CN105296416A

CN105296416A - 毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法

Info

Publication number: CN105296416A
Application number: CN201510874874.4A
Authority: CN
Inventors: 丁常宏; 王谦博; 王振月; 岳赛男
Original assignee: 王振月
Current assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: CN105296416B

Abstract

毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，本发明涉及悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立的方法。本发明的目的是为了解决现有技术对毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立研究空白的问题，为利用该体系生产药用有效成分提供技术基础。本发明的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法按以下步骤进行：一、毛脉酸模悬浮细胞的制备；二、马铃薯固体培养基(PDA)的制备；三、毛脉酸模内生真菌RGT-S4的活化及其孢子悬浮液的制备；四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4的共培养体系；完成毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌的共培养。该共生体系的建立能够为植物与内生真菌互作机制的研究提供依据和基础。

Description

毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法

技术领域

本发明涉及悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立的方法。

背景技术

毛脉酸模(RumexgmeliniTurcz.)为蓼科酸模属植物，含有白藜芦醇(resveratol)和白藜芦醇-3-O-β-D-S-葡萄糖苷(polydatin)、大黄素(emodin)，大黄酚(chrysophanol)、大黄素甲醚(physcion)、酸模素(nepodin)、芦丁(rutin)及多糖等化学成分。味酸苦、性寒，入心、肺、膀胱经，民间以根入药，对淋病、上呼吸道感染性疾病、癣病和疮毒有确切疗效，具有抗肿瘤、抗真菌、镇咳平喘、降压、抗病毒和抗氧化等作用。

毛脉酸模内生真菌RGT-S4经鉴定为曲霉属的一种真菌(Aspergillussp.)，经课题组研究发现当其与毛脉酸模共生时，会显著提高毛脉酸模中药用有效成分的含量，且该真菌对人胃癌细胞株MGC-803、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SSMMC-7721、人乳腺癌细胞株MCF-7四种细胞有显著的抑制作用，是毛脉酸模中分离出的一种极有应用价值和科学研究价值的内生真菌。RGT-S4的发现为利用内生真菌提高植物有效次生代谢产物提供了依据，同时可以通过对毛脉酸模与其内生真菌RGT-S4共生的研究揭示两者互作的机制，推进内生真菌在实践中的应用。近年来,利用植物悬浮细胞与内生真菌共培养来提高药用有效成分产量因为具有高效性和可持续性,已经成为一个新的研究方向,而现有技术对毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的研究尚为空白。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术对毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立研究空白的问题，为利用该体系生产药用有效成分提供技术基础，提供了一种毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立的方法。本发明致力于毛脉酸模内生真菌和毛脉酸模悬浮细胞共生体系的建立，为研究两者的互作机制提供科学基础，为利用该体系生产药用有效成分提供技术基础，同时该研究方法也可以为其它药用植物与内生真菌互作研究提供实践模板和理论依据。

本发明的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法按以下步骤进行：

一、毛脉酸模悬浮细胞的制备：选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用110目～130目砂纸磨去种皮，将去除种皮的毛脉酸模种子浸泡在蒸馏水中18h～26h；然后在无菌条件下用体积分数为70％～75％的酒精浸泡1min～3min，无菌水冲洗3次～5次；再用质量分数为8％～10％NaClO浸泡6min～10min，无菌水冲洗3次～5次，之后将去除种皮的毛脉酸模种子置于两层湿润的滤纸上8h～10h，提供湿润的环境让种子吸水膨胀，获得吸水膨胀的毛脉酸模种子；用质量分数为8％～10％NaClO浸泡吸水膨胀的毛脉酸模种子8min～12min，无菌水冲洗3次～5次，对吸水膨胀的毛脉酸模种子进一步灭菌，得消毒的种子；将消毒的种子接种在不含植物生长激素的MS固体培养基中，置于光照培养箱内培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～8d；获得毛脉酸模无菌苗；利用含有植物激素的MS固体培养基对毛脉酸模无菌苗的下胚轴进行诱导，诱导出愈伤组织；选取生长良好的愈伤组织，接种在含有植物激素的MS固体培养基中，培养温度23℃～27℃，光照12h/d～16h/d，光照强度1500Lx～2000Lx，获得诱导的疏松愈伤组织；将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基的容器中，培养温度23℃～27℃，100r/min～160r/min黑暗振荡培养；5d～8d后用60目～80目细胞筛去除大的细胞团块；将细胞悬浮培养物摇匀，稍静止，倒出上层培养液，向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，继续培养，可得到毛脉酸模悬浮细胞；

二、马铃薯固体培养基(PDA)的制备：取去皮马铃薯180g～220g，切块，加蒸馏水700mL～1000mL，煮沸15min～30min，6层～8层纱布过滤，将滤液倒入容器中，然后向容器里加入18g～20g葡萄糖和15g～20g琼脂，再加入蒸馏水至800mL～1000mL；分装，121℃灭菌20min～30min，得马铃薯固培养基；

三、毛脉酸模内生真菌RGT-S4的活化及其孢子悬浮液的制备：将内生真菌RGT-S4接到步骤二制备的PDA培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～5d完成活化；然后在超净工作台内，取3mL～6mL无菌水加入活化培养的毛脉酸模内真生菌RGT-S4的容器中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，重复此操作4次～8次，使用无菌水的总体积为25mL～35mL；充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；

四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4的共培养体系：向容器内加入30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基，培养毛脉酸模悬浮细胞，毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.1×10³个/mL～0.3×10³个/mL，培养8d～10d后，接入内生真菌RGT-S4的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.1×10³～0.3×10³个/mL，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为100r/min～160r/min，培养温度24.5℃～25.5℃，完成毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4共培养体系的建立；

所述诱导出愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、激素2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L～3mg/L和6-苄氨基腺嘌呤2.8mg/L～3.2mg/L的MS培养基；

所述获得诱导的疏松愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L～1.0mg/L和6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS培养基；

所述含有植物激素的MS液体培养基为添加3％～5％蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L～1.0mg/L和6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS液体培养基。

本发明使用的内生真菌RGT-S4在文献毛脉酸模内生真菌RGT-S4生长曲线及菌丝体化学成分初步研究中已经公开。

本发明相对于现有技术其优点在于：

目前植物悬浮细胞与其内生真菌共培养的研究尚处于起步阶段，且毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共生的研究尚为空白。药用植物内生真菌与植物共生常能促进药用有效成分的产量，将这种技术应用在细胞与真菌的共生水平，可以提高有效成分的生产效率。该共生体系的建立能够为植物与内生真菌互作机制的研究提供材料和基础,为利用该体系生产药用有效成分提供技术基础。同时该共生体系建立的研究方法也可以为其它药用植物与内生真菌共生体系建立提供实践模板和理论依据。

附图说明

图1为毛脉酸模悬浮细胞与RGT-S4共培养生长曲线图。

图2为毛脉酸模悬浮细胞与RGT-S4共培养过程中pH变化的测试图。

图3为本发明内生真菌RGT-S4菌落形态示意图。

图4为本发明内生真菌RGT-S4分生孢子乳酸棉兰染液染色显微图(10×40)。

图5为本发明毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系的图片。

图6为本发明毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养10倍的显微图片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌RGT-S4共培养体系建立的方法，该共培养体系建立的方法按以下步骤进行：

三、毛脉酸模内生真菌RGT-S4的活化及其孢子悬浮液的制备：将内生真菌RGT-S4接到步骤二制备的PDA培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度24℃～26℃，培养3d-5d完成活化；然后在超净工作台内，取3mL～6mL无菌水加入活化培养的毛脉酸模内真生菌RGT-S4的容器中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，重复此操作4次～8次，使用无菌水的总体积为25mL～35mL；充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；

四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4的共培养体系：向容器内加入30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基，培养毛脉酸模悬浮细胞，毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.1×10³个/mL～0.3×10³个/mL，培养8d～10d后，接入内生真菌RGT-S4的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.1×10³个/mL～0.3×10³个/mL，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为100r/min～160r/min，培养温度24.5℃～25.5℃，完成毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4共培养体系的建立；

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤一所述向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，其中容器里剩余的培养基与新的含有植物激素的MS液体培养基的体积比为1：(1～3)。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三所述用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，其中容器里加入5粒～8粒直径为3mm～4mm的玻璃珠，目的是使孢子液混合均匀。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.2×10³个/mL。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四培养时间为培养9d。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四接入内生真菌RGT-S4的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.2×10³个/mL。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四摇床转速为120r/min。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四培养温度为25℃。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

用以下实施例验证本发明：

实施例1：

一、毛脉酸模悬浮细胞的制备：选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用120目砂纸磨去种皮，浸泡在蒸馏水中24h；在无菌条件下用75％的酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，再用10％NaClO浸泡8min，无菌水冲洗5次，置于两层湿润的滤纸上10h；用10％NaClO浸泡10min，无菌水冲洗5次，将消毒的种子接种在不含植物生长激素的MS固体培养基中，置于光照培养箱，培养温度25C°；获得无菌苗；利用激素2,4-二氯苯氧乙酸1.7mg/L，6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、3％蔗糖和0.9％琼脂粉的MS固体培养基诱导下胚轴愈伤组织；选取生长良好的愈伤组织，接种在含有植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、3％蔗糖和0.9％琼脂粉的MS固体培养基中，培养温度25℃，光照14h/d，光照强度1800Lx，获得诱导的疏松愈伤组织；将疏松愈伤组织继代3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有40mLMS液体培养基的100mL三角瓶中，加入植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L，培养温度25℃，120r/min黑暗振荡培养。7d后用80目细胞筛去除大的细胞团块。将细胞悬浮培养物摇匀，稍静止，倒出上层培养液，加入新的培养液到40mL(新旧培养液比例1:1)，继续培养，可得到毛脉酸模悬浮细胞。

二、马铃薯固体培养基(PDA)的制备：取去皮马铃薯200g，切块，加蒸馏水适量，煮沸15min，8层纱布过滤，滤液加入20g葡萄糖及15g琼脂，加蒸馏水补足1000mL。分装，121℃灭菌20min，得马铃薯固体培养基

三、毛脉酸模内生真菌RGT-S4的活化及其孢子悬浮液的制备：将冷藏保存的内生真菌RGT-S4接到步骤二制备的PDA试管培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度25℃，培养3d完成活化。在超净工作台中，取5mL无菌水至活化培养的毛脉酸模内真生菌的试管中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到100mL的锥形瓶(含有数粒直径约4mm的玻璃珠)中，重复此操作几次，记录每次吸取的无菌水的体积，使无菌水用的总体积30mL。充分震荡混匀，制得孢子悬浮液。血球计数板计数，计算孢子悬浮液浓度的浓度

四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌的共培养体系：取40mL液体MS培养基(加入植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L)加入容器内，接入步骤一制备的毛脉酸模悬浮细胞，使悬浮细的浓度达到0.1×10³个/mL，控制温度为25℃，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为120r/min。

(一)内生真菌RGT-S4的接种量对共培养体系建立的影响

将RGT-S4的孢子悬浮液接入培养7天后的毛脉酸模悬浮细胞培养体系，使孢子浓度依次为0.1×10²个/mL、0.3×10²个/mL、0.5×10²个/mL、0.1×10³个/mL、0.3×10³个/mL、0.5×10³个/mL、0.1×10⁴个/mL、0.3×10⁴个/mL和0.5×10⁴个/mL。控制温度25℃，120r/min黑暗振荡培养，每两天观察，记录。研究内生真菌对毛脉酸模悬浮细胞的影响。

结果见表1。

表1

表1为内生真菌RGT-S4孢子悬浮液接种量对共培养体系建立的影响。其中“+”表示共生培养体系能存活，“-”表示共生培养体系死亡，ABC表示实验重复三次。可见以孢子悬浮液的性状加入到毛脉酸模悬浮细胞体系中能够建立共生体系，加入较低浓度孢子悬浮液的培养体系中，细胞和孢子悬浮液可以达到较长时间的共培养，当孢子悬浮液浓度为0.1×10³～0.3×10³个/mL时共培养可达17d以上。

(二)内生真菌RGT-S4接种时间对共培养体系建立的影响

分别在毛脉酸模悬浮细胞生长到3d、6d、9d、12d和15d时接入内生真菌RGT-S4孢子悬浮液，接种后使孢子浓度为0.1×10³个/mL，控制温度为25℃，120r/min黑暗振荡培养，每两天观察，记录。研究在不同的细胞培养时间接入内生真菌对共培养体系建立的影响。

表2

表2为内生真菌RGT-S4接种时间对共培养体系建立的影响，表2显示当毛脉酸模悬浮细胞培养3d～15d时接入内生真菌RGT-S4都能建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系，且在悬浮细胞培养9天后接种内生真菌RGT-S4，两者实现共培养的时间最长。

(三)毛脉酸模悬浮细胞起始浓度对共培养体系建立的影响

在100mL三角瓶中加入40mL液体MS培养基(加入植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L)培养悬浮细胞，培养9d，此时悬浮细胞的沉降体积比为2.0/5，将悬浮细胞分别稀释到0.5/5、1.0/5、1.5/5(沉降体积比)，接入内生真菌RGT-S4孢子悬浮液，接种量0.1×10³个/mL，控制温度25℃，120r/min黑暗振荡培养，每两天观察，记录。研究毛脉酸模悬浮细胞起始浓度对共培养体系建立的影响。

沉降体积比：取充分摇匀的培养物于5mL的刻度离心管中，直立沉降60分钟记录培养物沉降体积，该体积与总体积之比即为沉降体积比。

表3

表3为毛脉酸模悬浮细胞起始浓度对共培养体系建立的影响，表3表明，细胞起始浓度对共培养体系的建立有一定影响，在沉降体积比在0.5/5-2.0/5时都可以实现毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT-S4的共培养，且当沉降体积控制在1.5/5-2.0/5左右时，共生情况最好。

(四)摇床转速对共培养的影响

控制摇床转速分别100r/min、120r/min、140r/min、160r/min，在100mL三角瓶中加入40mL液体MS培养基(加入植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L)培养悬浮细胞，培养9d，悬浮细胞浓度控制在1.5/5-2.0/5左右(以沉降体积比计)，接入内生真菌RGT-S4孢子悬浮液，接种量0.1×10³个/mL，控制温度25±0.5℃，黑暗振荡培养，每两天观察，记录。研究不同的摇床转速对共培养体系建立的影响。

表4

表4为摇床转速对共培养的影响，表4表明摇床转速从100r/min～160r/min都能实现毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养，转速在120r/min时毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌能够共培养的时间最长。

(五)毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养生长特征的研究

在液体MS培养基(加入植物激素2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L)中，将内生真菌RGT-S4制成孢子悬浮液，在悬浮细胞培养到第9d时，接入孢子悬浮液0.1×10³个/mL，摇床120r/min，25℃，准备24个100mL的三角瓶进行共培养，每隔2天，随机取两瓶测鲜重增长量及培养液pH值，以培养时间为横坐标，鲜重增长量及培养液pH值为纵坐标，绘制生长曲线，考察生长特性。结果见图1和图2。

图1显示鲜重生长曲线基本可分为延迟期、指数生长期和平稳期。在共培养体系中的鲜物质较单独培养的快，在培养末期鲜重增长量成下降的趋势，这可能到培养末期，营养物质基本消耗完全，细胞和内生真菌开始利用自身营养，从而导致鲜重增长量下降。图2显示毛脉酸模细胞与RGT-S4共培养体系，在一个生长周期中培养液的pH变化大致相同，培养液pH均维持在4.0-5.8之间。细胞与RGT-S4在共培养的初期，培养液的pH从5.8迅速下降到4.3，第2天后pH开始逐渐上升；细胞与RGT-S11共培养的初期，培养液的pH从5.8迅速下降到4.1，第6天后pH开始逐渐上升，之后均维持在5.8左右。

图6是本实施方式毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养10倍的显微图片，从图中可见菌丝与细胞共存。

Claims

1.毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：该共培养体系建立的方法按以下步骤进行：

一、毛脉酸模悬浮细胞的制备：选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用110目～130目砂纸磨去种皮，将去除种皮的毛脉酸模种子浸泡在蒸馏水中18h～26h；然后在无菌条件下用体积分数为70％～75％的酒精浸泡1min～3min，无菌水冲洗3次～5次；再用质量分数为8％～10％NaClO浸泡6min～10min，无菌水冲洗3次～5次，之后将去除种皮的毛脉酸模种子置于两层湿润的滤纸上8h～10h，获得吸水膨胀的毛脉酸模种子；用质量分数为8％～10％NaClO浸泡吸水膨胀的毛脉酸模种子8min～12min，无菌水冲洗3次～5次，得消毒的种子；将消毒的种子接种在不含植物生长激素的MS固体培养基中，置于光照培养箱内培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～8d；获得毛脉酸模无菌苗；利用含有植物激素的MS固体培养基对毛脉酸模无菌苗的下胚轴进行诱导，诱导出愈伤组织；选取生长良好的愈伤组织，接种在含有植物激素的MS固体培养基中，培养温度23℃～27℃，光照12h/d～16h/d，光照强度1500Lx～2000Lx，获得诱导的疏松愈伤组织；将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基的容器中，培养温度23℃～27℃，100r/min～160r/min黑暗振荡培养；5d～8d后用60目～80目细胞筛去除大的细胞团块；将细胞悬浮培养物摇匀，稍静止，倒出上层培养液，向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，继续培养，可得到毛脉酸模悬浮细胞；

二、马铃薯固体培养基的制备：取去皮马铃薯180g～220g，切块，加蒸馏水700mL～1000mL，煮沸15min～30min，6层～8层纱布过滤，将滤液倒入容器中，然后向容器里加入18g～20g葡萄糖和15g～20g琼脂，再加入蒸馏水至800mL～1000mL；分装，121℃灭菌20min～30min，得马铃薯固培养基；

三、毛脉酸模内生真菌的活化及其孢子悬浮液的制备：将内生真菌接到步骤二制备的马铃薯固体培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～5d完成活化；然后在超净工作台内，取3mL～6mL无菌水加入活化培养的毛脉酸模内真生菌的容器中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，重复此操作4次～8次，使用无菌水的总体积为25mL～35mL；充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；

四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌的共培养体系：向容器内加入30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基，培养毛脉酸模悬浮细胞，毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.1×10³个/mL～0.3×10³个/mL，培养8d～10d后，接入内生真菌的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.1×10³个/mL～0.3×10³个/mL，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为100r/min～160r/min，培养温度24.5℃～25.5℃，完成毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系的建立；

所述含有植物激素的MS液体培养基为添加3％～5％蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/～1.0mg/L和6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS液体培养基。

2.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤一所述向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，其中容器里剩余的培养基与新的含有植物激素的MS液体培养基的体积比为1：(1～3)。

3.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤三所述用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，其中容器里加入5粒～8粒直径为3mm～4mm的玻璃珠。

4.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤四毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.2×10³个/mL。

5.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤四培养时间为培养9d。

6.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤四接入内生真菌RGT-S4的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.2×10³个/mL。

7.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤四摇床转速为120r/min。

8.根据权利要求1所述的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：步骤四培养温度为25℃。