CN105385733A - 一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺，具体包含以下步骤：一、蚕丝蛋白液的制备；二、单因素与正交测定；三、酶解液对DPPH自由基清除能力的测定。本发明以天然彩色蚕茧为原料，开展酶解产物的抗氧化水平研究，以期为蚕丝蛋白的食品应用和化妆品应用提供科学依据。

Description

一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺

技术领域

本发明涉及蚕丝蛋白酶解技术领域，具体涉及一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺。

背景技术

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质之一，享有“纤维皇后”之美誉。自20世纪70年代至今，国内外对蚕丝开发利用的研究逐渐发展到食品、生物制药、发酵工业新材料、能源利用、环保、临床诊断治疗、医用材料及化妆品等领域。

蚕丝是由丝胶和丝素组成的纤维蛋白，其中丝胶大约为20-30％，丝素为70-80％，另有碳水化合物1.2％-1.6％、色素0.2％等^[1]。其中，蚕丝蛋白为天然纤维蛋白，由多种氨基酸组成，含人体必需氨基酸大约为7％(其中丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸含量大约为85％)。氨基酸组成成分及含量见表1。

表1蚕丝蛋白多肽中氨基酸组成成分及含量^[2]

蚕丝蛋白是一种无毒、无刺激、结构致密、结晶度高、不溶于水的大分子蛋白质，相对分子质量大约为30000～450000Da，由于人体能消化吸收的是分子量在10000Da左右的小分子蛋白，蚕丝蛋白分子量偏大一般不易被人体直接吸收利用，需要降解处理后方可利用。蚕丝蛋白的水解产物蚕丝蛋白多肽是一种新型蛋白质资源，具有色泽浅，水溶性好，蛋白含量高等优良特性，且相对分子质量广泛分布在300-20000Da的范围内^[3]，易被人体消化器官和皮肤吸收，具有很好的食用价值和药用价值。因其良好的抗氧化活性，也被广泛地应用于日用化工业。

目前制备蚕丝蛋白多肽的常用方法有氯化钙水溶液降解、酸水解、碱水解、酶水解等方法^[4]，各种方法都有其优缺点。总体而言，酶解法所得产物效果优于其他方法。

施安辉等于2006年研究了适用于蚕丝营养素和丝多肽酶解的诱变株米曲霉CV_8_1和芽孢_1_1的最佳酶解条件，试验确定TYM-A复合蛋白酶的最佳配比及最佳酶解工艺条件^[5]

王芳林等于2006年研究了蚕丝水解液的制备工艺及水解过程中pH、温度、反应时间对水解程度的影响，结果表明：pH越高，蚕丝蛋白水解程度越大，收率越高^[6]。较高的温度可加速蚕丝蛋白的水解速率，但水解液颜色较深，较低的温度，水解速度缓慢。反应时间越长，蚕丝蛋白水解程度越大。

相入丽等于2007年研究了蚕丝丝胶蛋白的抗氧化作用，研究结果表明高温高压水处理获得的丝胶肽抗氧化作用最强，高温高压弱碱性水处理获得的丝胶肽抗氧化作用略低，而中性蛋白酶水解的丝胶肽对黑色素形成的抑制率最低^[7]。

黄雷于2006年对酶法水解丝素蛋白工艺的优化及丝素肽抗氧化活性功能进行了研究。试验通过6种酶对家蚕丝素蛋白进行水解，试验表明双酶解方法抗氧化效果最佳，其中Alcalase2.4L水解蚕丝蛋白的最佳作用条件是：8％的丝素溶液加入1％的酶，在55℃，pH值为8条件下反应6h；Flavorzyme水解蚕丝蛋白的最佳作用条件是：pH值7，温度50℃，酶浓度6％，底物浓度8％，反应时间3h。黄雷通过酶解工艺的优化，先以碱性蛋白酶Alcalase2.4L水解、再用Flavorzyme继续水解丝素蛋白。双酶解最佳条件为pH7、酶浓度2％、底物浓度8％、反应时间3h、温度50℃，双酶水解后制得的丝素肽分别采用NBT光还原法、D2-脱氧核糖法和体外动物实验模型进行了丝素肽的抗氧化作用研究，结果表明丝素肽对超氧阴离子自由基和羟基自由基有很强的清除作用，并且能显著的抑制H₂O₂诱导的红细胞氧化溶血反应的发生^[8]。

发明内容

本发明目的是提供一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺，它能有效地解决背景技术中所存在的问题。

一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺，具体包含以下步骤：

一、蚕丝蛋白液的制备：

(1)除杂：将彩色茧壳剪碎，浸泡于清水中，洗净，晾干。

(2)溶解：按照1∶20浴比将茧壳放入沸腾的40％的CaCl₂中溶解1h。

(3)透析：将蚕丝蛋白液倒入透析袋，在自来水中透析2d，在蒸馏水中透析1d。

(4)浓缩：使用旋转蒸发仪浓缩经透析的蚕丝蛋白液(温度55℃，转速为50rpm)。

(5)离心：在3000r/min转速下离心30min。

二、单因素与正交测定：丝素蛋白多肽的提取过程中，受酶解温度、PH、酶解时间、底物浓度、加酶量等诸多因素影响^[17]。本试验在参考其他文献的基础上，选择酶解温度、酶解时间和加酶量三个重要影响因素进行单因素试验，以确定最优试验条件。

试验设定pH值为8，研究不同的酶解温度、酶解时间和加酶量对蚕丝蛋白多肽液抗氧化能力的影响，根据单因素试验结果进行三因素三水平L₉(3)³的正交试验，酶解产物进行DPPH测定，以得出蚕丝蛋白液的最优提取方案。

三、酶解液对DPPH自由基清除能力的测定：

(1)预试：取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如：在预试过程中，发现加样到200μL时DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量，其用量梯度设为40μL、80μL、120μL、160μL、200μL。

(2)测量：A₀值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管中，加95乙醇1mL，充分混合，测A值(519nm)，此A值为A₀；A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管中，加样品液xμL(x是根据预试结果确定样品液的用量)，再加(1000-x)μL95乙醇(或无水乙醇)，混合，静置30分钟后，测A值(519nm)。

(3)DPPH自由基清除率的计算公式：DPPH清除率＝(A₀-A)/A₀×100％。

(4)统计分析：本试验所有试验数据重复测定三次，取平均值。

所述步骤一中透析所用的透析袋需经过预处理才能使用，具体处理步骤是：

(1)把透析袋剪成适合的长度(10-20cm)。

(2)在500mL体积分数为2％(W/V)的NaHCO₃和500mL1mmol/LEDTA(乙二胺四乙钠、pH8)的混合液中将透析袋煮沸10min。

(3)用蒸馏水彻底清洗透析袋。

(4)放在500mL1mmol/LEDTA(pH8)中将之煮沸10min。

(5)冷却后，存放于4℃，确保透析袋始终浸没在溶液内。

(6)用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。

由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：以天然彩色蚕茧为原料，开展酶解产物的抗氧化水平研究，以期为蚕丝蛋白的食品应用和化妆品应用提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明，下面将结合附图对实施例作简单的介绍。

图1是实施例2中单因素试验中加酶量对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响趋势图；

图2是实施例2中单因素试验中酶解时间对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响趋势图；

图3是实施例2中单因素试验中酶解温度对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响趋势图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

试验材料与仪器

1、原料：由安康学院陕西省蚕桑重点实验室恒口基地提供。

2、主要试剂：无水氯化钙；EDTA；NaHCO₃；无水乙醇分析纯试剂；透析袋、碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司；DPPH试剂购自西安热默尔生物科技公司。

3、主要仪器与设备：参看表2

表2主要仪器与设备

实施例2

单因素试验结果

1、加酶量对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响

在pH8、酶解温度55℃、酶解时间2h，加酶量分别选择500U/g、750U/g、1000U/g、1250U/g、1500U/g，探究不同加酶量对蚕丝蛋白多肽液的抗氧化能力，结果见图1。

图1表明，蚕丝蛋白酶解产物在水解初期，随着加酶量的增加，DPPH自由基清除率也在不断增大，从500U/g到1250U/g抗氧化能力上升的幅度较大，在酶量为1250U/g时DPPH自由基清除能力最强，当加酶量超过1250U/g时，可能由于加酶量过大干扰了酶解物的组成和活性^[19]，DPPH自由基清除率曲线变得平缓且略有降低，为提高产物的抗氧化活性须控制加酶量适度酶解^[20]。

2、酶解时间对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响

在pH8、酶解温度55℃、加酶量1250U/g条件下，酶解时间分别选择2h、4h、6h、8h、10h，探究不同酶解时间对蚕丝蛋白多肽液的抗氧化能力，结果见图2。

图2表明，蚕丝蛋白酶解产物在水解初期，抗氧化能力随着水解时间的增加而增加，达到4h后，随着水解时间的增加抗氧化能力上升的幅度明显降低并略有减弱，这可能是酶解时间过长，水解过度，产物中主要为小肽或氨基酸，因而抗氧化能力也降低。

3、酶解温度对蚕丝蛋白多肽酶解物DPPH清除作用的影响

在pH8、加酶量1250U/g，酶解2h条件下，酶解温度分别选择45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，探究不同温度对蚕丝蛋白多肽溶液的抗氧化能力，结果见图3。

图3表明，随着温度的升高，酶解的效率也逐渐增加，抗氧化能力也有所增加，从45℃到55℃DPPH抗氧化能力持续上升，55℃到65℃DPPH抗氧化能力逐渐下降。

正交试验分析

从单因素试验结果可以看出，加酶量、反应温度和反应时间是蚕丝蛋白多肽酶解的重要工艺参数。以酶解加酶量、酶解温度和酶解时间为试验因素，采用3因素3水平进行正交试验设计(因素与水平值见表3)，以DPPH自由基清除率为评价指标，对蚕丝蛋白多肽酶解工艺参数进行优化，其结果见表4。

表3正交试验因素水平表

表4蚕丝蛋白多肽酶解的正交试验结果与分析

正交试验结果表明：酶解因素对DPPH自由基清除率影响大小依次为：B＞A＞C；基于DPPH自由基清除率的蚕丝蛋白多肽最佳制备工艺是A₂B₂C₂。在此工艺条件下进行验证试验，经过三次平行试验，DPPH自由基清除率平均为68.53％，略高于正交试验的最高值67.08％，说明实验结果可靠。

本试验以DPPH自由基清除率为指标，选用碱性蛋白酶对蚕丝蛋白多肽进行酶解，通过单因素试验和正交试验对碱性蛋白酶的酶解进行了工艺参数优化。单因素试验结果表明，DPPH自由基清除能力最高的单因素条件分别是：酶解温度55℃，酶解时间4h，加酶量1250U/g。

在单因素试验结论基础上，选取温度，酶解时间和加酶量进行三因素三水平正交试验，试验结果表明：在水浴温度55℃，加酶量1250U/g，酶解时间4h下DPPH自由基清除能力最高，DPPH自由基清除能力为67.08％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺，其特征在于具体包含以下步骤：

一、蚕丝蛋白液的制备：

(1)除杂：将彩色茧壳剪碎，浸泡于清水中，洗净，晾干。

(2)溶解：按照1∶20浴比将茧壳放入沸腾的40％的CaCl₂中溶解1h。

(3)透析：将蚕丝蛋白液倒入透析袋，在自来水中透析2d，在蒸馏水中透析1d。

(4)浓缩：使用旋转蒸发仪浓缩经透析的蚕丝蛋白液(温度55℃，转速为50rpm)。

(5)离心：在3000r/min转速下离心30min。

二、单因素与正交测定：丝素蛋白多肽的提取过程中，受酶解温度、PH、酶解时间、底物浓度、加酶量等诸多因素影响^[17]。本试验在参考其他文献的基础上，选择酶解温度、酶解时间和加酶量三个重要影响因素进行单因素试验，以确定最优试验条件。

试验设定pH值为8，研究不同的酶解温度、酶解时间和加酶量对蚕丝蛋白多肽液抗氧化能力的影响，根据单因素试验结果进行三因素三水平L₉(3)³的正交试验，酶解产物进行DPPH测定，以得出蚕丝蛋白液的最优提取方案。

三、酶解液对DPPH自由基清除能力的测定：

(1)预试：取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如：在预试过程中，发现加样到200μL时DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量，其用量梯度设为40μL、80μL、120μL、160μL、200μL。

(2)测量：A₀值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管中，加95乙醇1mL，充分混合，测A值(519nm)，此A值为A₀；A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管中，加样品液xμL(x是根据预试结果确定样品液的用量)，再加(1000-x)μL95乙醇(或无水乙醇)，混合，静置30分钟后，测A值(519nm)。

(3)DPPH自由基清除率的计算公式：DPPH清除率＝(A₀-A)/A₀×100％。

(4)统计分析：本试验所有试验数据重复测定三次，取平均值。

2.根据权利要求1所述的一种基于抗氧化活性的天然黄茧蚕丝蛋白多肽酶解工艺，其特征在于所述步骤一中透析所用的透析袋需经过预处理才能使用，具体处理步骤是：

(1)把透析袋剪成适合的长度(10-20cm)。

(2)在500mL体积分数为2％(W/V)的NaHCO₃和500mL1mmol/LEDTA(乙二胺四乙钠、pH8)的混合液中将透析袋煮沸10min。

(3)用蒸馏水彻底清洗透析袋。

(4)放在500mL1mmol/LEDTA(pH8)中将之煮沸10min。

(5)冷却后，存放于4℃，确保透析袋始终浸没在溶液内。

(6)用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。