CN105142656A - 水性液体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含来源于WT1蛋白的癌抗原肽和添加剂并具有3-6的pH值的水性液体组合物，其中所述肽被稳定。在所述水性液体组合物中，所述肽选自下列(A)和(B)：(A)包含Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu(SEQ？ID？NO:？1)所示氨基酸序列的肽，和(B)具有通过缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸而来源于SEQ？ID？NO:？1所示氨基酸序列的氨基酸序列并能够诱导细胞毒性T细胞的肽；且所述添加剂为选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种：(C)乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐，(D)丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸及其药理学上可接受的盐，和(E)甲硫氨酸。

Description

水性液体组合物
技术领域
本发明属于癌症免疫疗法领域，并涉及包含具有细胞毒性T细胞诱导活性的来源于WT1蛋白的癌抗原肽的水性液体组合物，并涉及药物被该组合物稳定。
背景技术
一般而言，来源于WT1蛋白的癌抗原肽是来源于由449个氨基酸组成的人WT1蛋白(SEQ ID NO: 2)的部分肽，具体地讲是由8-12氨基酸组成的肽或其二聚体。它被呈递为主要组织相容性复合体(MHC) I类抗原，包括由细胞毒性T细胞(细胞毒性T-淋巴细胞，下文称为CTL)进行抗原识别的肽。人中的MHC称为人白细胞抗原(HLA)。
在来源于WT1蛋白的部分肽中，由9个氨基酸组成并以WT1126-134肽Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)的序列显示的部分肽和其中部分氨基酸被修饰的修饰肽(修饰肽)被报导为可用作与HLA结合诱导CTL的肽(参见专利文件1-3，非专利文件1)。
一般用于癌症疫苗的癌抗原蛋白质和癌抗原肽，在许多情况下与佐剂(免疫强化剂)一起给予以更有效地诱导CTL。
然而，常常难以维持包含这些蛋白质和肽的制剂的稳定性，特别是水中的稳定性。因此，一般选择通过冷冻干燥除去水的制剂。然而，从生产和成本的方面来看，冷冻干燥的制剂是不利的，且在用时还需要例如加入水等的操作。
由此看来，根据使用目的，开发能够容易地将癌抗原蛋白质或癌抗原肽与各种佐剂组合的稳定的水性液体组合物是重要的。
至于液体的稳定，公开了含有柠檬酸或甲硫氨酸作为促性腺激素的稳定剂的冷冻干燥的制剂(参见专利文件4)、含有甲硫氨酸作为G-CSF的稳定剂的制剂(参见专利文件5)和pH 4或更低且含有琥珀酸或酒石酸作为G-CSF的稳定剂的制剂(参见专利文件6)。
此外，公开了在溶液中含有以下作为修饰因子VIII多肽的稳定剂的制剂：(1) pH调节剂以落入约4.0-约8.0的范围内，(2)抗氧化剂，和(3)钙盐、镁盐(参见专利文件7)。另外，公开了含有生理活性药物、甲硫氨酸和新的红细胞发生刺激蛋白、且具有改进的稳定性的制剂(参见专利文件8)。
然而，本发明所涉及的含有具有SEQ ID NO: 1所示序列的部分肽或其修饰肽的稳定的水性液体组合物是未知的。
文献列表
专利文献
专利文件1：WO00/06602
专利文件2：WO00/18795
专利文件3：WO2009/072610
专利文件4：JP-A-H10-203997
专利文件5：JP-A-2000-247903
专利文件6：WO2005/39620
专利文件7：WO03/55511
专利文件8：WO03/20299
非专利文献
非专利文件1：EP-B-1127068的审查中的书面意见。
发明概述
发明要解决的问题
本发明的问题是提供提高具有SEQ ID NO: 1所示序列的部分肽或所述肽的修饰肽的稳定性的水性液体组合物，其可用于制备包含上述肽的癌症疫苗制剂。
解决问题的方法
本发明人进行了大量研究以试图解决上述问题，并且发现，包含具有SEQ ID NO: 1所示序列的部分肽或所述肽的修饰肽(下文有时简称为本发明的肽)的水性液体组合物的主要降解产物起因于肽中所含的甲硫氨酸残基的氧化。此外，他们发现，所述肽的甲硫氨酸残基的氧化通过加入特定的赋形剂作为稳定剂而被抑制，并且通过调节组合物以具有特定的pH获得在制剂稳定性方面优异的水性液体组合物，这导致了本发明的完成。
因此，本发明涉及以下方面。
第1项. 一种水性液体组合物，其包含肽和赋形剂，并具有3-6的pH：
其中
所述肽选自下列(A)和(B)，
(A) 由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成的肽，和
(B) 由缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸的SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成并具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽；和
赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种，
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E) 甲硫氨酸。
第2项. 第1项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种：
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自琥珀酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E) 甲硫氨酸。
第3项. 第1或2项的水性液体组合物，其中(B)为Phe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (FMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 3)、Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (RMMPNAPYL) (SEQ ID NO: 4)、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ ID NO: 5)、Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (YMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 6)或Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 7)。
第4项. 第1或2项的水性液体组合物，其中所述肽由(A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成。
第5项. 第1-4项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者。
第6项. 第1-5项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第7项. 第1-6项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自乙醇酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第8项. 第1-6项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自乳酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第9项. 第1-6项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自苹果酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第10项. 第1-6项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第11项. 第1-4项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(D)和(E)两者。
第12项. 第1、2、3、4或11项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(D)和(E)两者，且(D)是选自琥珀酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
第13项. 第1、2、3、4或11项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(D)和(E)两者，且(D)是选自马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
第14项. 第1-4项中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)、(D)和(E)的全部。
第15项. 第1、2、3、4或14项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)、(D)和(E)的全部，(C)是选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，且(D)是选自琥珀酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
第16项. 第1-15项中任一项的水性液体组合物，其中每体积α羟酸的含量为1-100 mM或每体积二羧酸的含量为10-100 mM。
第17项. 第1-16项中任一项的水性液体组合物，其中每体积甲硫氨酸的含量为1-300 mM。
第18项. 第1-17项中任一项的水性液体组合物，其具有4-5的pH。
第19项. 一种通过加入赋形剂提高水性液体组合物中肽的稳定性的方法：
其中
所述肽选自下列(A)和(B)，
(A) 由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成的肽，和
(B) 由缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸的SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成并具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽；和
所述赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种，
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E) 甲硫氨酸。
第20项. 第19项的方法，其中所述赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种：
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自琥珀酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E) 甲硫氨酸。
第21项. 第19或20项的方法，其中(B)为Phe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (FMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 3)、Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (RMMPNAPYL) (SEQ ID NO: 4)、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ ID NO: 5)、Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (YMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 6)或Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 7)。
第22项. 第19或20项的方法，其中所述肽由(A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成。
第23项. 第19-22项中任一项的方法，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者。
第24项. 第19-23项中任一项的方法，其中(C)和(E)两者作为赋形剂加入，且(C)是选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
第25项. 第19-22项中任一项的方法，其中(D)和(E)两者作为赋形剂加入。
第26项. 第19、20、21、22或25项的方法，其中(D)和(E)两者作为赋形剂加入，且(D)是选自琥珀酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
第27项. 第19-22项中任一项的方法，其中所述赋形剂包含(C)、(D)和(E)的全部。
第28项. 第19、20、21、22或27项的方法，其中所述赋形剂包含(C)、(D)和(E)的全部，(C)是选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，且(D)是选自琥珀酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
发明效果
使用本发明的水性液体组合物，可产生稳定包含具有细胞毒性T细胞诱导活性的本发明的肽的水性液体组合物，并且可配制具有优异稳定性的癌症疫苗。
附图简述
图1显示实验实施例5中测量的CTL诱导活性的试验结果。
具体实施方案
下面详细解释了本发明的实施方案。
在本说明书中，各实例的优选实施方案可与其它实例的优选实施方案组合，或可并入前述第1项-第28项中所述的相应实例中。
本发明的“水性液体组合物”是用于制备癌症疫苗的液体，其含有水作为主要溶剂，并可与不同的佐剂混合。虽然水一般用作溶剂，但是药理学上可接受的溶剂(例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇等)可与水部分混合，只要本发明的效果不受影响。优选仅水用作溶剂。
本发明的“肽”是用于制备癌症疫苗的癌抗原肽，并意指选自以下的肽：(A) “由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)的序列所示氨基酸序列组成的肽”和(B) “在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸并具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽”。优选为由(A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成的肽。
“由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成的肽”是作为维尔姆斯瘤(Wilms’ tumor)的抑癌基因WT1的基因产物的蛋白质，其具体来讲是由由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1) (WT1126-134肽)的9个氨基酸组成的氨基酸序列组成的肽，所述肽来自由来源于人WT1蛋白的449个氨基酸(SEQ ID NO: 2)组成的部分肽。该肽被呈递为MHC I类抗原并由CTL进行抗原识别。该肽可通过已知方法产生(参见专利文件1、2、3等)。
作为“由缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸的SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成并具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽”，可提及这样的修饰肽，其是由缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸的氨基酸序列组成且与HLA结合诱导CTL的前述部分肽。被取代的氨基酸的数目优选为1或2个，更优选1个。优选的取代位置为1位、3位或9位。待添加(还包括插入)的氨基酸的数目优选为1或2个，更优选1个。优选的添加位置为1位。待缺失的氨基酸的数目优选为1个。在变化中，待添加的氨基酸或待取代的氨基酸可以是除20种由基因编码的氨基酸以外的非天然的氨基酸。
当修饰肽含有至少一个半胱氨酸残基时，2个肽(单体)可通过二硫键彼此结合形成二聚体。
修饰肽可通过一般常用于本技术领域的方法制备。例如，它可通过描述于以下文献的肽合成方法合成：Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, 第2卷, Academic Press Inc., New York, 1976；peptide synthesis, Maruzen Co., 1975；Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co. 1985；Development of Pharmaceutical Product sequel 第14卷･Peptide Synthesis, Hirokawa-Shoten Ltd., 1991等。
修饰肽的实例包括下列修饰形式。
Phe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (FMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 3)，
Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (RMMPNAPYL) (SEQ ID NO: 4)，
Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ ID NO: 5)，
Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (YMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 6)，和
Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 7)。
这些修饰形式明确地为与HLA结合诱导CTL的修饰肽，并可通过已知方法制备(参见专利文件1-3和非专利文件1)。
作为是本发明中活性成分的肽，也可使用SEQ ID NO: 1所示WT1126-134肽的衍生物或其修饰肽。例如，可提及各种物质与其氨基酸序列的N端和/或C端结合的各肽等。例如，可结合氨基酸、肽、其类似物等。当所述物质结合至由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成的肽或其修饰肽时，该物质通过例如体内的酶等或胞内加工等过程处理等，以最终制备具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，并诱导WT1特异性CTL反应。
在本发明的水性液体组合物中，每体积“肽”的含量没有特别限定，可以是相对于从药理学或性质方面来看可接受的体积的含量。在“肽”中，例如，在水性液体组合物中，SEQ ID NO: 1所示WT1126-134肽(RMFPNAPYL)的优选含量为0.01 mg/mL-200 mg/mL，更优选0.1 mg/mL-100 mg/mL，可根据使用目的选择。
在本说明书中，上述肽在左侧具有N端，各个氨基酸符号意指下列氨基酸残基：
Ala或A：丙氨酸残基
Arg或R：精氨酸残基
Asn或N：天冬酰胺残基
Asp或D：天冬氨酸残基
Cys或C：半胱氨酸残基
Gln或Q：谷氨酰胺残基
Glu或E：谷氨酸残基
Gly或G：甘氨酸残基
His或H：组氨酸残基
Ile或I：异亮氨酸残基
Leu或L：亮氨酸残基
Lys或K：赖氨酸残基
Met或M：甲硫氨酸残基
Phe或F：苯丙氨酸残基
Pro或P：脯氨酸残基
Ser或S：丝氨酸残基
Thr或T：苏氨酸残基
Trp或W：色氨酸残基
Tyr或Y：酪氨酸残基
Val或V：缬氨酸残基
Abu：2-氨基丁酸残基(亦称为α-氨基丁酸残基)
Orn：鸟氨酸残基
Cit：瓜氨酸残基。
一般来讲，“赋形剂”意指活性成分以外的用于制剂的组分。本发明中“赋形剂”的实例(下文有时方便地称为“本发明的赋形剂”)包括：选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，选自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、富马酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和甲硫氨酸。
一般来讲，“α羟酸”是其中羟基也与羧基所键合的碳键合的羧酸。本发明中“α羟酸”的实例包括乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐。药理学上可接受的盐的实例包括碱加成盐。碱加成盐的实例包括铝盐、钙盐、钠盐、钾盐等。其实例包括但不限于乳酸铝、乳酸钙、乳酸钠、苹果酸钠、苹果酸二钠、酒石酸氢钾、酒石酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钠等。当两个或更多个羧基存在时，不同的碱基可加到各羧基上。其实例包括但不限于酒石酸钾钠等。然而，它可以是水合物。其实例包括但不限于乳酸钙水合物、苹果酸钠1/2水合物、苹果酸二钠一水合物、酒石酸钠二水合物、酒石酸钾钠四水合物、柠檬酸水合物、柠檬酸钠水合物等。使用乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸，可稳定包含本发明的肽的水性液体组合物。这些的一种或多种可组合使用。待用于本发明的α羟酸优选为乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或其药理学上可接受的盐，更优选酒石酸或其药理学上可接受的盐。虽然乳酸、苹果酸和酒石酸具有光学异构体，但是旋光形式和外消旋体不影响本发明的作用。酒石酸常用作药物产品的赋形剂，优选描述于日本药典(第16版)的L-(+)酒石酸。
在本发明的水性液体组合物中，虽然每体积“α羟酸”的含量没有特别规定，但优选为1-100 mM，更优选1-50 mM，最优选1-25 mM。
“二羧酸”一般意指分子中具有2个羧基的羧酸。本发明中“二羧酸”的实例包括丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、富马酸及其药理学上可接受的盐。药理学上可接受的盐的实例包括碱加成盐。碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐等。其实例包括但不限于丙二酸二钠、琥珀酸钠、戊二酸钠、富马酸二钠等。然而，它可以是水合物。其实例包括但不限于丙二酸二钠一水合物、琥珀酸钠6-水合物、马来酸一钠三水合物等。使用丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸或富马酸，可以稳定包含本发明的肽的水性液体组合物。可组合使用这些的一种或多种。待用于本发明的二羧酸优选为琥珀酸、马来酸、富马酸或其药理学上可接受的盐。
在本发明的水性液体组合物中，虽然每体积“二羧酸”的含量没有特别限定，但优选为10-100 mM，更优选25-100 mM，最优选50-100 mM。
本发明中的“甲硫氨酸”是必需氨基酸之一，并且是在侧链中包含硫原子的疏水氨基酸。虽然“甲硫氨酸”具有光学异构体，并包括D型、L型和DL型，但是可使用这些的任一种而不影响本发明的效果。甲硫氨酸常常用作药物产品的赋形剂，优选为日本药典(第16版)的L型。虽然本发明的水性液体组合物中每体积甲硫氨酸的含量没有特别限定，但是优选为1-300 mM。
“α羟酸”、“二羧酸”和“甲硫氨酸”甚至在其单独使用时也可稳定本发明的水性液体组合物。通过使用与“α羟酸”和/或“二羧酸”组合的“甲硫氨酸”，可预期进一步的稳定性。在这种情况下，待与“甲硫氨酸”组合的酸优选为乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸或富马酸，更优选苹果酸或酒石酸，最优选酒石酸。
虽然本发明的水性液体组合物具有pH 3-6，但是在生产期间未达到所预期的pH时，一般使用pH调节剂调节pH。从稳定性方面来看，优选的pH为3-6，更优选的pH为4-5。当pH小于3或超过6时，类似物例如本发明的肽中甲硫氨酸残基的氧化形式等往往在生产或存储期间增加。因此，水性液体组合物中本发明的肽的含量可能不优选地降低。
从通常用于药物制剂的pH调节剂中适当地选择和使用pH调节剂。具体来讲，可提及盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸三钠等。
另外，除上述赋形剂以外，本发明的水性液体组合物可适当地包含通常用于药物制剂的赋形剂，例如稳定剂、增溶剂、缓冲剂、等渗剂、增溶剂等，只要不影响本发明的效果。
可通过通常用于生产药物产品的方法等，来生产本发明的水性液体组合物。例如，在保持在5-25℃恒温的环境下，将注射用水加入合适的容器中，将提前称量的肽和赋形剂加入其中，同时轻轻搅拌混合物。然后，最后调节混合物至所需的pH。混合物通过过滤等灭菌，装入容器(例如玻璃小瓶等)中，将其用橡胶塞等密封。
使用本发明的水性液体组合物制备癌症疫苗的方法不受特别限制，可提及例如：通过与合适的佐剂混合以制备癌症疫苗的方法；通过提前与合适的佐剂混合并冷冻干燥混合物等，来制备癌症疫苗的方法；用时通过将本发明的水性液体组合物与佐剂混合，来制备癌症疫苗的方法等。佐剂的实例包括：弗氏佐剂；矿物凝胶例如氢氧化铝；表面活性物质例如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔䗩血蓝蛋白和二硝基苯酚；人佐剂例如BCG (Bacille de Calmette et Guérin)和短小厌氧棒状杆菌(Corynebacterium parvum)等。
使用本发明的水性液体组合物制备的癌症疫苗可用于预防或治疗WT1基因表达水平增加有关的癌症，例如，血液学癌症例如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等，和实体瘤例如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、泌尿膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌等。
因为本发明的水性液体组合物可以稳定地保持作为活性成分的癌抗原肽，所以可选择不同的给药形式。具体地说，可提及口服、经鼻、经肺、经皮、皮内、皮下、肌内、静脉内或腹膜内给药等，并且可根据使用目的通过上述方法制备癌症疫苗。总的来说，作为优选用于用癌症疫苗免疫刺激的给药途径，胃肠外给药是已知的，例如腹膜内给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药、静脉内给药以及经鼻给药、经皮给药等。这些当中，可优选提及经注射给药，例如皮下给药、皮内给药、腹膜内给药、肌内给药等。
实施例
下面参照不得解释为限制性的实施例、比较实施例、实验实施例等，更详细地解释本发明。在下面的实施例等中，“%”意指“wt%”，除非另有说明。
“乙醇酸(晶体) (由Nacalai Tesque生产)”用作乙醇酸，“乳酸(由Nacalai Tesque生产)”用作乳酸，“DL-苹果酸(由Nacalai Tesque生产)”用作苹果酸，“L(+)-酒石酸粉(由Merck生产)”用作酒石酸，和“柠檬酸一水合物(由Nacalai Tesque生产)”用作柠檬酸。“丙二酸(由Nacalai Tesque生产)”用作丙二酸，“琥珀酸(由Nacalai Tesque生产)”用作琥珀酸，“戊二酸(由Nacalai Tesque生产)”用作戊二酸，“马来酸(由Nacalai Tesque生产)”用作马来酸，和“L-甲硫氨酸(由Kyowa Hakko Bio Co.，Ltd.生产)”用作甲硫氨酸。为了调节pH，“1 mol/l-盐酸(由Nacalai Tesque生产)”用作盐酸，和“1 mol/l-氢氧化钠溶液(由Nacalai Tesque生产)”用作氢氧化钠。
在比较实施例中，“无水磷酸二氢钠(由Nacalai Tesque生产)”用作磷酸二氢钠，“乙酸钠三水合物(由Nacalai Tesque生产)”用作乙酸钠，“巯基乙醇酸钠(由Nacalai Tesque生产)”用作巯基乙醇酸钠，“焦亚硫酸钠(由Nacalai Tesque生产)”用作焦亚硫酸钠，和“L(+)-抗坏血酸(由Nacalai Tesque生产)”用作抗坏血酸。“L-α-丙氨酸(由Nacalai Tesque生产)”用作丙氨酸，“甘氨酸(由Nacalai Tesque生产)”用作甘氨酸，和“L-精氨酸盐酸盐(由Nacalai Tesque生产)”用作精氨酸。
“IFA (由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)”用作不完全弗氏佐剂，“NOFABLE EO-85S (由NOF Corp.生产)”用作油酸乙酯，“NOFABLE SO-991 (由NOF Corp.生产)”用作脱水山梨醇单油酸酯，“NIKKOL HCO-10 (由Nikko Chemicals生产)”用作聚氧乙烯氢化蓖麻油10，和“日本药典浓甘油(由NOF Corp.生产)”用作浓甘油。“NIKKOL ODM-100 (由Nikko Chemicals生产)”用作肉豆蔻酸辛基十二烷基酯，“NOFABLE GO-991 (由NOF Corp.生产)”用作甘油单油酸酯，和“NIKKOL HCO-20 (由Nikko Chemicals生产)”用作聚氧乙烯氢化蓖麻油20。
[水性液体组合物的制备]
[实施例1]
按表1所示量，将作为肽的肽(A)即SEQ ID NO: 1 (RMFPNAPYL)所示肽(下文称为肽(1))和作为赋形剂的赋形剂(C)即乙醇酸溶于注射用水中，用盐酸和/或氢氧化钠调节至pH 4.5。将混合物通过0.2 μm无菌滤器过滤，以1 mL装入玻璃小瓶，将小瓶用丁基橡胶塞密封，藉此得到水性液体组合物1。
[实施例2-38]
按与实施例1相同的方式，将作为肽(A)的肽(1)和作为赋形剂(C)、(D)和/或(E)的α羟酸、二羧酸和/或甲硫氨酸按表1-9所述的量制备，装入小瓶中，将小瓶用丁基橡胶塞密封，藉此得到水性液体组合物2-38。
[比较实施例1-23]
按与实施例1相同的方式，以表10-14所述的量制备，装入小瓶中，将小瓶用丁基橡胶塞密封，藉此得到水性液体组合物39-61。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[实验实施例1] 稳定性评价(1)
将制备的水性液体组合物贮存在60℃下的培养箱中2周。然后，根据下列方法测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于肽(1)中所含的甲硫氨酸残基氧化的肽。
使用用于流动相的纯水、乙腈、甲醇和三氟乙酸，使用C18反相柱(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)，通过反相系统高效液相色谱法测量氧化肽的含量。作为肽(1)，注入相当于10 μg的量，在220 nm的波长下进行分光镜检测。利用通过该方法测量的峰面积，通过下式计算氧化肽的含量(%)。
氧化肽的含量(%) = 氧化肽的峰面积/包含相关物质的肽的总峰面积× 100
在实施例和比较实施例获得的水性液体组合物中，将表1-6描述的实施例1-22和表10-12描述的比较实施例1-14贮存在60℃下2周。贮存后氧化肽的含量见表15和16。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
氧化产物的抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例1)中氧化肽的含量)-(表15或表16中实施例或比较实施例中的氧化肽的含量)}×100/(对照样品(比较实施例1)中氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表15]
[表16]
作为比较实施例，通过加入一般的酸或氨基酸作为赋形剂，来评价对肽(1)氧化的抑制作用。结果，赋形剂对氧化几乎没有抑制作用(小于10%)或氧化肽含量有所增加。相比之下，当在本发明中加入赋形剂时，总是发现对氧化的抑制作用。按照表15，证实了对氧化的抑制作用几乎不受本发明的赋形剂的每体积含量的影响。
[实验实施例2] 稳定性评价(2)
将制备的水性液体组合物贮存在60℃下的培养箱中2周。然后，以与稳定性评价(1)相同的方式测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸残基氧化的肽。
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，将表6和7中描述的实施例23-27和表10中描述的比较实施例1贮存在60℃下2周。在贮存后氧化肽的含量见表17。以与稳定性评价(1)相同的方式，计算表中氧化产物的抑制比率。
[表17]
按照表17，可以证实，在本发明中使用两种或更多种赋形剂的组合，得到与对照相比对氧化较高的抑制作用。
[实验实施例3] 稳定性评价(3)
将制备的水性液体组合物贮存在60℃下的培养箱中2周。然后，按与稳定性评价(1)中相同的方式测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸残基氧化的肽。
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，将表14中描述的比较实施例19和表9中描述的实施例37贮存在60℃下2周。在贮存后氧化肽的含量见表18。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
氧化产物的抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例19)中氧化肽的含量)-(表18中实施例37的氧化肽的含量)}×100/(对照样品(比较实施例19)中氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表18]
按照表15和表18，可以证实，本发明的赋形剂显示对氧化的抑制作用，不论水性液体组合物的肽浓度如何。
[实验实施例4] 稳定性评价(4)
将制备的水性液体组合物贮存在40℃下的培养箱中4周。然后，按与稳定性评价(1)中相同的方式测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸残基氧化的肽。使用C18反相柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，并使用纯水、乙腈和三氟乙酸用于流动相。
在比较实施例中得到的水性液体组合物中，将表14中描述的比较实施例20-23在40℃下贮存4周。在贮存后氧化肽的含量见表19。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例20)中氧化肽的含量)-(表19中比较实施例的氧化肽的含量)}×100/(对照样品(比较实施例20)中氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表19]
如表19所示，证实了与对照相比，加入作为常用于液体制剂的抗氧化剂的抗坏血酸、巯基乙醇酸钠或焦亚硫酸钠不能稳定肽(1)，并增加氧化产物。
[实验实施例5] 特异性CTL诱导活性的证实
将水性液体组合物36、37和38与佐剂混合，得到癌症疫苗组合物。
1) 癌症疫苗组合物a1、a2的制备
作为佐剂a，使用不完全弗氏佐剂。将水性液体组合物36用不含肽的10 mM酒石酸+ 50 mM甲硫氨酸溶液稀释1.7倍。将450 μL前述混合物吸入玻璃注射器(Top Corp.)中，使该注射器在接合处与含有450 μL佐剂a的另一个玻璃注射器连接。交替压下两个玻璃注射器的内筒30次以上，以使溶液乳化，藉此得到癌症疫苗组合物a1。
同样，将水性液体组合物38用不含肽的10 mM酒石酸+ 200 mM甲硫氨酸溶液稀释1.7倍，在类似情况下使用佐剂a处理，得到癌症疫苗组合物a2。
2) 癌症疫苗组合物b1、b2的制备
将油酸乙酯(96.5 g)、脱水山梨醇单油酸酯(17.5 g)、聚氧乙烯氢化蓖麻油10 (4.5 g)、浓甘油(1.5 g)和25 mM磷酸二氢钠水溶液(20.0 g)提前吸入300 mL玻璃高量杯中。然后，使用CLEAMIX CLM-1.5 (M Technique Co.，Ltd.)以10000 rpm搅拌混合物5分钟，得到佐剂b。
然后，将400 μL水性液体组合物37和930 μL佐剂b用试管混合器(touch mixer MT-51，Yamato Scientific Co.，Ltd.)混合，得到癌症疫苗组合物b1。
此外，在类似条件下处理水性液体组合物38和佐剂b，得到癌症疫苗组合物b2。
3) 癌症疫苗组合物c1、c2的制备
将油酸乙酯(49.0 g)、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯(49.0 g)、脱水山梨醇单油酸酯(7.0 g)、甘油单油酸酯(9.8 g)、聚氧乙烯氢化蓖麻油20 (1.4 g)、浓甘油(1.4 g)和25 mM磷酸二氢钠水溶液(22.4 g)提前吸入300 mL玻璃高量杯中。然后，使用CLEAMIX CLM-1.5 (M Technique Co.，Ltd.)以10000 rpm搅拌混合物5分钟，得到佐剂c。
然后，将400 μL水性液体组合物36和930 μL佐剂c用试管混合器(touch mixer MT-51，Yamato Scientific Co.，Ltd.)混合，得到癌症疫苗组合物c1。
此外，在类似条件下处理水性液体组合物38和佐剂c，得到癌症疫苗组合物c2。
4) CTL诱导活性评价
使用HLA-A*0201转基因小鼠(Eur. J. Immunol.: 34, 3060, 2004)，评价的上述1)-3)中制备的6种癌症疫苗组合物(a1-c2)诱导特异性CTL的能力。
将100 μL的各癌症疫苗组合物(600 μg，按肽剂量)皮内给予HLA-A*0201转基因小鼠尾根部。每组使用3只小鼠。在给药后7天分离出脾，制备脾细胞。将一部分脾细胞用100 μmol/L肽(1)脉冲1小时。脉冲意指将肽(1)加入脾细胞中，使得抗原肽与细胞表面上的HLA结合。将未用肽(1)脉冲的脾细胞和用肽脉冲的上述脾细胞混合，以7.8×106个细胞/孔接种到24孔板中培养。作为培养基，使用补充有10% FCS、10 mM HEPES、20 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1 mM MEM非必需氨基酸、1% MEM维生素和55 μM 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基，将细胞培养5天。通过51Cr释放测定法(J. Immunol.: 159, 4753, 1997)，测定给予的肽对培养的脾细胞的特异性CTL活性。对于HLA-A*0201和H-2Db嵌合MHC I类分子的稳定表达，使用通过基因转移至小鼠淋巴瘤来源的细胞系在巴斯德研究中心(Institut Pasteur)制备的细胞系EL4-HHD细胞(J. Exp. Med.: 185, 2043, 1997)。以3.7 MBq/5×105个细胞对靶细胞进行51Cr标记1小时，加入前述肽至167 μmol/L，将细胞进一步脉冲1小时。另外，未用前述肽脉冲(未脉冲)的靶细胞经51Cr标记2小时，得到对照靶细胞。将标记的靶细胞和较早制备的脾细胞以1:20的比率混合，培养4小时，从受损靶细胞的比率，确定CTL诱导活性(即细胞毒性)。结果见图1。以每给药小组3只小鼠的平均值表示细胞毒性。
如图1所示，给予使用本发明的水性液体组合物制备的癌症疫苗组合物的组针对用前述肽脉冲的靶细胞显示高细胞毒性，但是显示针对未用前述肽脉冲的对照靶细胞显示低细胞毒性，这阐明了肽特异性CTL的诱导。结果表明，与不同佐剂组合的本发明的水性液体组合物激活癌抗原特异性CTL的诱导。
[水性液体组合物的制备]
[实施例39-44]、[比较实施例24]
按表20中的量，将作为肽的是肽(A)的肽(1)、作为赋形剂是赋形剂(C)的酒石酸和作为赋形剂(E)的甲硫氨酸溶于注射用水中，用盐酸或/和氢氧化钠调节至表20所述pH。将混合物通过0.2 μm无菌滤器过滤，以1 mL装入玻璃小瓶，将小瓶用丁基橡胶塞密封，藉此得到水性液体组合物62-68。
[表20]
[实验实施例6] 稳定性评价(5)
将制备的水性液体组合物在40℃下的培养箱中贮存1个月。然后，根据下列方法测量肽(1)的含量(下文称为肽含量)。
使用C18反相柱(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)，使用用于流动相的纯水、乙腈、甲醇和三氟乙酸，通过反相系统高效液相色谱法测量肽含量。作为肽(1)，注入相当于10 μg的量，在220 nm的波长下进行分光镜检测。利用通过该方法测量的峰面积，肽含量(%)通过下式计算。
肽含量(%) =肽(1)的峰面积/含有相关物质的肽的总峰面积× 100
以相同方式测量贮存前(起始)的肽含量(%)，肽的残留比率(%)通过下式计算。
肽的残留比率(%) =贮存后的肽含量(%)/肽含量(起始) (%) × 100
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，表20中描述的实施例39-44和表20中描述的比较实施例24在40℃下贮存1个月。肽的残留比率(%)见表21.
[表21]
如表21所示，当pH在3-6的范围内时，获得具有高稳定性、残留比率不小于97%的水性液体组合物。另一方面，当pH为7.1时，肽的残留比率降低。
[实验实施例7] 稳定性评价(6)
将制备的水性液体组合物在40℃下的培养箱中贮存4周。按与稳定性评价(1)中相同的方式测量贮存后氧化肽的含量。
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，将表8中所述实施例34和表13所述的比较实施例15、16在40℃下贮存4周。在贮存后氧化肽的含量示于表22。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
氧化产物的抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例15)的氧化肽的含量)-(表8中实施例34或表13中比较实施例16的氧化肽含量)}×100/(对照样品(比较实施例15)的氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表22]
如表22所示，可以证实，甚至当水性液体组合物的肽浓度低时，本发明的赋形剂显示对氧化的抑制作用。
[水性液体组合物的制备]
[实施例45]、[比较实施例25]
按与实施例1相同的方式，制备按表23所述的量，装入小瓶中，将小瓶用丁基橡胶塞密封，藉此得到水性液体组合物69和70。
[表23]
[实验实施例8] 稳定性评价(7)
将100 μL的0.3% H2O2水加入1 mL制备的水性液体组合物中。在轻轻搅拌混合物后，立即测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸残基氧化的肽。通过类似于稳定性评价(1)的方法，测量氧化肽的含量。
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，在将100 μL的0.3% H2O2加入1 mL的以下每个中后的氧化肽的含量(%)见表24：表13所述比较实施例17、18，表23所述实施例45和比较实施例25，和表8所述实施例35。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
氧化产物的抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例17)的氧化肽的含量)-(表13、表23或表8中实施例或比较实施例的氧化肽的含量)}×100/(对照样品(比较实施例17)的氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表24]
如表24所示，可以证实，甚至当水性液体组合物的肽浓度高时，本发明的赋形剂显示对氧化的抑制作用。
[实验实施例9] 稳定性评价(8)
在制备的水性液体组合物中，将100 μL 0.3% H2O2水加入1 mL表14所述比较实施例20和表9所述实施例36、37和38的各水性液体组合物中。在轻轻搅拌混合物后，立即测量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸残基氧化的肽。通过类似于稳定性评价(1)的方法测量氧化肽的含量。
在实施例和比较实施例中得到的水性液体组合物中，在将100 μL 0.3% H2O2加入1 mL表14所述比较实施例20和表9所述实施例36、37和38的每个中之后的氧化肽的含量(%)见表25。通过下式计算表中氧化产物的抑制比率。
氧化产物的抑制比率(%)={(对照样品(比较实施例20)中氧化肽的含量)-(表9中实施例的氧化肽的含量)}×100/(对照样品(比较实施例20)中氧化肽的含量)
氧化产物抑制比率的较高数值意指对氧化较高的抑制作用和赋形剂对肽(1)的高稳定作用。
[表25]
如表25所示，可以证实，实施例36、37和38的水性液体组合物显示对氧化的抑制作用，其被证实在实验实施例5中显示CTL诱导活性。
工业实用性
按照本发明，可提供包含来源于WT1蛋白的癌抗原肽的高稳定的水性液体组合物，可按照使用目的，容易地将肽与不同的佐剂混合。

Claims (9)

1. 一种水性液体组合物，其包含肽和赋形剂，并具有3-6的pH：
其中
所述肽选自下列(A)和(B)，
(A) 由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成的肽，和
(B) 由缺失、取代和/或添加1-3个氨基酸的SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成并具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽；和
所述赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种，
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E)甲硫氨酸。
2. 权利要求1的水性液体组合物，其中所述肽由(A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成。
3. 权利要求1或2的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者。
4. 权利要求1-3中任一项的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(C)和(E)两者，且(C)是选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸。
5. 权利要求1或2的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(D)和(E)两者。
6. 权利要求1、2或5的水性液体组合物，其中所述赋形剂包含(D)和(E)两者，且(D)是选自琥珀酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸。
7. 权利要求1-6中任一项的水性液体组合物，其中每体积α羟酸的含量为1-100 mM或每体积二羧酸的含量为10-100 mM。
8. 权利要求1-6中任一项的水性液体组合物，其中每体积甲硫氨酸的含量为1-300 mM。
9. 一种通过加入赋形剂改进水性液体组合物中的肽稳定性的方法，所述肽由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列组成：
其中
所述赋形剂包含选自下列(C)、(D)和(E)的一种或多种，
(C) 选自乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的α羟酸，
(D) 选自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸及其药理学上可接受的盐的一种或多种的二羧酸，和
(E)甲硫氨酸。
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