CN105301140A - 一种注射用活血通络成分检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种注射用活血通络成分检测方法。该检测方法包括：取注射用活血通络供试品溶液以及标准品溶液进行UPLC检测，UPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱；根据UPLC检测结果，获得注射用活血通络成分及其含量。本发明提供的检测方法具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好；注射用活血通络指纹图谱的分离度、重现性均较好，信息全面，标示出21个共有峰，各批次样品相似度在0.95以上。本发明建立的注射用活血通络中5种成分的含量测定及指纹图谱研究方法为注射用活血通络的质量控制提供依据。

Description

一种注射用活血通络成分检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种注射用活血通络成分检测方法。

背景技术

高脂血症是指血脂水平过高，血脂异常者往往伴有多种心血管危险因素，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积所引起的动脉硬化。血脂水平和下降会使得心血管疾病的发生率和死亡率随着血清总胆固醇和LDL胆固醇水平的下降而降低。

桃红四物汤为调经要方之一，是《玉机微义》转引的《医垒元戎》中的一个方子，也称加味四物汤，桃红四物汤这一方名始于见《医宗金鉴》。该方由四物汤加味桃仁、红花而成，功效为养血活血。现代研究表明，桃红四物汤具有扩张血管、抗炎、抗疲劳、抗休克、调节免疫功能、降脂、补充微量元素、抗过敏等作用。

注射用活血通络是在“桃红四物汤”基础上，根据临床经验精简而成，由赤芍、川芎、桃仁等药味组成，具有活血化瘀、行气通络之功效，临床用于治疗中风中经络(脑血栓形成)之急性期证属痰瘀阻络者，半身不遂，口舌歪斜，舌强语謇，头晕目眩，舌泽暗淡等。注射用活血通络主要含苷类、有机酸及糖类成分。

随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要包括：

1、原药材的质量

中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的限制许多地方采取用种植的药材来代替这种家种的药材会严重影响药剂的质量，使药材的质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升家中药材的产量，从而导致这与野生药材的气味发生了改变，从而影响了中药的疗效。

2、生产过程

在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细的按照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。此外，还要注意中药制剂的粉碎、浓缩、干燥、精制和提取等方面的工序，这对中药成品的成分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量。

3、工艺用水、洁净区环境、工艺卫生

在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品。

4、包装材料及现代包装技术

现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性，它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解，使用劣质的保障袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因为受潮变质等问题的出现，这严重影响制剂的质量。

因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。目前关于注射用活血通络的质量控制方法尚无明确报道，因此急需一种注射用活血通络的质量控制方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种注射用活血通络成分检测方法。该检测方法具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好；注射用活血通络指纹图谱的分离度、重现性均较好，信息全面，标示出21个共有峰，各批次样品相似度在0.95以上。本发明建立的注射用活血通络中5种成分的含量测定及指纹图谱研究方法为注射用活血通络的质量控制提供依据；该方法简便可行、快速准确，可以作为评价注射用活血通络质量的有效方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种注射用活血通络成分检测方法，取注射用活血通络供试品溶液以及标准品溶液进行UPLC检测，UPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～6min，15％A→28％A；6～12min，28％A→44％A；12～20min，44％A→75％A；20～25min，75％A；

根据UPLC检测结果，获得注射用活血通络成分及其含量。

作为优选，UPLC检测的波长为230nm～260nm和/或321nm。

在本发明提供的一些实施例中，检测波长为230nm～260nm时，色谱峰较全面且各色谱峰分离较好，适宜指纹图谱的建立，同时适宜检测苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷含量。

优选地，UPLC检测的波长为260nm。

在本发明提供的一些实施例中，阿魏酸最大吸收波长为321nm，因此选择321nm为阿魏酸含量测定波长。

作为优选，酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两者以上的混合物。

优选地，酸为甲酸。

作为优选，在酸的水溶液中，酸的体积百分数为0.05％～0.10％。

优选地，在酸的水溶液中，酸的体积百分数为0.05％。

作为优选，UPLC检测的流动相流速为0.2～0.8mL/min。

优选地，UPLC检测的流动相流速为0.4mL/min。

作为优选，UPLC检测的柱温20℃～30℃。

优选地，UPLC检测的柱温20℃。

作为优选，C18色谱柱为C18小粒径色谱柱。C18小粒径色谱柱能够实现在相对较短的时间内分离成分且分离度好的效果。

在本发明提供的一些实施例中，C18色谱柱为ThermoC18柱(3×100mm，1.7μm)或AgilentC18(3×100mm，1.8μm)。

作为优选，标准品为苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷或阿魏酸中的一种或两者以上的混合物。

优选地，标准品为苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿魏酸的混合物。

作为优选，标准品中羟基芍药苷10～100μg/mL，苦杏仁苷300～2000μg/mL，芍药内酯苷10～200μg/mL，芍药苷400～2000μgμg/mL，阿魏酸1～30μg/mL。

优选地，标准品中羟基芍药苷20～60μg/mL，苦杏仁苷420～1082μg/mL，芍药内酯苷40～121μg/mL，芍药苷560～1502μgμg/mL，阿魏酸10～22μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，标准品中羟基芍药苷20μg/mL，苦杏仁苷420μg/mL，芍药内酯苷40μg/mL，芍药苷560μgμg/mL，阿魏酸10μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，标准品中羟基芍药苷60μg/mL，苦杏仁苷1082μg/mL，芍药内酯苷121μg/mL，芍药苷1502μg/mL，阿魏酸22μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，UPLC检测的理论板数按芍药苷峰计算不低于3000。

本发明还提供了该检测方法在构建注射用活血通络指纹图谱中的应用；

构建指纹图谱的方法包括：采用本发明提供的检测方法对不同批次的注射用活血通络进行UPLC检测，根据UPLC检测结果，标定共有峰，以中位数法建立注射用活血通络指纹图谱。

本发明提供了一种注射用活血通络成分检测方法。该检测方法包括：取注射用活血通络供试品溶液以及标准品溶液进行UPLC检测，UPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～6min，15％A→28％A；6～12min，28％A→44％A；12～20min，44％A→75％A；20～25min，75％A；根据UPLC检测结果，获得注射用活血通络成分及其含量。本发明至少具有如下优势之一：

本发明提供的检测方法具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好；注射用活血通络指纹图谱的分离度、重现性均较好，信息全面，标示出21个共有峰，各批次样品相似度在0.95以上。本发明建立的注射用活血通络中5种成分的含量测定及指纹图谱研究方法为注射用活血通络的质量控制提供依据；

与现有技术相比，本发明减少了实验次数(指纹与多成分含量测定同时进行)，实验操作简便，实验条件简单可控，同时具有分离效率高、快速、准确，样品量小，节省溶剂等特点。可以作为评价注射用活血通络质量的有效方法。

附图说明

图1示对照品色谱图；1号峰为苦杏仁苷，2号峰为羟基芍药苷，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为苯甲酸；

图2示供试品色谱图；1号峰为苦杏仁苷，2号峰为羟基芍药苷，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为苯甲酸；

图3示注射用活血通络对照指纹图谱；8号峰为苦杏仁苷，9号峰为羟基芍药苷，12号峰芍药内酯苷，S峰为芍药苷，15号峰为阿魏酸，17号峰为苯甲酸；其它峰为未知峰；

图4示注射用活血通络指纹图谱中色谱峰来源指认，指纹图谱中标定了21个共有峰，其中3、4、5、9、11、12、14、16、17、20、21号峰来自赤芍药材，1、2、10、13、15、18、19号峰来自川芎药材，6、7、8号峰来自桃仁药材。

具体实施方式

本发明公开了一种注射用活血通络成分检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的注射用活血通络成分检测方法中所用试剂、仪器均可由市场购得：

仪器:Agilent1290超高压液相色谱仪，DAD紫外检测器；MettlerAE240电子分析天平；BP211D型电子分析天平；Centrifuge5415D高速离心机；Milli-QAcademic纯水机；KQ-250DB型超声波清洗仪。

试药:苦杏仁苷对照品(批号：110820-201305，含量以85.8％计)、芍药苷对照品(批号：110736-201337，含量以94.9％计)、阿魏酸对照品(批号：111787-201002)，均购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷对照品(批号：MUST-14031214，纯度≥98.0％)，羟基芍药苷对照品(批号：MUST-14061108，纯度≥98.0％)，均购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

药品来源：本发明研究用注射用活血通络由江苏康缘药业股份有限公司生产。批号：120501、120601、120701、120801、120901、130101、130401、130501、130601、130701。

参照物的选择：注射用活血通络指纹图谱为针对处方中苷类及有机酸类成分建立的指纹图谱，因此选择保留时间适中、分离较好的芍药苷作为参照物。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～4注射用活血通络成分定量检测方法

对照品溶液的制备：取苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含羟基芍药苷20μg、苦杏仁苷420μg、芍药内酯苷40μg、芍药苷560μg、阿魏酸10μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：取注射用活血通络内容物，混匀，取约0.2g，精密称定，置50mL量瓶内，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高压液相色谱仪，测定，记录25min图谱，即得。色谱条件具体为：按表1中的规定进行梯度洗脱；柱温20℃；理论板数按芍药苷峰计算不低于3000。

表1梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～6	15→28	85→72
6～12	28→44	72→56
			12～20	44→75	56→25

20～25

75

25

其他色谱条件选择如表2所示，其中，第一检测波长为苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷的含量检测波长，同时为注射用活血通络指纹图谱的检测波长；第二检测波长为阿魏酸的含量检测波长。

表2本发明实施例1～4的色谱条件

按照表1所示色谱条件，采用本发明提供的梯度洗脱程序，分别对对照品溶液和供试品溶液进行色谱分析。其中，采用实施例1中提供的色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析所得色谱图如图1、2(260nm)所示。

用对照品进行对比，指认出1号峰为苦杏仁苷，2号峰为羟基芍药苷，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为苯甲酸。

采用其他实施例提供的色谱条件对标准品溶液和待检溶液进行分析的色谱图与此相似。

实施例5线性关系考察

精密称取羟基芍药苷、苦杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿魏酸对照品适量，每1mL含羟基芍药苷60.3μg、苦杏仁苷1082.4μg、芍药内酯苷121.4μg、芍药苷1502.2μg、阿魏酸22.4μg的混合溶液，将其作为母液，依次精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置1mL量瓶内，加水水稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2μL，注入液相色谱仪，按实施例1方法测定，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

各对照品线性范围、回归方程和相关系数见表3。

表3各对照品线性范围、回归方程和相关系数

成分	线性范围(μg/mL)	回归方程	相关系数
				苦杏仁苷	108.24～649.44	Y＝0.1681X-1.04	r＝0.9999
羟基芍药苷	6.03～36.18	Y＝10.434X+1.4133	r＝0.9998
				芍药内酯苷	12.14～72.84	Y＝0.6762X-0.3467	r＝0.9999
芍药苷	150.22～901.32	Y＝0.4378X+0.7867	r＝0.9999
				阿魏酸	2.24～13.44	Y＝5.1747X-0.3867	r＝0.9998

实施例6精密度试验

(1)对照品溶液精密度试验

取线性第四个点浓度的对照品混合对照品溶液2μL，注入超高压液相色谱仪，按实施例1方法测定，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明精密度良好，见表4。

表4对照品溶液精密度考察结果

重复	苦杏仁苷	羟基芍药苷	芍药内酯苷	芍药苷	阿魏酸
						1	76.4	169.4	32.3	267.3	46.3
2	76.9	169.5	33.1	265.8	46.1
						3	76.1	170.2	31.4	264.4	45.8
4	75.8	168.5	32.5	270.1	45.2
						5	77.8	170.1	31.9	268.1	47.5
6	75.6	168.4	32.4	268.3	46.7
						Ave	76.4	169.4	32.3	267.3	46.3
RSD	1.1	0.5	1.8	0.8	1.7

(2)样品精密度试验

取注射用活血通络内容物，混匀，取约0.2g，精密称定至50mL量瓶内，加水使溶解，稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，注入超高压液相色谱仪，按实施例1方法测定，连续进样6次，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积结果见表5和表6，5个指标成分峰面积结果见表7。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法精密度良好。

表5样品精密度考察结果

(共有峰的相对保留时间)

峰号	1	2	3	4	5	6	Ave	RSD(％)
									1	0.16	0.17	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	2.76
2	0.21	0.21	0.20	0.21	0.21	0.21	0.21	2.15
									3	0.34	0.34	0.35	0.34	0.34	0.34	0.34	1.31
4	0.36	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	1.27
									5	0.45	0.45	0.45	0.45	0.46	0.46	0.45	0.99
6	0.50	0.50	0.50	0.50	0.49	0.50	0.50	0.90
									7	0.55	0.55	0.55	0.55	0.55	0.57	0.55	0.00
8	0.66	0.66	0.65	0.65	0.66	0.66	0.66	0.83
									9	0.70	0.69	0.69	0.69	0.69	0.69	0.69	0.65
10	0.74	0.74	0.74	0.73	0.74	0.74	0.74	0.61
									11	0.77	0.77	0.77	0.77	0.79	0.77	0.77	1.16
12	0.80	0.80	0.81	0.80	0.80	0.80	0.80	0.56
									13	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.00
14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00
									15	1.29	1.29	1.29	1.30	1.29	1.29	1.29	0.35
16	1.34	1.34	1.34	1.34	1.34	1.36	1.34	0.00
									17	1.41	1.41	1.41	1.42	1.41	1.41	1.41	0.32
18	1.49	1.47	1.49	1.49	1.49	1.49	1.49	0.60
									19	1.55	1.55	1.53	1.55	1.56	1.55	1.55	0.71
20	1.65	1.68	1.68	1.68	1.69	1.68	1.68	0.90
									21	1.78	1.73	1.74	1.73	1.73	1.73	1.74	1.24

表6样品精密度考察结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

峰号	1	2	3	4	5	6	Ave	RSD(％)
									8(苦杏仁苷)	0.28	0.28	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	1.60
9(羟基芍药苷)	0.65	0.65	0.65	0.65	0.66	0.65	0.65	0.64
									12(芍药内酯苷)	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.47
14(S峰-芍药苷)	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00
									15(阿魏酸)	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.00
17(苯甲酸)	0.40	0.41	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	1.05
									18	0.47	0.47	0.46	0.47	0.47	0.47	0.47	0.54
21	0.21	0.21	0.20	0.21	0.21	0.21	0.21	2.57

表7苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸精密度考察结果

有效成分	1	2	3	4	5	6	Ave	RSD(％)
									苦杏仁苷	81.9	80.0	80.5	81.2	82.0	81.5	81.18	0.98
羟基芍药苷	185.0	186.1	184.5	187.4	187.3	184.1	185.73	0.76
									芍药内酯苷	36.4	36.1	35.8	37.4	36.8	37.0	36.58	1.63
芍药苷	283.2	283.3	282.9	284.1	282.4	280.5	282.73	0.43
									阿魏酸	182.3	182.8	180.4	183.5	182.6	180.8	182.07	0.66

上述结果表明精密度良好。

实施例7稳定性试验

取注射用活血通络内容物，混匀，取约0.2g，精密称定至50mL量瓶内，加水使溶解，稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，分别于0h、3h、6h、9h、12h、和18h注入高效液相色谱仪，按实施例1方法测定，记录其峰面积，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的相对峰面积结果见表8和表9，5个指标成分峰面积结果见表10。又以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均大于0.99，表明供试品溶液室温18小时内稳定性良好。

表8样品稳定性考察结果

(各共有峰的相对保留时间)

峰号	0h	3h	6h	9h	12h	18h	Ave	RSD(％)
									1	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.00
2	0.21	0.21	0.21	0.21	0.21	0.21	0.21	0.00
									3	0.34	0.34	0.35	0.34	0.34	0.34	0.34	1.31
4	0.36	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	1.27
									5	0.45	0.45	0.45	0.45	0.46	0.44	0.45	0.99
6	0.50	0.50	0.50	0.50	0.49	0.49	0.50	0.90
									7	0.55	0.55	0.55	0.55	0.55	0.57	0.55	0.00
8	0.66	0.66	0.65	0.65	0.66	0.66	0.66	0.83
									9	0.70	0.69	0.69	0.69	0.69	0.70	0.69	0.65
10	0.74	0.74	0.74	0.73	0.74	0.74	0.74	0.61
									11	0.77	0.77	0.77	0.77	0.78	0.79	0.78	0.58
12	0.80	0.80	0.81	0.80	0.80	0.80	0.80	0.56
									13	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.85	0.00
14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00
									15	1.29	1.29	1.29	1.30	1.29	1.29	1.29	0.35
16	1.34	1.34	1.34	1.34	1.34	1.36	1.34	0.00
									17	1.41	1.41	1.41	1.40	1.41	1.41	1.41	0.32
18	1.49	1.48	1.49	1.49	1.49	1.47	1.49	0.30
									19	1.55	1.55	1.53	1.55	1.56	1.55	1.55	0.71
20	1.65	1.68	1.68	1.68	1.64	1.68	1.67	1.17
									21	1.78	1.76	1.74	1.73	1.73	1.73	1.75	1.24

表9样品稳定性考察结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

峰号	0h	3h	6h	9h	12h	18h	Ave	RSD(％)
									8	0.28	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	1.30
9	0.65	0.65	0.65	0.65	0.64	0.65	0.65	0.61
									12	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.00
14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00

15	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.00
									17	0.41	0.41	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	1.32
18	0.47	0.47	0.46	0.47	0.47	0.46	0.46	0.68
									21	0.21	0.22	0.21	0.21	0.21	0.21	0.21	1.54

表10苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸稳定性考察结果

有效成分	0h	3h	6h	9h	12h	18h	Ave	RSD(％)
									苦杏仁苷	81.7	80.2	80.5	81.3	82.5	81.5	81.28	1.03
羟基芍药苷	185.0	185.9	184.5	185.2	184.9	183.8	184.88	0.38
									芍药内酯苷	36.8	36.5	35.8	37.6	36.8	37.0	36.75	1.61
芍药苷	284.9	285.6	283.7	284.1	282.4	281.4	283.68	0.55
									阿魏酸	182.5	182.1	184.3	183.2	182.6	180.8	182.58	0.64

实施例8重复性试验

取注射用活血通络内容物，混匀，取约0.2g，精密称定至50mL量瓶内，加水使溶解，稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，同法制备供试品溶液6份，按实施例1方法测定，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积结果见表11和表12，5个指标成分峰面积结果见表13。又以第1份样品所得指纹图谱做为对照计算另5份样品所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99。结果表明该方法重复性良好。

表11样品重复性考察结果

(各共有峰的相对保留时间)

峰号	1	2	3	4	5	6	Ave	RSD(％)
									1	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.00
2	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.00
									3	0.35	0.35	0.35	0.34	0.35	0.34	0.35	1.29
4	0.37	0.37	0.37	0.37	0.36	0.37	0.37	1.22
									5	0.46	0.46	0.46	0.47	0.46	0.46	0.46	0.97

6	0.51	0.51	0.51	0.52	0.51	0.51	0.51	0.87
									7	0.56	0.56	0.57	0.56	0.56	0.56	0.56	0.80
8	0.67	0.67	0.66	0.67	0.67	0.66	0.67	0.67
									9	0.71	0.71	0.71	0.72	0.71	0.70	0.71	0.63
10	0.75	0.75	0.75	0.75	0.74	0.75	0.75	0.60
									11	0.78	0.78	0.77	0.78	0.78	0.79	0.78	0.57
12	0.81	0.81	0.82	0.81	0.82	0.81	0.81	0.67
									13	0.87	0.87	0.86	0.86	0.87	0.87	0.87	0.63
14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00
									15	1.30	1.30	1.31	1.31	1.31	1.31	1.31	0.42
16	1.35	1.35	1.35	1.35	1.36	1.37	1.36	0.33
									17	1.42	1.42	1.42	1.42	1.43	1.43	1.43	0.31
18	1.50	1.51	1.52	1.52	1.52	1.51	1.51	0.59
									19	1.56	1.56	1.57	1.56	1.57	1.57	1.57	0.35
20	1.69	1.69	1.68	1.69	1.69	1.69	1.69	0.26
									21	1.79	1.79	1.79	1.80	1.79	1.80	1.79	0.25

表12样品重复性考察结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

峰号	1	2	3	4	5	6	Ave	RSD(％)
									8	0.29	0.28	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	1.30
9	0.64	0.64	0.65	0.65	0.64	0.65	0.64	0.83
									12	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.47
14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	0.00
									15	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.24
17	0.41	0.41	0.41	0.41	0.40	0.41	0.41	1.03
									18	0.47	0.47	0.47	0.47	0.47	0.46	0.47	0.69
21	0.22	0.22	0.21	0.22	0.22	0.22	0.22	1.87

表13苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸重复性考察结果(mg/g)

重复	苦杏仁苷	羟基芍药苷	芍药内酯苷	芍药苷	阿魏酸
						1	107.0	5.9	10.0	147.0	2.1
2	107.1	5.8	10.2	149.1	2.1
						3	106.5	5.8	10.3	146.9	2.1
4	105.6	5.7	9.8	145.2	2.1
						5	108.6	6.1	9.6	148.3	2.1
6	107.4	6.1	10.1	145.5	2.0
						Ave	107.0	5.9	10.0	147.0	2.1
RSD(％)	0.93	2.84	2.61	1.04	1.96

根据以上方法学考察结果，注射用活血通络指纹图谱及含量测定方法精密度、重复性、稳定性均较好。

实施例9加样回收率试验

取同一供试品(批号120501)内容物，取约0.1g，精密称定6份，分别置50mL量瓶中，精密量取混合对照品母液(每1mL含苦杏仁苷1082.4μg、羟基芍药苷60.3μg、芍药内酯苷121.4μg、芍药苷1502.2μg、阿魏酸22.4μg)10mL于以上6份样品中，加水溶解稀释定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，注入超高压液相色谱仪，计算回收率。结果羟基芍药苷、苦杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿魏酸的平均回收率分别为100.0％、100.7％、100.0％、102.1％和102.3％，RSD分别为2.73％、1.18％、2.53％、1.43％和1.87％。结果表明该方法能准确测定样品中苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿魏酸的含量，见表14。

表14加样回收结果

实施例10样品含量测定

根据上述含量测定方法测定10批注射用活血通络中上述5个成分的含量，结果见表15。

表1510批注射用活血通络含量测定结果(mg·g^-1)

批号	羟基芍药苷	苦杏仁苷	芍药内酯苷	芍药苷	阿魏酸
						120501	5.9	107.0	10.0	147.0	2.1
120601	6.1	100.4	8.9	151.0	2.0
						120701	6.6	101.5	13.8	149.5	1.9
120801	6.8	112.3	12.4	158.3	2.2

120901	5.4	118.3	13.7	142.5	1.9
						130101	5.2	110.5	12.9	155.6	2.0
130401	6.9	104.3	11.1	149.6	2.2
						130501	5.3	116.7	10.2	152.2	1.8
130601	5.1	112.5	9.9	154.3	2.3
						130701	6.0	113.6	8.6	149.8	2.1

采用实施例2～4提供的色谱条件对线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率进行考察，结果与上述结果相近，结果表明本发明提供的检测方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、重复性和加样回收率。

实施例11注射用活血通络指纹图谱检测及对照指纹图谱的获得

收集十批注射用活血通络样品，按实施例1供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算各共有峰的相对保留时间、主要峰的相对峰面积和相似度，结果见表16-18，用相似度软件以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，见图3。

表16注射用活血通络指纹图谱样品测定结果

(共有峰的相对保留时间)

编号	120501	120601	120701	120801	120901	130101	130401	130501	130601	130701
											1	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17
2	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22	0.22
											3	0.35	0.34	0.35	0.35	0.35	0.34	0.34	0.35	0.34	0.34
4	0.36	0.37	0.37	0.37	0.37	0.37	0.37	0.36	0.37	0.37
											5	0.47	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46
6	0.52	0.51	0.51	0.51	0.51	0.51	0.51	0.52	0.51	0.51
											7	0.57	0.56	0.56	0.56	0.56	0.56	0.56	0.56	0.56	0.56
8	0.66	0.67	0.66	0.67	0.67	0.66	0.57	0.66	0.66	0.66
											9	0.71	0.71	0.71	0.72	0.71	0.70	0.71	0.70	0.71	0.70
10	0.74	0.75	0.75	0.75	0.74	0.75	0.75	0.74	0.75	0.74
											11	0.79	0.78	0.77	0.78	0.78	0.79	0.79	0.78	0.79	0.79
12	0.82	0.81	0.81	0.81	0.82	0.81	0.81	0.81	0.81	0.80
											13	0.86	0.87	0.87	0.86	0.87	0.87	0.87	0.88	0.87	0.88

14	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
											15	1.31	1.30	1.30	1.31	1.31	1.30	1.31	1.30	1.31	1.31
16	1.36	1.35	1.35	1.35	1.35	1.37	1.36	1.37	1.36	1.37
											17	1.43	1.42	1.42	1.42	1.42	1.43	1.42	1.43	1.42	1.43
18	1.51	1.51	1.52	1.52	1.52	1.51	1.51	1.52	1.51	1.52
											19	1.55	1.56	1.56	1.56	1.57	1.57	1.56	1.57	1.57	1.56
20	1.70	1.69	1.68	1.69	1.69	1.70	1.69	1.69	1.69	1.69
											21	1.80	1.79	1.79	1.80	1.79	1.80	1.79	1.80	1.80	1.80

表17注射用活血通络指纹图谱样品测定结果

(主要色谱峰的相对峰面积)

表18注射用活血通络指纹图谱样品测定结果(相似度)

批号	相似度
		120501	0.987
120601	0.995
		120701	0.989
120801	0.997
		120901	0.991
130101	0.991

130401	0.989
		130501	0.980
130601	0.987
		130701	0.988

十批注射用活血通络指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，确定注射用活血通络用注射用活血通络指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.95。根据十批指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间，确定注射用活血通络指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间应符合表19的限度范围。

表19各共有峰相对峰面积和相对保留时间限度范围

峰号	相对保留时间	相对峰面积
			1	0.14～0.20	——
2	0.18～0.26	——
			3	0.28～0.42	——
4	0.29～0.44	——
			5	0.37～0.55	——
6	0.41～0.61	——
			7	0.45～0.67	——
8	0.53～0.80	0.20～0.36
			9	0.57～0.85	0.44～0.81
10	0.60～0.90	——
			11	0.62～0.94	——
12	0.65～0.98	——
			13	0.69～1.04	——
14(S-14芍药苷)	1	1
			15	1.05～1.57	0.09～0.17
16	1.08～1.63	－－
			17	1.14～1.72	0.26～0.49
18	1.21～1.82	0.42～0.77

19	1.25～1.88	——
			20	1.35～2.03	——
21	1.43～2.15	——

实施例12相关性研究

取赤芍药材、桃仁药材、川芎药材约0.5g，精密称定置具塞锥形瓶内，加50％甲醇50mL超声60min，取续滤液，过0.22μm滤膜，既得。按实施例1色谱条件进样分析，通过保留时间和DAD扫描分析，指纹图谱中标定的21个共有峰其中3、4、5、9、11、12、14、16、17、20、21号峰来自赤芍药材，1、2、10、13、15、18、19号峰来自川芎药材，6、7、8号峰来自桃仁药材。结果见图4。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种注射用活血通络成分检测方法，其特征在于，取注射用活血通络供试品溶液以及标准品溶液进行UPLC检测，所述UPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～6min，15％A→28％A；6～12min，28％A→44％A；12～20min，44％A→75％A；20～25min，75％A；

根据UPLC检测结果，获得注射用活血通络成分及其含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述UPLC检测的波长为230nm～260nm和/或321nm。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述UPLC检测的波长为260nm和/或321nm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两者以上的混合物。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述酸的水溶液中，所述酸的体积百分数为0.05％～0.10％。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述UPLC检测的流动相流速为0.2～0.8mL/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述UPLC检测的柱温20℃～30℃。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为C18小粒径色谱柱。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述标准品为苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷或阿魏酸中的一种或两者以上的混合物。

10.如权利要求1至9中任一项所述的检测方法在构建注射用活血通络指纹图谱中的应用。