烷基、-C1-C4烯基、-C1-C4炔基、-O-(C1-C4烷基)、-O-(C1-C4烯基)、-O-(C1-C4炔基)、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4烯基、-C(＝O)-C1-C4炔基、-C(＝O)-O-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-O-C1-C4烯基、-C(＝O)-O-C1-C4炔基，卤素、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-(C1-C3直链或支链烷基)-NH-(＝NH)-NH2、-NH(烷氧基-取代的C1-C4烷基)、-NH(羟基-取代的C1-C4烷基)、-N(烷氧基-取代的C1-C4烷基)(羟基-取代的C1-C4烷基)、-N(羟基-取代的C1-C4烷基)2或-N(烷氧基-取代的C1-C4烷基)2取代。
2.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物具有结构式(IIa)代表的结构：
3.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物具有结构式(IIIa)代表的结构：
4.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物具有结构式(IIb)或(IIIb)代表的结构：
5.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物具有结构式(IV)代表的结构：
6.权利要求1所述的化合物或盐，其中p为0。
7.权利要求1所述的化合物或盐，其中p为1至4。
8.权利要求1所述的化合物或盐，其中–(CH2)p-R1选自以下中的任意一个：
9.权利要求1所述的化合物或盐，其中R1选自苯基、饱和或不饱和的5至6元杂环和稠和双环8-至11-元饱和或不饱和的碳环或杂环。
10.权利要求1所述的化合物或盐，其中R1为稠和双环8-至11-元饱和或不饱和杂环。
11.权利要求1所述的化合物或盐，其中R1选自以下的任意一个：
12.权利要求11所述的化合物或盐，其中R1选自以下任意一个：
13.权利要求1所述的化合物或盐，其中R2选自5至7-元饱和的碳环或杂环、N连接的杂环和8-至11-元饱和或不饱和杂环。
14.权利要求1所述的化合物或盐，其中R2为N连接的5至7元饱和或不饱和杂环。
15.权利要求14所述的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
16.权利要求1所述的化合物或盐，其中R2为稠和双环8-至11-元饱和或不饱和杂环。
17.权利要求16所述的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
18.权利要求1所述的化合物或盐，其中R2选自以下任意一个：
19.权利要求18所述的化合物或盐，其中R2选自以下任意一个：
20.权利要求1所述的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
21.权利要求2的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
22.权利要求3的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
23.权利要求4的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个：
24.权利要求5的化合物或盐，其中所述化合物选自以下任意一个；
25.药物组合物，其包含药学上可接受的载体或稀释剂和权利要求1-24中任一项的化合物。
26.权利要求25的药物组合物，其还包含额外的活性剂。
27.提高细胞中沉默调节蛋白-1活性的方法，其包括将该细胞与权利要求26的组合物接触的步骤。
28.治疗患有或易感于胰岛素抗性、代谢综合征、糖尿病或其并发症的受试者的方法，或用于增加受试者的胰岛素敏感性的方法，其包括向有此需要的受试者给药权利要求25的组合物。
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