CN105377899A - 核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、其制造方法和医用材料 - Google Patents

核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、其制造方法和医用材料 Download PDF

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Abstract

本发明的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。

Description

核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、其制造方法和医用材料
技术领域
本发明涉及核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、其制造方法和医用材料。
背景技术
透明质酸为β-D-N-乙酰葡糖胺与β-D-葡萄糖醛酸相互键合而得到的直链状的高分子多糖。透明质酸由于表现出优异的生物体适应性和粘弹性，所以正向医用领域扩展。例如，作为用于变形性膝关节炎的粘性补充剂，市售有各种液体制剂。
透明质酸广泛分布于脊椎动物的玻璃体·关节液·皮肤等处，广泛应用于眼科手术辅助剂·关节注入剂等药品、医疗器械、化妆品和健康食品。透明质酸作为本来的生物体成分高浓度地存在于组织、器官中，因此本质上安全性极其高。
作为透明质酸，还已知有交联透明质酸凝胶。例如，使用了自交联的透明质酸颗粒的粘性补充剂被专利文献1公开了，通过将透明质酸高浓度地凝胶化，药效提高。
另一方面，还市售有生物体贮存性提高了的各种交联透明质酸凝胶(作为例子，有Synvisc：注册商标；Durolane：注册商标；Monovisc：注册商标；Gel-One：注册商标)。
但是，还已知交联透明质酸凝胶具有生物体贮存性提高的特性，另一方面，与透明质酸溶液相比较，有弱的异物反应(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第12/026468号
非专利文献
非专利文献1:Clin.Exp.Rheumatol.，Vol.20，p.445-454(2002)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度、生物体亲和性高的交联透明质酸凝胶颗粒。
另外，本发明的目的还在于，提供该凝胶颗粒的制造方法以及包含该凝胶颗粒的医用材料。
用于解决问题的方案
本发明提供一种核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。
本发明的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面具有接近透明质酸溶液的柔软度，尽管分子结构几乎不变化，但能够降低异物反应，从而得到高的生物体亲和性。
核壳型交联透明质酸凝胶颗粒优选为从拐点至表面的平衡溶胀倍率为40以上的颗粒。即，将核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的从重心至表面方向的长度作为横轴(X)、将规定的横轴位置的平衡溶胀倍率作为纵轴(Y)进行作图而得到的平衡溶胀倍率的变化曲线中，从拐点存在的横轴位置(Xc)至与表面对应的横轴位置(Xs)之间的平衡溶胀倍率的值(Y)优选为40以上。
通过核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面部分的平衡溶胀倍率为上述范围，则能够确保颗粒的表面为更接近透明质酸溶液的柔软度，因此核壳型交联透明质酸凝胶颗粒成为异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度的、具有高的生物体亲和性的颗粒。
本发明还提供一种核壳型透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，从拐点至表面的平衡溶胀倍率为65以上。
上述核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面具有接近透明质酸溶液的柔软度，尽管分子结构几乎不变化，但能够降低异物反应，能够得到高的生物体亲和性。
核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的从拐点至表面的距离优选为5μm以上。即，从横轴位置(Xc)至横轴位置(Xs)的长度在核壳型交联透明质酸凝胶颗粒中优选为5μm以上。
认为因为从拐点至表面的距离为上述范围，所以能够确保颗粒表面的柔软部分的厚度，颗粒在给予后在关节内等即使表面分解，也会从内部新出现平衡溶胀倍率高的表面部分，异物反应被降低至长期与透明质酸溶液相同程度，从而能够保持高的生物体亲和性。
本发明提供一种制造上述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，其包括：通过使交联透明质酸凝胶颗粒与碱性物质接触，从而使该凝胶颗粒形成核壳结构。
由这样的制造方法得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面具有接近透明质酸溶液的柔软度，在生物体内不易被识别为交联透明质酸凝胶颗粒，因此异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度，生物体亲和性高。
本发明还提供一种制造核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，其包括：在交联透明质酸凝胶颗粒的表面形成透明质酸的交联密度低于该交联透明质酸凝胶颗粒的交联透明质酸凝胶的壳。
通过这样的制造方法得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的表面也具有接近透明质酸溶液的柔软度，在生物体内不易被识别为交联透明质酸凝胶颗粒，所以异物反应能够被降低至与透明质酸溶液相同程度，生物体亲和性高。
本发明还提供包含上述核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的医用材料。
对于这样的包含核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的医用材料，例如向生物体内给予该医用材料的情况下，在生物体内不易被识别为异物，因此不易引起炎症作用等，能够确保与包含透明质酸溶液的医用材料同样高的生物体亲和性。
医用材料可以适用于选自关节注入剂、药理活性物质的载体、创伤敷剂、组织替代型生物体组织修复剂、防粘连剂、止血剂、人工细胞外基质和皮肤填充剂中的任意者。
这样的医用材料在生物体内等不易被识别为异物，所以不易引起炎症作用等，从而能够确保与包含透明质酸溶液的医用材料同样高的生物体亲和性。从以上这样的观点出发，特别是用作关节注入剂的情况下，能够发挥出显著的效果，因而更优选。
发明的效果
通过本发明，能够提供异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度、生物体亲和性高的交联透明质酸凝胶颗粒。
另外，还能够提供该凝胶颗粒的制造方法以及包含该凝胶颗粒的医用材料。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒在用亚甲基蓝染色之后、用苯胺黑水溶液进行负染色时的显微镜照片。
图2是将包含本发明的一个实施方式的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的关节注入剂与透明质酸制剂的疼痛抑制效果进行比较而示出的曲线图。
图3是将包含本发明的一个实施方式的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的关节注入剂与透明质酸制剂的疼痛抑制效果进行比较而示出的曲线图。
图4是表示本发明的一个实施方式的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率的变化曲线的曲线图。
具体实施方式
以下，对于本发明优选的的实施方式进行说明，但本发明不限定于这些的实施方式。
首先，对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒进行说明。实施方式的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒是从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点的颗粒。此处，核壳型交联透明质酸凝胶颗粒在凝胶的状态下具有颗粒形状即可，但未必限于球状的颗粒。另外，核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的中心是指该颗粒的重心，其位置可以用显微镜图像等确定。“从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点”是指使纵轴为平衡溶胀倍率、横轴为从中心到颗粒表面的直线距离(将中心作为横轴0)，对平衡溶胀倍率作图而得到的变化曲线存在拐点。需要说明的是，作图优选横轴每0.2～15μm(优选横轴每0.5～5μm)进行一次，优选作为作图的近似曲线得到变化曲线。
变化曲线的拐点可以存在多个，但优选存在1个拐点。作为变化曲线的形状，优选在横轴特定的区域平衡溶胀倍率的线急剧地上升的形状(上升的前后，平衡溶胀倍率优选显示平缓的变化。即，优选存在1个拐点，且在该拐点的前后，变化曲线的斜率的变化率由正向负变化)，在该特定区域间存在拐点。并且，可以将比该拐点更靠近内侧的颗粒部分称为“核”、将外侧的颗粒部分称为“壳”。需要说明的是，核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的从中心至表面的直线可以认为是多个，选择该直线的一个将其作为横轴、平衡溶胀倍率如上述变化即可。
交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率可以通过激光共焦显微拉曼光谱法而算出。通过激光共焦显微拉曼光谱法，对凝胶颗粒内特定微小范围内的透明质酸浓度进行分析，将平衡溶胀倍率已知的样品作为指标，由此能够计算出该特定微小范围内的平衡溶胀倍率。另外，由于能够计算出凝胶颗粒内任意特定微小范围的平衡溶胀倍率，所以通过重复利用激光共焦显微拉曼光谱法计算平衡溶胀倍率以及进行一定微小范围的移动，也可以观察凝胶颗粒内部的平衡溶胀倍率的现象变化。
测定分为二个阶段。第一阶段是如下阶段：通过对水系溶剂中(缓冲液中)处于平衡溶胀状态的凝胶颗粒内部的特定微小范围进行分析，由得到的来自水的峰的拉曼强度与来自透明质酸的峰的拉曼强度的比率计算出与透明质酸浓度相关的数值。第二阶段是如下阶段：使用平衡溶胀倍率已知的样品，制作平衡溶胀倍率和与透明质酸浓度相关的数值的标准曲线，基于交联透明质酸凝胶颗粒内特定的微小范围中的与透明质酸浓度相关的数值，计算出平衡溶胀倍率。更具体而言，由光学显微镜图像指定交联透明质酸凝胶颗粒中的0.5～5μm范围的测定部分，由得到的光谱图求出来自透明质酸的C-H键的波数(2940cm-1)相对于来自水的O-H键的波数(3420cm-1)的拉曼强度比，可以通过下述式(1)而计算。
平衡溶胀倍率的计算值＝[(HO-H/HC-H)-标准曲线的截距]/标准曲线的斜率·(1)
(HO-H：3420cm-1的拉曼强度、HC-H：2940cm-1的拉曼强度)
交联透明质酸凝胶颗粒整体的平衡溶胀倍率通过对水系溶剂中(缓冲液中)处于平衡溶胀状态的凝胶颗粒进行过滤而取出时的凝胶颗粒的体积与对该凝胶颗粒进一步干燥时的体积的倍率来表示。
上述平衡溶胀倍率可以使用通过过滤去除水系溶剂(缓冲液)时的交联透明质酸凝胶的湿润重量与进一步使之干燥时的交联透明质酸凝胶的重量比(Qw)和密度，通过下述式(2)而算出。
平衡溶胀倍率＝1+(ρ/ρ0)×(Qw-1)·(2)
(ρ：交联透明质酸凝胶颗粒的密度、ρ0：水系溶剂(缓冲液)的密度)
对于通过过滤去除水系溶剂(缓冲液)的方法没有特别的限定，可以适宜使用例如使用了离心式过滤单元的离心过滤法、使用了膜滤器的减压过滤法等。
平衡溶胀倍率受到溶剂的盐浓度、pH、温度、溶胀时间等影响，所以用NaCl浓度为0.9wt％的10mM磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)，5℃下使之溶胀1天，到达平衡溶胀状态之后进行测定。
需要说明的是，根据核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的组成和平衡溶胀倍率的测定法，拐点处的平衡溶胀倍率可以为20～80的范围(特别为40～60的范围，50左右)。
对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。此处，深度方向优选为从表面到中心(重心)的方向。另外，探针压入力是指作为使用扫描型探针显微镜测定的弹性而测定的。即，将水系溶剂中(缓冲液中)处于平衡溶胀状态的交联透明质酸凝胶颗粒置于试样台，由上方将前端安装有10μm直径的(球形)玻璃颗粒的胶体探针从交联透明质酸凝胶表面压入至深度800nm，作为施加到探针的力(探针压入力)而测定。
压入力优选为10nN以下。压入力为20nN以下是指核壳型交联透明质酸凝胶颗粒表面的弹性低，即便在向生物体内给予的情况下，在生物体内也不易被识别为异物，所以炎症作用被抑制，从而能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。
从拐点至表面的点即壳的平衡溶胀倍率优选为40以上，更优选为50以上，进一步优选为65以上。通过使核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的壳的平衡溶胀倍率为上述范围，能够确保该颗粒的表面为接近透明质酸溶液的柔软度，所以能够得到在生物体内不易被识别为异物、异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度的、具有高的生物体亲和性的颗粒。由以上这样的观点可知，上述平衡溶胀倍率特别优选为75以上。需要说明的是，壳的平衡溶胀倍率显示出高于上述拐点的平衡溶胀倍率的值。
从拐点至前述表面的点的、核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的厚度方向的距离优选为5μm以上。该距离为针对核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的至少1处以上从中心到表面依次测定特定微小范围中的平衡溶胀倍率时的、从前述拐点至前述表面的点的移动距离即可。通过壳的厚度为上述范围，核壳型交联透明质酸凝胶颗粒在生物体内不易被识别为异物，能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。另外，给予该凝胶颗粒之后，在关节内等平衡溶胀倍率高的壳表面部分即便分解，也会从内部新生成平衡溶胀倍率高的壳表面部分，所以能够长期地维持与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。由以上的观点可知，上述壳的厚度优选为10μm以上。
对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的壳的厚度，也可以通过仅对核进行了染色的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的显微镜观察、作为外壳的透明部分的厚度方向的长度进行测定。具体而言，用数字显微镜对被染色的核壳型交联透明质酸凝胶的图像进行拍摄，对每1个凝胶颗粒测定1点以上从该凝胶颗粒表面至核与壳的边界的距离。对于凝胶颗粒100个进行该测定，可以由其平均值算出壳的厚度。
染色也可以通过能够对透明质酸染色的公知的任意方法进行，但优选用亚甲基蓝或吖啶橙进行染色。进而，由于容易判断透明的壳与水系溶剂的边界，所以更优选只将水系溶剂用苯胺黑等进行负染色。具体而言，对于水系溶剂中(缓冲液中)处于平衡溶胀状态的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒添加亚甲基蓝水溶液，充分搅拌而进行染色。接着，将样品搭载于试样台，在即将利用数字显微镜进行观察之前，添加苯胺黑水溶液，由此能够进行负染色。
接着，对于制造核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的方法进行说明。
本发明的实施方式中，对于透明质酸，无论是从动物组织提取的还是用发酵法制造的，可以不问其来源地使用。
发酵法中使用的菌株优选为从自然界中分离得到的链球菌属等具有透明质酸生产能力的微生物、或者日本特开昭63-123392号公报中记载的马链球菌(Streptococcusequi)FM-100(微工研菌寄第9027号)、日本特开平2-234689号公报中记载的马链球菌FM-300(微工研菌寄第2319号)这样的以高收率生产稳定的透明质酸的变异株。
透明质酸可以以例如钠、钾或锂盐这样的本技术领域中允许的盐的形态使用。
交联透明质酸凝胶颗粒可以使用透明质酸自交联的具有酯结构的自交联透明质酸凝胶颗粒。
自交联透明质酸凝胶颗粒可以如下得到：使透明质酸与透明质酸浓度为5质量％以上的水以及与透明质酸的羧基等摩尔以上的酸成分共存，在低温下保持该共存状态。
对于与透明质酸共存的酸，没有特别的限定，可以使用公知的任意种酸，优选为比透明质酸强的酸，更优选为无机酸。进一步优选盐酸、硝酸或硫酸，其中，特别优选处理性等优异的硝酸。对于共存的酸的量，没有特别的限定，可以为与透明质酸的羧基等摩尔以上的酸成分的量。对于与透明质酸共存的酸，优选以含有透明质酸为整体的15质量％以上、优选20质量％以上且40质量％以下的量保持。该保持可以为-30℃以上且25℃以下的温度下1小时～20天的任意期间。特别优选在-25℃以上且-5℃以下的温度下保持1天～15天。透明质酸和与透明质酸共存的酸的混合优选如下进行：向共存的酸中以成为整体的15质量％以上、优选20质量％以上的方式加入透明质酸，使共存的酸为均匀的状态。除此以外，也可以以成为整体的15质量％以上、优选20质量％以上的方式浸渍与透明质酸共存的酸，进而也可以对以低浓度调节的透明质酸的酸性水溶液进行浓缩以使透明质酸成为整体的15质量％以上、优选20质量％以上。
得到的自交联透明质酸凝胶颗粒在悬浮液中的浓度例如可以如下进行定量。首先，用蒸馏水对自交联透明质酸凝胶悬浮液进行稀释，添加氢氧化钠水溶液，在室温下进行静置，由此将自交联透明质酸凝胶颗粒的酯键水解，从而溶解。接着，向该溶液中添加盐酸进行中和之后，通过本领域技术人员已知的咔唑硫酸法对葡萄糖醛酸浓度进行定量。由该葡萄糖醛酸浓度并将已知浓度的透明质酸作为标准物质，从而能够计算出自交联透明质酸凝胶颗粒在悬浮液中的浓度。
作为核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，可列举出：将交联透明质酸凝胶颗粒的表面部分的交联结构部分溶解并软化从而壳化的表面处理法；或者，在该颗粒的表面形成软的壳的壳合成法。通过这样的制造方法得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒由于在生物体内不易被识别为异物，所以能够抑制炎症作用，并且能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。
上述表面处理法是使之软化而壳化的方法，即，通过能够特异地分解透明质酸的交联结构的化学处理，将交联透明质酸凝胶颗粒的表面部分的交联部分地切断，降低透明质酸的交联密度，由此增加平衡溶胀倍率。由此，能够使交联透明质酸凝胶颗粒形成核壳结构。透明质酸的交联结构与能够特异地分解的化学处理的组合是任意的，可列举出例如：透明质酸的自交联的酯结构与利用碱性物质的处理的组合。利用该组合的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法是如下方法：以自交联透明质酸凝胶颗粒作为原料，用酸性溶液使之溶胀之后，在水与水溶性有机溶剂的混合液中，使该凝胶颗粒的表面与碱性物质接触。碱性物质由自交联透明质酸凝胶颗粒的表面向内部渗透，同时将酯键分解，从而增加经渗透部分的平衡溶胀倍率。
对于使自交联透明质酸凝胶颗粒溶胀的酸性溶液，没有特别的限定，可以使用公知的任一种酸，优选为水溶性的酸，更优选为无机酸的强酸。另外，对于酸性溶液的浓度没有特别的限定，优选为自交联透明质酸凝胶颗粒的羧基的等摩尔以上的浓度。对于酸性溶液的量，也没有特别的限定，例如，相对于自交联透明质酸凝胶颗粒的羧基优选为0.1～20倍摩尔，更优选为0.3～5倍摩尔。
对于混合液中的水溶性有机溶剂，没有特别限定，也可以使用公知的任一种水溶性有机溶剂，优选为甘油、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、乙二醇、聚乙二醇，其中，特别优选甘油。
对于混合液中的上述水溶性有机溶剂的比率，没有特别的限定，优选为50％以上，更优选为60～90％，特别优选为70～80％。
对于碱性物质，没有特别限定，也可以使用公知的任一种碱性物质，优选为水与水溶性有机溶剂的混合液中溶解的碱性物质，更优选为氢氧化季铵。作为这样的碱性物质，进一步优选为十六烷基三甲基氢氧化铵、二甲基二硬脂基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵，其中，特别优选为两亲性的十六烷基三甲基氢氧化铵。对于碱性物质的量，没有特别限定，优选为使自交联透明质酸凝胶颗粒溶胀的酸性溶液的1～30倍摩尔的量，更优选为2～10倍摩尔的量。
上述壳合成法为如下方法：在交联透明质酸凝胶颗粒的表面形成透明质酸的交联密度低于该交联透明质酸凝胶颗粒的交联透明质酸凝胶的壳。对于形成的壳的合成方法，没有特别的限定，可以通过公知的任一种交联透明质酸凝胶的合成法制造核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。
具体而言，在交联透明质酸凝胶颗粒的存在下将透明质酸溶液、具有交联基的化合物和交联剂进行混合，或者在交联透明质酸凝胶颗粒的存在下将用交联基进行了修饰的透明质酸溶液和交联剂进行混合，由此在该凝胶颗粒的表面形成透明质酸的交联密度低于该交联透明质酸凝胶颗粒的交联透明质酸凝胶的壳。
对于将透明质酸或用交联基进行了修饰的透明质酸溶解的溶液，没有特别限定，优选为水与水溶性有机溶剂的混合液，在该情况下，特别优选水溶性有机溶剂为THF、二氧杂环己烷、丙酮、乙醇等。
用交联基进行了修饰的透明质酸是指具有如下结构的修饰透明质酸：两端具有与透明质酸键合能力的结构的交联基的一端与透明质酸键合，并且是即便不追加具有交联基的化合物也单独具有通过交联剂进行凝胶化的能力的修饰透明质酸。
对于具有交联基的化合物，没有特别的限定，可以使用能够交联透明质酸的公知的任一种具有交联基的化合物，优选为能够在稳定的中性的反应条件下进行交联反应的化合物。
对于交联剂，没有特别的限定，可以使用能够交联透明质酸的公知的任一种交联剂，优选能够在稳定的中性的反应条件下进行交联反应的交联剂。
核壳型交联透明质酸凝胶颗粒只要是通常的医用材料和透明质酸所应用的领域，则可以没有特别的限制地使用，如果例示，则可列举出例如在关节注入剂、药理活性物质的载体、创伤敷剂、组织替代型生物体组织修复剂、防粘连剂、止血剂、人工细胞外基质、皮肤填充剂、其他的诊断或治疗中所使用的医疗器具、医疗用具等生物医学的产品或药品组合物中的应用等。其中，特别是作为关节注入剂使用的情况下，能够发挥显著的效果。
核壳型交联透明质酸凝胶颗粒在生物体内不易被识别为异物，所以能够抑制炎症作用，并且能够确保与透明质酸溶液同样高的生物体亲和性。本发明的实施方式中的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的高的生物体亲和性更具体而言是指：在兔子膝关节内将由于该凝胶颗粒的局部刺激性而增加的白血球数作为指标进行分析的情况下，在回收的膝关节液样品稀释液6mL中，优选为不超过100×104个/mL程度的白血球数，更优选为10×104个/mL以下的白血球数。
实施例
以下，通过实施例等对本发明进一步详细地进行说明，但本发明不限定于以下的实施例。
(比较例1)
将2N的硝酸75g加入至自转公转型混炼装置(PRIMIXCorporation.制造)，冷却至-10℃，得到冰霜(sherbet)状的硝酸冷冻物。向该硝酸冷冻物中投入粘均分子量220万的透明质酸钠粉末22.5g(水分含量10％)，在-10℃、100rpm下进行1小时混炼直至成为均匀的橡胶状为止(透明质酸钠20.8质量％)。将得到的透明质酸与硝酸的混合物在设定为-20℃的冷冻库中保存10天。之后，向5℃的纯水1L中投入该混合物，每1小时更换2次纯水。之后，进一步向5℃、50mM的磷酸盐缓冲液1L中投入该混合物，每1小时更换5次50mM的磷酸盐缓冲液，进行中和洗涤直至硝酸完全消失为止，由此得到自交联透明质酸凝胶。
对上述得到的自交联透明质酸凝胶进行中和之后静置30分钟，通过倾析去除上清液，对于沉降的自交联透明质酸凝胶，加入9倍重量的50mM磷酸盐缓冲液。将该自交联透明质酸凝胶悬浮液投入至高速旋转装置中进行破碎，由此得到自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液。
将上述得到的自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液静置30分钟，通过倾析去除上清液。对于剩余的自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液，加入9倍重量的生理盐水，每10分钟更换10次生理盐水。接着，按照网孔大小的顺序用筛(试验用：无铅、直径：150mm、深度：60mm、开口：500μm、355μm、212μm、125μm、53μm)进行分级，得到粒径不同的6种自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液(>500μm、500～355μm、355～212μm、212～125μm、125～53μm、<53μm)。
对于上述得到的自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液，用蒸馏水和乙醇进行洗涤，使之减压干燥而得到干燥的自交联透明质酸凝胶颗粒。
另外，自交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率如下算出。对于自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液0.4ml(溶剂：10mM磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)、氯化钠浓度0.9wt％)，使用离心式滤器单元(0.45微米孔径、MilliporeCorporation制造)，以5℃、2000rpm、30分钟进行离心分离而去除溶剂，测定去除了溶剂的自交联透明质酸凝胶颗粒的重量。进而，使该颗粒干燥20小时，测定经干燥的自交联透明质酸凝胶颗粒的重量。由两测定值计算出平衡溶胀倍率，结果得到的自交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率为5.9。
(实施例1)
用0.5M盐酸(0.7mL)、在室温(20～25℃)下，使比较例1中得到的经干燥的自交联透明质酸凝胶颗粒(0.1g、500～355μm)进行3分钟溶胀。添加25％十六烷基三甲基氢氧化铵/甲醇溶液(1.65mL)和80％甘油水溶液(45mL)的混合液，搅拌8分钟之后，添加6M盐酸(0.5mL)进行中和。
用70％乙醇和生理盐水进行各5次洗涤，以生理盐水悬浮液的状态得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。
得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的收率如下。将得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液总量的上清液去除，用蒸馏水进行稀释。加入1N氢氧化钠(2mL)，进行2分钟搅拌使之溶解，加入1N盐酸(2mL)进行中和。用咔唑硫酸法算出得到的透明质酸溶液的透明质酸浓度，由透明质酸溶液量和自交联透明质酸凝胶颗粒原料的量算出收率，结果为92％。
(实施例2)
将80％甘油水溶液变更为80％二甲基亚砜水溶液，将搅拌时间由8分钟变更为3分钟，除此以外，按照与实施例1同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为82％。
(实施例3)
将80％甘油水溶液变更为70％乙醇水溶液，将搅拌时间由8分钟变更为3分钟，除此以外，按照与实施例1同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为61％。
(实施例4)
将0.5M盐酸变更为0.5M乙酸，除此以外，用与实施例3同样的方法得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为3％。
(实施例5)
将搅拌时间由8分钟变更为12分钟，除此以外，用与实施例1同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为89％。
(实施例6)
将25％十六烷基三甲基氢氧化铵/甲醇溶液变更为25％二甲基二硬脂基氢氧化铵/甲醇溶液，除此以外，按照与实施例3同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为77％。
(比较例2)
将70％乙醇水溶液变更为10％乙醇水溶液，除此以外，用与实施例3同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为54％。
(比较例3)
不进行利用0.5M盐酸的溶胀，除此以外，用与实施例3同样的方法，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。收率为70％。
(参考例1)
使用透明质酸关节制剂“SUVENYL”(中外制药株式会社制造；粘均分子量200万、透明质酸浓度1w/v％、商品名)。
(试验例1)
对于实施例1～6以及比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒表面的弹性，由利用扫描型探针显微镜的表面的探针压入力分析。需要说明的是，测定条件如下。
扫描型探针显微镜：SPM-9700型(株式会社岛津制作所制造，商品名)
探针：安装有10μm直径的(球形)玻璃质颗粒的胶体型探针(CP-CONT-BSG-B、TOYOCorporation制造)
压入距离：800nm
测定次数：3次
测定温度：23±2℃
将各交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液采集至装置内的试样台，置于装置的台子上。用光学显微镜一边观察交联透明质酸凝胶颗粒，一边将探针设在测定位置的上方，使探针向正下方移动3000nm左右，得到力曲线(forcecurve)。由通过测定得到的力曲线，使从颗粒表面起至压入距离800nm期间探针弯曲的距离乘以探针的弹簧常数，算出力的大小，作为弹性。
(试验例2)
对于实施例1～6以及比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率，以透明质酸浓度作为指标使用显微共焦激光拉曼光谱仪，作为相当于交联透明质酸凝胶颗粒的平衡溶胀倍率的计算值进行分析。
将各交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液采集至载玻片上，用盖玻片覆盖悬浮液表面，作为测定用试样。将试样搭载于显微共焦激光拉曼光谱仪内的XYZ3轴自动台子上，使用光学显微镜，在交联透明质酸凝胶颗粒的外部附近设置观测起始点。面向颗粒的重心，使用在水平方向或垂直方向直线地重复进行移动和测定的自动测定功能，依次取得0.5～5μm的微小范围的拉曼光谱。需要说明的是，测定条件如下。
显微共焦激光拉曼光谱仪：Almega-XR(ThermoFisherScientificK.K.制造，商品名)
激光波长：532nm
曝光时间：1.0秒
曝光次数：8次
测定波数：4232～116cm-1
测定温度：25±2℃
由拉曼光谱使用以下所示的式(3)，计算出0.5～5μm的微小范围的平衡溶胀倍率。对平衡溶胀倍率的计算值依次作图，利用S型函数导出近似曲线，算出从该近似曲线中的拐点的位置即核与壳的边界至表面(也可以判定为，通过上述拉曼光谱算出的平衡溶胀倍率开始出现大的变化(噪音)，平衡溶胀倍率的移动平均值成为一定的点。)的平均值，作为壳的平衡溶胀倍率。
平衡溶胀倍率的计算值＝[(HO-H/HC-H)-3.1598]/0.2947·(3)
(HO-H：3420cm-1的拉曼强度、HC-H：2940cm-1的拉曼强度)
需要说明的是，由平衡溶胀倍率的图利用S型函数导出近似曲线，将其作为平衡溶胀倍率的变化曲线。将得到的变化曲线的曲线图示于图4。在该变化曲线中求出拐点。另外，对于表面的位置，通过如上所述的手法进行判断。
进而，在壳与外部的边界难以判断的情况下，从试样中去除生理盐水，取而代之，用来自水的O-H键的波数(3420cm-1)不具有峰的非水溶性液体(例如，石蜡等烃化合物)进行悬浮，由此使壳与外部的平衡溶胀倍率的计算值较大地变化，计算出平衡溶胀倍率。
(试验例3)
相对于实施例1～6以及比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和比较例1的自交联透明质酸凝胶颗粒的生理盐水悬浮液500μL，添加亚甲基蓝1％水溶液5μL。在室温下静置15分钟以上之后，在载玻片上采集70μL，进而加入苯胺黑1％水溶液1μL，使用数字显微镜(VHX-500F；KEYENCECORPORATION制造，商品名)对交联透明质酸凝胶颗粒的显微镜图像进行拍摄。将得到的图像示于图1。
从得到的显微镜图像中，将亚甲基蓝能否染色的边界作为核与壳的边界，将苯胺黑能否染色的边界作为壳与生理盐水的边界，对于每1个颗粒测定一处壳的厚度。计算出总计100个凝胶颗粒的壳的厚度的平均值，将该值作为壳的厚度。
上述的方法中，将亚甲基蓝1％水溶液变更为吖啶橙盐酸盐1％水溶液，通过同样的方法计算出壳的厚度。
(试验例4)
对于实施例1～6以及比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和比较例1的自交联透明质酸凝胶颗粒，与试验例2同样地计算出平衡溶胀倍率，计算出从核与壳的边界至壳表面与作为外部的生理盐水的边界为止的分析移动距离作为壳的厚度。
(试验例5)
对于实施例1～6以及比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒、比较例1的自交联透明质酸凝胶颗粒和参考例1的透明质酸溶液，为了评价组织亲和性，将在兔子膝关节内由于各试样所引起的局部刺激性而增加的白血球数作为指标，从而进行分析。
用于进行动物评价的包含注射剂用核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的组合物的调节如下进行。
对于实施例1～6和比较例2～3中得到的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液，如下进行调节以使交联透明质酸凝胶颗粒的干燥重量相对于总体积(浓度)成为3w/v％。
对于核壳型交联透明质酸凝胶颗粒浓度的定量，将样品50mg用蒸馏水1.55ml进行稀释，向其中添加1N氢氧化钠溶液0.2ml，在室温下静置30分钟，由此对核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的酯交联进行水解，将核壳型交联透明质酸凝胶颗粒溶解。进一步，添加1N盐酸0.2ml，进行中和之后，通过咔唑硫酸法，将已知浓度的透明质酸(粘均分子量190万)作为标准物质，计算出核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的浓度。基于该定量结果，以核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的浓度成为3w/v％的方式进行调节，得到核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的动物评价用的组合物。
用于进行动物评价的包含注射剂用自交联透明质酸凝胶颗粒的组合物的调节如下进行。
将比较例1中得到的自交联透明质酸凝胶颗粒的悬浮液投入至5℃、pH7.0的10mM磷酸缓冲生理盐水中，每隔一小时更换10mM磷酸缓冲生理盐水，重复进行2次。以自交联透明质酸凝胶颗粒的干燥重量相对于该交联透明质酸组合物的总体积(浓度)成为3w/v％的方式，用与上述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的浓度的定量同样的方法进行。
设置1天以上的驯化期间之后，使用1mL注射筒(TERUMOCORPORATION制造；TERUMO注射器1mL结核菌素用)和20G或21G注射针(TERUMOCORPORATION制造；TERUMO注射针20G或21G)向单侧的膝关节腔内给予实施例1～6和比较例2～3的注射剂0.1mL/kg，向相反侧的膝关节腔内给予比较例1或参考例1的注射剂0.1mL/kg。给予液量基于在给予日测定的体重、通过液量换算分别地算出。
为了进行膝关节液回收，给予1天之后，利用放血致死法处死兔子。之后，使用1mL注射筒和18G注射针向膝关节腔内注入生理盐水。使膝关节充分活动之后，使用1mL注射筒和18G注射针对膝关节液进行回收。将该操作重复4次，得到约2mL的膝关节液样品。
将回收的膝关节液样品用生理盐水稀释至3倍，充分地振荡，使之均匀地混悬之后采集100μL，添加染色液((武藤化学株式会社；Labostain、商品名)2μL对白血球进行染色。将染色的关节液15μL采集到Neubauer血球计算盘上，使用显微镜，测定1×1×0.1mm区域内的白血球数。将4分区的平均值作为各膝关节的白血球数，成为生物体亲和性的指标的各注射剂的白血球数作为上述膝关节数3以上的平均白血球数而求出。
如表1所示可知，实施例1～6的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒与比较例1的自交联透明质酸凝胶颗粒和比较例2～3的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒相比，生物体亲和性提高，与参考例1的透明质酸溶液是同样的。由此可知，凝胶颗粒中的壳的有无、壳的厚度和柔软度对于生物体亲和性是重要的。
[表1]
(试验例6)
对于实施例3～4的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒和参考例1的透明质酸溶液在关节腔内注射对疼痛的作用，使用基于兔子的膝关节半月板部分切除的实验性变形性关节病模型动物进行确认。
作为动物，准备13周龄的Kbl：JW(SPF)系兔子(雄)，作为对于评价装置的驯化，放入小动物用镇痛评价装置IncapacitanceTester(LintonInstrument公司制造、商品名)的主体容器(保持器)中，进行静置5秒钟的操作。
动物分别收容在安装在可动式齿条上的托架式金属制丝网地板笼(350W×500D×350Hmm)中，在温度25±3℃、湿度50±20％、换气次数12～18次/小时、照明时间8：00～20：00(明12小时、暗12小时)的环境下进行饲养。对于试样，通过不锈钢制喂食器，以150g/天的喂食限制给予实验动物用固体饵料RC4(OrientalYeastCo.,ltd.制)，作为饮用水，通过聚丙烯制给水瓶(前管不锈钢制)自由地给予自来水。动物的个体识别通过对耳廓用记号记录个体识别编号而进行识别，笼子中，在分组前附上记录了性别和个体识别编号的卡片；在分组后附上记录了试验编号、给予组、性别、动物编号、手术日、给予日、剖检日和个体识别编号的卡片。
在半月板部分切除手术日的前一天进行分组。在分组日，对所有例的体重与两后腿重量分配进行了测定。由测定的两后腿重量分配计算出左后腿重量分配比((左荷重/两侧总计荷重)×100(％))。以左后腿重量分配比为基准，按照个体值接近平均值的顺序进行选择。对于所选择的动物，使用基于左后腿的重量分配比的分层连续随机化法分配各组。确认左后腿重量分配比的平均值在各组中显示相同的值且没有组间差异之后，对于体重也确认了平均值在各组显示相同的值、没有组间差异。
半月板部分切除手术在分组日的第二天进行，将半月板部分切除手术日定义为术后0天。使用14～15周龄的动物，参考参考文献1～3所述的方法，制作半月板部分切除变形性关节病模型动物。
例如，参考文献1中记载了：准备KBL：JW家兔(13周龄、雌)32只，在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下，将左侧膝关节的外侧侧副韧带和籽骨韧带切离,将半月板部分切除3.0～4.0mm，使用26G的注射针对膝关节内以2周5次的频率，对A组和B组各8只注入高分子量HA溶液，对于作为对照的C组8只注入生理盐水，对于C组和D组每天经口给予乐松(Loxonin)，对于疼痛抑制效果和防止软骨变性效果进行评价。另外，参考文献2中记载了：准备新西兰白色家兔(体重2～3kg)72只，在麻醉下切断左侧膝关节的韧带，将半月板部分切除3～4mm，对于膝关节内以每周2次的频率、期间在第2周和第4周，对A组的48只注入分子量190万的1～0.01％HA溶液，对B组的12只注入分子量80万的1～0.01％HA溶液，对C组的12只注入生理盐水，处死之后，采集膝关节对药效进行评价。另外，参考文献3中记载了：对日本白色家兔(雌、2.5kg)15只在戊巴比妥钠麻醉下，切断左侧膝关节的外侧侧副韧带和籽骨韧带，将半月板部分切除3.0～4.0mm，使用25G的注射针对膝关节内以每周2次的频率进行注入，作为对照注入等量生理盐水，处死后，采集膝关节，对于药效进行评价。
参考文献1：OsteoarthritisandCartilage，Vol.15，No.5，p.543-549(2007)
参考文献2：OsteoarthritisandCartilage，Vol.4，No.2，p.99-110(1996)
参考文献3：关节外科、第15卷、第3号、p.92-98(1996)
参考文献4：药理与治疗、第23卷、p.833-841(1995)
参考文献5：药理与治疗、第33卷、p.303-312(2005)
参考文献6：整形外科基础科学、第9卷、p.77-79(1982)
参考文献7：整形外科基础科学、第11卷、p.125-127(1984)
参考文献8：Arthritis&Rheumatism，Vol.48，No.7，p.1923-1929(2003)
在大腿部肌肉内注射盐酸氯胺酮(SankyoYellYakuhinCo.,Ltd.制；Ketalar肌肉注射用500mg、产品名)和甲苯噻嗪(IntervetK.K.制；Skilpe2％注射液、产品名)进行组合麻醉下，对兔子的左膝关节部份进行除毛，背位固定于北岛式固定器(NATSUMESEISAKUSHOCOLTD.制)。无菌地在膝盖的外侧正下面皮肤施加约2cm的切口，使外侧侧副韧带显露之后，将该韧带切除。进一步，将膝盖窝肌肉起始部的腱切除，由此使外侧半月板显露，将半月板的大致中央部切除3.0-4.0mm。之后，对于皮下肌肉层和皮肤分别进行结节缝合，对大腿部肌肉内注射氨苄西林(MeijiSeikaPharmaCo.,Ltd.制；Bikushirinsol-15％、产品名)约0.2mL。
在手术后4天(疼痛发病日)的两后腿重量分配测定之后，使用1mL注射筒和23G注射针对手术侧(左侧)膝关节腔内给予1次实施例3～4和参考例1的注射剂0.1mL/kg。给予液量可以通过基于在给予日测定的体重的液量换算而分别地算出。
两后腿重量分配的测定中使用小动物用镇痛评价装置IncapacitanceTester。本装置通过设置于容器底面的双通道的传感器垫，将左右各自的重量以克为单位正确地检测放入至主体容器的动物的左右腿的重量分配，将该值用试验者所设定的时间进行平均化。主体容器使用兔子用的容器。测定设定时间设为在动物的静止状态下5秒。
使动物在兔子用主体容器(保持器)内移动，在动物的静止状态下进行测定(第1次)，接着使动物从保持器中出来，再次放入并在静止状态下进行测定(第2次)，再次重复该操作(第3次)。分别对于3次测定的两后腿重量分配，由左右重量(荷重)通过下述式(4)计算出左后腿重量分配比(％)。
左后腿重量分配比(％)＝{左荷重(g)/(右荷重(g)+左荷重(g))×100}·(4)
将3次计算出的左后腿重量分配比(％)的平均值定义为每测定1次的左后腿重量分配比(％)。将该结果示于图2和图3。
如图2和图3所示，可知给予了实施例3～4的核壳型交联透明质酸凝胶的兔子与给予了参考例1的透明质酸溶液的兔子相比，能够更长地保持疼痛抑制效果。
产业上的可利用性
通过本发明，能够提供异物反应被降低至与透明质酸溶液相同程度、生物体亲和性高的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。另外，还提供该凝胶颗粒的制造方法以及包含该凝胶颗粒的医用材料。

Claims (9)

1.一种核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，
从表面起至深度800nm的探针压入力为20nN以下。
2.根据权利要求1所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其中，从所述拐点至所述表面的平衡溶胀倍率为40以上。
3.一种核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其表面的平衡溶胀倍率比中心高，并且从中心到表面的平衡溶胀倍率的变化曲线存在拐点，
从拐点至表面的平衡溶胀倍率为65以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒，其中，从所述拐点至所述表面的距离为5μm以上。
5.一种制造权利要求1～4中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，其包括：使交联透明质酸凝胶颗粒与碱性物质接触，从而使该凝胶颗粒形成核壳结构。
6.一种制造权利要求1～5中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒的制造方法，其包括：在交联透明质酸凝胶颗粒的表面形成透明质酸的交联密度低于该交联透明质酸凝胶颗粒的交联透明质酸凝胶的壳。
7.一种医用材料，其包含权利要求1～4中任一项所述的核壳型交联透明质酸凝胶颗粒。
8.根据权利要求7所述的医用材料，其是选自关节注入剂、药理活性物质的载体、创伤敷剂、组织替代型生物体组织修复剂、防粘连剂、止血剂、人工细胞外基质和皮肤填充剂中的任意者。
9.根据权利要求7或8所述的医用材料，其是关节注入剂。
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