CN105367675A

CN105367675A - 一种从灵芝中提取多糖的方法

Info

Publication number: CN105367675A
Application number: CN201510811693.7A
Authority: CN
Inventors: 黄霄; 单玉军; 王颖
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-03-02

Abstract

本发明公开了一种从灵芝中提取多糖的方法。属于中药提取技术领域，本发明以水提取法为基础，在提取之前通过用热水煮沸，破坏灵芝中其他的成分，在保证多糖结构能被很少破坏的同时能提高多糖的提取率，同时结合酶解、膜分离和柱层析的方法，经过试验摸索，得到了最佳的提取工艺参数，极大提高了多糖的提取率。本发明为灵芝的综合利用和灵芝有效成分的工业化生产提供一定的理论和实践依据，同时对灵芝药用价值的评价具有重要的意义。

Description

一种从灵芝中提取多糖的方法

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及一种从灵芝中提取多糖的方法。

背景技术

灵芝(学名：GanodermaLucidumKarst),别称红芝、丹芝、木灵芝、菌灵芝、万年蕈、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。灵芝主要分布在中国、朝鲜半岛和日本，中国分布最广的在江西。早在东汉时期，张衡的《西京赋》中就出现了灵芝一词，距今已经有两千多年的历史。《本草纲目》收录了黄芝、白芝、黑芝、青芝、赤芝、紫芝六种，每种均按照释名、集解、正误、修治、气味、主治、附方等项，详加注解。

灵芝具有保肝解毒、治疗糖尿病、改善心血管系统、肌肤美白、补气安神、止咳平喘的功效，主治神疲乏力、头晕、心悸、失眠、虚劳、冠心病、尘肺、久咳气喘等。近些年来，癌症患者的数量逐年增加，各种抗癌药物的研发成为热点。研究表明灵芝制剂对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌有一定的辅导治疗效果。灵芝中的化学成分复杂，其中的三萜类和糖类化合物是主要的活性成分。现代药理研究表明，灵芝多糖具有显著的提高免疫力抗肿瘤功效，可以通过巨噬细胞、T淋巴细胞释放能抑制或杀死肿瘤细胞的细胞因子如肿瘤坏死影子(TNF)和干扰素(IFN)来杀死肿瘤细胞或促其凋亡，也可以通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞的功能，间接杀死肿瘤细胞。

灵芝活性成分的提取方法有多种，多糖的提取方法有水浴提取法，碱提取法，超声提取法，酶提取法，超临界流体萃取等。各种提取方法都有自己的优缺点，水浴提取法优点是简单方便，缺点是提取效率低，有时会破坏多糖的结构。

发明内容

为了克服现有的灵芝提取多糖的方法存在的缺点，本发明提供了一种从灵芝中提取多糖的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的从灵芝中提取多糖的方法的具体步骤如下：

(1)水浸提取：

将灵芝加入粉碎机中粉碎，称取粉碎后的灵芝粉，加入蒸馏水，灵芝粉与蒸馏水的重量体积比为1:30-90g/ml，浸泡5-10min，再加入蒸馏水，加入的蒸馏水与灵芝粉的体积重量比为300-600:1ml/g，置于恒温水箱中50-90℃恒温水浴1-3h，之后煮沸1h，将煮沸后的溶液经漏斗过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，继续煮沸，沸腾时间0.5h然后过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，过滤之后把滤渣弃掉，三次过滤留下的滤液收集备用；

(2)纤维素酶和植物蛋白酶酶解及膜分离：

将步骤(1)水浸提后滤液加入滤液重量0.1-1wt％纤维素酶和0.5-2wt％植物蛋白酶，在pH5.0时，于40-70℃水浴下酶解30-90min；将滤液装入离心管中行离心，在压力为0.05～0.1MPa时，用超滤膜进行膜分离，离心后将残渣去掉，离心液于4℃放置2h；

(3)去蛋白质：

用6mol/LHCl调节步骤(2)的离心液pH到3，用等体积比的三氯甲烷萃取两次，留上清液进行过滤，滤液上DEAE-SephadexA-25柱，然后用NaCl洗脱，洗脱液浓缩透析除盐；

(4)除色素：

将步骤(3)得到的洗脱液依次用无水乙醚和无水乙醇洗涤，然后进行逆向流水透析，最后浓缩冷冻干燥，放入真空干燥箱烘干得灵芝多糖。

步骤(1)中，粉碎后的灵芝粉的粒度大于80目。

步骤(1)中，优选称取粉碎后的灵芝粉，蒸馏水，灵芝粉与蒸馏水的重量体积比为1:60g/ml，浸泡5min。

步骤(1)中，优选加入的蒸馏水与灵芝粉的体积重量比为480:1ml/g，置于恒温水箱中70℃恒温水浴2h。

步骤(2)中，优选将步骤(1)水浸提后滤液加入滤液重量0.5wt％纤维素酶和1wt％植物蛋白酶，在pH5.0时，于55℃水浴下酶解60min。

步骤(2)中，滤液在5000r/min的速度下进行离心，时间20min。

步骤(2)中，真空干燥箱烘干是先于45℃下干燥2h，之后调节温度到60℃烘干。

本发明的积极效果如下：

本发明以水提取法为基础，在提取之前通过用热水煮沸，破坏灵芝中其他的成分，在保证多糖结构能被很少破坏的同时能提高多糖的提取率，同时结合酶解、柱层析的方法，经过试验摸索，得到了最佳的提取工艺参数，极大提高了多糖的提取率。

本发明为灵芝的综合利用和灵芝有效成分的工业化生产提供一定的理论和实践依据，同时对灵芝药用价值的评价具有重要的意义。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

本发明的从灵芝中提取多糖的方法的具体步骤如下：

(1)水浸提取：

将灵芝加入粉碎机中粉碎，称取粉碎后的灵芝粉1g，加入30ml蒸馏水，浸泡8min，再加入300ml蒸馏水，置于恒温水箱中50℃恒温水浴3h，之后煮沸1h，将煮沸后的溶液经漏斗过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，继续煮沸，沸腾时间0.5h然后过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，过滤之后把滤渣弃掉，三次过滤留下的滤液收集备用；

(2)纤维素酶和植物蛋白酶酶解：

将步骤(1)水浸提后滤液加入滤液重量0.1wt％纤维素酶和0.5wt％植物蛋白酶，在pH5.0时，于40℃水浴下酶解90min；将滤液装入离心管中行离心，在压力为0.05～0.1MPa时，用超滤膜进行膜分离，离心后将残渣去掉，离心液于4℃放置2h；

(3)去蛋白质：

(4)除色素：

步骤(1)中，粉碎后的灵芝粉的粒度大于80目。

步骤(2)中，滤液在5000r/min的速度下进行离心，时间20min。

实施例2

本发明的从灵芝中提取多糖的方法的具体步骤如下：

(1)水浸提取：

将灵芝加入粉碎机中粉碎，称取粉碎后的灵芝粉，加入90ml蒸馏水，浸泡10min，再加入600ml蒸馏水，置于恒温水箱中90℃恒温水浴1h，之后煮沸1h，将煮沸后的溶液经漏斗过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，继续煮沸，沸腾时间0.5h然后过滤，滤液备用，滤渣加入蒸馏水，过滤之后把滤渣弃掉，三次过滤留下的滤液收集备用；

(2)纤维素酶和植物蛋白酶酶解：

将步骤(1)水浸提后滤液加入滤液重量1wt％纤维素酶和2wt％植物蛋白酶，在pH5.0时，于70℃水浴下酶解30min；将滤液装入离心管中行离心，在压力为0.05～0.1MPa时，用超滤膜进行膜分离，离心后将残渣去掉，离心液于4℃放置2h；

(3)去蛋白质：

(4)除色素：

步骤(1)中，粉碎后的灵芝粉的粒度大于80目。

步骤(2)中，滤液在5000r/min的速度下进行离心，时间20min。

实施例3

(1)水浸取法

从袋装成品中取出灵芝若干，放入粉碎机粉碎28-30min，精密称取0.500g灵芝放入烧杯中，加入蒸馏水30ml充分浸泡约5min，再加入240ml蒸馏水置于恒温水箱中70℃恒温水浴2h,之后在电加热炉上煮沸1h。将煮沸后的溶液经漏斗过滤，滤液备用，滤渣加入90ml蒸馏水，继续煮沸，沸腾时间0.5h然后过滤，滤液备用，滤渣加入60ml蒸馏水，过滤之后把滤渣弃掉，三次过滤留下的滤液收集到烧杯中，待用。

(2)纤维素酶和植物蛋白酶酶解法

水浸提后滤液加入0.5％纤维素酶和1％植物蛋白酶在pH5.0时于55℃水浴下酶解60min。

将滤液装入离心管中，在5000r/min的速度下进行离心，时间20min，在压力为0.05～0.1MPa时，用超滤膜进行膜分离。离心后将残渣去掉，离心液于4℃放置2h。

(3)去蛋白质

用6mol/LHCl调pH到3。用等体积比的三氯甲烷通分液漏斗萃取两次，留上清液进行过滤，滤液上DEAE-SephadexA-25柱，然后用0.5M的NaCl洗脱，洗脱液浓缩透析除盐。

(4)除色素

依次用无水乙醚和无水乙醇洗涤，降低聚糖等小分子杂质逆向流水透析，最后浓缩冷冻干燥得灵芝多糖。放入真空干燥箱于45℃下干燥2h，之后调节温度到60℃烘干。

灵芝多糖的含量测定：

取烘干后的样品加入10ml水和10mlDNS试剂，充分混匀后，取出1ml液体，沸水浴5min后冷到室温，加入4ml水；取0.5mlDNS试剂和0.5ml蒸馏水，沸水浴5mim后冷到室温加入4.0ml水作为对照，用紫外分光光度计在490nm波长下测定吸光度。

准确称取葡萄糖250mg，加蒸馏水定容到1000ml，配制成250μg/ml葡萄糖标准溶液。分别取0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml于6个试管中，加入蒸馏水至每个试管的液体为0.5ml。每个试管再加入0.5mlDNS试剂，沸水浴5min，冷却后加入4.0ml蒸馏水。测定每个的吸光度。

以葡萄糖含量为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。求得实施例1-3的灵芝多糖的提取率为1.4％、1.6％、1.9％。

传统水浴提取灵芝多糖的提取率能都低于1％，本发明通过以水提取法为基础，在提取之前通过用热水煮沸，破坏灵芝中其他的成分，在保证多糖结构能被很少破坏的同时能提高多糖的提取率，同时结合酶解、柱层析的方法，经过试验摸索，得到了最佳的提取工艺参数，使多糖的提取率大于1.4％，最高达到1.9％，远远高于常规水浴提取法，起到了预料不到的技术效果。

虽然本发明的方法与超临界流体萃取等新颖的多糖提取技术存在一定的差距。但是水煎煮法和超临界流体萃取法等比较是，可以大大的减少实验费用，并且操作简单。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)水浸提取：

(2)纤维素酶和植物蛋白酶酶解及膜分离：

(3)去蛋白质：

(4)除色素：

2.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中，粉碎后的灵芝粉的粒度大于80目。

3.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中，称取粉碎后的灵芝粉，蒸馏水，灵芝粉与蒸馏水的重量体积比为1:60g/ml，浸泡5min。

4.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中，加入的蒸馏水与灵芝粉的体积重量比为480:1ml/g，置于恒温水箱中70℃恒温水浴2h。

5.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(2)中，将步骤(1)水浸提后滤液加入滤液重量0.5wt％纤维素酶和1wt％植物蛋白酶，在pH5.0时，于55℃水浴下酶解60min。

6.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(2)中，滤液在5000r/min的速度下进行离心，时间20min。

7.如权利要求1所述的从灵芝中提取多糖的方法，其特征在于：步骤(2)中，真空干燥箱烘干是先于45℃下干燥2h，之后调节温度到60℃烘干。